Gasdermin family proteins as a permeabilization factor of cell membrane in pyroptosis process

Ekspresja genu GSDMA kodującego białko gazderminę A występuje w komórkach nabłonkowych skóry, w których jest odpowiedzialna za stan zapalny, obecna jest również w nabłonku górnego odcinka przewodu pokarmowego i płuc oraz uczestniczy w apoptozie komórek żołądka przez aktywację kaspazy-3 i -7 [10, 22]. Gen GSDMA jest też odpowiedzialny za regulacje prawidłowego wzrostu gruczołów i przewodów sutkowych. Mutacja w genie GSDMA wpływa na przewlekłą aktywację układu odpornościowego, co prowadzi do powstawania przewodów sutkowych o różnej długości i zaburzenia funkcji wydzielniczej gruczołu [13]. Zaobserwowano również związek między zmiennością genetyczną w obrębie genu GSDMA a ryzykiem wystąpienia astmy [46]. Gazdermina A jest powiązana z zależną od TGF-ß sygnalizacją apoptotyczną. Na skutek zwiększenia ekspresji GSDMA przez czynnik wzrostu TGF- ß dochodzi do aktywacji apoptozy w nabłonku żołądka i zahamowania nowotworzenia [31, 46]. Białko to pełni także funkcję regulatorową szlaku apoptozy indukowanej przez czynnik TNF-α, a po jej aktywacji następuje stymulacja kaspazy-3 i apoptozy w keranocytach i auto-fagii na szlaku zależnym od mitochondriów [31]. Według Ruan i wsp. w mysim modelu GSDMA3 zaobserwowano tworzenie się porów w błonie komórkowej na skutek powinowactwa α-helisy do lipidów błony, takich jak kardiolopina, co powoduje zmianę konformacji N-końca GSDMA3 i powstanie porów [35]. Przypuszcza się, że mysia GSDMA3 może tworzyć pory w błonie mitochondrialnej komórki oddziałując przez receptor TOM70 z białkiem TRAP1. Aktywność tego białka zmniejsza mitochondrialny stres oksydacyjny, hamując tym samym tworzenie porów i związaną z tym apoptozę. Podczas oddziaływania GSDMA3 z TRAP1 dochodzi do zahamowania funkcji TRAP1, a więc również indukcji powstania porów [10].

Nadekspresję genu GSDMB kodującego białko gazderminę B wykryto w: komórkach nabłonkowych [29], nowotworowych żołądka, szyjki macicy i piersi [4] oraz limfocytach i hepatocytach [21]. Ponadto polimorfizm GSDMB wiąże się z występowaniem nieswoistego zapalenia jelit [4] lub zmniejszeniem podatności na astmę w wyniku utraty zdolności indukcji pyroptozy [28]. GSDMB jednak rożni się od innych białek gazdermin tym, iż może być aktywną postacią białka o pełnej długości lub samego N-końca i oddziaływać zarówno z fosfolipidami, tak jak w przypadku innych gazdermin, jak również z siarczanami glikolipidów. Umożliwia to GSDMB oddziaływanie z zewnętrzną błoną komórkową. Jednocześnie dwie aktywne postaci gazderminy B sugerują, że domena C-końcowa GSDMB, nie ma zdolności do hamowania jego N-końca. Jednak tylko białko w postaci N-końca jest zdolne do tworzenia porów i indukcji cech podobnych do pyroptozy w błonie komórek ludzkich [10]. Podobnie jak w gazderminie D, może dojść do cięcia gazderminy B przez apoptotyczne kaspazy-3, -6 i -7 [4]. Gazdermina B może również zostać zaktywowana przez NF-κB, a to wywołuje aktywację kaspazy-4 niezbędnej do przecięcia gazderminy D, w konsekwencji uruchamiając niekanoniczny szlak pyroptozy. W wyniku sprzężenia zwrotnego aktywnej kaspazy-4 może dojść do przecięcia gazderminy B [5]. Indukcja pyroptozy może również zajść poprzez kaspazę-1, która rozkłada GSDMB na C i N-końce, tworzące pory w błonie cytoplazmatycznej umożliwiając tym samym sekrecję IL-1β jak w przypadku gazderminy D oraz IL-33 [28]. Po aktywacji apoptotycznej kaspazy-3, zarówno białko GSDMB jak i GSDMD mogą ulec inaktywacji, a to zapobiega inicjacji procesu pyroptozy [21].

Zwiększoną ekspresję genu GSDMC kodującego białko gazderminę C zaobserwowano w komórkach nowotworowych jelita grubego, skóry oraz czerniaka [4, 25]. Zwiększona ekspresja GSDMC w raku jelita grubego jest powiązana z mutacjami występującymi w genie kodującym białko TGFBR2. TGFBR2 jest jednym z białek należących do szlaku sygnalizacyjnego TGF-ß, który odpowiada za hamowanie tworzenia nowotworów oraz regulację procesów biologicznych, takich jak: różnicowanie komórek, apoptoza i odpowiedź immunologiczna. W wyniku mutacji TGFBR2 dochodzi do inaktywacji białka TGFBR2, a tym samym również do zahamowania szlaku TGF-ß, co jest chrakterystyczne dla wielu nowotworów. Jednocześnie zostaje uruchomiona nadekspresja genu gazderminy C i zwiększona proliferacja komórek nowotworowych w jelicie [25]. Ekspresja GSDMC występuje również w: prawidłowych komórkach nabłonkowych tchawicy, śledzionie, przełyku i żołądka [36]. W komórkach żołądka i przełyku w wyniku nowotworzenia dochodzi do jej obni-żenia. Wykazano również, że gazdermina C odpowiada za hamowanie proliferacji tych komórek nowotworowych, co sugeruje jej rolę jako supresora w nowotworach żołądka i przełyku [25, 36]. Zwiększona ekspresja N-końca GSDMC indukuje cechy podobne do pyroptozy [10].

Gazderminę E wcześniej nazywano białkiem DFNA5. Mutacja genu kodującego GSDME powoduje rozwój głuchoty związanej z dziedziczeniem autosomalnym dominującym [6]. W ostatnich latach zbadano udział gazderminy E w zjawisku pyroptozy indukowanej przez kaspazę-3. Przez apoptotyczną kaspazę-3 dochodzi do pocięcia gazderminy E na C- i N-koniec, które odpowiadają za permeabilizację błony komórkowej. Powstałe w błonie pory, umożliwiają uwolnienie DAMP, które są sygnałem dla komórek odpornościowych rekrutując je w miejsce apoptozy lub stanu zapalnego oraz zewnętrznej błony komórkowej mitochondriów. Jednocześnie uwalniają one krytyczne czynniki proapoptotyczne Cyt c i HtrA2. Powstanie porów odbywa się tu przez oddziaływanie N-końca GSDME z lipidami błony komórkowej czy mitochondrialnej. Wielkość porów waha się w granicach 10–18 nm w zależności od rodzaju lipidów budujących błonę mitochondrialną. Taki rozmiar porów w błonie mitochondrialnej umoż-liwia uwolnienie czynników proapoptotycznych Cyt c i HtrA2, mających średnicę około 3 nm [33, 34]. Uwolniony cyt c zwiększa aktywację apoptotycznego czynnika apoptosomu Apaf-1 i w wyniku dodatniego sprzężenia zwrotnego uaktywnia kaspazę-3. Tak więc po permeabilizacji błony mitochondrialnej N-koniec GSDME powoduje tworzenie porów w błonie komórkowej i wtórną martwicę bądź pyroptozę [34]. Szlak GSDME kierujący komórkę na drogę apoptozy może się łączyć ze szlakiem GSDMD, która w wyniku aktywacji przez zapalne kaspazy może również permeabilizować błonę mitochondrialną przez aktywacje kaspazy-3 i wywołać apoptozę. Oba białka gazdermina E i D są zdolne do indukcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej podczas infekcji bakteryjnej i zabicia patogenów wewnątrzkomórkowych [33]. W wyniku takich działań może dojść do wtórnej martwicy. Jeśli komórki apoptotyczne nie są usunięte dochodzi do ich obrzęku i lizy charakterystycznej dla pyroptozy lub nekrozy. Gazdermina E odpowiada również za uwięzienie apoptotycznych patogenów wewnątrz komórki, takich jak wirus zapalenia jamy ustnej (VSV) czy wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (ECMV) i ich eliminację w procesie fagocytozy [24, 34]. Jednak niedawne doniesienia Tixeira i wsp. zaprzeczają roli gazderminy E jako białka powodującego wtórną martwicę [42]. GSDME może być supresorem w rożnych typach nowotworów żołądka, jelita grubego i piersi [6].

GSDMD to jedno z najlepiej poznanych białek rodziny gazdermin. Ekspresje GSDMD zaobserwowano w: komórkach immunologicznych, nabłonkowych żołądka, przełyku i jelit [21, 36]. GSDMD pełni ważną funkcję u ludzi w reakcji odpornościowej organizmu, w której jest niezbędnym białkiem aktywującym komórki wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, tj. monocyty i makrofagi podczas infekcji drobnoustrojowej, wywołując ich lizę osmotyczną w wyniku pyroptozy [32]. Istotna jest tu budowa białka charakterystyczna dla wszystkich członków rodziny. GSDMD składa się z domeny C-końcowej, która spełnia rolę kontrolną, części łączącej i domeny N-końcowej odpowiedzialnej za tworzenie porów w błonie komórkowej.

Gazdermina D jest odpowiedzialna za szlak niekanoniczny zjawiska pyroptozy. Aktywatorem tego szlaku jest lipopolisacharyd bakteryjny wchodzący w skład zewnętrznej błony komórkowej bakterii Gram-ujemnych [32, 39, 45]. Składa się z lipidu A, części rdzeniowej oligosacharydu oraz antygenu O. Lipid A jest odpowiedzialny za oddziaływanie z domenami CARD ludzkich kaspaz-4 i -5, u myszy kaspazy-11 [15]. LPS jest transportowany przez rodzaj zewnątrzkomórkowych pęcherzyków OMV tworzonych przez bakterie z ich zewnętrznej błony. OMV zawierają składniki macierzystej bakterii, takie jak: PAMP, LPS, lipoproteiny, peptydoglikan, RNA i DNA, które aktywują sygnały prozapalne zależne od receptorów PRR. Zewnątrzkomórkowe pęcherzyki w wyniku endocytozy przenikają do środowiska wewnątrzkomórkowego, gdzie dochodzi do uwolnienia LPSu z endosomów do cytozolu przez białka GBP [29] i aktywacji kaspazy-1 lub -4 i -5.

Aktywacja ta powoduje uruchomienie niekanonicznego szlaku pyroptozy [15, 29, 39]. Aktywacja kaspaz -4, -5 lub -1 prowadzi do pocięcia gazderminy D i powstania C-i N-końców [30]. Fragmenty te wiążą się z lipidami błony komórkowej, tj. fosforanami fosfatydyloinozytolu oraz fosfatydyloseryną. Ulegają one oligomeryzacji i tworzą pory o wielkości około 12 nm o kształcie szczelinowym, łukowym lub pierścieniowym. Pory szczelinowe i łukowe przechodzą później w pierścieniowe (ryc. 2). Następnie składniki tworzące pory, takie jak lipidy i białko gazdermina, mogą zostać uwolnione na zewnątrz [27]. N-koniec zaktywowanej gazderminy może również wykazywać powinowactwo do kardiolipiny i fosfatydyloseryny komórek bakteryjnych i w ten sposób prowadzić do śmierci bakterii wewnątrz komórki, jak i prawdopodobnie komórek bakteryjnych na zewnątrz komórki gospodarza in vitro [31].

Ryc. 2

Szlak niekanoniczny łączy się ze szlakiem kanonicznym pyroptozy przez możliwość aktywacji inflamasomu NLRP3 w tym białka ASC, które mogą stymulować kaspazę-1 należącą do szlaku kanonicznego [19]. Kaspaza-1 może również w dalszej kolejności powodować cięcie gazderminy D, tak samo jak kaspazy szlaku niekanonicznego i również powoduje tworzenie porów, w celu uwolnienia IL-1β i IL-18. Uwalnianie interleukin poprzez pory gazderminowe jest możliwe ze względu na rozmiar tych interleukin IL-1β (4,5 nm) i IL-18 (5,0 nm), który umożliwia im wydostanie się do środowiska zewnątrzkomórkowego [21]. Interleukina-18 powoduje wydzielanie interferonu γ (IFN-γ) w komórkach Th1, NK i cytotoksycznych komórkach T oraz bierze udział w rozwoju komórek Th2, wzmacniając ty samym dalszą odpowiedź immunologiczną [16]. Natomiast IL-1β jest cytokiną prozapalną, która odpowiada za indukowanie komórek wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i modulowanie komórek swoistej odpowiedzi immunologicznej [16].

Gazdermina D odpowiada więc za uwalnianie interleukin podczas hiperaktywacji makrofagów oraz indukcji pyroptozy. Białko to jest bifunkcyjne w odpowiedzi immunologicznej komórki. Pośredniczy w uwalnianiu cytokin zapalnych podczas procesu pyroptozy, a to prowadzi do lokalnej odpowiedzi immunologicznej przy jednoczesnej śmierci komórki. Podczas pyroptozy, na skutek powstałych porów, dochodzi do zaburzenia gradientu jonowego, a więc zaburzenia ciśnienia osmotycznego, powodując obrzęk, lizę osmotyczną, śmierci komórki i w wyniku tego uwalniają się z niej cytokiny. GSDMD uczestniczy również w uwalnianiu tej interleukiny podczas hiperaktywacji makrofagów. Interleukiny uwalniane są z żywych makrofagów, komórek dendrytycznych czy też neutrofili za pośrednictwem gazderminy, które nie są kierowane na drogę pyroptozy, czyli nie dochodzi do śmierci komórki. W tym procesie w wyniku aktywacji komórek przez patogeny stymulowany jest inflamasom aktywujący kaspazę-1, która tnie gazderminę tworzącą pory, powodując uwolnienie interleukin. Jednak ten proces charakteryzuje mniejsza ilość uwalnianych cytokin niż podczas pyroptozy [8, 9, 17]. Poza wydzielaniem interleukin może dojść również do uwalniania innych białek cytozolowych, których rozmiar umożliwi przejście przez pory utworzone przez GSDMD [17]. Inną rolą białka GSDMD jest funkcja regulatorowa wypływu jonów K+ oraz zależna od cGAS odpowiedź interferonu na cytozolowe DNA. Gazdermina D może również być aktywowana podczas indukcji białka AIM2 inflamasomu i szlaku cGAS-STING-IFN-β za pomocą cytozolowego DNA, w wyniku czego dochodzi do wypływu jonów K+ przez pory gazderminowe powstałe w błonie komórkowej. Wyciek jonów natomiast hamuje cGAS, a więc wykrycie cytozolowego DNA. Tym samym zatrzymana jest odpowiedź interferonu typu I [2].