Use of proteases to improve filtration and stability of Austrian wine

Die Herkunft des Traubenmaterials Grüner Veltliner aus dem Jahre 2019 stammt vom Versuchsgut Götzhof der HBLAuBA in Langenzersdorf. Die Trauben wurden in der Abteilung Kellerwirtschaft abgepresst sowie geschwefelt und für 24 h wurde der Most abgesetzt, sonst waren die Moste unbehandelt bzw. weitere Mostschönungen wurden nicht durchgeführt. In der Abteilung Obstbau erfolgte die Erhitzung (E) auf 75 °C für 1 min in dem Pasteur-Gerät (KKP360, Kreuzmayr GmbH, Wallern an der Traun, Österreich).

Der Most wurde in 34-L-Glasflaschen und in drei Tanks abgefüllt. Die Versuchsansätze (Abbildung 1) wurden mit der Hefe Lalvin^® EC1118 (Lallemand GmbH, Wien, Österreich; 10 g/30 l), Vitamin B₁ (Vitamon^® B Sticks, Erbslöh GmbH, Geisenheim, Deutschland; 18 mg/30 l) und Diammoniumphosphat (Preziso Hefenährstoffbasis Basis B, RWA, Wien, Österreich; 7 g/30 l) versetzt. Es wurden diese Enzymkomplexe verwendet. Lallzyme-P1-Versuchsenzym (Lallemand GmbH, Wien, Österreich; 1 ml/30 l) ist eine Mischung aus Pectinase, Hemicellulose und einer sauren Protease (EC 3.4.23.18 Endopeptidase, Aspergillopepsin I, Lallemand GmbH, Wien), Lallzyme-P2-Versuchsenzym (Lallemand GmbH, Wien, Österreich; 1 ml/30 l) ist eine saure Protease (EC 3.4.23.18 Endopeptidase, Aspergillopepsin I, Lallemand GmbH, Wien) alleine und Lallzyme C-MAX™ (Lallemand GmbH, Wien, Österreich, 1 mg/30 l) enthält eine Pektinase und Hemicellulose. Ansatz 1 stellt bei den Kleingebinden die Nullvariante dar und beinhaltet nur die oben angeführten Nährstoffe. Der Ansatz 2 beinhaltet zusätzlich alle Enzymkomplexe, der Ansatz 3 Lallzyme P2 sowie der Ansatz 4 Lallzyme C-MAX™ und Lallzyme P1. Der Tank TU1 war unerhitzt (U), beinhaltet die oben angeführte Nährstoffzugabe, TU2 war erhitzt; es wurden die Enzyme des Ansatzes 2 inklusive aller Nährstoffe verabreicht. TE2 unterschied sich von TU2 durch eine 1 min lange Erhitzung auf 75 °C.

Abbildung 1

Die Gärkontrolle erfolgte durch tägliche Messungen mit einem Oenofoss™-Messgerätes (Fa. Foss GmbH, Hilleroed, Dänemark). Es wurde Alkohol, Zucker, Gesamtsäure, Apfelsäure, pH-Wert und flüchtige Säure erhoben. Am Ende der Gärung bei 20 °C wurden mittels des FTIR (Fourier-transformierter Infrarotspektroskopie, Wine Scan, Firma Foss, Hilleroed, Dänemark) die Messdaten des Jungweines erhoben und anschließend erhielten die Weine 25 mg/l Kaliumpyrosufit.

Der Plugging-Index – Verblockungsindex – (Abbildung 2) nach Schillinger und Steindl-Kratochvil (2003) stellt die Zeitdifferenz der Filtration zweier exakt definierter Volumina durch einen spezifizierten Membranfilter in einem Messvorgang ohne Unterbrechung bei definiertem konstantem Druck dar. Die Messung wurde unter 2 bar mit einer definierten Membran (Filter Supor^® 0,45 μm 25 mm PES 100/pk, Art.: 60172 Pall Coporation, Mexiko) durchgeführt. Aufgrund der geringen Durchflussleistung wurden die Volumina auf ein 1/10 reduziert. Die Berechnung des Verblockungsindexes erfolgte in Sekunden und wurde modifiziert von Schillinger und Steindl-Kratochvil (2003) übernommen. Es wurden Volumina von 20 g und 40 g herangezogen. Die Filtrierbarkeit des maximalen Volumens (V_Max-Bestimmung) repräsentiert das maximale filtrierbare Volumen einer Flüssigkeit, in unserem Fall Wein, durch eine definierte Membran (Supor^® 0,45 μm 47 mm PES 100/pk, Art.:60173 Pall Coperation, Mexiko). Die Filtermembran der Filtrationsapparatur wurde in entionisiertes Wasser getaucht und bei jeder Messung gewechselt. Es wurde in den ersten 3 min alle 15 sec die Flüssigkeitsmenge über die Messung des Gewichtes bestimmt, nach 3 Minuten alle 30 sec bis zur letzten Messung hin bis 10 min. Die Messung erfolgte unter 1 bar Druck. Die Berechnung des maximalen filtrierbaren Volumens erfolgte nach der Formel von Schillinger und Steindl-Kratochvil (2003). Der NTU- (Nephelometrischer Trübungswert) Wert wurde mittels Turb^® 430 IR, WTW (Artikel-Nr.: WW600321, Xylem Analytics Germany Sales GmbH & Co. KG, Deutschland) ermittelt.

Abbildung 2

Die Weine wurden in Flaschen abgefüllt als Vorbereitung für eine sensorische Verkostung. Die Abfüllung der Flaschen erfolgt nach einer Vorbehandlung mit Lallzyme HCTM (Lallemand GmbH, Wien Österreich), eine Mischung aus Polygalacturonase, Pectin-Esterase und Pectin-Lyase, damit eine Abschlussfiltration durchgeführt werden konnte.

Die sensorische Verkostung wurde mit sechs erfahrenen Verkostern durchgeführt, wobei alle subjektiven Eindrücke in Form von Rangordnungstests und deskriptiver Beschreibung gesammelt und zusammengefasst wurden.

Bentonitbedarf, Wärmestabilitätstest und Schönungsvorversuch wurden nach hausinternen Protokollen der Abteilung Chemie durchgeführt.

Zur Probenvorbereitung zur Darstellung der Proteine mittels SDS- (Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid) Gele wurden die Weinproben filtriert (Faltenfilter 595 ½, Artikel-Nr.: 10311645 und 602 H ½, Artikel-Nr.: 10312645, Fa. GE Healthcare Life Sciences, Whatman™, Deutschland), danach erfolgte eine Proteinaufkonzentrierung durch Acetonfällung. Es wurden 2 ml Wein mit 8 ml Aceton (Fa. Roth, Artikel-Nr.: 5025.6, Österreich) bei −18 °C versetzt und 10 min mit 10000 rpm bei −4 °C zentrifugiert (Zentrifuge 5702R, Eppendorf, Österreich). Der Überstand wurde dekantiert mit einer folgenden Pellet-Trocknung bei Raumtemperatur über mindestens 2 Stunden, beziehungsweise über Nacht durchgeführt. Am nächsten Tag erfolgte die Pellet-Resuspension in 200 μl SDS Ladepuffer (4,2 ml Wasser; 1,0 ml 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8; 800 μl Glycerin; 1,6 ml 10 % (w/v) SDS; 400 μl 2-Mercaptoethanol; 20 μl 10 % (w/v) Bromphenolblau). Die fertiggestellten Proben wurden sofort für die Elektrophorese verwendet oder einige Tage bei −18 °C aufbewahrt. Vor der Durchführung der Elektrophorese wurden die Proben denaturiert, dabei wurden die Proben 5 min bei 95 °C erhitzt und anschließend bei 10000 rpm 5 min zentrifugiert. Die elektrophoretische Trennung erfolgte mittels einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE), wobei Tris-HCl-Fertiggele (Mini-Protean^®TGX Gels, Fa. BIO-RAD, Nr.: 456-1043) und ein Marker (Marker Precision Plus Protein™ Standard, Fa. Bio-Rad Nr. 161-0363) verwendet wurden. Die Trennung wurde mit einem System der Firma Bio-Rad (Mini Protean^® Tetra Cell) mit dazugehöriger Steuereinheit (PowerPac HCTM, Bio-Rad) bei einer Stromstärke von 100 Volt durchgeführt. Zur Proteintrennung wurde ein Puffer aus 1 g Tris, 72 g Glycin und 5 g SDS in 5 l Wasser verwendet. Anschließend wurden die Gele einer Coomassie-Färbung (SERVA HPETM Coomassie^®Staining, Art. Nr.: 43396, SERVA Elektrophoresis GmbH, Deutschland) unterzogen. Die Dokumentation erfolgte mittels Fotografie einer Leuchtplatte (Kaiser simlite plano, Fa. Kaiser Fototechnik GmbH & Co KG, Deutschland).

Die Berechnungen und Darstellungen wurden alle mit Microsoft Excel 2016 (Microsoft Corporation, Redmond, USA) erstellt.

Abbildung 3 zeigt, dass die Tankprobe TE2 die schnellste Gärfähigkeit aufweist. Eine schnellere Gärung wurde durch die Größe des Gebindes von 200 l sowie die Zugabe aller Enzyme und Nährstoffe veranlasst. Im Vergleich dazu waren die Proben in den kleinen Glasballons langsamer. Prinzipiell zeigten die erhitzten Proben eine schnellere Gärung im Gegensatz zu den unerhitzten Proben ohne Enzymzugabe in kleineren Gefäßen, die am langsamsten durchgegoren worden sind. Die Aufspaltung der Proteine durch die Enzyme (Berg et al., 2003) erleichterte der Hefe die Aufnahme von Nährstoffen (Dittrich und Grossmann, 2005) und unterstützt damit eine zügige Durchgärung. Durch die Erhitzung der Proben kam es zu einem Ausfall von Proteinen (Berg et al., 2003) sowie zu einer Abtötung von unerwünschten Mikroorganismen (Fuchs et al., 1992). In weiterer Folge kam es dadurch zu einer klaren Fruchtausbildung im Wein. Alle erhitzen Weine wurden von der Mehrheit der Verkoster als besser bezeichnet und konnten eindeutig geschmacklich unterschieden werden.

Abbildung 3

Die unvollständige Gärung bei den Proben 1U (A–C) (Tabelle 1) mit verbleibendem Restzucker führte zu einem reduzierten Alkoholgehalt im Vergleich zu den anderen Proben 0,2 ≤ 0,6 vol.-%. Diese nicht erhitzten Proben im Kleinballon wiesen mit Werten von 0,4 g/l die höchsten flüchtigen Säurewerte auf. Darüber hinaus war auch ein erhöhter Gesamtzucker sowie Fructose noch im Wein vermehrt messbar. Andererseits konnte bei den anderen Proben nur sehr wenig bis keine Fructose gemessen werden. Die Glucosewerte waren bei allen Weinen nicht nachweisbar und die titrierbaren Säuren waren abgesehen von der Probe 2UA, ein Ausreißer, bei den erhitzten Proben höher (Tabelle 1). Der pH-Wert war bei allen Proben 3,45 ± 0,04 sehr ähnlich, während die Weinsäure von 3,4 bis 4,2 g/l schwankte. Sie war bei den erhitzten Proben erhöht und bestätigte, dass die Wirkung auf die Weinsäureausfällung sehr stark von der Temperatureinwirkung abhängt (Li et al., 2019). Im Verhältnis zur Weinsäure zeigten die anderen Säuren wie Apfel-, Zitronen- und Milchsäure geringe Schwankungen.

Die größten Verblockungswerte (Abbildung 4) zeigten die Proben (TU1, 1E, 1U) ohne Enzymzugabe, gefolgt von den Proben mit alleiniger Proteasezugabe (3E und 3U). Diese Proben wiesen zusätzlich Unterschiede zwischen erhitzten und nicht erhitzten Proben auf, wobei die Erhitzten deutlich schlechtere Werte lieferten. Eine gute Filtrierbarkeit mit geringem Verblockungsindex resultierte aus der Zugabe von Pectinase- und Glucanasezugaben in die Probe (4E und 4U), wobei festgestellt wurde, dass sich die Erhitzung mit dieser Enzymzugabe negativ auf den Verblockungsindex auswirkte. Den kleinsten Verblockungsindex (Abbildung 4) zeigten die Proben (TE2, TU2, 2E, 2U) mit allen Enzymzugaben, was in diesem Fall beweist, dass einerseits die Erhitzung des Mostes bei Zugabe aller Enzyme keine Rolle spielt und andererseits eine Verbesserung in der Filtrationsleistung erreicht wird.

Abbildung 4

Die Filtrierbarkeit der Proben durch den Einfluss von Wärme und Enzymzugabe ist in Abbildung 5 dargestellt. Eine Enzymzugabe erhöht die Filtrierbarkeit, wohingegen die Erhitzung der Probe die Filtrierbarkeit wiederum wie in Probe 1U (89 ml/min) und 1E (29 ml/min) ohne Enzymzugabe durch die Erhitzung senkt. Die beste Filtrierbarkeit zeigte die Probe 4E (665 ml/min), die sowohl erhitzt wie auch mit dem Enzym Lallzyme P2 sowie mit Pectinasen versetzt wurde, gefolgt von der Probe 2E, wo eine Erhitzung sowie eine Zugabe aller Enzyme erfolgt war. Im Tank kam es im Vergleich zwischen „unerhitzt“ (TU2, 456 ml/min) und „erhitzt“ (TE2, 523 ml/min) zu dem Ergebnis, dass Enzymzugaben sehr wichtig für erhitzte Weinproben sind und die Filtrierbarkeit durch die Enzyme stark erhöht wird. Zusätzlich haben Proteasen den Vorteil, dass diese leicht herausgefiltert werden können (de Souza et al., 2015).

Abbildung 5

Bei der Trübungsmessung (Abbildung 6) wies die Probe 1E mit 31,9 NTU die stärkste Trübung auf. Es gab hier keine Zugabe von Enzymen und durch die Erhitzung auf 75 °C wurden die meisten Enzyme wie auch Mikroorganismen (Fuchs et al., 1992) inaktiviert. Die die geringsten Trübungen (1,3–1,7 NTU) zeigten die Enzymzugaben nach Variante 2 und 4 sowohl erhitzt wie unerhitzt. In der Variante 3 – nur mit einer Protease behandelt – kam es zu leichten Trübungen und Werten von 3,5–9,5 NTU. Durch die Zugabe von Enzymen konnte gezeigt werden, dass der NTU-Wert und die damit verbundene Trübung massiv im Wein gesenkt werden konnten.

Abbildung 6

Zur Ermittlung der erforderlichen Bentonitmenge wurden Wärmetests durchgeführt. Die erhitzten Proben zeigten einen negativen Wärmetest bei den Kleinversuchen, wohingegen beim 200-l-Tank ein Bedarf (Tabelle 2) von 50 g/hl festgestellt wurde und der Bentotest bei 100 g/hl oder 150 g/hl lag. In Bezug auf die erhitzten Proben zeigten alle unerhitzten einen positiven Wärmetest und einen Bedarf von 150 oder 200 g/hl Bentonit. Hierbei ist ersichtlich, dass durch eine Erhitzung Bentonit eingespart werden kann. Die Zugabe von Enzymen führte zu keiner verbesserten Stabilität und verringertem Bentonitbedarf im Versuchswein im Gegensatz zu der Studie Fischerleitner et al. (2003), in der die Reduzierung des Bentonitbedarfes durch die Protease (Papain) bestätigt wurde.

Darüber hinaus war es auch sehr wichtig festzustellen, ob und inwieweit sich die Proben hinsichtlich der Sensorik voreinander unterscheiden. Daher wurde eine Verkostung mittels eines Rangordnungstestes mit deskriptiver Beschreibung mit Hilfe von sechs Verkostern durchgeführt. Die erhitzten Weine unterschieden sich sensorisch markant von den unerhitzten Proben und es konnten alle vier Serien von allen Verkostern eindeutig zu geordnet werden. Die Rangsumme der erhitzen Proben lag bei 28 im Vergleich zu den unerhitzten bei 44. Ein einziger Koster präferierte die unerhitzten Proben, wohingegen die restlichen fünf Verkoster die erhitzten bevorzugten. Die Enzymvarianten zeigten geschmacklich keinen großen Unterschied im Vergleich zu den Weinen ohne Enzymeinsatz, was auch in der Studie von Marangon et al. (2012) beschrieben wurde. In der Studie von Fischerleitner et al. (2003) konnte die Geschmacksneutralität des Enzyms nicht bestätigt werden, es kam durch das Enzym Papain zu einer negativen Beeinflussung des Geschmackes.

Weitere wenige Unterschiede zwischen Proben mit und ohne Enzymbehandlung zeigten die Ergebnisse der SDS-PAGE-Gelanalyse (Abbildungen 7–10), die durchgeführt wurde, um zu untersuchen, welche Auswirkungen die Wärmebehandlung auf die Proteine im Wein hatte, sowie die Wirkung von Protease auf diese zu bestimmen. Beim Vergleich der Intensitäten der Banden im Bereich von 20 und 25 kDa (TLPs und Chitinasen) zeigte sich, dass die Proteinabnahme im Verlauf der Fermentation deutlich sichtbar wurde. Die Bandenintensität stellt die Reaktion der Moste bzw. Weine auf die Proteasen dar und hängt stark von der Sorte ab (Marangon et al., 2012). Ein ähnliches Phänomen konnte in der Studie von Marangon (2012) festgestellt werden, wobei die Abbildung im SDS-Gel nicht so viel widerspiegelte wie die absoluten Proteinmessungen. Obwohl die Proteingehalte stark reduziert waren, blieb der Bedarf an Bentonit (Tabelle 2) bestehen. Dies konnte auch in unserer Studie bestätigt werden sowie die Wirkung der Erhitzung der Moste. Die Kurzzeiterhitzung beeinflusste die Proteine und führte zu ihrem starken Ausfall, was teilweise in der Darstellung von den SDS-Gelen (Abbildungen 6–9) zu sehen war. Die erhitzten Varianten zeigten auch in anderen Tests die besseren Ergebnisse, insbesondere bei der sensorischen Bewertung der Weine, wo sie als sichtbar besser bewertet wurden.

Abbildung 7

Abbildung 8

Abbildung 9

Abbildung 10