Technologia sekwencjonowania następnej generacji (NGS, Next Generation Sequencing), zwana również wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem (HTS, High Throughput Sequencing) wraz wielkoskalowymi technikami „omics” stała się powszechnie wykorzystywanym narzędziem w dziedzinie nauk o żywności i żywieniu. W 2009 roku grupa Cifuentesa zaproponowała nową koncepcję oraz praktyczne podejście „foodomiki” do wdrożenia metod „omics” w analizach żywności [8]. Obecnie, foodomika jest definiowana jako nowa, globalna dyscyplina, która łączy dziedziny badań żywności i żywienia przy użyciu zaawansowanych technologii omicznych, tj. genomika, transkryptomika, proteomika, metabolomika oraz bioinformatyka, umożliwiając przeprowadzenie kompleksowej oceny mikrobiologicznej produktów spożywczych [90]. Zainteresowanie technologiami „food-omics” zbiega się z wyraźną zmianą trendu w medycynie i biotechnologii w kierunku popularyzacji zdrowego żywienia i zapobiegania chorobom cywilizacyjnym, a także z promocją tak zwanej żywności funkcjonalnej [10].
Metagenomika, jako dyscyplina foodomiki, zwana również genomiką populacji mikroorganizmów, umożliwia dokładną charakterystykę mibrobioty (d. mikroflory) spożywczej pod kątem genetycznym dając podstawę do dalszych analiz filogenetycznych i funkcjonalnych, bez konieczności ich hodowli w oparciu o klasyczne metody [20]. Już w tej chwili możliwe jest dokonanie precyzyjnej i szybkiej identyfikacji drobnoustrojów na poziomie rodzaju, a nawet gatunku oraz określenie ich zasobów genetycznych. W ostatnich latach technologia HTS w oparciu o analizy metagenomiczne jest szeroko stosowane w analizach mikrobiologii żywności, obejmujących profilowanie metagenomu produktów spożywczych, typowanie szczepów oraz monitorowanie procesów przechowywania i produkcji żywności [5, 35]. Zintegrowane techniki metagenomowe ujawniły nowy wgląd w dynamikę ekosystemów fermentacyjnych oraz charakterystykę różnorodności i interakcji gatunków mikroorganizmów w trakcie tego procesu. Wykazano, że wzajemne interakcje mikrobioty jelit i mieszanych konsorcjów mikrobioty ziaren kefirowych mogą mieć pozytywny wpływ na jakość produktów fermentowanych poprzez wymianę „informacji” i metabolitów. Zjawisko wyczuwania liczebności (quorum sensing) może odgrywać istotną rolę w złożonych społecznościach mikroorganizmów biorących udział w procesie fermentacji [81]. W oparciu o profilowanie mikrobioty fermentowanych produktów opisano szereg nowych szczepów starterowych, które mają istotne znaczenie w przemyśle spożywczym przy opracowaniu nowej gamy produktów mlecznych, tj. sery i kefir [1, 14]. W odniesieniu do bezpieczeństwa żywności, zastosowanie zintegrowanych analiz metagenomów fermentacyjnych znacząco przyczyniło się do zrozumienia biologicznych i biochemicznych procesów produkcyjnych lokalnej fermentowanej żywności [21, 30]. Jednym z kluczowych zastosowań zintegrowanych technologii „food-omics” w przemyśle spożywczym jest zrozumienie pierwotnej przyczyny skażeń żywności oraz szybkiej i precyzyjnej charakterystyki patogenów w celu zapewnienia odpowiedniej kontroli bezpieczeństwa i jakości żywności w całym łańcuchu żywnościowym [20, 45].
W niniejszym przeglądzie przedstawiamy najnowsze postępy w badaniach metagenomu produktów żywnościowych z wykorzystaniem technologii „food-omics” w celu wyjaśnienia w jaki sposób to podejście może być cennym narzędziem w dokładniejszej charakterystyce żywności i jej biotransformacji oraz opracowaniu strategii kontroli jakości i bezpieczeństwa żywności. Ponadto, omawiamy aktualne wyzwania oraz przyszłe zastosowania zintegrowanych technologii „food-omics” w przemyśle spożywczym.
W ostatniej dekadzie wysokoprzepustowe sekwencjonowanie (HTS) przekształciło się z narzędzia badawczego w rutynowe stosowanie w wielu dziedzinach, w tym diagnostyce, badaniach epidemiologicznych, analizach mikrobiologicznych żywności, monitorowaniu skażeń żywności oraz analizach autentyczności produktów spożywczych [6, 35]. Dostępność tak potężnego zestawu narzędzi oferuje ogromne możliwości analizy metagenomów żywności w celu zapewnienia wydajności procesu, jakości produktu i bezpieczeństwa żywności.
Modelowy eksperyment metagenomiczny zakłada charakterystykę różnorodności taksonomicznej mikroorganizmów (bakterie, grzyby) poprzez klasyfikację zakonserwowanych sekwencji markerów (np. rDNA). Analogiczne podejście można również zastosować do charakterystyki chemotypów, wykorzystując zdolność mikroorganizmów do produkcji różnych klas metabolitów wtórnych, dzięki niezwykle różnorodnym genom szlaku biosyntezy [6]. Przygotowanie eksperymentu z zakresu metagenomiki przebiega w kilku etapach: (1) izolacja DNA, (2) tworzenie bibliotek dla docelowych grup taksonomicznych, (3) sekwencjonowanie z wykorzystaniem platformy, (4) analiza bioinformatyczna wyników sekwencjonowania, oraz (5) szczegółowy raport. Zalety badań profilowania metagenomu opartego na HTS w porównaniu do metod tradycyjnych, obejmują: (1) możliwość identyfikacji tysięcy mikroorganizmów w czasie pojedynczej analizy; (2) możliwość identyfikacji bioróżnorodności gatunkowej, jak i obfitości ich wzrostu; (3) możliwość identyfikacji nowych gatunków i szczepów mikroorganizmów, których identyfikacja w laboratorium jest niemożliwa; (4) bardzo szybki screening złożonych konsorcjów mikrobioty oraz (5) lepsze zrozumienie procesów fizjologicznych w celu kontroli mikrobioty.
Metagenomika to termin, który jest często używany do opisania 3 różnych podejść: (1) określenie całej sekwencji genomu pojedynczego hodowanego izolatu, zwane jako „sekwencjonowanie całego genomu” (WGS), (2) „metagenomika”, w której NGS generuje sekwencje całej genomowej zawartości społeczności, zwane jako „losowe sekwencjonowanie” (WMG) oraz (3) sekwencjonowanie amplikonu w oparciu o określone rodziny genów markerowych [35]. Analizy amplikonu wykorzystują markery genetyczne w oparciu o regiony hiperzmienne (16S, bakterie) i transkrybowanej transkrypcji wewnętrznej (ITS, grzyby) a wyniki wysokoprzepustowego sekwencjonowania generowane są z dużą liczbą odczytów danej sekwencji w ciągu jednej analizy. Masowe równoległe sekwencjonowanie tych apmlikonów (metabarkoding, profilowanie mikrobiologiczne) generuje szereg informacji na temat złożonej mikrobioty różnych nisz ekologicznych. Jedną z korzyści metody opartej na amplikonach jest możliwość śledzenia kolejnych populacji drobnoustrojów w czasie na różnych poziomach taksonomicznych. W porównaniu z losowym sekwencjonowaniem metagenomu (WMG), metody oparte na 16S rDNA i ITS, umożliwiają szczegółowy wgląd w dynamikę różnorodności populacji mikroorganizmów w odpowiednim czasie lub pod wpływem zmian warunków środowiska. Zazwyczaj sekwencjonowanie amplikonu ogranicza się do identyfikacji na poziomie rodzaju, chociaż niektóre analizy osiągnęły przypisanie na poziomie gatunku, dzięki dedykowanym klasyfikatorom gatunku i zastosowaniu dłuższych technologii odczytu [75].
Metagenomika, oparta na losowym sekwencjonowaniu genomu (WMS) ma klika zalet w porównaniu z podejściem opartym o amplikony. Wyjątkową zaletą WMS jest możliwość monitorowania dynamiki populacji mikroorganizmów i ich potencjału metabolicznego bezpośrednio w matrycy, a tym samym identyfikacji i charakterystyki szerokiej gamy genów, w tym nowych genów i operonów całej społeczności drobnoustrojów. Co więcej, możliwe jest otrzymanie kompletnych genomów mikrobiologicznych z metagenomów, uzyskując w ten sposób rozdzielczość na poziomie szczepu. Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) jest szeroko stosowane do badań pod kątem wykrywania, identyfikacji i charakterystyki patogenów, dostarczając cennego i szybkiego obrazu obecności markerów genetycznych, określających serotyp, zjadliwość czy oporność patogenu [26]. Chociaż sekwencjonowanie WMS zapewnia znacznie dokładniejszą charakterystykę taksonomiczną i genetyczną populacji mikroorganizmów, koszt analiz jest wciąż znacznie wyższy w porównaniu z podejściem opartym na amplikonie.
Najczęściej stosowane platformy do sekwencjonowania metagenomu w oparciu o 16S rDNA i ITS, to sekwenator Miseq (Illumina) oraz Ion Torrent Personal Machine (PGM) firmy Life Technologies. Platformy wysokoprzepustowe nowej generacji, tj. NexSeq 500, i seria Hiseq (Illumina) oraz Ion Torrent (Life Technologies) umożliwiają sekwencjonowanie genomów zarówno organizmów prokariotycznych jak i eukariotycznych. Sekwenatory Illumina i Ion różnią się znacznie pod względem chemii do sekwencjonowania, wydajności (długość odczytu, pokrycie), dokładności i kosztu analiz. Wybór platformy zależy od celu analiz i potrzeb użytkownika oraz od przepustowości sekwencjonowania. Ważnymi platformami do analiz sekwencjonowania metagenomów są również platformy PacBio RS II (Pacific Biosciences) i Nanopore MinION (Oxford Nanopore Technologies) należące do sekwenatorów trzeciej generacji (Third Generation Sequencing, TGS). PacBio wykorzystuje technologię sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym (SMRT), podczas gdy MinION technologię nanoporów [75]. Co ważne odczyty generowane przez PacBio i MinION są znacznie dłuższe niż generowane przez sekwenatory Illumina i Ion, co powoduje, ze obie platformy są dedykowane do sekwencjonowania genomu
Dzięki rozwojowi technologii „omics” metagenomika oparta na sekwencjonowaniu DNA, została poszerzona o analizy profilowania metatranskryptomu (RNA-seq), metaproteomu i metabolomu. Metatranskryptomika obejmuje sekwencjonowanie cDNA, wygenerowane z transkryptów mRNA w pojedynczej próbie zmieszanej społeczności mikroorganizmów w celu globalnej analizy ekspresji genów. Kompleksowe analizy metagenomu z zastosowaniem RNA-seq umożliwiają funkcjonalną identyfikację szlaków metabolicznych o istotnym znaczeniu dla produkcji nie opisanych wcześniej metabolitów. Profilowanie ekspresji genów umożliwia również poznanie zmian ekspresji genów mikroorganizmów w odpowiedzi na zmieniające się warunki środowiska, tj. temperatura, wilgotność, składniki pokarmowe [15].
W przemyśle spożywczym techniki oparte na profilowaniu metagenomów, mogą znaleźć zastosowanie w optymalizacji procesów produkcyjnych oraz w monitorowaniu autentyczności i bezpieczeństwa żywności. W mikrobiologii żywności metabolomikę i metaproteomikę stosuje się odpowiednio do identyfikacji i oceny ilościowej metabolitów i białek drobnoustrojów w matrycy żywności. Spośród enzymów o dużym znaczeniu biotechnologicznym, szczególnie poszukiwane są lipazy i esterazy, pektynazy czy endonukleazy. Takim bogatym źródłem identyfikacji nowych metabolitów jest metagenom żywności [15]. Analizy oparte o spektrometrię mas (MALDI-TOF MS) czy chromatografię cieczową (LC) umożliwiają analizę proteomu i metabolomu mikroorganizmów w celu identyfikacji ważnych szlaków metabolicznych, w tym metabolitów wtórnych o potencjalnym zastosowaniu w biotechnologii, rolnictwie i przemyśle spożywczym.
Metagenomika jest cennym narzędziem do identyfikacji społeczności mikroorganizmów w procesie fermentacji żywności. W przemyśle spożywczym technika ta została wykorzystana w opracowaniu profili taksonomicznych mikrobioty jogurtów, kefirów czy serów, a także do monitorowania etapów ich dojrzewania [14]. Analizy taksonomiczne i funkcjonalne mikrobioty uczestniczącej w tradycyjnych procesach fermentacyjnych umożliwiły identyfikację rdzennych kultur starterowych oraz dowiodły, że manipulując procesami produkcji w sposób istotny można stymulować środowisko mikrobioty w kierunku uzyskania fermentowanego produktu o pożądanych walorach organoleptycznych przy jednoczesnym zachowaniu wymaganych właściwości produktu. Wykazano, że różne rodzaje serów dojrzewających różnią się profilem gatunkowym mikroorganizmów, który jest istotnie skorelowany z poszczególnymi etapami ich dojrzewania. Na przykład, metagenom serów dojrzewających półtwardych cechował się wyższym składem ilościowym
Ponadto kilka badań dotyczyło oceny różnorodności taksonomicznej oraz metabolicznej mikrobioty serów w obrębie trzech badanych typów skórek; skórka z porostem pleśni (Brie i Camembert), naturalna skórka sera z mleka niepasteryzowanego (St. Nectaire i Tomme de Savoie), skórka serów pielęgnowanych i przemywanych (Taleggio, Gruyere i Epoisses), pobranych ze 137 różnych typów sera pochodzących z 10 krajów Europy i Stanów Zjednoczonych [89]. W produkcji serów tradycyjnie dojrzewających na ich powierzchni tworzy się biofilm, zwany skórką, składający się z gatunków bakterii i grzybów pochodzących z surowego mleka, kultur starterowych oraz „starzejącego” się środowiska [46]. Analizy oparte na wysokprzepustowym sekwencjonowaniu (HTS) w oparciu o 16S rDNA i ITS, wykazały, że profil taksonomiczny mikrobioty jest istotnie zróżnicowany w serach w zależności od typu skórki, pH i wilgotności środowiska produkcji, niezależnie od pochodzenia geograficznego. Wzory składu taksonomicznego i sukcesji metagenomu serów wykazały obecność 24 rodzajów bakterii (
W odniesieniu do bioróżnorodności mikroorganizmów lub potencjału funkcjonalnego analiza przestrzennego rozkładu aktywnej mikrobioty trzech włoskich serów Fiore Sardo, Pecorino Siciliano i Pecorino Toscano wykazała istotną korelację między mezofilnymi LAB (
Podejście metagenomiczne w oparciu o analizy HTS znalazły zastosowanie również w odniesieniu do bioróżnorodności i funkcji mikrobioty podczas naturalnej fermentacji serów rzemieślniczych, objętych chronioną nazwą pochodzenia (ChNP), których produkcja odbywa się bez udziału kultur starterowych. Analizy w oparciu o WMS i 16S rDNA zostały użyte do prześledzenia profilu populacji bakteryjnej meksykańskiego sera Cotija, otrzymywanego na bazie surowego mleka krowiego [21]. Dojrzewanie Cotija odbywa się w otwartym środowisku, w którym wilgotność i temperatura są ważnymi parametrami fermentacji. Ponadto, drewniane powierzchnie używane do zagniatania skrzepu podczas solenia są źródłem rezydentnej mikrobioty, występującej w serze. Około 80% bakteryjnej populacji Cotija składało się z
Analizę 16S rDNA wykorzystana do identyfikacji, typowania i charakterystyki mikrobiomu tradycyjnego wędzonego polskiego sera, Oscypka, produkowanego z surowego mleka bez kultur starterowych [1]. Dominującą grupę bakterii stanowiły
Dostępność tych informacji może być przydatna nie tylko pod względem wyboru kultur starterowych specyficznych dla serów wytwarzanych w warunkach rzemieślniczych, a także do podkreślenia konieczności przestrzegania niektórych środków higieny, które powinny być podjęte w celu poprawy bezpieczeństwa produktu.
W ostatnich latach, w przemyśle winiarskim nastąpił gwałtowny wzrost zastosowania wysokoprzepustowych metod sekwencjonowania (HTS) do szczegółowej oceny złożonych społeczności mikrobiomu winorośli i wina. Szczególny nacisk kładziony jest zrozumienie dynamiki procesu fermentacji, jej kontroli oraz identyfikacji nowych kultur starterowych [48]. Winogrona i moszcz winny zawierające złożony mikrobiom, odgrywają kluczową rolę w fermentacji wina, wpływając na jego smak i aromat, a tym samym na ostateczną jakość i styl. Globalne badania z wykorzystaniem metagenomiki zostały wykorzystane w celu profilowania różnorodności mikroorganizmów, zarówno grzybowych jak i bakteryjnych związanych ze spontanicznymi fermentacjami wina, biorąc pod uwagę zarówno odmiany winorośli oraz region ich uprawy [60]. Stwierdzono, że wina produkowane w różnych regionach charakteryzują się odmiennym składem taksonomicznym mikrobioty, korelującym z odmiennym profilem metabolitów wtórnych odzwierciadlającym specyficzny
Analizy 16S rDNA i ITS zostały również wykorzystane do określenia różnorodności i dynamiki metagenomu wina, sześciu portugalskich apelacji (Minho, Douro, Dão, Bairrada, Estremadura, Alentejo) w odniesieniu do poszczególnych etapów fermentacji oraz ich potencjału funkcjonalnego [60]. Skład populacji mikroorganizmów w trakcie początkowego procesu fermentacji był istotnie skorelowany z filosferą winorośli oraz składem metagenomu gleby. Rodzaje
Profilowanie 16S rDNA oraz metabolomika zostały wykorzystane do analizy zależności między bioróżnorodnością i dynamiką mikrobioty a profilem metabolicznym fermentowanego chińskiego wina ryżowego Shaoxing [49] oraz Wuyi Hong Qu [32]. Wino Shaoxing produkowane jest z ryżu z dodatkiem pszenicy Qu jako środka scukrzającego oraz drożdży (
Podobne zależności sukcesji mikrobioty fermentacyjnej i dynamiki szlaków metabolicznych w oparciu o technologię HTS i metabolomikę, wykazano w trakcie procesu fermentacji chińskiego wina ryżowego Wuyi Hong Qu [31, 32]. Bakterie
Zintegrowane podejście „food-omics” zostało również wykorzystane do analizy profilu sukcesji i aktywności metabolicznej mikrobioty, tradycyjnej chińskiej herbaty Pu-erh, wytwarzanej z liści drzewa herbacianego
Funkcjonalne analizy metagenomiczne ujawniły również nowy wgląd w dynamikę mikrobiologiczną, różnorodność i interakcje mikrobioty biorącej udział w procesie fermentacji ziarna kakaowego [33]. W szczególności wykryto obecność rzadkich taksonów obejmujących oportunistyczne gatunki, tj.
Na skalę przemysłową, technologia HTS w oparciu o sekwencjonowanie amplikonu 16S i 18S rDNA została wykorzystana w celu zoptymalizowania i kontroli procesu fermentacji Kombucha, azjatyckiego fermentowanego napoju na bazie zielonej i czarnej herbaty [11]. Obecnie ten naturalnie musujący napój stał się popularny w Europie i Ameryce Północnej, jako suplement wykazujący właściwości zdrowotne (detoksykacja, przeciwnowotworowe), które mogą pochodzić z samej herbaty lub metabolitów wytwarzanych przez mikrobiotę podczas procesu fermentacji [7]. Pomimo zarzutów kampanii marketingowych dotyczących bezpieczeństwa mikrobiologicznego Kombucha, w literaturze wciąż brakuje badań potwierdzających właściwości zdrowotne tego produktu. Tradycyjnie uzyskiwany przez fermentacje słodzonej czarnej lub zielonej herbaty (8–12 dni w warunkach tlenowych i statycznych) w obecności rdzennej społeczności mikroorganizmów tworzących naturalny pływający celulozowy biofilm, zwany „błonką”, produkt końcowy jest szczególnie bogaty w kwasy organiczne i CO2; każda fermentacja prowadzi do nowej warstwy biofilmu, która jest wykorzystywana do przyszłych fermentacji jako starter [56]. Mikrobiologiczną dynamikę zmian monitorowano zarówno w oparciu o fermentację czarnej i zielonej herbaty oraz biofilmu [11]. Dominujące rodzaje bakterii należały do
Technologie „food-omics” okazały się potężnym narzędziem do badania złożonej mikrobioty środowiskowej i śledzenia procesów fermentacji azjatyckiej żywności pochodzenia roślinnego, tj. pasty sojowe [84], tofu [23], Kinema [42] czy Kimchi [36]. Produkty te należą do tradycyjnych fermentowanych produktów, powstających w spontanicznej fermentacji z użyciem naturalnych kultur starterowych o złożonych kompozycjach mikrobiologicznych. Spożywane jako dodatek do warzyw, ryb, mięs lub jako składnik przyprawowy cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na obecność różnych prozdrowotnych związków bioaktywnych wytwarzanych podczas procesu ich fermentacji. Rosnące zainteresowanie produktami pochodzenia roślinnego na których oparta jest dieta wegańska spowodowała intensyfikację technik „omics” w kierunku poznania funkcjonalnej roli mikrobioty fermentacyjnej i jej interakcji w generowaniu unikalnych walorów smakowych i aromatycznych oraz ich właściwości zdrowotnych.
Społeczność bakteryjna „meju” koreańskiego produktu fermentowanego pochodzącego z soi, została scharakteryzowana w jednym z pierwszych badań ekologii mikrobiologicznej żywności przy zastosowaniu podejścia 16S rDNA [41]. Meju przypominające japońskie „natto” i „miso” oraz indonezyjskie „tempeh” jest podstawą wielu azjatyckich produktów, w których sfermentowane pasty sojowe miesza się z przyprawami, warzywami i ryżem, np.: Cheonggukjang [63], Doenjang [61] i Kochjang [62]. Analiza populacji bakteryjnej z wykorzystaniem 16S rDNA dla wszystkich trzech produktów wykazała ogólna dominację
Innym koreańskim produktem, który był aktywnie badany, jest Kimchi [36, 39]. W fermentacji Kimchi sekwencjonowanie metagenomu ujawniło zaangażowanie złożonej kohorty bakteryjnej i zmianę ekspresji genów na różnych etapach fermentacji. Dominującą populacją metagenomu podczas procesu fermentacji Kimchi były
Ciekawe wyniki, w oparciu o zintegrowane analizy metagenomiczne i metabolomiczne zostały opublikowane w przypadku fermentowanych produktów sojowych, tj. sufu [85], Kinema [42] i sos sojowy [84]. W oparciu o WMS przeanalizowano profil sukcesji i potencjału funkcjonalnego metagenomu pasty sojowej Kinema, otrzymywanej w procesie spontanicznej fermentacji gotowanych żółtych nasion soi [42]. Analiza społeczności bakteryjnej wykazała, że
Sufu, zwany także „serem orientalnym” jest produktem fermentacji soi, który w zależności od szczepu zastosowanego jako starter oraz koloru i smaku jest klasyfikowany jako czerwone i białe sufu [85]. Analizy w oparciu o 16S rDNA wykazały, że
Analizy 16S rDNA zastosowano również do prześledzenia struktury mikrobioty sfermentowanych oliwek stołowych w stylu hiszpańskim i greckim [9]. Fermentacja w stylu greckim obejmuje naturalne, nieprzetworzone oliwki, które są bezpośrednio solone po zbiorach; fermentacja w stylu hiszpańskim obejmuje poprzedni etap mycia owoców rozcieńczonych roztworem NaOH (2–3%). Początkowy etap fermentacji, zarówno greckiej, jak i hiszpańskiej charakteryzował się wysokim poziomem halofilnych bakterii
Analizy metagenomiczne wykorzystano również w prześledzeniu procesów fermentacji zakwasów piekarskich, które od bardzo dawna odgrywają istotna rolę w produkcji żywności opartej na bazie mąki. Zakwas jest szeroko stosowany jako starter do wyrobu chleba w całej Europie [29], a także jako idealne inokolum w wytwarzaniu chińskiego chleba na parze [93]. W technologii chleba ocena różnorodności, struktury i dynamiki populacji mikroorganizmów jest zwykle przeprowadzana podczas procesu fermentacji zakwasu. Stabilne ekosystemy zakwasów mogą być zamieszkałe przez proste lub bardzo złożone konsorcja reprezentowane przez różne gatunki LAB i drożdże [18, 29]. Najbardziej rozpowszechnione gatunki LAB należą do rodzajów
Szeroko zakrojone analizy w oparciu o 16S rDNA i ITS mikrobioty spontanicznych zakwasów wykazały, że na bioróżnorodność i stabilność konsorcjum zakwasów mają wpływ mikrobiologiczny i chemiczny skład surowców, interakcje między populacjami mikroorganizmów oraz różne parametry fermentacji, w tym temperatura, wielkość inokulum, wydajność ciasta i czas fermentacji [51]. Badania mające na celu prześledzenie dynamiki zmian mikrobioty podczas 72 h procesu fermentacji, wykazały wysokie tempo zmienności w obrębie struktury taksonomicznej populacji drożdży i bakterii. Ponadto, dynamika społeczności mikroorganizmów w spontanicznie rozpoczynających się zakwasach wykazała, że konsorcjum zakwasów osiąga stabilizację poprzez trójfazową ewolucję, charakteryzującą się przewagą nietypowych LAB, typowych LAB i wysoce dostosowanych LAB zakwasów [58]. W oparciu o meta-analizę 583 zakwasów, uwzględniającą zarówno warunki procesu jak i różnorodność mikrobioty wykazano, że najbardziej rozpowszechnioną grupę bakterii w zakwasach były LAB reprezentowane przez
Kolejnym obszarem szerokiego wykorzystania badań z zakresu metagenomiki jest sektor przemysłu mięsnego. Badania koncentrują się głównie na określeniu składu gatunkowego mikrobiomu kiełbas. Przeprowadzono kilka niezależnych badań w oparciu o analizy 16S rDNA, dotyczących określenia składu taksonomicznego oraz dynamiki zmian mikrobioty w fermentowanych produktach mięsnych [69, 73]. Wykazano, że ponad 30 różnych rodzajów
Podejście metagenomowe w połączeniu z analizami metabolicznymi zostało wykorzystane do prześledzenia etapów spontanicznej i inokulowanej fermentacji tradycyjnych włoskich kiełbas [25]. Skład taksonomiczny mikrobioty kiełbas podczas inokulowanej fermentacji wykazał dominację
Fermentowane owoce morza zwane Jeotgal są powszechnie spożywane w Azji zwłaszcza w Korei Południowej. Do niedawna różnorodność mikrobiologiczna fermentowanych produktów z owoców morza pozostawała w przeważającej mierze nie opisana. NGS oraz analizy taksonomiczne w oparciu o 16S rDNA i ITS umożliwiły identyfikację metagenomu krewetek, mątw czy krabów [39]. We wszystkich analizowanych produktach zidentyfikowano dwa rodzaje bakterii z grupy LAB,
W oparciu o 16S rDNA wykazano dynamiczną sukcesję społeczności bakteryjnej oraz ich korelacji z jakością fermentowanego chińskiego sosu rybnego [19]. Tworzenie unikalnych smaków i składników odżywczych sosu było ściśle powiązane z aktywnością mikrobioty fermentacyjnej. Dominującą biotą bakteryjną fermentacji sosu rybnego były
Większość badań w oparciu o technologie „omics” koncentruje się na dynamice mikrobioty żywności, ale niewiele wiadomo na temat zmienności produkcji partii i zmian mikrobiologicznych zachodzących podczas przechowywania. W celu wydłużenia okresu trwałości wielu łatwo psujących się produktów spożywczych w przemyśle stosuje się różne metody przedłużania ich trwałości, tj. chłodzenie, pakowanie próżniowe, pakowanie w modyfikowanej atmosferze, dodatek nizyny [24]. Wiadomo, że mikrobiota produktów spożywczych ulega znacznej zmianie składu gatunkowego i ilościowego pod wpływem modyfikacji temperatury, pH oraz stężeń NaCl a wahania w składzie mikrobiomu mają istotny wpływ na końcową jakość uzyskiwanego produktu [6]. Przechowywanie w warunkach chłodniczych jest powszechnym podejściem umożliwiającym zachowanie świeżości i wartości odżywczych żywności. Jednak zastosowanie niskich temperatur, opakowań i środków przeciwdrobnoustrojowych może mieć wpływ na sukcesję i aktywność metaboliczną „efemerycznych mikroorganizmów powodujących psucie” (ESO), a ich rzeczywisty wkład w psucie zależy w dużej mierze od warunków przechowywania. Narzędzia metagenomiczne mogą poprawić zrozumienie ekologii mikrobiologicznej linii przetwarzania żywności [39]. Producenci żywności będą mogli zweryfikować lub usprawnić bieżące zarządzanie zagrożeniami mikrobiologicznymi, wykorzystując podejście metagenomiczne do monitorowania zarówno liczebności jak i aktywności metabolomicznej mikrobioty w celu zaplanowania odpowiednich warunków przetwarzania i przechowywania produktów żywnościowych.
W oparciu o 16S rDNA wykazano, że długotrwałe chłodzenie istotnie zwiększyło skład gatunkowy
Podejście metagenomiczne poprzez precyzyjne sklasyfikowanie społeczności mikrobiologicznej zostało wykorzystane do opracowania strategii eliminowania wad produktów spożywczych związanych z obecnością mikrobioty ESO [20]. Połączone analizy WMS oraz 16S rDNA umożliwiły identyfikację termofilnej bakterii
Ze względu na środowisko produkcji żywności i zagrożeń spowodowanych skażeniami, wdrożenie analiz metagenomicznych umożliwi identyfikację i monitorowanie zanieczyszczeń mikrobiologicznych żywności, w tym świadomych i biologicznych strategii kontroli patogenów w środowisku łańcucha pokarmowego [5, 45]. Źródło skażeń mikrobiologicznych w przemyśle spożywczym, to przede wszystkim mikrobiota pierwotna produktów zwierzęcych i roślinnych (mięso, jaja, mleko, warzywa, owoce), mikrobiota surowców dodatkowych (cukier, przyprawy, sól), mikrobiota środowisk urządzeń i higiena personelu produkcyjnego. Żywność jest źródłem składników odżywczych dla człowieka, ale również idealnym środowiskiem rozwoju wielu mikroorganizmów. Część z tych drobnoustrojów to mikroorganizmy charakterystyczne dla danego produktu (saprofityczne), które stanowią mikrobiotę rodzimą oraz naniesioną, pochodzącą ze środowiska zewnętrznego. Mikrobiota ta powoduje pogorszenie cech smakowych lub zapachowych produktu, jego struktury, konsystencji i barwy oraz obniżenie wartości odżywczej. Drugą grupę stanowią mikroorganizmy chorobotwórcze (patogeny), wywołujące zatrucia i zakażenia pokarmowe. Podejście w oparciu o WMS umożliwia identyfikację patogenów żywności o określonych cechach wirulencji. Na przykład, stosując wysokoprzepustowe sekwencjonowanie metagenomu (WMS) szpinaku zidentyfikowano szczep
Analizy metagenomiczne mogą znaleźć zastosowanie do badań na różnych etapach łańcucha produkcyjnego lub w różnych obszarach zakładu produkcyjnego, w których konieczne jest podjęcie działań zmierzających do poprawy stosowanych praktyk higienicznych. Zakłady produkcyjne można postrzegać jako swego rodzaju ekosystemy mikrobiologiczne, gdzie konieczne jest regularne monitorowanie miejsc szczególnie narażonych na występowanie siedlisk mikroorganizmów lub źródła ich potencjalnego skażenia. Drobnoustroje w zakładach przetwórczych występują najczęściej w zorganizowanych, przytwierdzonych do podłoża skupiskach, zwanych biofilmem. Dzięki takiej organizacji bakterie zyskując odporność na środki czyszczące i dezynfekujące, mogą stanowić źródło skażenia środowiska produkcyjnego i zanieczyszczenia produktów żywności [5]. Ponadto, podkreśla się, że środowisko produkcyjne jest źródłem ciągłej „inokulacji” szczepów podczas fermentacji i dojrzewania, które mogą mieć istotne cechy technologiczne i wpływać na cechy produktu końcowego [30]. Techniki oparte na 16S rDNA i ITS wykazały, że
Należy pamiętać, że jakość końcowego produktu spożywczego zależy nie tylko od higieny środowiska przetwarzania, ale także od jakości użytych surowców. Na przykład, podejście oparte o 16S rDNA wykazało, że mleko o większej liczbie komórek somatycznych było związane z wyższą liczebnością niektórych taksonów bakteryjnych, w tym
Podobne obserwacje dotyczą zakładów przetwórstwa mięsnego. Środowisko produkcji ma istotny wpływ na ekologię mikrobiologiczną tusz zwierzęcych. Tusze zwierzęce charakteryzowały się dużą różnorodnością mikrobiologiczną, w wśród której stwierdzenio dobrze znane rodzaje bakterii skorelowane z psuciem mięsa. Badania z wykorzystaniem wysokoprzepustowego sekwencjonowania (HTS) zostały użyte do śledzenia źródeł zanieczyszczeń świeżego mięsa, gotowanych kiełbas, filetów z łososia a także gotowej do spożycia żywności [15]. Większość gatunków bakterii zidentyfikowanych w wymazach środowiskowych z rzeźni, wykryto również w befsztykach wołowych, np.:
Przemysł spożywczy w coraz większym stopniu będzie wykorzystywał technologię NGS do szerokiej gamy analiz związanych z kontrolą jakości żywności, w tym oceny autentyczności, pochodzenia, składu oraz bezpieczeństwa na wszystkich etapach produkcji żywności. Przede wszystkim jest to podyktowane koniecznością monitorowania procedur fermentacyjnych i kontroli żywności wzbogacanej kulturami bakterii probiotycznych oraz suplementami diety. Zastosowanie zintegrowanej technologii „food-omics” będzie miało istotne znaczenie w celu zwiększenia bezpieczeństwa dostępnej na rynku spożywczym fermentowanej żywności, poprzez ocenę przetrwania patogenów, toksynogenów lub identyfikację gatunków odpowiedzialnych za psucie się fermentowanych produktów. Na przykład, analizy 16S rDNA i metabolomu zostały wykorzystane do identyfikacji mikroorganizmów odpowiedzialnych za syntezę amin biogennych w chińskim winie ryżowym. Stwierdzono silną korelacje między poziomem produkowanych amin biogennych a względną liczebnością kilku taksonów bakteryjnych, tj. Staphylococcus, Leuconostoc,
Uwierzytelnienie żywności poprzez ocenę składu produktów spożywczych jest ważne dla ograniczenia zanieczyszczeń krzyżowych, fałszerstw żywnościowych oraz ochrony jakości żywności na każdym etapie łańcucha dostaw. Technologie „food-omics” mogą znaleźć zastosowanie w uwierzytelnianiu roślinnych produktów żywnościowych, autentyczności produktów, wykrywania śladowych ilości DNA gatunków obcych oraz w identyfikacji często błędnie oznakowanych gatunków ryb i suplementów ziołowych [52]. Wraz ze wzrostem światowego handlu produktami żywnościowymi i suplementami diety, dokładne i szybkie uwierzytelnienie jest niezbędne do prawidłowego etykietowania produktów w celu zapewnienia bezpieczeństwa żywności. Analizy proteomiczne umożliwiły szybkie i bezpośrednie porównanie i klasyfikację 33 chorwackich białych win [74]. Profilowanie metaproteomu win wykazało obecność 20 białek. Co ciekawe, tylko pięć z nich było bezpośrednio skorelowanych z odpowiednią odmianą winogron, pozostałe profile białkowe zostały przypisane do rdzennie zróżnicowanej mikrobioty bakterii i grzybów. Natomiast profilowanie metabolomu zostało wykorzystana do autoryzacji drożdży piwowarskich [94], włoskiego sera mozzarella bawolego lub krowiego [67], a także do określenia pochodzenia geograficznego Kimchi [40].
Nie mniej jednak, analizy metagenomiczne w oparciu o WGS nie mogą być obecnie stosowane do identyfikacji i kwantyfikacji patogenów w celach regulacyjnych z powodu ograniczeń dostępnej technologii i niekompletności baz danych genomów bakteryjnych. Maksymalne korzyści z wykorzystania WGS patogenów zostaną osiągnięte jeśli zsekwencjonowane genomy zostaną zdeponowane w publicznych bazach danych. Aby rozwinąć to podejście, w ramach Konsorcjum Sekwencjonowania Łańcucha Dostaw Żywności (CSFSC) została opracowana spójna baza danych sekwencji genomowych i metagenomowych społeczności mikroorganizmów oraz niestandardowe symulowane zestawy danych sekwencji żywności
Podobnie jak w innych dziedzinach nauki, techniki oparte na sekwencjonowaniu następnej generacji (NGS) ostatecznie zrewolucjonizują mikrobiologię żywności. Profilowanie metagenomów, wykrywanie patogenów, eksploracja danych genetycznych, łączenie genotypów i fenotypów, określenie losów starterów i patogenów w produkcji i dojrzewaniu żywności oraz przewidywanie okresu przydatności produktów będą domeną tych wysokowydajnych technologii. Analizy te muszą być jednak połączone z integrowanymi metodami „omics”, które łączą metagenomikę z metatranskryptomiką i metaproteomikę z metabolomiką. W przyszłości technologie „food-omics” będą wdrożone do śledzenia surowców i produktów spożywczych na różnych etapach łańcucha produkcyjnego i w różnych obszarach zakładów produkcyjnych, gdzie konieczne jest podjęcie działań zmierzających do poprawy stosowanych praktyk higienicznych, optymalizacji procesów produkcyjnych, opracowania i ulepszania strategii zarządzania bezpieczeństwem i jakością żywności. Sektor przemysłu spożywczego już w tej chwili musi sprostać wyzwaniom stawianym przez konsumentów, którzy coraz częściej oczekują zapewniania dostępu do rzetelnych informacji na temat jakości i bezpieczeństwa oferowanego produktu. Jednak, cały proces monitorowania łańcucha żywnościowego musi być szybki i niedrogi, aby technologie oparte na NGS mogły być powszechnie stosowane.
Podsumowując, metagenomika w połączeniu z technologiami „food-omics” umożliwi precyzyjne zaprojektowanie skutecznych strategii analiz i konserwacji żywności w celu osiągnięcia równowagi pomiędzy zapewnieniem bezpieczeństwa produktów a utrzymaniem wysokich standardów ich jakości.