Programowana śmierć komórki to jeden z podstawowych mechanizmów wpływających na prawidłowe funkcjonowanie systemu immunologicznego oraz przebieg procesów fizjologicznych. Procesy: apoptozy, autofagii, katastrofy mitotycznej, nekrozy, pyroptozy oraz starzenia się obejmują ukierunkowane na śmierć komórki szlaki metaboliczne zależne od czynników inicjujących czy też fazy cyklu komórkowego [37]. Spośród wymienionych wyżej różnych rodzajów śmierci komórki można wyróżnić pyroptozę, której mechanizm różni się od apoptozy i jest ściśle związany z odpowiedzią zapalną wywoływaną przez wewnątrzkomórkowe patogeny. W przebiegu pyroptozy dochodzi do aktywacji kaspaz-1 lub -4, -5 i -11, a następnie białka; gazdermina, która tworząc pory w błonie biologiczne, umożliwia... sekrecję interleukiny-1 beta oraz interleukiny-18 [3]. Białka z rodziny gazdermin poza zdolnością do formowania porów w błonie komórek eukariotycznych mogą również tworzyć pory w zewnętrznej błonie komórkowej bakterii Gram-ujemnych w czasie infekcji [31]. Inicjacja procesu pyroptozy może się odbywać na drodze jednego z dwóch szlaków zależnych od aktywacji swoistych dla nich receptorów błonowych i pośrednio kaspaz (ryc. 1). Aktywacja tych receptorów może być wywoływana przez różne patogeny, takie jak: wirusy, bakterie, grzyby czy pasożyty [15].
Schemat procesu pyroptozy z uwzględnieniem szlaków kanonicznego i niekanonicznego
Śmierć komórki w procesie pyroptozy jest aktywowana przez szlak kanoniczny lub niekanoniczny w zależ-ności od rodzaju kaspaz (kaspaza-1, -11 [19], -4, -5 [1]) zaangażowanych w daną ścieżkę sygnalizacyjną (ryc. 1). W przypadku drogi kanonicznej pyroptozy, wzorce molekularne związane z patogenami PAMP i niezakaźne związane z uszkodzeniem komórek DAMP są rozpoznawane przez receptory PRR: zewnątrzkomórkowe TLR [12] i CLR [26] lub wewnątrzkomórkowe NLR [47], RLR i ALR. W wyniku aktywacji receptorów tworzy się kompleks białkowy zwany inflamasomem, który poza receptorami PRR głównie NLR, zawiera: białko AIM2, pirynę, białko adaptorowe ASC oraz prokaspazę-1 [26, 40, 47]. Aktywacja inflamasomu prowadzi do oligomeryzacji receptorów NLR, a następnie przekazania sygnału w procesie fosforylacji, przez ich N-końcową domenę pirynową PYD, na białko ASC. Białko ASC poprzez swoją domenę rekrutacyjną CARD oddziałuje z domeną CARD (oddziaływania CARD-CARD) prokaspazy-1, powodując powstanie jej aktywnej postaci w wyniku proteolitycznego cięcia w miejscu dwóch katalitycznych domen kaspazy: podjednostki p10 i p20. Podjednostki te w wyniku oligomeryzacji tworzą proteolityczne tetramery zdolne do przekształcenia pro-interleukin proIL-1β i -18 do ich aktywnych postaci [18, 26, 40, 47]. IL-1β i IL-18 są uwalniane przez pory w błonie komórkowej utworzone przez białko gazderminę D (GSDMD). Aktywna postać kaspazy-1 odpowiada nie tylko za uwalnianie interleukin i inicjację odpowiedzi immunologicznej w wyniku kanonicznej pyroptozy, ale również za indukcję niekanonicznego szlaku przez aktywację GSDMD, łącząc tym samym obie drogi, zmieniając przepuszczalność błony komórkowej [18, 19]. O ile kaspaza-1 może brać udział w szlaku kanoniczym i niekanonicznym, o tyle kaspazy ludzkie -4, -5 czy mysia -11 mogą niezależnie od kaspazy-1, inflamasomu i klasycznej drogi pyroptozy aktywować sygnalizację niekanoniczną i indukować gazderminę D. Aktywacja ta prowadzi do sekrecji interleukin IL-1β i IL-18, tak jak to się dzieje w przypadku szlaku kanonicznego [47].
Białka z rodziny gazdermin tworzą pory w błonie komórkowej w czasie pyroptozy. Rodzina ta składa się z gazderminy A, B, C, D, E i DFNB59 o homologii na poziomie 45%.
Białka te składają się z domeny C-końcowej (SID) i N- koń-cowej (PFD), które są konserwatywne w obrębie tej rodziny w przeciwieństwie do domeny środkowej [31]. Domena C-końcowa spełnia rolę kontrolną i hamującą aktywność N-końca, który charakteryzuje się cytotoksyczną aktywnością i może tworzyć pory w błonie komórkowej. Tak więc zdolność domeny N-końcowej do zmiany przepuszczalności błony komórkowej sugeruje skłonność białek z rodziny gazdermin do permeabilizacji błony. C-koniec białek z rodziny gazdermin przeważnie zawiera strukturę α-helikalną, podczas gdy N-koniec ma dodatkowo strukturę β-harmonijki odpowiedzialną za tworzenie części transmembranowej porów, natomiast część α -helisy jest odpowiedzialna za łączenie się z częścią hydrofilową lipidów błon np. z kardiolipiną [43]. Jednak poza gazderminą A, D i E, których mechanizm tworzenia porów jest poznany, sposób permeabilizacji innych białek wymaga dalszych badań [38]. Geny kodujące GSDMA i GSDMB znajdują się na chromosomie 17q21.2, a dla GSDMC i GSDMD na chromosomie 8q24. Ekspresja genów gazderminy jest swoista tkankowo i ujawnia się głównie w komórkach nabłonkowych układu pokarmowego [41] i płuc [23], ale również można ją zaobserwować w tkankach szyjki macicy, piersi [4], naskórka [41] oraz w komórkach układu odpornościowego [21]. Rodzina GSDM odpowiada za regulację proliferacji i róż-nicowania komórek nabłonkowych oraz procesu apoptozy odgrywając tym samym istotną rolę w rozwoju nowotworów różnych narządów [25]. Białka te mogą być zarówno supresorami, jak i onkogenami nowotworowymi. GSDMA, GSDMC i GSDMD hamują rozwój raka żołądka i przełyku w przeciwieństwie do GSDMB, której nadekspresja jest widoczna w przebiegu raka żołądka, szyjki macicy oraz raku piersi i jest związana ze stopniem rozwoju nowotworu i przerzutami [4, 46].
Ekspresja genu
Nadekspresję genu
Zwiększoną ekspresję genu
Gazderminę E wcześniej nazywano białkiem DFNA5. Mutacja genu kodującego GSDME powoduje rozwój głuchoty związanej z dziedziczeniem autosomalnym dominującym [6]. W ostatnich latach zbadano udział gazderminy E w zjawisku pyroptozy indukowanej przez kaspazę-3. Przez apoptotyczną kaspazę-3 dochodzi do pocięcia gazderminy E na C- i N-koniec, które odpowiadają za permeabilizację błony komórkowej. Powstałe w błonie pory, umożliwiają uwolnienie DAMP, które są sygnałem dla komórek odpornościowych rekrutując je w miejsce apoptozy lub stanu zapalnego oraz zewnętrznej błony komórkowej mitochondriów. Jednocześnie uwalniają one krytyczne czynniki proapoptotyczne Cyt c i HtrA2. Powstanie porów odbywa się tu przez oddziaływanie N-końca GSDME z lipidami błony komórkowej czy mitochondrialnej. Wielkość porów waha się w granicach 10–18 nm w zależności od rodzaju lipidów budujących błonę mitochondrialną. Taki rozmiar porów w błonie mitochondrialnej umoż-liwia uwolnienie czynników proapoptotycznych Cyt c i HtrA2, mających średnicę około 3 nm [33, 34]. Uwolniony cyt c zwiększa aktywację apoptotycznego czynnika apoptosomu Apaf-1 i w wyniku dodatniego sprzężenia zwrotnego uaktywnia kaspazę-3. Tak więc po permeabilizacji błony mitochondrialnej N-koniec GSDME powoduje tworzenie porów w błonie komórkowej i wtórną martwicę bądź pyroptozę [34]. Szlak GSDME kierujący komórkę na drogę apoptozy może się łączyć ze szlakiem GSDMD, która w wyniku aktywacji przez zapalne kaspazy może również permeabilizować błonę mitochondrialną przez aktywacje kaspazy-3 i wywołać apoptozę. Oba białka gazdermina E i D są zdolne do indukcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej podczas infekcji bakteryjnej i zabicia patogenów wewnątrzkomórkowych [33]. W wyniku takich działań może dojść do wtórnej martwicy. Jeśli komórki apoptotyczne nie są usunięte dochodzi do ich obrzęku i lizy charakterystycznej dla pyroptozy lub nekrozy. Gazdermina E odpowiada również za uwięzienie apoptotycznych patogenów wewnątrz komórki, takich jak wirus zapalenia jamy ustnej (VSV) czy wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (ECMV) i ich eliminację w procesie fagocytozy [24, 34]. Jednak niedawne doniesienia Tixeira i wsp. zaprzeczają roli gazderminy E jako białka powodującego wtórną martwicę [42]. GSDME może być supresorem w rożnych typach nowotworów żołądka, jelita grubego i piersi [6].
Białko DFNB59, inaczej nazywane białkiem PJKV, zalicza się do rodziny gazdermin ze względu na homologię sekwencji genu [10, 41]. N-końcowa domena efektorowa białka DFNB59 nie spełnia tej samej funkcji jak w innych białkach należących do gazdermin [14], natomiast C-końcowa domena jest krótsza od pozostałych przedstawicieli rodziny [21]. W wyniku stresu oksydacyjnego, białko DFNB59 stymuluje peroksyfagię i tym samym reguluje proliferację peroksysomów dotyczących komórek włosków i neuronów słuchowych, chroniąc je przed uszkodzeniem [7, 14]. Nie zidentyfikowano aktywności białka DFNB59 związanego z tworzeniem porów w błonie komórkowej, która dotyczy pozostałych członków rodziny gazdermin [20].
GSDMD to jedno z najlepiej poznanych białek rodziny gazdermin. Ekspresje
Gazdermina D jest odpowiedzialna za szlak niekanoniczny zjawiska pyroptozy. Aktywatorem tego szlaku jest lipopolisacharyd bakteryjny wchodzący w skład zewnętrznej błony komórkowej bakterii Gram-ujemnych [32, 39, 45]. Składa się z lipidu A, części rdzeniowej oligosacharydu oraz antygenu O. Lipid A jest odpowiedzialny za oddziaływanie z domenami CARD ludzkich kaspaz-4 i -5, u myszy kaspazy-11 [15]. LPS jest transportowany przez rodzaj zewnątrzkomórkowych pęcherzyków OMV tworzonych przez bakterie z ich zewnętrznej błony. OMV zawierają składniki macierzystej bakterii, takie jak: PAMP, LPS, lipoproteiny, peptydoglikan, RNA i DNA, które aktywują sygnały prozapalne zależne od receptorów PRR. Zewnątrzkomórkowe pęcherzyki w wyniku endocytozy przenikają do środowiska wewnątrzkomórkowego, gdzie dochodzi do uwolnienia LPSu z endosomów do cytozolu przez białka GBP [29] i aktywacji kaspazy-1 lub -4 i -5.
Aktywacja ta powoduje uruchomienie niekanonicznego szlaku pyroptozy [15, 29, 39]. Aktywacja kaspaz -4, -5 lub -1 prowadzi do pocięcia gazderminy D i powstania C-i N-końców [30]. Fragmenty te wiążą się z lipidami błony komórkowej, tj. fosforanami fosfatydyloinozytolu oraz fosfatydyloseryną. Ulegają one oligomeryzacji i tworzą pory o wielkości około 12 nm o kształcie szczelinowym, łukowym lub pierścieniowym. Pory szczelinowe i łukowe przechodzą później w pierścieniowe (ryc. 2). Następnie składniki tworzące pory, takie jak lipidy i białko gazdermina, mogą zostać uwolnione na zewnątrz [27]. N-koniec zaktywowanej gazderminy może również wykazywać powinowactwo do kardiolipiny i fosfatydyloseryny komórek bakteryjnych i w ten sposób prowadzić do śmierci bakterii wewnątrz komórki, jak i prawdopodobnie komórek bakteryjnych na zewnątrz komórki gospodarza
Schemat tworzenia się porów w błonie komórkowej. N-koniec wiążę się z lipidami w błonie komórkowej, ulegając oligomeryzacji i tworząc pory o wielkości ok. 12 nm w kształcie szczelinowym (I), łukowym (I) lub pierścieniowym (II). Pory szczelinowe i łukowe przechodzą później w pierścieniowe (II). Schemat według Mulvihill [25] (zmieniony)
Szlak niekanoniczny łączy się ze szlakiem kanonicznym pyroptozy przez możliwość aktywacji inflamasomu NLRP3 w tym białka ASC, które mogą stymulować kaspazę-1 należącą do szlaku kanonicznego [19]. Kaspaza-1 może również w dalszej kolejności powodować cięcie gazderminy D, tak samo jak kaspazy szlaku niekanonicznego i również powoduje tworzenie porów, w celu uwolnienia IL-1β i IL-18. Uwalnianie interleukin poprzez pory gazderminowe jest możliwe ze względu na rozmiar tych interleukin IL-1β (4,5 nm) i IL-18 (5,0 nm), który umożliwia im wydostanie się do środowiska zewnątrzkomórkowego [21]. Interleukina-18 powoduje wydzielanie interferonu γ (IFN-γ) w komórkach Th1, NK i cytotoksycznych komórkach T oraz bierze udział w rozwoju komórek Th2, wzmacniając ty samym dalszą odpowiedź immunologiczną [16]. Natomiast IL-1β jest cytokiną prozapalną, która odpowiada za indukowanie komórek wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i modulowanie komórek swoistej odpowiedzi immunologicznej [16].
Gazdermina D odpowiada więc za uwalnianie interleukin podczas hiperaktywacji makrofagów oraz indukcji pyroptozy. Białko to jest bifunkcyjne w odpowiedzi immunologicznej komórki. Pośredniczy w uwalnianiu cytokin zapalnych podczas procesu pyroptozy, a to prowadzi do lokalnej odpowiedzi immunologicznej przy jednoczesnej śmierci komórki. Podczas pyroptozy, na skutek powstałych porów, dochodzi do zaburzenia gradientu jonowego, a więc zaburzenia ciśnienia osmotycznego, powodując obrzęk, lizę osmotyczną, śmierci komórki i w wyniku tego uwalniają się z niej cytokiny. GSDMD uczestniczy również w uwalnianiu tej interleukiny podczas hiperaktywacji makrofagów. Interleukiny uwalniane są z żywych makrofagów, komórek dendrytycznych czy też neutrofili za pośrednictwem gazderminy, które nie są kierowane na drogę pyroptozy, czyli nie dochodzi do śmierci komórki. W tym procesie w wyniku aktywacji komórek przez patogeny stymulowany jest inflamasom aktywujący kaspazę-1, która tnie gazderminę tworzącą pory, powodując uwolnienie interleukin. Jednak ten proces charakteryzuje mniejsza ilość uwalnianych cytokin niż podczas pyroptozy [8, 9, 17]. Poza wydzielaniem interleukin może dojść również do uwalniania innych białek cytozolowych, których rozmiar umożliwi przejście przez pory utworzone przez GSDMD [17]. Inną rolą białka GSDMD jest funkcja regulatorowa wypływu jonów K+ oraz zależna od cGAS odpowiedź interferonu na cytozolowe DNA. Gazdermina D może również być aktywowana podczas indukcji białka AIM2 inflamasomu i szlaku cGAS-STING-IFN-β za pomocą cytozolowego DNA, w wyniku czego dochodzi do wypływu jonów K+ przez pory gazderminowe powstałe w błonie komórkowej. Wyciek jonów natomiast hamuje cGAS, a więc wykrycie cytozolowego DNA. Tym samym zatrzymana jest odpowiedź interferonu typu I [2].
Białka należące do rodziny gazdermin pełnią ważną rolę w odpowiedzi immunologicznej organizmu. Ich charakterystyczna cecha, jaką jest tworzenie porów w błonachkomórkowych, może mieć istotne znaczenie w dalszych badaniach nad infekcjami bakteryjnymi, szczególnie bakterii Gram-ujemnych, których barierę jaką jest zewnętrzna błona komórkowa trudno pokonać. Jeśli udało by się udowodnić rolę gazdermin w oddziaływaniu na błonę komórkową bakterii, stworzyłoby to nowe możliwości w terapii przeciwbakteryjnej.