Caramel colors in terms of scientific research, with particular consideration of their toxicity

5-HMF to związek O-heterocykliczny, pochodna furanu (ryc. 1). Powstaje w czasie termicznej obróbki węglowodanów, zarówno podczas karmelizacji, jak i w reakcji Maillarda (reakcja amino-karbonylowa). Reakcja tworzenia 5-HMF przebiega głównie przez 1,2- lub 2,3-enolizację cukru i β-eliminację wody, z wytworzeniem 1-, 3- i 4-heksuloz. Wewnątrzcząsteczkowa cyklizacja i dalsze odwodnienie powodują powstanie wielu różnorodnych związków O-heterocyklicznych typu furan i piran z przewagą HMF, HDF i HAF (hydroksyacetylofuran). 5-HMF może wchodzić w następne reakcje, stanowiąc prekursor w tworzeniu innych związków, np. 5-sulfooksymetylofurfuralu (5-sulphooxymethylfurfural, SMF) i 5-chlorometylofurfuralu (5-chloromethylfurfural, CMF) (ryc. 1). 5-HMF jest również jednym z produktów rozkładu kwasu askorbinowego [28, 58].

Ryc. 1

W świeżej, niepoddanej obróbce żywności, 5-HMF jest nieobecny; jego stężenie zwiększa się podczas podgrzewania, dlatego jest użytecznym narzędziem do oceny uszkodzeń termicznych w produktach spożywczych. Jest to również uznany parametr świeżości i jakości żywności – kontrola analityczna 5-HMF została wykorzystana w nadzorze nad żywnością, zarówno do oceny jakości metody przetwarzania, jak i właściwości organoleptycznych produktu końcowego. Kodeks Żywnościowy (Codex Alimentarius, CA) i Unia Europejska ustaliły maksymalny poziom zawartości 5-HMF m.in. w miodzie (<40 mg/kg) i w soku jabłkowym (<50 mg/l), gdzie jest przede wszystkim wskaźnikiem intensywności obróbki cieplnej. Nadal brakuje jednak określenia dopuszczalnego stężenia 5-HMF dla barwników karmelowych [8, 58, 60].

Badania z 1992 r. wykazały obecność 5-HMF we wszystkich klasach karmeli w stężeniu 700–33700 mg/kg, przy czym jego koncentracja była najniższa w karmelu amoniakalnym (tabela 1). Późniejsze analizy karmeli klasy III i IV, wykonane przez ekspertów EFSA wykazały, że zawartość 5-HMF w karmelu amoniakalnym mieściła się w zakresie 5–140 mg/kg, a w karmelu amoniakalno-siarczynowym koncentracja 5-HMF zależała od mocy barwienia – dla pojedynczej mocy barwienia wynosiła 48–183 mg/kg, dla podwójnej: 22,7–147 mg/kg [8, 60].

Co się dzieje z HMF w organizmie nadal jeszcze dokładnie nie poznano; jest tylko kilka raportów dotyczących absorpcji, transportu i szlaków metabolicznych HMF. W 2008 r. oceniono transport HMF za pomocą modelu jelita ludzkiego in vitro. Wartość stężenia HMF w komórkach jelita Caco-2 była dodatnio skorelowana z zawartością HMF w pożywce. Badania myszy i szczurów również wykazały, że 5-HMF szybko wchłania się w przewodzie pokarmowym, skąd trafia przede wszystkim do wątroby, nerek i pęcherza moczowego [27]. Zhou i wsp. wykazali, że HMF wiąże się z ludzkimi albuminami osocza (human serum albumin, HSA) w subdomenie IIA, głównie za pomocą wiązań wodorowych i sił van der Waalsa. Stwierdzono również, że obecność niektórych składników pokarmowych, takich jak: kwas askorbinowy, chlorogenowy, czy floretyna, mogą osłabiać wiązanie 5-HMF z HSA [64]. Wydalanie HMF odbywa się głównie z moczem – w zależności od badania 60–80% lub 95–100% podanej dawki tego związku, było wydalane odpowiednio w ciągu 48 h i 24 h. Dokładnie produkty przemian ustrojowych HMF jeszcze nie zostały poznane, ale przeprowadzone badania wskazują na występowanie pewnych różnic gatunkowych. U szczurów HMF jest wydalany głównie jako kwas 5-hydroksymetylo-2-furoinowy (5-hydroxymethyl-2-furoic acid, HMFA) i jego koniugat z glicyną – N-(5-hydroksymetylo-2-furoilo)-glicyna (N-(5-hydroxymethyl-2-furoyl)-glycine, HMFG). Wskazuje to na istotne znaczenie w biotransformacji HMF reakcji utleniania (I faza biotransformacji) i sprzężenia z glicyną (II faza biotransformacji) [27]. Natomiast pierwsze obserwacje u ludzi wykazały, że HMF jest prawie w 50% przekształcany do HMFA i kwasu furano-2,5-dikarboksylowego (furan-2,5-dicarboxylic acid, FDCA), które są wydalane z moczem, ale tylko w 38 lub 74%, w zależności od dawki.

Pozostała część HMF prawdopodobnie jest zatrzymywana w organizmie, w postaci związanej z grupami tiolowymi i aminowymi białek. Warto wspomnieć, że Jellum i wsp. nie stwierdzili obecności HMFG w moczu, co mogło być spowodowane zastosowaną metodą analityczną, uniemożliwiającą wyizolowanie tego związku lub też zmniejszoną dostępnością wolnej glicyny w organizmie [23]. Późniejsze badania wykazały bowiem funkcjonowanie alternatywnego szlaku przemian HMF – przy braku glicyny nasila się wydalanie HMF w postaci wolnego kwasu 2-furoinowego (2-furoic acid, FA) lub FDCA. W 2006 r. potwierdzono, że głównym metabolitem HMF jest HMFA, ale oprócz niego w moczu oraz w osoczu zidentyfikowano obecność: HMFG, (5-karboksylo-2-furoilo)-glicyny ((5-carboxylicacid-2-furoyl)-glycine, CAFG) i 5-hydroksymetylo-2-furoilo-aminometanu (5-hydroxymethyl-2-furoyl-aminomethane, CAFAM). Nie uzyskano natomiast dowodów na powstawanie FDCA. Naukowcy zwracają również uwagę, na możliwy udział w metabolizmie HMF, mikroflory jelitowej, która prawdopodobnie przekształca go do 2,5-bis(hydroksymetylo)-furanu (2,5-bis(hydroxymethyl)-furan, BHMF) [27].

Toksyczne działanie HMF nie zostało jeszcze dokładnie określone. Badania przeprowadzone w latach 60. i 70. XX w. wskazywały na niewielką toksyczność ostrą i podprzewlekłą HMF u myszy i szczurów [1]. Stwierdzono wówczas, że w wysokich stężeniach – nieistotnych w żywieniu – HMF może być cytotoksyczny oraz może podrażniać oczy, górne drogi oddechowe, skórę i błonę śluzową [38]. Jednak budowa chemiczna HMF (w tym obecność pierścienia furanowego, α,β-nienasyconej grupy karbonylowej oraz allilowej grupy hydroksylowej) wskazuje na możliwe działanie genotoksyczne i rakotwórcze tego związku. Zhang i wsp. wykazali, że HMF inicjuje i promuje zmiany przednowotworowe (nieprawidłowości w kryptach jelitowych) w okrężnicy szczura [64]. Dowodem na potencjalne działanie rakotwórcze HMF były również badania wskazujące na możliwość inicjowania zmian nowotworowych w naskórku myszy. Niejednoznaczne wyniki uzyskano w 2-letnich badaniach, związanych z narażeniem doustnym na HMF u szczurów Fischer 344N i myszy B6C3F1, prowadzonych w ramach Krajowego Programu Toksykologicznego (National Toxicology Program, NTP) Amerykańskiego Departamentu Zdrowia [40]. U szczurów obu płci oraz u samców myszy, HMF nie miał działania rakotwórczego, ale wpływał na występowanie zmian patologicznych w nabłonku węchowym i oddechowym jamy nosowej. Natomiast u samic myszy narażonych na HMF zaobserwowano częstsze występowanie raka wątrobowokomórkowego, wynoszące około 53% dla dawek: 134 i 268 mg/kg mc/dzień (dla porównania 28% w grupie kontrolnej). Trzecia grupa dawkowania – 750 mg/kg mc, nie została uwzględniona w ocenie potencjału rakotwórczego, ze względu na zmniejszoną przeżywalność oraz występowanie objawów klinicznych związanych z leczeniem. W oparciu o uzyskane wyniki, szacuje się, że dzienne narażenie na HMF nie powinno przekraczać 60–300 mg/kg mc, ale ze względu na brak dokładniejszych analiz, trudno określić dopuszczalną dawkę. Według wcześniejszych doniesień, dzienne spożycie HMF z pożywieniem waha się w granicach 30–150 mg/osobę, co odpowiada 0,4-2,1 mg/kg mc dla osoby o masie 70 kg [1, 40]. ESFA w opinii poświęconej karmelom nie uznaje wyników badań NTP uzyskanych w badaniach na myszach, istotnych dla oceny ryzyka działania kancerogennego HMF u ludzi, głównie ze względu na brak analogicznych objawów u szczurów [8].

Toksyczność HMF może wynikać nie tylko z jego działania bezpośredniego, ale również z działania związków, do których jest metabolizowany. Wykazano, że w cytozolu komórek wątrobowych szczurów, związek ten może ulec aktywacji do elektrofilowego estru kwasu siarkowego – 5-sulfooksymetylofurfuralu (ryc. 1). Aktywacja jest możliwa jedynie w obecności 3′-fosfoadenozyno-5′-fosfosiarczanu (3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulphate, PAPS), dawcy grupy sulfonowej oraz pod wpływem sulfotransferaz (sulphotransferase, SULT) [1]. Cytozolowe sulfotransferazy są jednymi z ważniejszych enzymów uczestniczących w II fazie biotransformacji, których celem jest ułatwienie eliminacji ksenobiotyków, chociaż w niektórych związkach, np. HMF, sulfonowanie przyczynia się do ich bioaktywacji. SULF w postaci wielu izoform występują powszechnie w organizmach żywych, w tym również u człowieka, m.in. w: wątrobie, płucach, mózgu, skórze, płytkach krwi, nerkach i przewodzie pokarmowym [54]. Powstały na skutek sulfonowania SMF jest wysoce elektrofilową postacią chemiczną, która może wchodzić w interakcje z DNA, tworząc różne addukty, przez co wykazuje działanie mutagenne bez aktywacji metabolicznej [31, 35]. Warto podkreślić, że wytwarzanie SMF u ludzi wiąże się z podwyższonym ryzykiem działania toksycznego, ze względu na swoistość substratową i dystrybucję tkankową SULT. Wykazano, że sulfonowanie HMF jest najczęściej katalizowane przez ludzką SULT1A1, która ulega silnej ekspresji w wątrobie i wielu tkankach pozawątrobowych. Natomiast u gryzoni, które najczęściej są obiektem doświadczalnym, sulfonowanie przebiega mniej intensywnie a stężenie sulfotransferazy jest znacznie niższe, zwłaszcza poza wątrobą [35].

Powstawanie SMF z HMF w organizmach żywych zbadano w 2009 r. na myszach. Maksymalne stężenie SMF w osoczu myszy zaobserwowano w pierwszej próbce, pobranej po 2,5 min od podania HMF. Na podstawie danych kinetycznych oszacowano, że 452–551 mg/kg początkowej dawki HMF, wynoszącej 500 mg/kg, ulegało przekształceniu do SMF. W opinii autorów rzeczywiste stężenie SMF w osoczu mogło być jeszcze wyższe, ponieważ związek ten prawdopodobnie reagował z białkami i DNA już w miejscu powstawania [35].

Toksyczne działanie SMF również poddano badaniom. Mutagenność SMF potwierdzono w teście Ames z użyciem Salmonella Typhimurium szczep TM677, a także w stosunku do ludzkich limfoblastów, w zależności od dawki [27]. Natomiast badania na myszach in vivo dowiodły, że SMF stosowany miejscowo na skórę, ma dużą aktywność pronowotworową, większą niż HMF [55]. Bauer-Marinovic i wsp. podawali SMF dootrzewnowo myszom FVB/N, w dawkach 0, 31,25, 62,5, 125 i 250 mg/kg mc, z uwzględnieniem różnych systemów dawkowania (1, 2 lub 4 dawki). Stwierdzono, że głównym celem toksycznego działania SMF były kanaliki proksymalne, których uszkodzenia były największe przy najwyższej dawce. Ponadto SMF działał hepatotoksycznie i powodował zapalenie błon surowiczych otrzewnej. W drugiej części badania autorzy podawali HMF myszom w wodzie pitnej (0, 134 i 536 mg/kg mc/dzień) przez 12 tygodni. Wykorzystano typowy szczep FVB/N myszy, a także szczep FVB/N-hSULT1A1/2, zawierający wiele kopii genu hSULT1A1 – głównej sulfotransferazy u ludzi. Zaobserwowano uszkodzenia nefronów i zwiększoną proliferację hepatocytów, ale tylko w najwyższej dawce HMF. Wszystkie zmiany były łagodne i co istotne, nie były skorelowane z ekspresją genu hSULT1A1. Autorzy stwierdzili, że SMF w czystej postaci wykazuje działanie nefrotoksyczne, ale jego ilość powstająca z HMF w organizmie nie jest wystarczająca do wywołania podobnego efektu [1]. Możliwe działanie SMF, po biotransformacji HMF, zostało również sprawdzone przez NTP [40]. W badaniu, roztworem HMF traktowano komórki HepG2, zdolne do ekspresji zarówno cytochromu P450 (CYP), jak i SULT. W teście kometowym widoczne były pewne oznaki uszkodzenia DNA, ale bez zmiany struktury i liczby chromosomów [40]. W 2009 r. określano działanie genotoksyczne HMF w teście kometowym, kilku linii komórkowych o różnym poziomie ekspresji SULT1A1. Wykazano, że HMF jest czynnikiem uszkadzającym DNA in vitro, niezależnie od aktywności SULT1A1 w badanych komórkach. Indukowane przez HMF uszkodzenie DNA obserwowano tylko przy wysokich stężeniach, co zwykle wiązało się z jednoczesnym spadkiem żywotności komórek [4].

HMF może również ulegać przemianom w obecności jonów chlorkowych, z wytworzeniem 5-chlorometylofurfuralu (CMF) (ryc. 1). Związek ten wykazuje silniejsze działanie mutagenne i cytotoksyczne na komórki bakteryjne (S. Typhimurium TM677) niż HMF i SMF. Ponadto dodatek glutationu do hodowli bakteryjnej nie chroni komórek przed toksycznością CMF. Wykazano również, że chlorometylowe pochodne HMF mają dużą aktywność kancerogenną - u myszy H6C3F, CMF indukował rozwój zmian nowotworowych w obrębie skóry (stosowany miejscowo) i w wątrobie (stosowany doustnie). Jednoczesne stosowanie SMF i CMF może nasilać ich działanie toksyczne [56].

5-HMF, oprócz nie do końca poznanych mechanizmów toksyczności, ma kilka zalet. Coraz częściej zgłaszane są jego właściwości przeciwutleniające i trwają badani nad stosowaniem tej substancji jako naturalnego przeciwutleniacza. Ponadto wykazano zdolność 5-HMF do regulacji procesów alergicznych, a także jego działanie przeciwnadciśnieniowe. W Afryce trwają badania kliniczne związane z możliwością wykorzystania HMF w leczenie anemii sierpowatej. Sugeruje się również możliwość stosowania HMF w leczeniu chorych z cukrzycą, ze względu na jego ochronę śródbłonka naczyń przed stresem oksydacyjnym, wywołanym podwyższonym stężeniem glukozy. Zaobserwowano także korzystne działanie metabolitów HMF, np. HMFA hamuje mitozę w komórkach rakowych i dlatego rozpatruje się możliwość wykorzystania tego związku w terapii nowotworowej [27].

Obecnie dostępnych jest wiele możliwości pozwalających na obniżenie poziomu 5-HMF w żywności, tj. zastosowanie promieniowania UV (redukcja o 62%) i mikrofal (redukcja o 40%), dodawanie związków fenolowych (redukcja o 50–86%), fermentacja (redukcja o 61–99%), pakowanie próżniowe (redukcja o 20–50%), homogenizacja ultrawysokociśnieniowa (redukcja o 84–99%) czy zastępowanie glukozy sacharozą (redukcja o 75–88%) [29].

4(5)-MeI to metylowa pochodna imidazolu, dobrze rozpuszczalna w wodzie i etanolu, o masie cząsteczkowej 82,1 Da. Istnieją trzy izomery metyloimidazolu: 2-, 4- lub 5-metyloimidazol (ryc. 2). Spośród nich 4- i 5-MeI występują jako tautomery w roztworze wodnym o pH od obojętnego do zasadowego. Tautomery różnią się między sobą pozycją protonowania. 4-metyloimidazol to bardziej stabilny, Nτ-protonowany tautomer (Nτ-H), a 5-metyloimidazolto Nπ- protonowany tautomer (Nπ). Zawartość tautomeru 4-i 5-MeI w roztworze wodnym wynosi odpowiednio około 57 i 43%. W obu postaciach grupa metylowa pozostaje w tym samym miejscu, w pierścieniu imidazolowym, ale zmienia się numer atomu węgla (z 4 na 5) z powodu transferu protonu. Obecnie nazwę chemiczną 4-MeI często zastępuje się określeniem 4(5)-MeI [15]. Natomiast 2-MeI nie został wykryty w komercyjnych barwnikach karmelowych oraz w produktach spożywczych z ich dodatkiem, dlatego nie zostanie ujęty w artykule [60].

Ryc. 2

Alkiloimidazole (w tym 4(5)-MeI) po raz pierwszy zsyntetyzowano w połowie XIX w., w reakcji związków α-dikarbonylowych (metyloglioksalu lub metyloglioksalu-dimetyloacetalu z formaldehydem) w obecności wodnego roztworu soli amonowych, nazywanej później reakcją Debusa-Radziszewskiego [15, 20, 63]. Inną reakcją wykorzystywaną w chemicznej syntezie 4(5)-MeI, może być katalityczna cyklizacja propylen-1,2-diaminy i kwasu mrówkowego z wytworzeniem 4-metyloimidazoliny, z której następnie usuwa się wodór [13]. Mimo wielu doniesień naukowych na temat powstawania 4(5)-MeI dokładny mechanizm tej reakcji w dalszym ciągu nie jest znany [15, 60].

Ugrupowanie imidazolowe odgrywa istotną rolę w systemach biologicznych. Pierścień imidazolowy, charakterystyczny dla 4(5)-MeI, występuje w histydynie oraz w zawierających ją białkach i enzymach. 4(5)-MeI może być również obecny w wielu produktach, takich jak: leki, barwniki, środki chemiczne wykorzystywane w rolnictwie, chemikalia fotograficzne czy kauczuk. Ponadto badano jego zastosowanie jako surowca w syntezie stymulatorów układu sercowo-naczyniowego, środków obniżających stężenie cholesterolu, antagonistów neuroprzekaźników, środków przeciwpierwotniakowych i inhibitorów aromatazy. Odnotowano także uwalnianie 4(5)-metyloimidazolu do środowiska podczas jego produkcji i stosowania. Narażenie na 4(5)-MeI może być również spowodowane paleniem papierosów, wykryto go w dymie tytoniowym w zakresie od 2,3 (niska zawartość substancji smolistych w papierosie) do 15,0 (papierosy niefiltrowane) μg/papieros. Jednak szczególne znaczenie ma obecność tego związku w produktach spożywczych. Źródłem metyloimidazoli w żywności i napojach jest reakcja Maillarda, która może przebiegać bezpośrednio w produkcie, podczas jego obróbki termicznej lub poza żywnością, np. w czasie produkcji barwników karmelowych klasy III i IV [19, 24, 36].

Ilość 4(5)-MeI powstająca w produktach, może być zróżnicowana. W wielu badaniach sprawdzano przebieg tego procesu z wykorzystaniem układu modelowego charakterystycznego dla reakcji Maillarda. Stwierdzono, że ilość powstającego 4(5)-MeI zależy od rodzaju cukru stanowiącego substrat dla reakcji – ogrzewanie L-ramnozy i amoniaku (T = 100°C, t = 2 h) spowodowało wytworzenie większych ilości 4(5)-MeI (0,91 mg/ml), niż w przypadkuogrzewania (T = 100°C, t = 6 h) D-glukozy z amoniakiem (0,70 mg/ml) [15]. Wykazano również, że istotną rolę w tworzeniu metyloimidazoli odgrywają sole kwasu siarkowego (IV). W układzie reakcyjnym D-glukoza/amoniak, dodatek siarczynu w stężeniu 0,1M był związany ze wzrostem stężenia 4(5)-MeI o 54%, podczas gdy największą redukcję w syntezie tego związku (o 68%) odnotowano przy stężeniu siarczynu wynoszącym 0,2 M [30]. Przeprowadzono także badanie, w którym w zastępstwie amoniaku stosowano mieszaninę aminokwasów (L-alanina, L-arginina, glicyna, L-lizyna, L-seryna). Wykazano, że wytwarzanie 4(5)-MeI zależy od rodzaju aminokwasu (w obecności L-argininy powstawało najwięcej 4(5)-MeI) oraz od stężenia reagentów (w najwyższym badanym stężeniu D-glukozy-aminokwasu – 0,15 M, powstawało więcej 4(5)-MeI). Ponadto istotne znaczenie w tworzeniu metyloimidazoli, miała temperatura procesu – w T = 60°C nie stwierdzono obecności 4(5)-MeI, podczas gdy w T = 160°C odnotowano istotny wzrost jego stężenia (0,15–1,0 mg/kg) [24].

Przeprowadzone badania potwierdziły obecność 4(5)-MeI w barwnikach karmelowych klasy III i IV, przy czym karmel klasy IV (0–1276 ppm), w większości analiz, charakteryzował się większą zawartością tego związku, niż karmel klasy III (0,025–463 ppm). W karmelach klasy I i II alkiloimidazole nie występują ze względu na brak źródła azotu dla reakcji (tabela 1). Duże stężenia 4(5)-metyloimidazolu odnotowywano również w produktach zawierających barwniki karmelowe, takich jak: napoje gazowane, zwłaszcza typu cola (0–692 ppm), ciemne piwa (0–424 ppm), sos Worcestershire (0,027–3,4 ppm), sos sojowy (0,002–4,8 ppm), whiskey (0,12–0,14 ppm), czy napoje energetyczne (0–37 ppm) [15]. Obecność 4(5)-MeI w tych produktach była bezpośrednio związana z obecnością dodatków karmelowych.

Potwierdzeniem tego mogą być badania przeprowadzone przez Yamaguchi i Masuda, którzy zaobserwowali, że w naturalnie warzonym sosie sojowym koncentracja 4(5)-MeI była bardzo niska, 0,002–0,023 µg/g, podczas gdy w sosie sojowym z dodatkiem karmelu amoniakalno-siarczynowego odnotowano znacznie wyższe stężenie tego związku (na poziomie 0,43–4,8µg/g) [62]. Druga grupa produktów spożywczych, w której stwierdza się obecność metyloimidazoli, to produkty poddane obróbce termicznej. W tym przypadku odnotowane stężenia 4(5)-MeI były znacznie niższe i mieściły się w granicach: od <0,01 ppm dla gotowanych warzyw, prażonych orzechów, chleba, grillowanych ryb, czy soków owocowych, przez 0,22–0,29 ppm w przypadku grillowanego mięsa i kakao, do 2,05 ppm dla palonej kawy [11, 15].

Stężenie 4(5)-MeI w barwnikach karmelowych podlega pewnym regulacjom prawnym. Komisja Europejska oraz JECFA ustaliły limit zawartości 4(5)-MeI do 200 mg/kg dla karmelu klasy III oraz 250 mg/kg dla karmelu klasy IV (tabela 1) [22, 47]. Natomiast w przepisach amerykańskiego prawa krajowego nie ma zapisów dotyczących dopuszczalnego stężenia 4(5)-MeI w karmelach. Są jedynie rekomendacje United States Pharmacopeial Convention (USP) z 2016 r., ale nie są przestrzegane. W opinii USP zawartość 4(5)-MeI w karmelach klasy III i IV nie powinna przekraczać 250 mg/kg (indywidualnie) [11].

Metabolizm 4(5)-MeI był poddawany wielu badaniom, które wykazały występowanie pewnych różnic gatunkowych. U szczurów związek był wydalany w postaci niezmienionej z moczem po około 30 min od wstrzyknięcia (pojedyncza dawka=216 mg/kg mc), a w ciągu 8 h usunięciu ulegało prawie 90% dawki początkowej. Największy wychwyt 4(5)-MeI zaobserwowano głównie w jelitach, a następnie w wątrobie, krwi, żołądku i nerkach. U owiec połowa podanej oralnie dawki była wchłaniana poniżej 30 min, a maksymalne stężenie 4(5)-MeI w osoczu osiągano w ciągu 5 h po podaniu. Biodostępność 4(5)-MeI wynosiła 68%, a jego okres biologicznego półtrwania około 9 h 30 min. Tylko 0,07 mg/kg, z początkowej dawki wynoszącej 20 mg/kg, było wydalane z moczem, jako niezmieniony związek macierzysty. Próba wykrycia metabolitów 4-MeI nie powiodła się. U innych zwierząt (np. kóz) 4(5)-MeI był dystrybuowany głównie do wątroby, nerek i płuc, natomiast jego wydalanie odbywało się przede wszystkim z moczem, a w mniejszym stopniu z mlekiem i kałem. W badaniu u samców szczurów Fischer F344, 4(5)-MeI podawany zgłębnikiem do żołądka, osiągał maksymalne stężenie w osoczu po 0,5, 1 i 3 h, odpowiednio dla dawek wynoszących: 5, 50 i 150 mg/kg mc. Biodostępność związku wynosiła 60–70%, a jego okres półtrwania zależał od dawki początkowej. Związek prawdopodobnie podlegał niewielkim przemianom w organizmie, ponieważ w moczu oraz w osoczu stwierdzono obecność jednego hydrofilowego metabolitu. Po 48 h główną drogą wydalania 4(5)-MeI był układ moczowy (85%), ale wykazano również znikome ilości tego związku w kale (3%) i w wydychanym powietrzu (0,6% jako CO₂, 0,04% jako lotne związki organiczne). Fennell i wsp. porównali metabolizm 4(5)-MeI u myszy i szczurów in vivo. Po doustnym podaniu związku w dawkach 50 i 150 mg/kg mc, stwierdzono, że po 48 h eliminacja odbywała się głównie z moczem, w 79–89% u szczurów i w 41–70% u myszy. U obu gatunków zwierząt związek przeważnie (71–88%) był usuwany w niezmienionej postaci [9, 19].

Metabolity 4(5)-MeI nadal nie są jeszcze dokładnie poznane i scharakteryzowane. Większość przeprowadzonych analiz wykazała, że przemiany tego związku w organizmach żywych są bardzo ograniczone. W 1993 r. zidentyfikowano w moczu kóz i jałówek trzy metabolity 4(5)-MeI: 5-metylohydantoinę, kwas 2-metylohydantoinowy i mocznik [19]. Odnotowano jeszcze obecność czwartego związku, ale jego wysoka polarność uniemożliwiła dalszą charakterystykę. W 2008 r. w oparciu o przemiany innych 5-członowych związków heterocyklicznych, zaproponowano metabolizm 4(5)-metyloimidazolu do potencjalnie reaktywnego związku epoksydowego [3]. Nie zostało to jednak potwierdzone w przeprowadzonych badaniach. W 2019 r. Fennell i wsp. wykazali, że 4(5)-MeI jest metabolizowany do glukuronidów oraz innych utlenionych związków, w tym do metylohydantoiny [9, 19].

Dokładny mechanizm działanie 4(5)-MeI pozostaje nieznany, ale wykazano, że związek ten może wpływać na funkcjonowanie komórek przez tworzenie kompleksów z enzymami zawierającymi hem, np. z cytochromem P450 (CYP). Udowodniono, że 4(5)-MeI w istotny sposób hamuje aktywność izoformy CYP2E1 w wątrobie szczura oraz CYP2C9 (hydroksylaza tolbutamidowa) w mikrosomach u ludzi i szczurów. Jednocześnie stymuluje fosforylację Na+ i K+-trifosfatazy adenozynowej oraz wykazuje znaczącą aktywność przeciwutleniającą [19].

Wyniki badań toksyczności ostrej 4(5)-MeI są zróżnicowane. Nishie i wsp. ustalili wartość LD50 dla 4(5)-MeI, po podaniu doustnym, na poziomie 370 mg/kg mc dla myszy oraz 599 mg/kg mc dla kurcząt. W dawkach zbliżonych do LD50 głównym objawem narażenia zwierząt na ten związek były silne drgawki [7]. Natomiast późniejsze badania, przeprowadzone przez NTP, wykazały, że stosowanie wysokich dawek 4(5)-MeI (300 i 800 mg/kg mc) w przypadku szczurów i myszy nie tylko nie powoduje śmierci zwierząt, ale nie odnotowano nawet różnic w masie ciała i narządów oraz w wynikach badań klinicznych w porównaniu z grupą kontrolną. Dla szczurów istotne zmiany zaobserwowano dopiero przy narażeniu na dawkę 2500 mg/kg mc – znaczny spadek masy ciała, zwiększenie masy wątroby i spadek masy śledziony, a przy dawkach 5000 i 10000 mg/kg mc widoczne były jeszcze zmiany w wyglądzie zwierząt, problemy z oddychaniem, łagodne drżenie, zaburzona koordynacja ruchowa, ataksja czy zwężenie źrenic. Ponadto 4(5)-MeI w dwóch najwyższych dawkach, indukował przejściową erytrocytozę i minimalną, zależną od stężenia, niedokrwistość mikrocytarną (u szczurów obu płci), a u samców szczurów widoczny był znaczny spadek stężenia albumin (w 14 tygodniu) oraz zwyrodnienie jąder. U myszy narażenie na 4(5)-MEI było związane z występowaniem niedokrwistości makrocytarnej, a w przypadku samców – ze wzrostem stężenia trójjodotyroniny i z przejściowym spadkiem stężenia tyroksyny (brak zmian w tarczycy). Przy dawce ≥2500 mg/kg mc u samic myszy nastąpił znaczny spadek bezwzględnej masy ciała i wzrost względnej masy serca, prawej nerki i wątroby [39].

Badania wykazały możliwe działanie neurotoksyczne 4(5)-MeI. Sivertsen i wsp. stwierdzili w testach in vitro, że 4(5)-metyloimidazol w stężeniu 2–20 mM znacząco hamuje aktywność mózgowej dekarboksylazy glutaminianowej (glutamate decarboxylase, GAD), ale słabiej niż inna postać izomerowa metyloimidazolu – 2-MeI. 5–20 mM 4(5)-MeI hamował kompetycyjnie wiązanie kwasu γ-aminomasłowego (gamma-aminobutyric acid, GABA) do mózgowych receptorów GABA, bez wpływu na poziom glutaminianu i GABA [52].

Opublikowano również badania nad możliwym wpływem 4(5)-metyloimidazolu na homeostazę glukozy. Zaobserwowano, że u myszy otrzymujących 4(5)-MeI w dawce 32 µg/kg mc/dzień, występowała ciężka hipoglikemia i hiperinsulinemia. Stwierdzono również rozrost komórek beta-trzustki, indukcję zaburzeń homeostazy glukozy i lipidów oraz promocję lipogenezy. Badania u ludzi spożywających napoje bezalkoholowe z dodatkiem barwników karmelowych wykazały zwiększone stężenia peptydu C, cholesterolu frakcji LDL i trójglicerydów [45].

4(5)-metyloimidazol został przebadany również pod kątem działania rakotwórczego po podaniu doustnym. Podstawowy jest raport opublikowany przez NTP w 2007 r., który zawiera wyniki 2-letnich badań narażenia na 4(5)-MeI myszy i szczurów. Stwierdzono, że związek ten zwiększał częstość występowania gruczolaka pęcherzykowego/oskrzelikowego u samic myszy (dawki: 40, 80, 170 mg/kg mc), raka pęcherzykowego/oskrzelikowego u samców myszy (dawka: 170 mg/kg mc) oraz współistniejących gruczolaka i raka pęcherzykowego/oskrzelikowego u samców (dawka: 170 mg/kg mc) i samic myszy (dawki: 80, 170 mg/kg mc). Natomiast wyniki badań na szczurach, nie były jednoznaczne. Podawany doustnie 4(5)-MeI w najwyższej dawce – 260 mg/kg mc, zwiększał częstość występowania białaczki z komórek jednojądrzastych u samic szczurów. Jednocześnie naukowcy podkreślają, że ten rodzaj nowotworu często występuje u wykorzystanej w badaniach rasy szczurów F344/N. Przypuszcza się, że 4(5)-MeI mógł jedynie zaostrzyć już występujące u zwierząt zmiany, zwłaszcza że u samic z grupy kontrolnej białaczka była odnotowana w 624 dniu badania, podczas gdy u samic narażonych na 260 mg 4(5)-MeI/kg mc zaobserwowano ją już w 368 dniu [41]. W 2011 r., głównie w oparciu o wyniki badań NTP, Gabinet Oceny Zagrożeń dla Zdrowia Środowiskowego (Office of Environmental Health Hazard Assessment, OEHHA) Kalifornijskiej Agencji Ochrony Środowiska (California Environmental Protection Agency, CEPA) uznał 4(5)-MeI za związek rakotwórczy, uwzględniając go w wykazie Proposition 65 (tzw. Ustawa o bezpieczeństwie wody pitnej i egzekwowaniu przepisów dotyczących substancji toksycznych z 1986 r.). Ustalony przez OEHHA poziom bez istotnego ryzyka (No Significant Risk Level, NSRL) dla 4(5)-MeI wynosi 29 µg/dzień, czyli znacznie poniżej stężenia tego związku wykrywanego w produktach spożywczych, np. w napojach gazowanych (maksymalna wykryta zawartość 4(5)-MeI, wynosiła 690 ppm, czyli ~690 tys. µg/kg produktu) [46]. W marcu 2012 r., pod naciskiem organizacji konsumenckich, koncerny takie jak Coca-Cola i Pepsi podjęły decyzję o modyfikacji procesów technologicznych w taki sposób, aby sprostać nowym wymaganiom. Stężenie 4(5)-MeI zostało znacząco obniżone w napojach tych firm (poniżej wartości NSRL), ale jedynie w stanie Kalifornia. Ponadto w 2011 r. Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem (International Agency for Research on Cancer, IARC) zaklasyfikowała 4(5)-MeI do grupy 2B, czyli substancji o możliwym działaniu rakotwórczym dla człowieka [19, 37]. Natomiast w opinii EFSA oszacowane narażenie na 4(5)-MeI, jako składnika barwików karmelowych, nie budzi obaw [7].

Działanie genotoksyczne 4(5)-MEI było sprawdzane w wielu badaniach. Testy mutacji powrotnych z użyciem Salmonella Typhimurium (szczepy: TA97, TA98, TA100, TA1535, TA153, TA102, TA1538) (dawki: 5–10 000 µg/płytkę) oraz Escherichia coli (dawki: 9,77–5000 µg/płytkę), dały wynik negatywny, zarówno z, jak i bez aktywacji metabolicznej frakcją S9. W teście mikrojąder, na komórkach krwi obwodowej myszy i na komórkach szpiku kostnego myszy i szczurów, dla dawek 25–3200 mg/kg mc/dzień, również uzyskano wyniki negatywne [19, 37]. Natomiast badania z użyciem testu aberracji chromosomowych na komórkach szpiku kostnego myszy (Swiss Albino) wykazały, że 4(5)-metyloimidazol w stężeniu: 100–160 mg/kg mc, znacząco zwiększał odsetek aberracji chromosomowych podczas 12 h narażenia. Związek dodatkowo obniżał indeks mitotyczny (MI) badanych komórek we wszystkich stężeniach po 24 h, a po 12 h, wyłącznie w najwyższej dawce (16 mg/kg mc) [42]. Działanie genotoksyczne i cytotoksyczne 4(5)-MeI wykazały również analizy przeprowadzone przez Celik i Topaktas na ludzkich limfocytach krwi obwodowej traktowanych 4(5)-MeI (300, 450, 600 i 750 mg/ml) przez 24 i 48 h. Badany związek indukował wymianę chromatyd siostrzanych (we wszystkich stężeniach, po 48 h) oraz aberracje chromosomowe i tworzenie mikrojąder (w dwóch najwyższych dawkach: 600 i 750 mg/ml, po 24 i 48 h). Ponadto zaobserwowano, że 4(5)-MeI w najwyższym stężeniu (750 mg/ml) silniej wpływał na tworzenie mikrojąder w ciągu 24 h, niż mitomycyna C (mitomycin C, MMC) w kontroli pozytywnej [2].

2-acetylo-4-tetrahydroksy-butyloimidazol to pochodna imidazolu, o nazwie: 2-acetylo-4-((1R,2S,3R)-1,2,3,4-tetrahydroksy-butylo-)imidazol. THI w wyniku spontanicznej przemiany izomerycznej może występować pod postacią tautomeru – 2-acetylo-5-tetrahydroksy-butyloimidazolu, dlatego podobnie jak w przypadku 4(5)-MeI, zamiennie stosuje się nazwę 2-acetylo-4(5)-tetrahydroksy-butyloimidazol (ryc. 3) [32]. THI jest jednym ze związków LMW powstających podczas ogrzewania cukrów ze związkami azotowymi. Reakcja syntezy pochodnych acetyloimidazolowych jest podobna do syntezy metyloimidazoli. Produkt pirolizy węglowodanów – metyloglioksal, kondensuje z jednocześnie wytworzonymi związkami azotowanymi, takimi jak: formamid lub iminofruktozamina. Stereochemia łańcucha bocznego THI zależy od cukru stanowiącego substrat dla reakcji [6].

Ryc. 3

Obecność THI potwierdzono w karmelu klasy III w zróżnicowanej ilości: 2,4–10 mg/kg, 14,03 mg/kg i 1,0–74,3 mg/kg [8, 25, 61]. Nie stwierdzono występowania tego związku w karmelu klasy IV, mimo potencjalnie odpowiednich warunków do jego syntezy. Przypuszcza się, że dodatek związków siarki podczas otrzymywania E150d może hamować powstawanie acyloimidazoli [8]. THI może być również obecny w produktach spożywczych, co prawdopodobnie wynika z dodawania do nich E150c. Badania przeprowadzone w Belgii w 2018 r. wykazały, że THI występował w 22,4% analizowanych produktów (n=552) na poziomie nieprzekraczającym 551 µg/kg, przy czym największe koncentracje związku odnotowano w takich produktach jak: chleb i zboża (<5–145 µg/kg), produkty mięsne (<5–184 µg/kg), napoje alkoholowe, w tym piwo (<5–328 µg/kg), ciastka i przekąski (<5–376 µg/kg), gotowe zupy i sosy (<5–551 µg/kg) [10]. Wang i wsp. także wykazali obecność THI w wybranych produktach – w occie winnym (0,5–119,2 µg/L) oraz w napojach bezalkoholowych (0,5–2,7 µg/L) (tabela 1) [61].

Dopuszczalna zawartość THI w karmelu amoniakalnym została określona w Rozporządzeniu Komisji nr 231/2012z dnia 9 marca 2012 r. Zgodnie ze specyfikacją E150c, zawartość THI nie może przekraczać 10 mg/kg w przeliczeniu na ekwiwalent bazy barwnika [47]. Natomiast JECFA w 2011 r. określił dopuszczalną ilość THI w karmelu klasy III na poziomie 25 mg/kg, w przeliczeniu na ekwiwalent bazy barwnika (tabela 1) [22].

Toksyczność THI została potwierdzona już w latach 70 ub.w., kiedy wykazano, że związek indukuje limfopenię [8]. MacKenzie i wsp. określili NOAEL w odniesieniu do działania limfopenicznego THI wynoszący: 380 μg/kg mc /dzień u samców i 120 μg/kg mc/dzień u samic szczurów [33]. Badania prowadzone w latach 80. i 90. ub.w. pozwoliły zbliżyć się do określenia mechanizmu toksyczności tego związku, z możliwą główną rolą niedoboru witaminy B6. W badaniach na szczurach (czas trwania: 7 dni), którym podawano karmel klasy III (dawka THI=200–2000 µg /kg mc/dzień), zaobserwowano istotny spadek liczby limfocytów krwi obwodowej oraz wszystkich leukocytów. Jednak dopiero obniżenie stężenia witaminy B6 w diecie szczurów (2–3 mg/kg) wiązało się z silniejszym działaniem limfopenicznym THI, widocznym już przy dawce 20 µg/kg mc/dzień [8]. Limfopenię związaną z narażeniem na THI, przy jednoczesnym niedoborze witaminy B6, potwierdzono również w innych badaniach z wykorzystaniem zwierząt [12, 17]. Przeprowadzono również doświadczenie z udziałem ludzi (n=24, zdrowi mężczyźni, wiek ≥ 65 lat, z niskim poziomem witaminy B6), którzy spożywali przez 7 dni karmel klasy III na poziomie 200 mg/kg mc/dzień, zawierający 23 ppm THI (karmel komercyjny) lub 143 ppm THI (próbka karmelu zsyntetyzowana na potrzeby badania). Nie stwierdzono znaczących różnic w średniej liczbie limfocytów we krwi między grupą kontrolną, a grupami badanymi. Ponadto, u żadnej z osób nie zaobserwowano różnic w liczbie limfocytów w trakcie doświadczenia. Autorzy porównali swoje wyniki z dawkami THI, które wywołują limfopenię u szczurów i uznali, że ludzie mogą być mniej wrażliwi na działanie tego związku, co prawdopodobnie wynika z metabolicznych różnic gatunkowych [16, 18]. Późniejsze analizy wykazały, że działanie limfopeniczne THI może być wtórne do jego działania immunosupresyjnego. Ustalono, że związek ten zmniejsza aktywność liazy sfingozyno-1-fosforanu (sphingosine 1-phosphate lyase, S1PL). Sfingozyno-1-fosforan (sphingosine 1-phosphate, S1P) odgrywa główną rolę jako regulator układu odpornościowego i sercowo-naczyniowego – działając na powierzchniowe receptory komórkowe sprzężone z białkiem G, reguluje ruch komórek układu immunologicznego między tkanką limfatyczną a krwią i resztą organizmu. W prawidłowych warunkach poziom S1P w większości tkanek, w tym w tkance limfatycznej, jest niski natomiast we krwi i limfie utrzymywany jest na wysokim poziomie, co stanowi siłę napędową do migracji limfocytów i innych komórek immunokompetentnych do krążenia obwodowego. Inhibicja S1PL wpływa na zaburzenie gradientu S1P między narządami limfatycznymi a krwią/limfą, hamując ruch komórek immunokompetentnych [8, 49]. Obserwowano więc gromadzenie dojrzałych limfocytów T w grasicy czy blokowanie wyjścia limfocytów z węzłów chłonnych, co wywoływało spadek ich liczby w badaniach krwi [49].

Wciąż nie poznano jeszcze mechanizm toksycznego działania THI. Nie wiadomo czy związek ten działa bezpośrednio, czy istotną rolę w jego toksyczności odgrywają mechanizmy pośrednie. Coraz częściej sugeruje się, że istotne znaczenie w działaniu THI może mieć aktywacja metaboliczna tego związku, zwłaszcza, że w badaniach in vitro (komórkowych i bezkomórkowych) nie potwierdzono aktywności hamującej samego THI w stosunku do S1PL [44]. Potwierdzeniem tej hipotezy mogą być badania Ohtoyo i wsp. Autorzy odkryli nowy inhibitor S1PL – A6770 (1-[4(5)-(hydroksymetylo)-1H-imidazol-2-il]etanon), który (po uprzedniej fosforylacji) wykazywał identyczne działanie limfopeniczne do THI, zarówno in vitro, jak i in vivo. Ponadto A6770 wykryto w osoczu szczurów po doustnym podaniu THI, dlatego autorzy sugerują, że A6770 może być podstawowym metabolitem THI [43]. Innym wyjaśnieniem zmniejszonej aktywności S1PL jest hamowanie powstawania kofaktora tego enzymu, czyli fosforanu pirydoksalu [44]. Bazując na wynikach badań na zwierzętach już wcześniej sugerowano, że główną rolę w mechanizmie toksyczności THI może odgrywać hamowanie kinazy pirydoksalu, która katalizuje zależną od ATP fosforylację pirydoksalu do fosforanu pirydoksalu, czyli aktywnej postaci witaminy B6 [53]. Ponadto wykazano, że enzym ten jest hamowany przez wiele substancji pochodzenia naturalnego i syntetycznego, zwłaszcza przez niskocząsteczkowe związki heterocykliczne. Elsinghorst i wsp. zaobserwowali, że THI rzeczywiście hamuje kinazę pirydoksalu w procesie inhibicji kompetycyjnej, ale jego powinowactwo do enzymu określono na poziomie od niskiego do umiarkowanego. Autorzy zauważają, że uwzględniając maksymalny dozwolony poziom THI w E150c wynoszący 10 mg/kg, nie oczekuje się istotnego hamowania kinazy pirydoksalu, ponieważ przy 80 kg masie ciała maksymalne dzienne pobranie THI wynosi 240 mg. Przy założeniu średniej zawartości wody w organizmie wynoszącej 60% i całkowitej resorpcji THI z równomiernym rozkładem w całym ciele zapewniłoby to lokalne stężenie THI na poziomie 20 nM. Należy jednak pamiętać, że zróżnicowany lokalnie rozkład witaminy B6 może być bardzo istotny w działaniu THI w różnych częściach organizmu [5].