“Food-Omics” Applications In The Food Metagenom Profiling

Metagenomika jest cennym narzędziem do identyfikacji społeczności mikroorganizmów w procesie fermentacji żywności. W przemyśle spożywczym technika ta została wykorzystana w opracowaniu profili taksonomicznych mikrobioty jogurtów, kefirów czy serów, a także do monitorowania etapów ich dojrzewania [14]. Analizy taksonomiczne i funkcjonalne mikrobioty uczestniczącej w tradycyjnych procesach fermentacyjnych umożliwiły identyfikację rdzennych kultur starterowych oraz dowiodły, że manipulując procesami produkcji w sposób istotny można stymulować środowisko mikrobioty w kierunku uzyskania fermentowanego produktu o pożądanych walorach organoleptycznych przy jednoczesnym zachowaniu wymaganych właściwości produktu. Wykazano, że różne rodzaje serów dojrzewających różnią się profilem gatunkowym mikroorganizmów, który jest istotnie skorelowany z poszczególnymi etapami ich dojrzewania. Na przykład, metagenom serów dojrzewających półtwardych cechował się wyższym składem ilościowym Lactococcus lactis i Staphylococcus xylosus w porównaniu do serów dojrzewających twardych, dla których charakterystyczny skład mikrobioty stanowiły Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus i Lactobacillus helveticus [89].

Ponadto kilka badań dotyczyło oceny różnorodności taksonomicznej oraz metabolicznej mikrobioty serów w obrębie trzech badanych typów skórek; skórka z porostem pleśni (Brie i Camembert), naturalna skórka sera z mleka niepasteryzowanego (St. Nectaire i Tomme de Savoie), skórka serów pielęgnowanych i przemywanych (Taleggio, Gruyere i Epoisses), pobranych ze 137 różnych typów sera pochodzących z 10 krajów Europy i Stanów Zjednoczonych [89]. W produkcji serów tradycyjnie dojrzewających na ich powierzchni tworzy się biofilm, zwany skórką, składający się z gatunków bakterii i grzybów pochodzących z surowego mleka, kultur starterowych oraz „starzejącego” się środowiska [46]. Analizy oparte na wysokprzepustowym sekwencjonowaniu (HTS) w oparciu o 16S rDNA i ITS, wykazały, że profil taksonomiczny mikrobioty jest istotnie zróżnicowany w serach w zależności od typu skórki, pH i wilgotności środowiska produkcji, niezależnie od pochodzenia geograficznego. Wzory składu taksonomicznego i sukcesji metagenomu serów wykazały obecność 24 rodzajów bakterii (Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes) i grzybów (Saccharomycetales, Microascales, Hypocreales, Eurotiales) oraz stwierdzono, że co najmniej 60% bakterii i 25% grzybów nie należało do kultur starterowych [89]. Ponadto, zidentyfikowano dwa rodzaje bakterii, Yaniella i Nocardiopsis, o których nigdy nie informowano w ekosystemach mikrobiologicznych żywności. Stwierdzono również że halotolerancyjne γ-Proteobacteria, tj. Vibrio, Halomonas i Pseudoalteromonas, związane ze środowiskiem morskim były szeroko rozpowszenione w biofilmach serów wytwarzanych we wszystkich regionach geograficznych. Kilka taksonów grzybowych (Scopulariopsis, Aspergillus) i bakteryjnych (Actionobacteria, Staphylococcus) dominujących w skórkach serów St. Nectaire i Tomme de Savoie, wykazało pozytywną korelację z parametrami wilgotności w trakcie procesu dojrzewania. Sery Taleggio, Gruyere i Epoisses, znane z ich ostrych aromatów, były wzbogacone w wiele ścieżek metabolicznych zaangażowanych w produkcję związków smakowych, obejmujących szlak cysteiny i metioniny powiązany z wytwarzaniem lotnych związków siarki oraz szlak degradacji waliny, leucyny i izoleucyny powiązany ze specyficznym aromatem tych serów [55]. Pseudoalteromonas, obficie zidentyfikowane w serach Brie i Camembert oraz Taleggio posiadały gen kodujący gamma-liazę metioninową (mgl) przekształcającą L-metioninę w metanotiol, powodując powstawanie lotnych związków siarki nadających tym serom specyficzny aromat. Ponadto, w genomie Pseudoalteromonas haloplanktis zidentyfikowano geny kodujące lipazy i proteazy przystosowane do zimna, uczestniczące w lipolizie i proteolizie oraz γ-liazę metioniny ważnego enzymu w produkcji siarki. Enzymy te uważana są za korzystne w serze dojrzewającym i przechowywanym w niskich temperaturach, ponieważ przyczyniają się do powstawania korzystnych związków smakowych [89].

W odniesieniu do bioróżnorodności mikroorganizmów lub potencjału funkcjonalnego analiza przestrzennego rozkładu aktywnej mikrobioty trzech włoskich serów Fiore Sardo, Pecorino Siciliano i Pecorino Toscano wykazała istotną korelację między mezofilnymi LAB (Lactobacillus plantarum) i wtórną proteolizą, a także syntezą składników lotnych, tj. estry, alkohole, aldehydy i związki siarki [16]. Analizy metatranskryptomiczne odegrały kluczową rolę w zrozumieniu procesów fermentacji i dojrzewania sera Camembert i Reblochon [46]. Badania funkcjonalne w oparciu o RNA-seq wykazały, że geny związane ze szlakami metabolicznymi odpowiedzi na stres były różnie wyrażane podczas dojrzewania sera. Obserwowany profil ekspresji genów był istotnie zróżnicowany w pierwszych dwóch tygodniach okresu dojrzewania. Geny szlaku katabolizmu aminokwasów Debaryomyces hansenii i Geotrichum candidum, były skorelowane z parametrami smaku i tekstury sera. Dodatkowo, analizy 16S rDNA wykazały, że podczas degradacji matrycy mlecznej dominującymi gatunkami mikrobioty serów były L. lactis, Corynebacterium casei, Debaryomyces hansenii oraz Geotrichum candidum. Ponadto, uzupełniające badania Monnet i wsp. [59] wyjaśniły rolę szczepu Geotrichum candidum w różnych fazach dojrzewania sera typu Reblochon. Szczep Geotrichum candidum był ważny w pierwszej fazie procesu dojrzewania, w której ekspresja genów związanych z katabolizmem aminokwasów była istotnie wysoka. Podejście metatranskryptomiczne umożliwiło stworzenie funkcjonalnych profili genów i szlaków metabolicznych skorelowanych z parametrami smaku, zapachu i tekstury sera [12].

Podejście metagenomiczne w oparciu o analizy HTS znalazły zastosowanie również w odniesieniu do bioróżnorodności i funkcji mikrobioty podczas naturalnej fermentacji serów rzemieślniczych, objętych chronioną nazwą pochodzenia (ChNP), których produkcja odbywa się bez udziału kultur starterowych. Analizy w oparciu o WMS i 16S rDNA zostały użyte do prześledzenia profilu populacji bakteryjnej meksykańskiego sera Cotija, otrzymywanego na bazie surowego mleka krowiego [21]. Dojrzewanie Cotija odbywa się w otwartym środowisku, w którym wilgotność i temperatura są ważnymi parametrami fermentacji. Ponadto, drewniane powierzchnie używane do zagniatania skrzepu podczas solenia są źródłem rezydentnej mikrobioty, występującej w serze. Około 80% bakteryjnej populacji Cotija składało się z Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides i Weissella paramesenteroides, a drewniane powierzchnie były najprawdopodobniej źródłem obecnych gatunków Leuconostoc i Weissella. Analizy szlaków metabolicznych wykazały, że gatunki te są odpowiedzialne za rozwój autentycznych związków smakowo-zapachowych wynikających z ich aktywności lipolitycznej i proteolitycznej podczas procesu dojrzewania. Klasyfikacja sieci metabolicznych ujawniła dodatnie korelacje mikrobioty sera z katabolizmem fenyloalaniny i aminokwasów oraz produkcją enzymów biorących udział w katabolizmie wolnych kwasów tłuszczowych, tj. reduktaza karbonylowa i monooksydaza fenolowa. Ścieżki metaboliczne w odniesieniu do smaku i aromatu, zostały również wychwycone w oparciu o analizy WMS, w badaniach mikrobioty innego, rzemieślniczego sera chińskiego Kazak, wytwarzanego podczas spontanicznej fermentacji świeżego mleka krowiego w torbach ze skóry koziej. Dominujące Acetobacter, Lactococcus, Bacillus, Staphylococcus, Kurthia i Moraxella wykazały dodatnie korelacje ze szlakiem metabolizmu aminokwasów, tj. kwas glutaminowy, histydyna, izoleucyna i prolina. Wśród grzybów Dipodascus korelował ze stężeniem kwasu 9-oktadecenowego, Pichia i Penicillium z kwasem 9-heksadecenowym, a Issatchenkia i Candida były skorelowane z poziomem leucyny i fenyloalaniny oraz z syntezą lotnych związków (estry, alkohole, aldehydy) [96].

Analizę 16S rDNA wykorzystana do identyfikacji, typowania i charakterystyki mikrobiomu tradycyjnego wędzonego polskiego sera, Oscypka, produkowanego z surowego mleka bez kultur starterowych [1]. Dominującą grupę bakterii stanowiły Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus i Enterococcus, natomiast Bifidobacteriaceae oraz Moraxellaceae (głównie Enhydrobacter) stanowiły niski odsetek (0,7% i 4%) całkowitej puli społeczności bakteryjnej Oscypka. Ponadto w świeżym serze zanurzonym w solance zidentyfikowano kilka rodzajów bakterii związanych ze środowiskiem morskim, tj. Sanguibacter, Flavobacteriaceae, Tetragenococcus oraz Chromohalobacter spp. Niektóre z tych grup obejmowały patogeny oraz bakterie przyczyniające się do psucia produktów żywnościowych. Podczas procesu produkcji sera zaobserwowano zmiany w składzie populacji Lactobacillales (Firmicutes), Streptococcus, Enterococcus, Flavobacteriaceae, Leuconostoc i Bifidobacteriaceae (Actinobacteria), których liczba zmniejszyła się istotnie po etapie solanki i wędzenia; odwrotne zależności zaobserwowano dla Lactococcus. Obserwowany spadek liczby Enterococcus podczas wędzenia sera sugeruje, że proces ten ma istotny wpływ na poprawę jakości i bezpieczeństwa tradycyjnie wytwarzanego produktu. Przypuszcza się, że podczas procesu wędzenia powstające lotne związki fenolowe o właściwościach bakteriostatycznych, mogą hamować wzrost populacji tych drobnoustrojów. Ponadto, selektywne obniżenie liczby tych drobnoustrojów może wynikać z zakwaszenia środowiska podczas procesu lub wytwarzanych metabolitów przeciwdrobnoustrojowych przez szczepy LAB [1]. Na uwagę zasługuje również obecność populacji Actinobacteria (0,97%), należących do rodziny Bifidobacteriaceae i gatunku Bifidobacterium, które mogą stanowić duży potencjał biotechnologiczny jako kultury pomocnicze w procesie tradycyjnego wytwarzania Oscypka.

Dostępność tych informacji może być przydatna nie tylko pod względem wyboru kultur starterowych specyficznych dla serów wytwarzanych w warunkach rzemieślniczych, a także do podkreślenia konieczności przestrzegania niektórych środków higieny, które powinny być podjęte w celu poprawy bezpieczeństwa produktu.

W ostatnich latach, w przemyśle winiarskim nastąpił gwałtowny wzrost zastosowania wysokoprzepustowych metod sekwencjonowania (HTS) do szczegółowej oceny złożonych społeczności mikrobiomu winorośli i wina. Szczególny nacisk kładziony jest zrozumienie dynamiki procesu fermentacji, jej kontroli oraz identyfikacji nowych kultur starterowych [48]. Winogrona i moszcz winny zawierające złożony mikrobiom, odgrywają kluczową rolę w fermentacji wina, wpływając na jego smak i aromat, a tym samym na ostateczną jakość i styl. Globalne badania z wykorzystaniem metagenomiki zostały wykorzystane w celu profilowania różnorodności mikroorganizmów, zarówno grzybowych jak i bakteryjnych związanych ze spontanicznymi fermentacjami wina, biorąc pod uwagę zarówno odmiany winorośli oraz region ich uprawy [60]. Stwierdzono, że wina produkowane w różnych regionach charakteryzują się odmiennym składem taksonomicznym mikrobioty, korelującym z odmiennym profilem metabolitów wtórnych odzwierciadlającym specyficzny terroir wina danego regionu [66]. Rozkład biogeograficzny związany z winem został zbadany w winnicach z rożnych regionów Kalifornii [2], Nowej Zelandii [86] oraz w tradycyjnych, biodynamicznych i zintegrowanych winnicach z południa Afryki [77]. Analizy 18S rDNA wykazały, że wzory geograficzne metagenomu wina są bardziej zróżnicowane dla populacji grzybów. Wykazano znaczący związek Aspergillus i Penicillium spp. z winem Chardonnay z Napie. Natomiast Saccharomycetes i Erysiphe necator stanowiły istotną populację mikrobioty wina produkowanego w centralnej części wybrzeża Kalifornii [3]. Charakterystyczne profile biogeograficzne zarówno dla społeczności grzybowych, jak i bakteryjnych występujące w początkowych etapach fermentacji moszczu winogron mogą przyczyniać się do wytworzenia cennego stylu oraz unikalnych walorów sensorycznych win regionalnych [70].

Analizy 16S rDNA i ITS zostały również wykorzystane do określenia różnorodności i dynamiki metagenomu wina, sześciu portugalskich apelacji (Minho, Douro, Dão, Bairrada, Estremadura, Alentejo) w odniesieniu do poszczególnych etapów fermentacji oraz ich potencjału funkcjonalnego [60]. Skład populacji mikroorganizmów w trakcie początkowego procesu fermentacji był istotnie skorelowany z filosferą winorośli oraz składem metagenomu gleby. Rodzaje Botryotinia, Phomopsis, Aspergillus, Penicillium, Aureobasidium, Rhodotorula czy Sphingomonas były charakterystyczne dla mikrobiomu winorośli oraz winnic. Analizy 16S rDNA wykazały, że wśród społeczności bakterii Enterobacteriaceae (Tatumella sp.) stanowiły dominującą mikrobiotę we wszystkich apelacjach, z wyjątkiem Alentejo, dla którego dominującą populacją były Halomonadaceae (Halotalea i Zymobacter). Społeczności grzybowe charakteryzowały się zarówno obecnością mikroorganizmów środowiskowych i fitopatogenów w moszczu winogron, jak też drożdży związanych z fermentacja alkoholową, tj. Saccharomyces, Lachancea, Hanseniaspora, Sporothrix czy Schizosaccharomyces. Ponadto, zmiany różnorodności biologicznej w trakcie procesu fermentacji ujawniły większą dynamikę struktury społeczności grzybowej w porównaniu z populacjami bakterii. Analizy HTS genu 18S rDNA podczas spontanicznej fermentacji moszczu winogronowego Aglianico i Greco di Tufo wykazały, że dynamika społeczności grzybów podczas fermentacji obejmuje spadek liczby grzybów i drożdży innych niż Saccharomyces [14]. Na początku fermentacji znaleziono złożony mikrobiom charakteryzujący się dominacją Hanseniaspora uvarum, Candida zemplinina oraz Pichia fermentans. Natomiast Saccharomyces cerevisiae stał się dominujący po 6 dniach fermentacji wina, przy czym C. zemplinina występowała nadal na wysokim poziomie. Ponadto, zaobserwowano dodatnie korelacje S. cerevisiae z poziomem cukru oraz stężeniem etanolu i glicerolu oraz stwierdzono, że obecność Candida, Hanseniaspora i Issatchenkia w mieszanych współfermentacjach z S. cerevisiae poprawia profil smaku i aromatu wina [2, 14]. Analiza 16S rDNA i ITS mikrobioty podczas fermentacji wina z suszonych winogron (słodkie Vino Santo Trentino) wykazała, że na wczesnych etapach fermentacji stężenie glukozy i etanolu oraz pH moszczu odgrywają istotną rolę w kształtowaniu populacji mikrobiomu, przy czym kwasowość moszczu odgrywa dominującą rolę, zarówno przy wyborze początkowej populacji grzybów, jak i definiowaniu ich właściwości fermentacyjnych [82]. Biorąc pod uwagę, że bakterie i grzyby mogą wpływać na siebie poprzez konkurencję metaboliczną/synergię lub modyfikację środowiska wykazano, że silne korelacje pomiędzy Candida ethanolica, Pichia fermentans a Hymenobacter oraz Psychrobacterium i Ralstonia przyczyniają się do pożądanych właściwości organoleptycznych końcowego produktu.

Profilowanie 16S rDNA oraz metabolomika zostały wykorzystane do analizy zależności między bioróżnorodnością i dynamiką mikrobioty a profilem metabolicznym fermentowanego chińskiego wina ryżowego Shaoxing [49] oraz Wuyi Hong Qu [32]. Wino Shaoxing produkowane jest z ryżu z dodatkiem pszenicy Qu jako środka scukrzającego oraz drożdży (S. cerevisiae) jako startera fermentacyjnego. Ze względu na szczególny proces warzenia, obejmującego fermentację wstępną w wyższej temperaturze (28–30°C) przez okres 4 dni oraz fermentację wtórną w niższej temperaturze (16–18°C) przez długi czas (20 dni), wina ryżowe mają unikalne cechy smakowe. Mikrobiota fermentacyjna buduje złożoną symbiotyczną relację podczas procesu warzenia i odgrywa ważną rolę w produkcji związków smakowych wina decydując o jego ogólnej jakości. Analizy metagenomiczne 16S rDNA wykazały bogatą różnorodność bakteryjną w fermentowanych zacierach oraz istotne zróżnicowanie profilu taksonomicznego mikrobioty w początkowych i końcowym etapie procesu [32, 49]. Jako główne taksony w procesie fermentacji wina Shaoxing sklasyfikowano 10 dominujących rodzajów bakterii (Bacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Weissella, Thermoactinomyces, Pseudomonas, Staphylococcus, Enterobacter, Lactobacillus). Analizy metabolomiczne wykazały, że związki karbonylowe obecne w winie były dodatnio skorelowane z Bacillus, Staphylococcus, Lactococcus i Weissella, natomiast Pseudomonas, Enterobacter, Thermoactinomyces, Lactobacillus i Lactococcus uczestniczyły w syntezie estrów, fenoli, alkanów oraz związków zawierających azot i siarczki. Ponadto, Pseudomonas, Enterobacter korelowały z wiekszością zidentyfikowanych związków aromatycznych i przyczyniały się do wzbogacenia smaku i aromatu wina [49].

Podobne zależności sukcesji mikrobioty fermentacyjnej i dynamiki szlaków metabolicznych w oparciu o technologię HTS i metabolomikę, wykazano w trakcie procesu fermentacji chińskiego wina ryżowego Wuyi Hong Qu [31, 32]. Bakterie Lactobacillus, Bacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Raoultella, Staphylococcus, Pediococcus i Weissella oraz grzyby należące do Saccharomyces, Saccharomycopsis, Rhizopus, Monascus, Pichia, Wickerhaamomyces, Candida i Aspergillus zostały zidentyfikowane jako dominująca mikrobiota fermentacyjna wina. Dynamika mikrobiologiczna wykazała, że skład taksonomiczny mikrobioty zmniejszał się wraz z postępującym procesem fermentacji z sukcesywną dominacją Lactobacillus i S. cerevisiae w końcowej fazie procesu [31]. Ponadto analiza współwystępowania ujawniła korzystne i antagonistyczne relacje pomiędzy różnymi rodzajami lub gatunkami drobnoustrojów. Bakterie kwasowe, w tym Gluconacetobacter spp., Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus alimentarius, i Lactococcus pisicium okazały się prawie antagonistyczne dla Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens i Brevibacillus spp. Natomiast, korelacja pomiędzy bakteriami a grzybami wykazała, że B. amyloliquefaciens, B. subtilis, Weissella confused, Lactobacillus brevis i Pediococcus pentosaceus korzystnie współwystępowały z Candida ploysorbophila, Candida glabrata, Meyerozym guilliermondii i Rhizopus oryzae. Trzy rodzaje bakterii, a mianowicie Gluconacetobacter, Lactobacillus, Lactococcus oraz trzy rodzaje grzybów Pichia, Wickerhamomyces i Saccharomyces, zostały określone jako podstawowe mikroorganizmy funkcjonalne w produkcji lotnych metabolitów wtórnych (estry, alkohole, lotne kwasy), skorelowanych z poprawą jakości aromatycznej Wuyi Hong Qu [32].

Zintegrowane podejście „food-omics” zostało również wykorzystane do analizy profilu sukcesji i aktywności metabolicznej mikrobioty, tradycyjnej chińskiej herbaty Pu-erh, wytwarzanej z liści drzewa herbacianego Camellia sinensis i Camellia assamica, wyłącznie w prowincji Yunnan [47, 97]. Rola herbaty Pu-erh jako napoju przeciwutleniającego, przeciwnowotworowego, o właściwościach hipolipidemicznych, zmniejszającym toksyczność oraz wspomagającym trawienie, jest dobrze znana [6]. W przeciwieństwie do najczęściej spożywanej czarnej herbaty, która powstaje w procesie utlenienie katechin, herbata Pu-erh wytwarzana jest poprzez spontaniczną fermentację drobnoustrojową i staje się coraz bardziej popularna w Europie i Stanach Zjednoczonych [47]. Przetwarzanie surowej herbaty Pu-erh obejmuje naturalne wysychanie, prażenie, walcowanie, suszenie na słońcu i prasowanie [100]. Liście Pu-erh są następnie poddawane starzeniu w celu promowania naturalnej, stałej fermentacji substratu. Przetwarzanie dojrzałej herbaty zwykle obejmuje dodatkowy etap zwany palowaniem (kompostowaniem) wykonywanym przed suszeniem w celu ułatwienia procesu starzenia. Etap ten zwany fermentacją w stanie stałym, obejmuje obróbkę liści w ciepłym i wilgotnym środowisku trwającą około 65 dni, a szczególny smak i właściwości herbaty wynikają ze złożonych interakcji mikrobiologicznych i procesu utleniania [95]. Analiza metagenomiczna wykazała, że dominującymi taksonami bakteryjnymi podczas 30 dniowego procesu fermentacji Pu-erh były Proteobacteria (48,42%), Firmicute (19,91%), Actinobacteria (16,91%), Sinicobacteria (9,95%) i Bacteroidetes (3,79%), a najczęściej obserwowane taksony grzybowe należały do rodzaju Aspergillus, Debaryomyces, Rasamsonia i Thermomyces [95]. Wśród Proteobacteria dominowały Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Achromobacter, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Erwinia, Enterobacter oraz Klebsiella. W porównaniu ze społecznością grzybów, względna liczebność bakterii (27–37%) w trakcie spontanicznej fermentacji Pu-erh była niższa w porównaniu do mikroorganizmów eukariotycznych (48–55%). Sieci genów 16S i ITS wykazały, że bakterie i grzyby wykluczają się wzajemnie, np.: Bacillaceae, Pseudoalteromonadaceae, Comamonadaceae wykazywały ujemną korelację z grzybami Aspergillus, Rasamsonia, Panicillium, Debaryomyces i Saccharomycetes [99]. Większość białek sklasyfikowanych w oparciu o profilowanie metaproteomu (MALDI-TOF MS) stanowiły oksydoreduktazy, transferazy, dehydrogenazy, peroksydazy, metylotransferazy, hydrolazy, które zostały przypisane do Proteobacteria (75%) i Ascomycota (96,6%). Szlaki funkcjonalne zostały również powiązane z metabolizmem aminokwasów, biosyntezą metabolitów wtórnych czy metabolizmem węglowodanów. Wykazano, że specyficzny aromat oraz unikalna jakość smakowa herbaty Pu-erh, jest istotnie skorelowana z różnorodnością i aktywnością mikrobiologiczną, zarówno mikrobioty bakteryjnej jak i grzybowej podczas poszczególnych etapów fermentacji [47]. Analiza metabolomiczna wykazała, że polifenole, pigmenty herbaciane i alkaloidy są w dużej mierze syntezowane podczas fermentacji w wyniku zwiększonej aktywności peroksydazy, oksydazy i lakazy. Rodzaj Aspergillus był funkcjonalnym taksonem odpowiedzialnym za ich biokonwersję na wczesnych etapach fermentacji, podczas gdy Bacillus, Rasamsonia, Lichtheimia i Debaryomyces katalizowały szereg reakcji związanych z powstawaniem aromatu w późnym stadium dojrzałej fermentacji Pu-erh. Analiza sieci interakcji biologicznych, wykazała wzrost ekspresji szlaków skorelowanych z jakością zapachu herbaty, w tym związanych z biotransformacją karwonu oraz pochodnych kwasu fenolowego. Wysoki poziom ekspresji metylotransferazy był istotnie skorelowany z Pseudomonas (49,34%) i Aspergillus (43,35%) na wczesnym etapie fermentacji. Ponadto, badania w oparciu o analizy metabolomu wykazały, że zawartość kofeiny w liściach fermentowanej herbaty zmniejsza się około 30% podczas biodegradacji w teofilinę, katalizowanej z udziałem Aspergillus niger, Aspergillus sydowii, Candida albicans, Candida famata i Pseudomonas sp. [98].

Funkcjonalne analizy metagenomiczne ujawniły również nowy wgląd w dynamikę mikrobiologiczną, różnorodność i interakcje mikrobioty biorącej udział w procesie fermentacji ziarna kakaowego [33]. W szczególności wykryto obecność rzadkich taksonów obejmujących oportunistyczne gatunki, tj. Erwinia tasmaniensis, L. lactis, L. mesenteroides, Oenococcus oeni oraz społeczności fagowe Myoviridae i Siphoviridae przypisane do sekwencji Lactobacillus i Enterobacter. Dzięki rekonstrukcji szlaków metabolicznych wykazano dominujący udział LAB, w tym Lactobacillus fermentum i Lactobacillus plantarum w heterolaktycznej fermentacji i szlaku asymilacji cytrynianu. Rola Enterobacteriaceae w konwersji substratów została wykazana poprzez obecność genów kodujących enzymy szlaku syntezy mleczanu, octanu, etanolu oraz detoksykacji metyloglikosalu. Ponadto wyniki badań potwierdziły kluczową rolę utleniającego etanol Acetobacter pasteurianus, umożliwiając przyszłą ukierunkowaną selekcję współistniejących szczepów jako funkcjonalne kultury starterowe do kontrolowanych procesów fermentacji ziaren kakaowych.

Na skalę przemysłową, technologia HTS w oparciu o sekwencjonowanie amplikonu 16S i 18S rDNA została wykorzystana w celu zoptymalizowania i kontroli procesu fermentacji Kombucha, azjatyckiego fermentowanego napoju na bazie zielonej i czarnej herbaty [11]. Obecnie ten naturalnie musujący napój stał się popularny w Europie i Ameryce Północnej, jako suplement wykazujący właściwości zdrowotne (detoksykacja, przeciwnowotworowe), które mogą pochodzić z samej herbaty lub metabolitów wytwarzanych przez mikrobiotę podczas procesu fermentacji [7]. Pomimo zarzutów kampanii marketingowych dotyczących bezpieczeństwa mikrobiologicznego Kombucha, w literaturze wciąż brakuje badań potwierdzających właściwości zdrowotne tego produktu. Tradycyjnie uzyskiwany przez fermentacje słodzonej czarnej lub zielonej herbaty (8–12 dni w warunkach tlenowych i statycznych) w obecności rdzennej społeczności mikroorganizmów tworzących naturalny pływający celulozowy biofilm, zwany „błonką”, produkt końcowy jest szczególnie bogaty w kwasy organiczne i CO₂; każda fermentacja prowadzi do nowej warstwy biofilmu, która jest wykorzystywana do przyszłych fermentacji jako starter [56]. Mikrobiologiczną dynamikę zmian monitorowano zarówno w oparciu o fermentację czarnej i zielonej herbaty oraz biofilmu [11]. Dominujące rodzaje bakterii należały do Acetobacteraceae i w mniejszym stopniu do Lactobacteriaceae, podczas gdy główne drożdże sklasyfikowano do Dekkera, Hanseniaspora i Zygosaccharomyces. Gluconacetobacter europaeus, Gluconobacter oxydans i Acetobacter peroxydans reprezentowały gatunki dominujące, a Oenococcus oeni, był silnie skorelowany z fermentacją zielonej herbaty. Zaobserwowano, że kinetyka wzrostu jest bardzo podobna dla wszystkich grup mikroorganizmów, zarówno w fermentacji Kombucha czarnej, jak i zielonej herbaty, ale z wyższymi wartościami w porównaniu do stabilnego biofilmu.

Technologie „food-omics” okazały się potężnym narzędziem do badania złożonej mikrobioty środowiskowej i śledzenia procesów fermentacji azjatyckiej żywności pochodzenia roślinnego, tj. pasty sojowe [84], tofu [23], Kinema [42] czy Kimchi [36]. Produkty te należą do tradycyjnych fermentowanych produktów, powstających w spontanicznej fermentacji z użyciem naturalnych kultur starterowych o złożonych kompozycjach mikrobiologicznych. Spożywane jako dodatek do warzyw, ryb, mięs lub jako składnik przyprawowy cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na obecność różnych prozdrowotnych związków bioaktywnych wytwarzanych podczas procesu ich fermentacji. Rosnące zainteresowanie produktami pochodzenia roślinnego na których oparta jest dieta wegańska spowodowała intensyfikację technik „omics” w kierunku poznania funkcjonalnej roli mikrobioty fermentacyjnej i jej interakcji w generowaniu unikalnych walorów smakowych i aromatycznych oraz ich właściwości zdrowotnych.

Społeczność bakteryjna „meju” koreańskiego produktu fermentowanego pochodzącego z soi, została scharakteryzowana w jednym z pierwszych badań ekologii mikrobiologicznej żywności przy zastosowaniu podejścia 16S rDNA [41]. Meju przypominające japońskie „natto” i „miso” oraz indonezyjskie „tempeh” jest podstawą wielu azjatyckich produktów, w których sfermentowane pasty sojowe miesza się z przyprawami, warzywami i ryżem, np.: Cheonggukjang [63], Doenjang [61] i Kochjang [62]. Analiza populacji bakteryjnej z wykorzystaniem 16S rDNA dla wszystkich trzech produktów wykazała ogólna dominację Bacillus spp. (B. subtilis, Bacillus licheniformis, B. amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans), a następnie Enterococcus spp. (Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis), Lactobacillus spp. oraz gatunki innych rodzajów LAB (Leuconostoc, Weissella, Tetragenococcus). Ponadto, podczas fermentacji Doenjang, Lactobacillus był istotnie skorelowany ze wzrostem kwasu γ-aminomasłowego (GABA), natomiast Tetragenococcus dominował w fazie wzrostu mleczanu, octanu, putrescyny i tyraminy [37]. Przypuszcza się, że Tetragenococcus może być przede wszystkim odpowiedzialny za produkcję kwasów organicznych i amin biogennych.

Innym koreańskim produktem, który był aktywnie badany, jest Kimchi [36, 39]. W fermentacji Kimchi sekwencjonowanie metagenomu ujawniło zaangażowanie złożonej kohorty bakteryjnej i zmianę ekspresji genów na różnych etapach fermentacji. Dominującą populacją metagenomu podczas procesu fermentacji Kimchi były Proteobacteriae i Firmicute. Ponadto, skład ilościowy mikrobioty zmieniał się podczas poszczególnych etapów fermentacji; we wczesnej fazie fermentacji dominowały Enterobacter, Vibrio i Pseudomonas, podczas gdy Lactobacillus, Weissella i Leuconostoc stanowiły dominującą mikrobiotę na późniejszych etapach procesu [36]. Ponadto analiza oparta na RNA-seq ujawniła, że geny związane z wytwarzaniem smaku były kodowane przez L. mesenteroides na początkowych etapach procesu fermentacji, co sugeruje, że gatunek ten może odgrywać znaczącą rolę w procesie kształtowania się pożądanych cech organoleptycznych. Profile ekspresji genów wskazywały zmniejszenie metabolizmu białek w czasie, w połączeniu ze wzrostem syntezy witamin, tolerancji na stres i metabolizmu węglowodanów, szczególnie szlaków fermentacji kwasu mlekowego. Kwantyfikacja metabolitów tworzonych podczas fermentacji Kimchi wykazała, że wzrost mleczanu, octanu i etanolu we wczesnej fazie fermentacji był istotnie skorelowany z aktywnością metaboliczną LAB, które również były dominującymi producentami mannitolu.

Ciekawe wyniki, w oparciu o zintegrowane analizy metagenomiczne i metabolomiczne zostały opublikowane w przypadku fermentowanych produktów sojowych, tj. sufu [85], Kinema [42] i sos sojowy [84]. W oparciu o WMS przeanalizowano profil sukcesji i potencjału funkcjonalnego metagenomu pasty sojowej Kinema, otrzymywanej w procesie spontanicznej fermentacji gotowanych żółtych nasion soi [42]. Analiza społeczności bakteryjnej wykazała, że B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, Corynobacterium glutamicum, Bacillus pumilus i L. lactis były dominującymi gatunkami, a ich różnorodność wahała się nieznacznie w całym okresie fermentacji, wskazując na aktywne występowanie sukcesji bakteryjnej. Ponadto, wykryto obecność patogennych gatunków Bacillus cereus, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Proteus penneri, E. faecalis i Staphylococcus saprophyticus, których liczebność zmieniała się w zależności od pory roku. Funkcjonalne profilowanie metagenomu ujawniło obecność genów biorących udział w metabolizmie alaniny, glutaminianu, argininy, proliny, powiązanych z biosyntezą związków aromatycznych w trakcie fermentacji. Geny sklasyfikowane do Lactococcus, Enterococcus i Streptococcus były istotnie skorelowane z metabolizmem kofaktorów witamin, niezbędnych do funkcjonowania enzymów i metabolizmu komórkowego, które ostatecznie poprawiają jakość odżywczą fermentowanego produktu. Większość enzymów metabolizmu węglowodanów (hydrolazy, glikozylotransferazy, esterazy) przypisanych do Firmicutes (91,29%), Actinobacteria (7,41%) i Proteobacteria (3,75%), było zaangażowane w biosyntezę disacharydów, oligosacharydów oraz degradację hemicelulozy, polisacharydów i pektyn. Ponadto, rekonstrukcja szlaków metabolicznych wykazała obecność biokatalizatorów, prawdopodobnie zaangażowanych w transformację polimerów białkowych i węglowodanowych w bioaktywne cząsteczki o korzystnych prozdrowotnych właściwościach. W genomie Enterococcus sp., B. cereus, Lactobacillus lactis i Carnobacterium maltaromaticum zidentyfikowano geny kilku pożądanych enzymów, tj. β-galaktozydaza, β-glukozydaza, β-ksylozydaza i dekarboksylaza glutaminianowa. Katalityczna funkcja dekarboksylazy glutaminianowej została potwierdzona dla biosyntezy kwasu γ-aminomasłowego (GABA) [42]. Ponadto, w zacierach sosu sojowego, szlaki genowe Enterococcus, Pediococcus były dodatnio skorelowane z obecnością fosfofruktokinazy, kinazy pirogronianowej i dehydrogenazy mleczanowej, kluczowych enzymów szlaku produkcji kwasu mlekowego [84].

Sufu, zwany także „serem orientalnym” jest produktem fermentacji soi, który w zależności od szczepu zastosowanego jako starter oraz koloru i smaku jest klasyfikowany jako czerwone i białe sufu [85]. Analizy w oparciu o 16S rDNA wykazały, że Lactococcus, Actinobacter, Tetragenococcus, Pseudomonas i Lactobacillus były dominującymi bakteriami i kluczowymi czynnikami podczas fermentacji sufu, lecz profile taksonomiczne różniły się między handlowym czerwonym, a białym sufu. W szczególności Lactococcus, Streptococcaceae i Lactobacillales dominowały w próbkach czerwonego sufu, podczas gdy Enterococcus, Tetragenococcus i Bacillales były powszechne w próbkach białego. Profile metabolomiczne fermentacji sufu, wykazały dodatnią korelację Lactococcus z produkcją lotnych związków smakowych (etanol, octan etylu, benzaldehyd) oraz kwasów organicznych (mrówkowy, jabłkowy). Tetragenococcus i Comamonas były istotnie skorelowane ze szlakiem syntezy i transformacji aminokwasów, a Streptococcaceae i Moraxellaceae promowały wzrost stężenia kwasu mrówkowego. Ponadto, Moraxellaceae reprezentowany głównie przez Actinobacter był pozytywnie powiązany z metabolitami smakowymi, szczególnie estrami [85].

Analizy 16S rDNA zastosowano również do prześledzenia struktury mikrobioty sfermentowanych oliwek stołowych w stylu hiszpańskim i greckim [9]. Fermentacja w stylu greckim obejmuje naturalne, nieprzetworzone oliwki, które są bezpośrednio solone po zbiorach; fermentacja w stylu hiszpańskim obejmuje poprzedni etap mycia owoców rozcieńczonych roztworem NaOH (2–3%). Początkowy etap fermentacji, zarówno greckiej, jak i hiszpańskiej charakteryzował się wysokim poziomem halofilnych bakterii Chromohalobacter i Halomonas, Marinilactibacillus, które stanowiły około 60% całkowitej populacji bakterii, podczas gdy pod koniec procesu fermentacji Lactobacillus reprezentował główną populację bakteryjną obecną na powierzchni oliwek. Wśród Lactobacillus dominujące gatunki stanowiły Lactobacillus plantarum i Lactobacillus pentosus, podczas gdy Chromohalobacter salarius i Marinilactibacillus piezotolerans zidentyfikowano wśród rodzajów halofilnych. Fermentacja w stylu hiszpańskim była związana z większą liczbą Enterobacteriaceae, takich jak Enterobacter, Citrobacter, Escherichia i Klebsiella. Różnice te mogą tłumaczyć szczególne właściwości bezpieczeństwa i zachowania tych dwóch form fermentowanych surowców.

Analizy metagenomiczne wykorzystano również w prześledzeniu procesów fermentacji zakwasów piekarskich, które od bardzo dawna odgrywają istotna rolę w produkcji żywności opartej na bazie mąki. Zakwas jest szeroko stosowany jako starter do wyrobu chleba w całej Europie [29], a także jako idealne inokolum w wytwarzaniu chińskiego chleba na parze [93]. W technologii chleba ocena różnorodności, struktury i dynamiki populacji mikroorganizmów jest zwykle przeprowadzana podczas procesu fermentacji zakwasu. Stabilne ekosystemy zakwasów mogą być zamieszkałe przez proste lub bardzo złożone konsorcja reprezentowane przez różne gatunki LAB i drożdże [18, 29]. Najbardziej rozpowszechnione gatunki LAB należą do rodzajów Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc i Weissella, podczas gdy reprezentujące gatunki drożdży należą do kladów Kazachstanstania i Saccharomyces [17]. Procesy fermentacyjne poprawiające jakość powstałego produktu pod względem tekstury, smaku, wartości odżywczej oraz wydłużenia okresu przydatności do spożycia są ściśle związane ze stabilnością i aktywnością metaboliczną mikrobioty spontanicznych zakwasów.

Szeroko zakrojone analizy w oparciu o 16S rDNA i ITS mikrobioty spontanicznych zakwasów wykazały, że na bioróżnorodność i stabilność konsorcjum zakwasów mają wpływ mikrobiologiczny i chemiczny skład surowców, interakcje między populacjami mikroorganizmów oraz różne parametry fermentacji, w tym temperatura, wielkość inokulum, wydajność ciasta i czas fermentacji [51]. Badania mające na celu prześledzenie dynamiki zmian mikrobioty podczas 72 h procesu fermentacji, wykazały wysokie tempo zmienności w obrębie struktury taksonomicznej populacji drożdży i bakterii. Ponadto, dynamika społeczności mikroorganizmów w spontanicznie rozpoczynających się zakwasach wykazała, że konsorcjum zakwasów osiąga stabilizację poprzez trójfazową ewolucję, charakteryzującą się przewagą nietypowych LAB, typowych LAB i wysoce dostosowanych LAB zakwasów [58]. W oparciu o meta-analizę 583 zakwasów, uwzględniającą zarówno warunki procesu jak i różnorodność mikrobioty wykazano, że najbardziej rozpowszechnioną grupę bakterii w zakwasach były LAB reprezentowane przez Lactobacillus sanfranciscensis (47%) oraz Lactobacillus plantarum (44%) [87]. Spontaniczna fermentacja na bazie trzech rodzajów mąki (orkiszowa, pszenna, żytnia) wykazała, że dominującą populacją we wszystkich rodzajach zakwasów po 72 h fermentacji były Firmicutes, reprezentowane wyłącznie przez Lactobacillales, a dwa pozostałe i mniej liczne typy bakterii stanowiły Proteobacteria i Bacteroidetes. Po 24 h fermentacji zakwasu żytniego dominującym rodzajem był Weissella sp., który na dalszych etapach procesu fermentacji został zdominowany przez Lactobacillus, podobnie jak w pszenicy i zakwasie orkiszowym. Lactobacillus dominował we wszystkich zakwasach po 72 h fermentacji [4]. Analiza metagenomiczna różnorodność LAB i drożdży tradycyjnych zakwasów z zachodniego regionu Mongolii wykazała, że dominującymi gatunkami populacji mikroorganizmów były Lactobacillus plantarum i S. cerevisiae [93], podczas gdy Liu in. [51] wykazał, że kluczowym gatunkiem LAB chińskich zakwasów był Lactobacillus sanfranciscensis. W sumie, meta-analiza wykazała, że ponad 90% opisanych bakterii w zakwasach należało do LAB, reprezentujących 24 gatunki, z czego 17 z nich stanowiły pałeczki kwasu mlekowego.

Kolejnym obszarem szerokiego wykorzystania badań z zakresu metagenomiki jest sektor przemysłu mięsnego. Badania koncentrują się głównie na określeniu składu gatunkowego mikrobiomu kiełbas. Przeprowadzono kilka niezależnych badań w oparciu o analizy 16S rDNA, dotyczących określenia składu taksonomicznego oraz dynamiki zmian mikrobioty w fermentowanych produktach mięsnych [69, 73]. Wykazano, że ponad 30 różnych rodzajów Staphylococcaceae i Lactobacillaceae jest obecnych podczas dojrzewania sfermentowanych kiełbas, z dominacją Lactobacillus sakei podczas spontanicznej fermentacji, jak również innych bakterii, tj. Lactobacillus curvatus, Leuconostoc carnosum, S. xylosus i Staphylococcus succinus [30]. Rozwój koagulozoujemnych Staphylococcus i Kocuria podczas fermentacji prowadzi do proteolizy i lipolizy mięsa, podczas gdy Lactobacillus są odpowiedzialne za spadek pH, produkcję kwasu mlekowego oraz wytwarzanie niewielkich ilości kwasu octowego, etanolu, acetoiny, dwutlenku węgla i kwasu pirogronowego [73].

Podejście metagenomowe w połączeniu z analizami metabolicznymi zostało wykorzystane do prześledzenia etapów spontanicznej i inokulowanej fermentacji tradycyjnych włoskich kiełbas [25]. Skład taksonomiczny mikrobioty kiełbas podczas inokulowanej fermentacji wykazał dominację L. sakei i S. xylosus, jako kultur starterowych oraz spadek proporcji Lactibacillus curvatus, Staphylococcus equorum i Actinobacter sp. Wzrost dominacji L. sakei był istotnie skorelowany z szybszym tempem zużycia substratów fermentacyjnych, obniżeniem pH oraz wzrostem ilości kwasu octowego i związanego z nim zapachu (ostry, kwaśny, serowy, octowy) obniżającego walory organoleptyczne produktu. Podczas fermentacji spontanicznej kiełbas, najliczniejszą grupę metagenomu stanowiły L. sakei (56%) i L. curvatus (20%) oraz szereg mniej licznych taksonów zidentyfikowanych jako S. xylosus, Leuconostoc sp., L. lactis, a także Actinobacterium, Pseudomonas i Priopionibacterium. Rdzenna mikrobiota spontanicznie fermentowanych kiełbas charakteryzowała się obecnością genów szlaku biosyntezy ex novo kwasów tłuszczowych, syntezowanych z metabolizmu pirogronianów i aminokwasów. Zgodnie z tym, podwyższony poziom estrów o długich łańcuchach, tj. oktonian etylu i dekanonian pod koniec procesu dojrzewania był pozytywnie skorelowany z owocowym i słodkim zapachem kiełbas [25].

Fermentowane owoce morza zwane Jeotgal są powszechnie spożywane w Azji zwłaszcza w Korei Południowej. Do niedawna różnorodność mikrobiologiczna fermentowanych produktów z owoców morza pozostawała w przeważającej mierze nie opisana. NGS oraz analizy taksonomiczne w oparciu o 16S rDNA i ITS umożliwiły identyfikację metagenomu krewetek, mątw czy krabów [39]. We wszystkich analizowanych produktach zidentyfikowano dwa rodzaje bakterii z grupy LAB, Lactobacillus i Weissella, które były obecne w różnych proporcjach w zależności od rozpatrywanego produktu. Tylko w jednym produkcie, opartym na fermentacji ostryg dominującą mikrobiotą była halofilna bakteria Salinivibri, stanowiąca 89% analizowanego metagenomu [43]. Badania te, są sprzeczne z wynikami Jung i in. [36], w których wykazano, że w Saeu-jot (jeotgal oparty na fermentacji krewetek) LAB stanowiły niewielką populację oraz były stabilne podczas całego procesu fermentacji. W początkowym etapach fermentacji krewetek dominowały Proteobacteriae (Photobacterium, Vibrio), które na dalszych etapach procesu fermentacji zostały zdominowane przez Firmicutes, tj. Staphylococcus, i Alcalibacillus oraz Halanaerobium. Co ciekawe, analizy metagenomu doprowadziły również do stwierdzenia, że szeroko rozpowszechnioną bakterią w koreańskich sfermentowanych produktach z owoców morza są Archaebacteriae.

W oparciu o 16S rDNA wykazano dynamiczną sukcesję społeczności bakteryjnej oraz ich korelacji z jakością fermentowanego chińskiego sosu rybnego [19]. Tworzenie unikalnych smaków i składników odżywczych sosu było ściśle powiązane z aktywnością mikrobioty fermentacyjnej. Dominującą biotą bakteryjną fermentacji sosu rybnego były Firmicutes (Halanaerobium, Bacillus, Tetragenococcus) i Proteobacteria, głównie tym Shewanella, a różnorodność i bogactwo społeczności bakteryjnej stopniowo rosło wraz z wydłużeniem czasu fermentacji. Na poziomie typu Proteobacteria wykazywała tendencję wczesnego spadku, a później wzrostu, podczas gdy Firmicutes wykazywały tendencję odwrotną. Wiele innych rodzajów bakterii, w tym Pseudomonas, Psychrobacter, Tissierella, Carnobacterium i Gallicola zostało sklasyfikowanych na późnym etapie fermentacji. Halanaerobium był dodatnio skorelowany z produkcją trimetyloaminy, natomiast Tetragenococcus wykazał nie tylko potencjał do produkcji kwasu, ale również do redukcji szkodliwych substancji, takich jak amoniak i aminy.