Enzymatic Hydrogen Bioproduction. Structure, Function And Application Of Hydrogenases

Większość poznanych dotychczas hydrogenaz należy do grupy [NiFe]. Zidentyfikowano je w organizmach należących do archeonów oraz bakterii (ścisłych i fakultatywnych beztlenowców), a także w mikroorganizmach tlenowych [75]. Niektóre enzymy należące do grupy hydrogenaz [NiFe] wykazują znacznie mniejszą wrażliwość na działanie tlenu niż hydrogenazy [FeFe]. Wśród hydrogenaz [NiFe] wyróżnia się hydrogenazy standardowe (O₂-sensitive), które w obecności tlenu ulegają nieodwracalnej inaktywacji oraz hydrogenazy oporne na działanie tlenu (O₂-tolerant), które wykazują aktywność katalityczną również w obecności O₂ [20, 22, 32].

Najlepiej poznaną do tej pory grupą hydrogenaz opornych na działanie tlenu są hydrogenazy związane z błoną (MBHs, membrane-bound hydrogenases). Należą do nich między innymi enzymy pochodzące z morskiego mikroorganizmu Hydrogenovibrio marinus [103], bakterii wodorowych Ralstonia eutropha H16 [19], hipertermofilnych bakterii Aquifex aeolicus [63] oraz modelowego mikroorganizmu – Escherichia coli [6]. Enzymy te są heterodimerami, składającymi się z dużej podjednostki (LSU, large subunit), małej podjednostki (SSU, small subunit), a także cytochromu b, który jest integralnym białkiem błonowym [101]. Do grupy hydrogenaz opornych na działanie tlenu należą również hydrogenazy [NiFeSe]. Jest to podklasa hydrogenaz [NiFe], posiadająca w centrum aktywnym atom selenu zamiast jednego z atomów żelaza. Przykładami enzymów należących do tej grupy są hydrogenazy wyizolowane z Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F, czy z Desulfomicrobium baculatum [95]. Charakteryzują się one wyższą w porównaniu do hydrogenaz [NiFe] aktywnością katalityczną, która nie ulega inhibicji w obecności wodoru. Właściwości hydrogenaz [NiFeSe] związane są z obecnością selenocysteiny, jako jednego z ligandów w centrum aktywnym [49]. Dzięki wspomnianym powyżej właściwościom, enzymy te wykazują istotny potencjał biotechnologiczny w procesach bioprodukcji wodoru. Porównanie struktury hydrogenaz [NiFe] z Desulfovibrio gigas oraz [NiFeSe] z D. vulgaris wykazało znaczne podobieństwa strukturalne w konserwowanych motywach szkieletu białkowego tych enzymów [7].

Mechanizm, dzięki któremu część enzymów z grupy hydrogenaz [NiFe] ulega jedynie odwracalnej inaktywacji w obecności tlenu, nie został dokładnie poznany. Wskazuje się jednak, że kluczowym elementem jest kształt oraz rozmiar kieszeni występujących w wewnętrznej strukturze enzymu. Kieszenie te tworzą hydrofobowe kanały, umożliwiające dostęp do centrum katalitycznego. Służą one jako szlaki transportu elektronów i protonów oraz umożliwiają przepływ gazów [32]. O ile wiadomo, że elektrony transportowane są przy udziale klastrów Fe–S, znajdujących się w małej podjednostce [15], szlaki transportu protonów oraz szlaki dyfuzji gazów (H₂, O₂, CO) nie zostały dokładnie poznane [60]. Przypuszcza się jednak, że osłonięcie centrum katalitycznego, a przez to zmniejszenie ilości gazu docierającego do centrum aktywnego na drodze dyfuzji, umożliwia funkcjonowanie tych enzymów również w obecności tlenu [20, 59]. Mutageneza selenocysteiny z centrum katalitycznego [NiFeSe] hydrogenazy, skutkująca wymianą tego aminokwasu na mniejszą cząsteczkę cysteiny, doprowadziła do obniżenia oporności tego enzymu na działanie tlenu [7].

W centrum aktywnym hydrogenaz z grupy [NiFe] występują: (i) konserwowany ewolucyjnie rdzeń, zawierający jony niklu i żelaza, oraz, podobnie jak w przypadku omawianych dalej hydrogenaz [FeFe] i [Fe], (ii) niebiałkowe ligandy: tlenek węgla(II) i aniony cyjankowe, stabilizujące centralny jon żelaza na niskim (+2) stopniu utlenienia [70]. Analiza struktury krystalicznej hydrogenazy [NiFe] z Desulfovibrio desulfuricans ujawniła również obecność w centrum aktywnym tego enzymu ligandów SO [28]. W centrum katalitycznym hydrogenaz [NiFe] jon żelaza posiada w sferze koordynacyjnej dwa ligandy CN^– i jeden ligand CO [28]. W trakcie procesu katalizy jon żelaza pozostaje na stałym, niskim stopniu utlenienia. Jon niklu, zarówno w przypadku hydrogenaz [NiFe], jak i hydrogenaz [NiFeSe], może, na różnych etapach katalizy, występować na +1, +2 lub +3 stopniu utlenienia. Jony niklu i żelaza związane są przez grupy tiolowe, pochodzące z dwóch reszt cysteinowych, a także przez trzeci, dodatkowy ligand – zmienny w zależności od stanu redoks enzymu. W przypadku nieaktywnej, utlenionej formy enzymu, ligandem jest grupa OH^–. W momencie aktywacji hydrogenazy pozycja ta pozostaje wolna lub zajmowana jest przez H^– [81]. Kolejne dwie reszty cysteinowe (lub w przypadku hydrogenaz [NiFeSe]: reszta cysteinowa i selenocysteinowa) wiążą grupę prostetyczną z częścią białkową enzymu [21].

Wszystkie hydrogenazy [NiFe] są co najmniej dimerami, składającymi się z podjednostki LSU, która zawiera centrum katalityczne oraz z podjednostki SSU, zawierającej od jednego do trzech klastrów siarkowo-żelazowych (Fe–S). Klastry te odpowiadają za transport elektronów pomiędzy centrum aktywnym a przenośnikami elektronów [85, 90]. Hydrogenazy [NiFe] podzielono na klasy i podklasy, których przedstawiciele pełnią podobne funkcje fizjologiczne. Pierwsza klasyfikacja, w której wyróżniono 6 klas hydrogenaz [NiFe], powstała w oparciu o podobieństwa sekwencji aminokwasowej motywów koordynujących centrum aktywne [100]. Późniejsze klasyfikacje również opierają się na tym kryterium [65, 90], a także na związkach filogenetycznych i podobieństwach w organizacji operonów [23].

Ryc. 2.

Mechanizm katalityczny hydrogenaz nie jest dokładnie poznany pomimo rosnącej liczby przeprowadzonych eksperymentów. Na podstawie danych krystalograficznych i spektroskopowych, dotyczących hydrogenazy [NiFe] z D. vulgaris Miyazaki F, proponuje się mechanizm, w trakcie którego jon niklu zmienia swój stopień utlenienia. W zależności od potencjału redoks hydrogenazy [NiFe], enzym może znajdować się w konfiguracji aktywnej lub nieaktywnej [42]. Forma utleniona jest formą nieaktywną enzymu, w której wyróżnia się dodatkowo stan Ni–A (unready state) oraz Ni–B (ready state). W strukturach obu stanów zidentyfikowano jony Fe(II) oraz Ni(III), a także związany jon tlenu (ryc. 2). Oba stany mogą zostać aktywowane w obecności H₂, jednak aktywacja Ni–A do Ni–SIa, w której nikiel znajduje się na drugim stopniu utlenienia, jest powolna (kilka godzin) i zależy od temperatury oraz pH [59]. Aktywacja stanu Ni–B przebiega w ciągu sekund i generuje, w zależności od liczby przeniesionych elektronów, jeden lub kilka stanów aktywnych: Ni–SI, Ni–C, Ni–R. Stan Ni–C nie może spontanicznie redukować protonów do H₂, ponieważ w obecności wodoru jest niestabilny. Oksydacja Ni–SI za pomocą O₂ prowadzi do utworzenia mieszaniny Ni–A oraz Ni–B, natomiast oksydacja w warunkach beztlenowych, na przykład za pomocą [Fe(CN)₆]³⁻, prowadzi do odtworzenia wyłącznie stanu Ni–B [1].

Przeważająca część hydrogenaz [FeFe] to enzymy monomeryczne, chociaż znane są także enzymy należące do tej grupy o strukturze dimerycznej, trimerycznej oraz tetramerycznej [54]. Hydrogenazy [FeFe] katalizują głównie reakcję biegnącą w kierunku redukcji protonu do wodoru cząsteczkowego. W swojej strukturze zawierają konserwowany ewolucyjnie motyw nazywany klastrem H (H–cluster). Składa się on z dwóch subklastrów: standardowego, kubicznego klastra [4Fe4S] oraz struktury [2Fe2S], pełniącej funkcje katalityczne. Dwa z czterech jonów żelaza w klastrze [4Fe4S] koordynowane są przez dwa ligandy CN^– oraz trzy ligandy CO. Ligandy CO związane są słabiej niż ligandy CN^–, co umożliwia im zmianę pozycji w kolejnych etapach katalizy [57]. Oba typy ligandów stabilizują stan spinowy jonów żelaza. Sekwencje N- oraz C-końca hydrogenaz [FeFe] wykazują dużą zmienność. Odpowiadają one za wiązanie klastrów Fe–S oraz domen wiążących kofaktory, co sugeruje, że hydrogenazy [FeFe] mogą oddziaływać z wieloma różnymi substratami reakcji redoks [10, 51]. Klaster H połączony jest z resztą białkową wiązaniami kowalencyjnymi przez reszty cysteinowe, koordynujące jony Fe w klasterze kubicznym. Poza tymi wiązaniami, szkielet białkowy i niebiałkowe ligandy oddziałują ze sobą wyłącznie za pomocą wiązań wodorowych i oddziaływań elektrostatycznych [64].

W przypadku hydrogenaz [FeFe] mechanizm działania również jest niejasny. Podobnie jednak jak dla grupy hydrogenaz [NiFe] zidentyfikowano utlenione, nieaktywne formy enzymu. W centrum aktywnym oba jony żelaza występują na niskim stopniu utlenienia (Fe(II) – Fe(II)). Przypuszcza się, że obecność cząsteczki wody, związanej w sferze koordynacyjnej, może być przyczyną inaktywacji enzymu. Redukcja klastra 2Fe powoduje usunięcie cząsteczki wody i związanie H₂ lub utworzenie jonów wodorkowych. Uważa się, że heterolityczne cięcie wiązania w cząsteczce H₂ zachodzi prawdopodobnie w pozycji terminalnej dystalnego jonu Fe [43, 56]. Anion wodorkowy pozostaje związany z jonem Fe, natomiast proton przenoszony jest do ligandu CN^– lub innego akceptora o charakterze zasadowym.

Hydrogenaza [FeFe] wyizolowana z Chlamydomonas reinhardtii (CrHyda1) nie zawiera w swojej strukturze klastrów Fe–S, a jedynie klaster H. Ze względu na prostotę struktury przyjęta została jako modelowa hydrogenaza typu [FeFe], również w badaniach dotyczących modeli dojrzewania centrum katalitycznego hydrogenaz tego typu [17, 53, 68]. Badania nad tą hydrogenazą pozwoliły zidentyfikować nowe produkty pośrednie reakcji katalitycznej tworzenia wodoru, a także potwierdzić istotną rolę ligandów w tym procesie [45].

Zaobserwowano znaczne różnice pomiędzy funkcjami pełnionymi przez ligandy CO podczas katalizy w prostych hydrogenazach [FeFe], izolowanych z alg morskich, oraz bardziej skomplikowanych hydrogenazach [FeFe], takich jak na przykład hydrogenaza z Clostridium pasteurianum [10]. Struktury krystaliczne hydrogenaz [FeFe] z C. pasteurianum oraz D. desulfuricans pozwoliły na opracowanie modelu centrum katalitycznego, który w hydrogenazach tego rodzaju posiada unikalny klaster [6Fe–6S]. Redukcja protonów do wodoru cząsteczkowego powiązana została z subklastrem 2Fe [58], związanym z ligandami CO, CN^– oraz z ligandem ditiolowym [54]. Podobnie jak w przypadku hydrogenaz [NiFe] obecność ligandów CO oraz CN^– stabilizuje jony żelaza na niskim stopniu utlenienia [66, 40].

Ważną rolę dla aktywności katalitycznej hydrogenaz oraz regulacji przepływu elektronów odgrywa również szkielet aminokwasowy, otaczający centrum aktywne. W strukturach enzymów należących do hydrogenaz [NiFe] oraz [FeFe] zidentyfikowano reszty aminokwasowe, obdarzone ładunkiem elektrycznym, które tworzą zewnętrzną sferę koordynacyjną. Biorą one udział w transferze protonów, koordynacji cząsteczek wody i oddziałują z klastrem H [37, 54]. Reszty aminokwasowe, znajdujące się w kieszeni hydrofobowej klastra H, biorą wraz z subklastrem 2Fe, udział w wiązaniu wodoru [9, 88].

Podobnie jak w wypadku hydrogenaz [NiFe], dojrzewanie hydrogenaz typu [FeFe] wymaga obecności zestawu białek specyficznych dla danego enzymu. U wszystkich organizmów, u których zidentyfikowano hydrogenazę HydA (w tym E. coli), zidentyfikowano również geny hydE, hydF oraz hydG, których produkty ekspresji są niezbędne do uzyskania aktywnej hydrogenazy HydA [36, 67]. Produkty ekspresji wymienionych genów (białka HydE oraz HydG) należą do rodziny enzymów wytwarzających rodniki S-adenozylometioniny (SAM) [8, 71]. Natomiast HydF jest monomerycznym białkiem, należącym do rodziny GTPaz [77], odpowiadającym za wiązanie klastrów żelazowo-siarkowych, które są wcześniej syntezowane w komórce [54]. Białko HydG bierze udział w katalizie reakcji, w wyniku których powstają dwuatomowe ligandy centrum katalitycznego: CO oraz CN^– [41, 76]. W przypadku białka HydE nie udało się do tej pory dokładnie określić jego funkcji oraz substratu/substratów [65].

Hydrogenazy [Fe] są strukturalnie najmniej skomplikowaną grupą hydrogenaz. Katalizują reakcję wodorowania substratów biologicznych poprzez heterolityczny rozkład wodoru cząsteczkowego. Funkcją hydrogenaz [Fe] jest odwracalna redukcja metenylotetrahydrometanopteryny (metenylo-H₄MPT+) do metylenotetrahydrometanopteryny (metylenoH₄MPT) [73]. Reakcja ta jest elementem szlaku metabolicznego metanogenów, redukującego CO₂ do metanu. Wodorowanie metenylo-H₄MPT⁺ jest więc odpowiednikiem reakcji utleniania/redukcji H₂ u pozostałych grup hydrogenaz. W przeciwieństwie do pozostałych grup hydrogenaz, hydrogenazy [Fe] nie ulegają dezaktywacji w obecności 100% O₂, jeżeli w centrum aktywnym nie ma związanego substratu. W obecności O₂ hydrogenazy tej grupy nie ulegają inhibicji, lecz stopniowej dezaktywacji [27, 30].

W centrum aktywnym hydrogenaz [Fe] występuje pojedynczy jon Fe koordynowany, podobnie jak w przypadku pozostałych hydrogenaz: (i) przez atom siarki, pochodzący z cysteiny, (ii) dwa ligandy CO, (iii) kofaktor pirydynowy oraz (iv) cząsteczkę wody [24, 48]. Na podstawie badań krystalograficznych oraz spektroskopowych ustalono, że centrum aktywne hydrogenaz [Fe] posiada geometrię oktaedryczną (6 koordynowanych ligandów) lub piramidy kwadratowej (pięć koordynowanych ligandów) [78]. Centralny jon żelaza, jest nieaktywny w reakcji redoks i nie ulega inaktywacji przez O₂ [35]. Kofaktor zawierający centrum żelazowe może być jednak rozłożony przez H₂O₂ oraz O₂⁻, powstające w wyniku katalizowanej przez hydrogenazę reakcji redukcji O₂ do H₂O₂. W przeciwieństwie do hydrogenaz [NiFe] oraz [FeFe], elektrony są dostarczane bezpośrednio do centrum katalitycznego hydrogenazy [Fe]. Powstające jony wodorkowe są bezpośrednio wiązane przez kofaktor metenylo–H₄MPT+.

Podobnie jak w przypadku hydrogenaz [NiFe] oraz [FeFe], mechanizm katalityczny hydrogenaz [Fe] nie jest dokładnie poznany. Uważa się, że cząsteczka H₂ ulega najpierw heterolitycznemu rozpadowi przy udziale Fe(II), a następnie jon wodorkowy przenoszony jest do akceptora (karbokation) [102]. Na podstawie struktury krystalicznej hydrogenazy [Fe] z Methanocaldococcus jannaschii ustalono, że na homodimer składają się trzy domeny: centralna oraz dwie zewnętrzne. Centralna domena złożona jest z dwóch splecionych domen C-terminalnych. Dwie zewnętrzne domeny to domeny N-końcowe, wiążące kofaktory [29]. Trzy domeny tworzą kieszeń, w której znajduje się centrum aktywne. Podczas wiązania się substratu kieszenie zamykają się, zbliżając do siebie jon żelaza i karbokation substratu, będący akceptorem jonów wodorowych. Po zamknięciu kieszeni, H₂ dociera do centrum aktywnego wąskim kanałem pomiędzy domeną centralną a zewnętrzną, podobnie jak w przypadku innych hydrogenaz. Do tej pory rozwiązano jedynie struktury krystaliczne hydrogenaz [Fe] w formie otwartej, w kompleksie z substratem, jednakże wyniki badań spektroskopii UV oraz elektronowe widma dichroizmu kołowego potwierdzają zmianę konformacji enzymu [80].