Otwarty dostęp

Fragile X syndrome and,-dependent diseases - Diagnostic scheme based on own experience

Aleksandra Landowska
Aleksandra Landowska
, 
Sylwia Rzońca
Sylwia Rzońca
, 
Jerzy Bal
Jerzy Bal
 oraz 
Monika Gos
Monika Gos
   | 12 kwi 2018
Journal of Mother and Child's Cover Image
O artykule
Poprzedni artykuł
Następny artykuł
Zacytuj
Data publikacji: 12 kwi 2018
Zakres stron: 22 - 32
Otrzymano: 29 lis 2017
Przyjęty: 19 gru 2017
DOI: https://doi.org/10.34763/devperiodmed.20182201.2232
© 2018 Aleksandra Landowska, Sylwia Rzońca, Jerzy Bal, Monika Gos, published by Sciendo
This work is licensed under the Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Ryc. 1

Analiza molekularna genu FMR1 pod kątem obecności mutacji dynamicznej z wykorzystaniem testu przesiewowego.Test przesiewowy wykonywany jest w oparciu o technikę PCR z wykorzystaniem starterów fluorescencyjnych (a). Produkty amplifikacji rozdzielane są w żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (b) lub w sekwenatorze kapilarnym (c). Technika umożliwia identyfikację alleli z zakresu prawidłowego oraz premutacji (do 130 powtórzeń CGG). Razem z próbkami badanymi (1-8) amplifikowane są kontrole (K1 – pełna mutacja, K2 – kontrola prawidłowa, żeńska, 20 i 30 powtórzeń CGG, K3 – kontrola, allel z zakresu „szarej strefy” męska (46 powtórzeń CGG). Oznaczenia: Wz – marker wielkości 1kb (ThermoFisher), „-” – allel z zakresu prawidłowego, p – allel z zakresu premutacji, m – allel z zakresu pełnej mutacji, M – płeć męska, K – płeć żeńska. Na rycinie podano liczbę powtórzeń CGG. Fig. 1. Molecular analysis of dynamic mutation in the FMR1 gene with pre-screening PCR test. The pre-screening test is performed with PCR technique and fluorescently labeled primers (a). The amplification products are resolved in agarose gels with ethidium bromide (b) or by capillary electrophoresis (c). The pre-screening test allows to identify normal or low (up to 130 CGG repeats) premutation alleles. Together with patient samples (1-8), the appropriate controls are amplified (K1 – full mutation, K2 – normal female control with 20 and 30 CGG repeats, K3 – “grey zone” (46 CGG repeats) male control). Legend: Wz – size marker 1kb (ThermoFisher), „-” – normal allele, p – premutation allele, m – full mutation allele, M – male, K – female. The number of CGG repeats is shown.
Analiza molekularna genu FMR1 pod kątem obecności mutacji dynamicznej z wykorzystaniem testu przesiewowego.Test przesiewowy wykonywany jest w oparciu o technikę PCR z wykorzystaniem starterów fluorescencyjnych (a). Produkty amplifikacji rozdzielane są w żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (b) lub w sekwenatorze kapilarnym (c). Technika umożliwia identyfikację alleli z zakresu prawidłowego oraz premutacji (do 130 powtórzeń CGG). Razem z próbkami badanymi (1-8) amplifikowane są kontrole (K1 – pełna mutacja, K2 – kontrola prawidłowa, żeńska, 20 i 30 powtórzeń CGG, K3 – kontrola, allel z zakresu „szarej strefy” męska (46 powtórzeń CGG). Oznaczenia: Wz – marker wielkości 1kb (ThermoFisher), „-” – allel z zakresu prawidłowego, p – allel z zakresu premutacji, m – allel z zakresu pełnej mutacji, M – płeć męska, K – płeć żeńska. Na rycinie podano liczbę powtórzeń CGG. Fig. 1. Molecular analysis of dynamic mutation in the FMR1 gene with pre-screening PCR test. The pre-screening test is performed with PCR technique and fluorescently labeled primers (a). The amplification products are resolved in agarose gels with ethidium bromide (b) or by capillary electrophoresis (c). The pre-screening test allows to identify normal or low (up to 130 CGG repeats) premutation alleles. Together with patient samples (1-8), the appropriate controls are amplified (K1 – full mutation, K2 – normal female control with 20 and 30 CGG repeats, K3 – “grey zone” (46 CGG repeats) male control). Legend: Wz – size marker 1kb (ThermoFisher), „-” – normal allele, p – premutation allele, m – full mutation allele, M – male, K – female. The number of CGG repeats is shown.

Ryc. 2

Metody wykorzystywane w diagnostyce zespołu łamliwego chromosomu X uwzględniające analizę metylacji w badanym regionie: hybrydyzacja typu Southern (A) i MS-MLPA (B). A) DNA trawione jest enzymami restrykcyjnymi (EcoRI i wrażliwy na metylację NruI) i rozdzielane w żelu agarozowym. Rozdzielony DNA przenoszony jest na membranę nitrocelulozową (transfer), a następnie prowadzona jest hybrydyzacja z sondą specyficzną dla locus FMR1. Kolejnym etapem jest detekcja sondy związanej z DNA i analiza wzoru prążków. Na obrazie widać dwa zakresy fragmentów DNA: pierwszy o wielkości ≥2,8kpz odpowiadający sekwencjom niemetylowanym (allele prawidłowe i z zakresu premutacji) oraz drugi ≥5,2kpz odpowiadający sekwencjom metylowanym (allele z zakresu mutacji, u kobiet dodatkowo fragmenty odpowiadające allelom znajdującym się na inaktywowanym chromosomie X). Oznaczenia: „-” – allel z zakresu prawidłowego, p – allel z zakresu premutacji, m – allel z zakresu pełnej mutacji, M – płeć męska, K – płeć żeńska. B) Metoda MS-MLPA jako modyfikacja klasycznej metody MLPA, umożliwia jednoczesną ocenę liczby kopii badanego regionu i analizę metylacji; technika wykorzystuje działanie metylowrażliwego enzymu restrykcyjnego HhaI – sekwencje niemetylowane są trawione enzymem restrykcyjnym, co uniemożliwia ligację sond specyficznych względem badanego regionu i skutkuje brakiem produktu amplifikacji. Badanie, wiarygodne jedynie w przypadku pacjentów płci męskiej, prowadzone jest z wykorzystaniem zestawu ME029 zawierającego m.in. sondy specyficzne dla genu FMR1. U osób płci męskiej z prawidłowym allelem (kontrola), gen FMR1 jest niemetylowany co jest równoznaczne z brakiem sygnału dla wybranych sond (strzałki). U pacjentów z pełną mutacją, gen jest metylowany, w związku z czym obserwuje się sygnał dla sond specyficznych względem genu FMR1 (w tym przypadku mamy do czynienia z mozaiką metylacyjną – metylowanych jest ok. 50% alleli)Fig. 2. Techniques used in the molecular diagnosis based on the methylation analysis of the examined region: Southern blotting (A) and MS-MLPA (B). A) DNA is digested with restriction enzymes (EcoRI and methylation-sensitive NruI), resolved in agarose gel and then transferred to the nitrocellulose membrane. Next the hybridization is performed with probe specific for FMR1 locus. Finally, the probe detection, visualization and analysis of band pattern are performed. The hybridization signals two ranges of DNA fragments are present: first ≥2,8kbp that corresponds to unmethylated sequences (normal and premutation alleles) and second ≥5.2kbp that corresponds to methylated sequences (full mutation alleles, in females DNA fragments that match to alleles on inactivated X chromosome). Legend: „-” – normal allele, p – premutation allele, m – full mutation allele, M – male, K – female. B) MS-MLPA analysis as a modification of classic MLPA technique allows to identify copy number variation and methylation defects in single reaction; this technique uses HhaI – a methyl-sensitive restriction enzyme that digests unmethylated DNA. Therefore, the probes specific for the examined region cannot bind to their target sequences and be amplified. The analysis with MS-MLPA and ME029 kit, that contains probes specific for FMR1 gene, is only reliable in male patients. In male patients with normal allele (control), the FMR1 gene is unmethylated therefore there is no amplification for probes specific to methylated FMR1 sequences (indicated by arrows). In patients with full mutation, the FMR1 gene is usually methylated, so amplification of specific probes is present. In presented case, the methylation mosaicism is present (about 50% of methylated alleles).
Metody wykorzystywane w diagnostyce zespołu łamliwego chromosomu X uwzględniające analizę metylacji w badanym regionie: hybrydyzacja typu Southern (A) i MS-MLPA (B). A) DNA trawione jest enzymami restrykcyjnymi (EcoRI i wrażliwy na metylację NruI) i rozdzielane w żelu agarozowym. Rozdzielony DNA przenoszony jest na membranę nitrocelulozową (transfer), a następnie prowadzona jest hybrydyzacja z sondą specyficzną dla locus FMR1. Kolejnym etapem jest detekcja sondy związanej z DNA i analiza wzoru prążków. Na obrazie widać dwa zakresy fragmentów DNA: pierwszy o wielkości ≥2,8kpz odpowiadający sekwencjom niemetylowanym (allele prawidłowe i z zakresu premutacji) oraz drugi ≥5,2kpz odpowiadający sekwencjom metylowanym (allele z zakresu mutacji, u kobiet dodatkowo fragmenty odpowiadające allelom znajdującym się na inaktywowanym chromosomie X). Oznaczenia: „-” – allel z zakresu prawidłowego, p – allel z zakresu premutacji, m – allel z zakresu pełnej mutacji, M – płeć męska, K – płeć żeńska. B) Metoda MS-MLPA jako modyfikacja klasycznej metody MLPA, umożliwia jednoczesną ocenę liczby kopii badanego regionu i analizę metylacji; technika wykorzystuje działanie metylowrażliwego enzymu restrykcyjnego HhaI – sekwencje niemetylowane są trawione enzymem restrykcyjnym, co uniemożliwia ligację sond specyficznych względem badanego regionu i skutkuje brakiem produktu amplifikacji. Badanie, wiarygodne jedynie w przypadku pacjentów płci męskiej, prowadzone jest z wykorzystaniem zestawu ME029 zawierającego m.in. sondy specyficzne dla genu FMR1. U osób płci męskiej z prawidłowym allelem (kontrola), gen FMR1 jest niemetylowany co jest równoznaczne z brakiem sygnału dla wybranych sond (strzałki). U pacjentów z pełną mutacją, gen jest metylowany, w związku z czym obserwuje się sygnał dla sond specyficznych względem genu FMR1 (w tym przypadku mamy do czynienia z mozaiką metylacyjną – metylowanych jest ok. 50% alleli)Fig. 2. Techniques used in the molecular diagnosis based on the methylation analysis of the examined region: Southern blotting (A) and MS-MLPA (B). A) DNA is digested with restriction enzymes (EcoRI and methylation-sensitive NruI), resolved in agarose gel and then transferred to the nitrocellulose membrane. Next the hybridization is performed with probe specific for FMR1 locus. Finally, the probe detection, visualization and analysis of band pattern are performed. The hybridization signals two ranges of DNA fragments are present: first ≥2,8kbp that corresponds to unmethylated sequences (normal and premutation alleles) and second ≥5.2kbp that corresponds to methylated sequences (full mutation alleles, in females DNA fragments that match to alleles on inactivated X chromosome). Legend: „-” – normal allele, p – premutation allele, m – full mutation allele, M – male, K – female. B) MS-MLPA analysis as a modification of classic MLPA technique allows to identify copy number variation and methylation defects in single reaction; this technique uses HhaI – a methyl-sensitive restriction enzyme that digests unmethylated DNA. Therefore, the probes specific for the examined region cannot bind to their target sequences and be amplified. The analysis with MS-MLPA and ME029 kit, that contains probes specific for FMR1 gene, is only reliable in male patients. In male patients with normal allele (control), the FMR1 gene is unmethylated therefore there is no amplification for probes specific to methylated FMR1 sequences (indicated by arrows). In patients with full mutation, the FMR1 gene is usually methylated, so amplification of specific probes is present. In presented case, the methylation mosaicism is present (about 50% of methylated alleles).

Ryc. 3

Analiza molekularna genu FMR1 z wykorzystaniem metody TP-PCR: schemat reakcji i przykładowe wyniki analizy. Jako kontrola wykorzystywana jest mieszania fragmentów odpowiadających allelom z zakresu prawidłowego (18, 30 i 32 powtórzenia CGG), premutacji (56, 86 i 116 powtórzeń CGG) i pełnej mutacji. Oznaczenia: K – płeć żeńska, M – płeć męskaFig. 3. Molecular analysis of FMR1 gene with TP-PCR method: the reaction scheme and examples of analysis results. As a control, a mixture of fragments corresponding to normal (18, 30 and 32 CGG repeats), premutation (56, 86 and 116 CGG repeats) and full mutation alleles. Legend: K – female, M – male
Analiza molekularna genu FMR1 z wykorzystaniem metody TP-PCR: schemat reakcji i przykładowe wyniki analizy. Jako kontrola wykorzystywana jest mieszania fragmentów odpowiadających allelom z zakresu prawidłowego (18, 30 i 32 powtórzenia CGG), premutacji (56, 86 i 116 powtórzeń CGG) i pełnej mutacji. Oznaczenia: K – płeć żeńska, M – płeć męskaFig. 3. Molecular analysis of FMR1 gene with TP-PCR method: the reaction scheme and examples of analysis results. As a control, a mixture of fragments corresponding to normal (18, 30 and 32 CGG repeats), premutation (56, 86 and 116 CGG repeats) and full mutation alleles. Legend: K – female, M – male

Ryc. 4

Schemat postępowania diagnostycznego w przypadku podejrzenia FXS, FXTAS lub FXPOI.Fig. 4. The diagnostic workflow in case of clinical suspicion of FXS, FXTAS or FXPOI.
Schemat postępowania diagnostycznego w przypadku podejrzenia FXS, FXTAS lub FXPOI.Fig. 4. The diagnostic workflow in case of clinical suspicion of FXS, FXTAS or FXPOI.

The summary of molecular methods used in Fragile X syndrome molecular diagnosis.Tabela I. Podsumowanie metod molekularnych stosowanych w diagnostyce zespołu łamliwego chromosomu X.

Metoda Technique PCR PCR PCR+GeneScan PCR+GeneScan Hybrydyzacja Hybridization TP-PCR TP-PCR MS-MLPA MS-MLPA MS-TP-PCR MS-TP-PCR PCR-HRM PCR-HRM NGS (PacBio) NGS (PacBio)
Ilość DNA DNA amount min. 50ng min. 50ng 10 ug 20 - 80ng 50-200ng 160 ng 100ng >1.2pg
Metoda przesiewowa Pre-screening test + + - - - - + -
Dokładne określenie liczby powtórzeń CGG Assessment of CGG repeat number - + (<130) - + (<200) - + (<200) - +
Analiza metylacji Methylation analysis - - + - + + - ?
Oznaczenie liczby przerw AGG The number of AGG breaks - - - + - - - +
Analiza mozaikowości somatycznej Analysis of somatic mosaicism - - + + - + - +
Analiza mozaikowości metylacyjnej Analysis of methylation mosaicism - - + - + + - ?
eISSN:
2719-535X
Język:
Angielski
Częstotliwość wydawania:
Volume Open
Dziedziny czasopisma:
Medicine, Clinical Medicine, Pediatrics and Juvenile Medicine, Paediatric Haematology and Oncology, Public Health
Kanał RSS czasopisma