This work is licensed under the Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
Potranslacyjne modyfikacje białek
Łańcuch nukleotydowy o długości 150 par zasad potencjalnie może kodować 10195 różnychbiałek. Liczba ta wynika jedynie z jego długości [35]. Różnorodność białek istotnie wzrasta na poziomie translacji, co jest efektem m.in. wykorzystania aminokwasów niekanonicznych: selenocysteiny, selenometioniny oraz pirolizyny [116]. Ponadto znaczącą część proteomu tworzą białka, których łańcuch/y boczny/e ulega/ją potranslacyjnym modyfikacjom (PTM; Post-Translational Modification). Z ponad 200 zidentyfikowanych do tej pory chemicznych modyfikacji białek do najczęściej spotykanych należą: fosforylacja, glikozylacja, acylacja, metylacja, acetylacja, oksydacja, hydroksylacja, deaminacja oraz tworzenie wiązania dwusiarczkowego [54]. PTM wpływają na strukturę białek, regulują ich aktywność enzymatyczną i interakcje z innymi molekułami. Wykazano, że około jedna trzecia białek występujących w komórkach ssaków zawiera kowalencyjnie związane fosforany, których poziom jest kontrolowany przez aktywność kinaz i fosfataz białkowych. Fosforylacja umożliwia kontrolę różnych procesów komórkowych, w tym cyklu komórkowego, wzrostu, apoptozy. Jest również istotnym elementem transdukcji sygnałów.
Niniejsza publikacja traktuje o glikozylacji – jednej z najbardziej rozpowszechnionych potranslacyjnych modyfikacji białek. Chociaż jej znaczenie w komórkach organizmów eukariotycznych było, i nadal jest, źródłem intensywnych badań, glikozylacja u prokariotów stosunkowo niedawno zwróciła uwagę społeczności naukowej. Odkrycie glikoprotein u bakterii przyniosły dopiero lata 70. XX wieku [83]. Różnorodność białek prokariotycznych modyfikowanych przez dołączenie grup cukrowych wskazuje jednak, że glikozylacja w tych organizmach jest raczej normą niż wyjątkiem.
Glikozylacja – charakterystyka
Glikozylacja białek polega na enzymatycznym przyłączaniu glikanu do określonych reszt aminokwasowych polipeptydu. Do tej pory opisano cztery jej rodzaje: O-glikozylację, N-glikozylację, S-glikozylację oraz C-mannozylację [10]. Przyłączenie jednostki cukrowej do atomu tlenu grupy hydroksylowej w bocznym łańcuchu seryny (Ser) i/lub treoniny (Thr) ma miejsce w przypadku O-glikozylacji. Dołączenie reszty cukrowej do azotu grupy aminowej asparaginy charakteryzuje natomiast N-glikozylację. Warunkiem koniecznym jest obecność asparaginy (Asn) w obrębie sekwencji konsensusowej Asn-X-Ser/Thr, gdzie X to dowolny aminokwas z wyjątkiem proliny. W przypadku komórek Campylobacter wykazano, że w pozycji – 2 od modyfikowanej asparaginy musi dodatkowo występować kwasowy aminokwas, tj. kwas glutaminowy (Glu) lub kwas asparaginowy (Asp) [63]. Opisano również S-glikozylację, w której grupa cukrowa wiąże się z cysteiną, oraz występującą tylko u ssaków C-mannozylację, którą cechuje dołączenie mannozy do atomu węgla C2 grupy indolowej tryptofanu poprzez wiązanie C-C [83, 97]. Jak dotąd S-glikozylowane białka opisano w komórkach m.in. Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis czy Enterococcus faecalis [79, 85, 108]. W glikoproteinach zidentyfikowanych w obrębie Bacteria i Archaea dominuje typ wiązania O-glikozydowego.
Glikoproteiny charakteryzuje ogromna różnorodność, co w dużej mierze wynika z właściwości monosacharydów budujących grupy cukrowe. Mogą one występować w różnych postaciach epimerycznych (glukoza, mannoza i galaktoza), ulegać dodatkowym modyfikacjom polegającym na przyłączeniu grup siarczanowych, acetylowych czy fosforanowych, jak również łączyć się ze sobą na wiele sposobów (zarówno pod względem pozycji, jak i stereochemii wiązania). Olbrzymią różnorodność warunkuje także zdolność cukrów do tworzenia rozgałęzień, a to sprawia, że glikany związane z białkami są unikalne pod względem składu i/lub architektury, zatem idealnie nadają się do przechowywania szerokiego zestawu informacji biologicznych i biorą aktywny udział w komunikacji międzykomórkowej [27].
Ustalenie budowy cukrowego składnika glikoprotein nie jest łatwym zadaniem. Dopiero pojawienie się zaawansowanych technik analitycznych, w tym jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR) i wariantów spektrometrii masowej (MS) umożliwiło gwałtowny rozwój glikoproteomiki [32].
Glikozylacja białek w komórkach organizmów eukariotycznych
Glikoproteiny mają olbrzymie znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania komórek eukariotycznych. Szacunki mówią, że stanowią one połowę proteomu [44], a 90% z nich zawiera jednostkę cukrową przyłączoną do atomu azotu asparaginy. Obecność reszt cukrowych w strukturze białka zmienia jego właściwości fizyczne, w tym rozmiar, kształt, stopień sfałdowania, rozpuszczalność i ładunek elektryczny. Biologiczna rola tak zmodyfikowanych białek jest niezwykle istotna w procesach rozwoju, wzrostu i funkcji organizmu. Obecność grup cukrowych chroni białka przed proteolizą i decyduje o czasie ich eliminacji przez wątrobę. Glikozylacja, obok wpływu na sekrecję i sortowanie białek, jest także ważna dla mechanizmu wzajemnego rozpoznawania się komórek oraz dla modulowania aktywności różnych enzymów, receptorów błonowych, transporterów, czynników wzrostu i hormonów [19, 23].
Glikany biorą udział w prawie każdym aspekcie wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej. Glikozylacji ulegają m.in. białka głównego układu zgodności tkankowej (MHC, Major Histocompatibility Complex) oraz wszystkie przeciwciała w konserwowanych pozycjach ich łańcuchów ciężkich. Odkryto, że zmiany we wzorze glikozylacji fragmentu Fc (fragment, crystallizable) przeciwciała IgG są istotne w procesie starzenia, a także wielu chorobach autoimmunologicznych i nowotworowych [39, 117]. Nieprawidłowości w glikozylacji przeciwciał towarzyszą reumatoidalnemu zapaleniu stawów (RA, Rheumatoid Arthritis) [16], a wrodzone niedobory glikozylacji białek (CDG, Congenital Disorder of Glycosylation) prowadzą do wystąpienia chorób metabolicznych o różnorodnych objawach i zaburzają funkcje wielu układów i narządów [31]. Większość ze 130 opisanych jak dotąd chorób związanych z defektami enzymów na drodze syntezy glikanów jest dziedziczona w sposób autosomalny recesywny. Główne skutki zaburzeń glikozylacji to opóźnienie wzrostu i rozwoju, hipotonia, dysmorfie twarzy, zaburzenia krzepnięcia krwi i nieprawidłowości układu hormonalnego [15]. Znaczenie tej modyfikacji białek u ludzi podkreśla fakt, że eksperymentalne zablokowanie N-glikozylacji u zwierząt laboratoryjnych jest letalne na wczesnych etapach życia płodowego [89].
W komórkach eukariotycznych proces N-glikozylacji rozpoczyna się w obrębie retikulum endoplazmatycznego (RE). Do difosforanu dolicholu – lipidowego nośnika osadzonego w błonie RE, od strony cytozolowej przyłączany jest rdzeń heptasacharydowy złożony z 5 mannoz i 2 reszt N-acetyloglukozaminy (GlcNAc). W kolejnym etapie ma miejsce odwrócenie orientacji lipidowego nośnika i dobudowanie, już od strony światła RE, kolejnych monosacharydów. Powstały glikan przenoszony jest na docelowe reszty asparaginy syntetyzowanego białka przy udziale związanego z błoną RE kompleksu białek transmembranowych – transferazy oligosacharydowej (OST, oligosaccharyltransferase). Za enzymatyczną aktywność tego kompleksu białkowego odpowiedzialne jest Stt3p – białko o silnie konserwowanej sekwencji aminokwasowej [60]. N-glikozylowane białko kierowane jest następnie do aparatu Golgiego, gdzie glikan jest dalej przebudowywany przez dodawanie i/lub usuwanie poszczególnych reszt cukrowych, co gwarantuje różnorodność strukturalną [2].
Aparat Golgiego oraz RE to miejsca, w których odbywa się również O-glikozylacja. Proces ten najczęściej zaczyna się od przyłączenia N-acetylogalaktozaminy (GalNAc) do reszt seryny/treoniny. Do niej dobudowywane są kolejne monosacharydy [19]. Przykładem modyfikowanych w ten sposób białek są mucyny, fetuina oraz gonadotropiny [99].
Glikozylacja białek u bakterii
Bakterie syntetyzują rozmaite glikokoniugaty. Są to, występujące zarówno u bakterii Gram-ujemnych jak i Gram-dodatnich, peptydoglikan, otoczki polisacharydowe, egzopolisacharyd, czy też charakterystyczne tylko dla jednej z tych grup bakterii: lipopolisacharyd i lipooligosacharyd (Gram-ujemne) oraz kwasy tejchojowe i lipotejchojowe (Gram-dodatnie). Dzięki powierzchniowej lokalizacji i ogromnej różnorodności tworzą one unikalny „kod kreskowy” na powierzchni bakterii, a tym samym pośredniczą w specyficznych interakcjach z otoczeniem. Wiele z tych struktur w przypadku mikroorganizmów chorobotwórczych jest wykorzystywana jako MAMP (Microbe-Associated Molecular Patterns) i pełni kluczową rolę w modulowaniu działania układu immunologicznego.
Do roku 1999 w glikoproteinach zidentyfikowanych w obrębie domeny Bacteria stwierdzano wyłącznie obecność wiązania O-glikozydowego. Okazało się jednak, że w skład proteomów bakteryjnych wchodzą także N-glikoproteiny. Pierwszą bakterią, u której opisano szlak N-glikozylacji, był Campylobacter jejuni, przedstawiciel Epsilonproteobacteria [101, 115]. Dziś wiadomo, że niemal wszystkie bakterie należące do Epsilonproteobacteria (m.in. Helicobacter, Wolinella, Nitratiruptor), podobnie jak Campylobacter posiadają przynajmniej jeden ortolog transferazy oligosacharydowej (OST), enzymu potrzebnego do przeprowadzenia tej modyfikacji. Takie enzymy wykryto również u przedstawicieli Deltaproteobacteria (np. Desulfovibrio), co wskazuje, że system ten jest dużo bardziej powszechny niż początkowo sądzono [83].
Struktura glikanu przyłączonego do białka zależy od zestawu enzymów obecnych w komórce, w której zachodzi modyfikacja. W dobudowywaniu łańcucha oligosacharydowego mogą brać udział hydrolazy, glikozydazy, acetylazy, ale największe znaczenie mają glikozylotransferazy (GT), o czym świadczy ich rozpowszechnienie. Szacunki wskazują, że stanowią one od 1 do 3% wszystkich białek proteomu bakteryjnego. Aktualna klasyfikacja obejmuje 110 rodzin wyodrębnionych na podstawie rodzaju przenoszonego cukru, np. galaktozylotransferazy, mannozylotransferazy [72]. Do utworzenia wiązania glikozydowego określonego typu potrzebna jest zatem konkretna glikozylotransferaza. Miejscem ich działania jest cytoplazma a substratami zaktywowane nukleotydocukry. Produkt działania jednej glikozylotransferazy staje się akceptorem dla następnej, w wyniku czego dochodzi do wydłużenia oligosacharydu. Syntetyzowane glikany są zwykle dość proste, co oznacza, że składają się z jednego rodzaju lub kilku różnych monosacharydów. Po zsyntetyzowaniu glikoproteiny są transportowane przez błonę cytoplazmatyczną. Ten sposób tworzenia glikanu nazwano glikozylacją sekwencyjną (Ryc. 1A) [105]. Nieco inny przebieg ma glikozylacja blokowa (glikozylacja en-bloc). Wówczas, w wyniku aktywności glikozylotransferaz, na nośniku lipidowym, jakim jest zakotwiczony w błonie cytoplazmatycznej difosforan undekaprenylu, powstaje jednostka oligosacharydowa, która następnie w całości zostaje przeniesiona na łańcuch białkowy. Składanie glikanu zachodzi od strony cytoplazmatycznej, po czym struktura ta ulega odwróceniu, a transfer grupy cukrowej na białko, będący wynikiem aktywności transferazy oligosacharydowej (OST), zachodzi w peryplazmie (Ryc. 1B) [105].
Ryc. 1.
Schemat przedstawiający przebieg glikozylacji
Na rycinie przedstawiono przebieg glikozylacji sekwencyjnej (A) oraz en block (B). Skróty: GT – glikozylotranferaza; UDP – urydynodifosforan; OST – transferaza oligosacharydowa.
Jeszcze do niedawna uważano, że według mechanizmu sekwencyjnego powstają O-glikoproteiny, natomiast mechanizm blokowy, a więc również obecność OST, jest typowy dla N-glikozylacji. Aktualna wiedza wskazuje, że możliwa jest także N-glikozylacja sekwencyjna. Została ona opisana dla białka HMW1C Haemophilus influenzae [37] oraz w komórkach Actinobacillus pleuropneumoniae [95]. W ostatnich latach u przedstawicieli rodzaju Neisseria opisano także O-glikozylację wg. mechanizmu en bloc [105]. Przykłady białek glikozylowanych w mechanizmie zależnym i niezależnym od OST przedstawiono w tabeli I.
Przykłady białek N- i O-glikozylowanych w mechanizmie zależnym i niezależnym od obecności transferazy oligosacharydowej
Dominującym typem glikozylacji w świecie organizmów prokariotycznych jest glikozylacja typu O. Występuje w komórkach wielu gatunków bakterii, z których duża część to organizmy chorobotwórcze (np. Neisseria, Borrelia, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus, Campylobacter i in.). Podlegają jej przede wszystkim białka powierzchniowe, będące jednocześnie istotnymi czynnikami wirulencji (piliny, flageliny, adhezyny).
O-glikozylacji niezależnej od obecności transferazy oligosacharydowej (OST) ulega głównie flagelina, białko budujące włókna rzęski bakteryjnej, a więc struktury potrzebne komórce bakteryjnej do poruszania się. Szczególną rolę pełnią one u bakterii patogennych – ich brak często uniemożliwia kolonizację tkanek gospodarza. W toku ewolucji u organizmów wyższych powstały mechanizmy umożliwiające rozpoznawanie białkowych monomerów budujących włókno rzęski, co wskazuje na jej istotne znaczenie jako czynnika wirulencji.
Systemy glikozylacji flageliny odnaleziono u wielu bakterii Gram-ujemnych oraz Gram-dodatnich rodzajów Clostridium i Listeria [104]. Wykazują one bardzo dużą różnorodność, co objawia się m.in. w liczbie miejsc akceptorowych czy budowie przyłączanych glikanów. Na przykład Listeria monocytogenes glikozyluje flagelinę tylko w jednym miejscu, a w przypadku Campylobacter przyłączony składnik cukrowy może stanowić nawet 10% masy tego białka. W komórkach C. jejuni do flageliny FlaA może bowiem zostać dołączonych aż 19 grup cukrowych, co czyni ją jednym z najmocniej zmodyfikowanych w ten sposób, zidentyfikowanych do tej pory, białek [103]. Mechanizm przyłączenia glikanu wydaje się bardziej zależeć od dostępności seryny lub treoniny na powierzchni pofałdowanego białka, aniżeli od określonej sekwencji konsensusowej. Badania techniką spektometrii mas wykazały, że glikany są przyłączane w centralnym, wysoko zmiennym regionie flageliny i są eksponowane do środowiska [103].
Większość szczepów z niedoborem glikozylacji nie jest w stanie wytworzyć funkcjonalnej rzęski; wydaje się więc, że glikan umożliwia złożenie struktury i zapewnia jej stabilność [71, 83]. Inaczej jest u Pseudomonas aeruginosa. Modyfikacja ta nie wpływa bowiem ani na powstawanie rzęski, ani na ruchliwość komórek Pseudomonas. Odnotowano natomiast, że glikozylowana flagelina, w porównaniu do białka pozbawionego tej modyfikacji, wywołuje znacznie wyższą odpowiedź immunologiczną, a szczepy Pseudomonas z niedoborem glikozylacji mają obniżoną zjadliwość [6, 109].
W komórkach Campylobacter występuje jeden z lepiej zbadanych systemów O-glikozylacji flageliny. Glikany przyłączane do tego białka to jednostki monosacharydowe składające się z jednego z dwóch rzadkich 9-węglowych cukrów, pochodnych kwasu sjalowego: kwasu pseudaminowego (Pse5Ac7Ac, kwas 5,7-diacetamido-3,5,7,9-tetradeoksy-L-manno-nonulosonowy) lub kwasu legionaminowego (Leg5Am7Ac, kwas 5-acetamidyno-7-acetamido-3,5,7,9-tetradeoksyD-glicero-D-galakto-nonulosonowy), które mogą być dodatkowo modyfikowane przez dołączenie np. grupy acetylowej, acetamidynowej czy N-acetyloglutaminy [36]. Szczepy Campylobacter mogą produkować oba te cukry, albo tylko jeden z nich, co oczywiście zależy od zestawu posiadanych genów w obrębie locus O-glikozylacji. Region ten charakteryzuje się dużą zmiennością. Tak na przykład w komórkach C. jejuni NCTC11168 obejmuje on blisko 50 genów, natomiast w obrębie locus O-glikozylacji szczepu 81–176, należącego do tego samego gatunku, znajdują się tylko 24 geny [41]. Oprócz genów biorących udział w biosyntezie kwasu pseudoaminowego (geny neu, neuraminic acid genes) [17, 93] i/lub genów zaangażowanych w biosyntezę kwasu legionaminowego (geny ptm, post-translational modification genes) [94] w obrębie tego regionu występują m.in. geny rodziny 1318 (maf, motility accessory factor), geny rodziny 617 oraz geny kodujące podjednostki strukturalne flageliny FlaA i FlaB [87]. Zarówno geny rodziny 1318 jak i 617 mogą podlegać zmienności fazowej: zawierają w swej sekwencji nukleotydowej powtórzenia, tzw. nieprzewidywalne loci, których obecność doprowadza do poślizgu polimerazy w trakcie replikacji [59, 106]. Może to powodować zmiany strukturalne w glikoproteinach rzęsek.
Glikozylacja flageliny w komórkach Campylobacter ma znaczenie dla jej struktury i właściwości immunogennych. Jest niezbędna do biosyntezy funkcjonalnych rzęsek, co umożliwia kolonizację przewodu pokarmowego gospodarza, warunkuje autoaglutynację, formowanie biofilmu, jak również sekrecję czynników wirulencji [29, 40, 67, 77, 103]. Różne rodzaje składników cukrowych na powierzchni flageliny Campylobacter umożliwiają specyficzne oddziaływanie komórek tego patogenu ze środowiskiem bądź z organizmem gospodarza [47, 100]. Odporność wrodzona działa w oparciu o istnienie receptorów PRR (Pattern Recognition Receptors), rozpoznających struktury drobnoustrojów zwane PAMP (Pathogen Associated Molecular Patterns). Jednym z przedstawicieli PRR są receptory TLR (Toll-like receptor), które odgrywają główną rolę w rozpoznaniu zagrożenia i inicjacji odpowiedzi immunologicznej. Za rozpoznawanie flageliny odpowiedzialny jest receptor TLR5. W odróżnieniu do większości flagelin bakteryjnych, flagelina Campylobacter nie jest zdolna do aktywacji receptora TLR5, a zatem unika rozpoznania przez wrodzony układ odpornościowy. Stwierdzono jednak, że glikozylacja flageliny nie odgrywa roli w mechanizmie unikania odporności [24].
O-glikozylacji często podlega białko budujące pilusy typu IV. Przykładem jest pilina chorobotwórczych gatunków Neisseria, Neisseria meningitidis i Neisseria gonorrhoeae [64, 110]. Pilusy Neisseria to struktury, które odgrywają rolę w agregacji, ruchliwości, przylganiu i inwazji do komórek gospodarza, tworzeniu biofilmu i modulowaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza [76]. Stwierdzono, że glikozylacja piliny N. gonorrhoeae ma kluczowe znaczenie dla skutecznego zakażenia szyjki macicy [53]. Glikozylotransferazy (np. PglA) Neisseria mogą podlegać zmienności fazowej. Prowadzi to do powstania wielu glikoform piliny, czego efektem jest zdolność patogenu do unikania odpowiedzi odpornościowej gospodarza [11]. Badania ostatniej dekady wykazały, że N. gonorrhoeae, oprócz piliny, jest w stanie glikozylować co najmniej 19 białek. Niektóre z nich stanowią składniki pomp efflux, których działanie polega na aktywnym wypompowywaniu różnych substancji antybakteryjnych z komórki (m.in. antybiotyków, barwników, detergentów, toksyn) [4, 5, 110]. W komórkach Neisseria glikozylacja może przebiegać z udziałem transferazy oligosacharydowej [5, 64, 90]. Enzymy te zostały zidentyfikowane również w genomach Burkholderia [69] i Acinetobacter [51]. Zaobserwowano, że glikozylacja zachodzi w regionach białka bogatych w reszty alaniny, seryny i proliny, wciąż jednak nie jest znany motyw rozpoznawany przez ten enzym.
N-glikozylacja w komórkach bakteryjnych
Identyfikacja N-glikozylowanych białek w komórkach bakterii była dość nieoczekiwanym odkryciem. Genomika porównawcza pokazała jednak, że systemy glikozylacji białek są znacznie bardziej powszechne, niż wcześniej sądzono. Campylobacter jejuni to mikroorganizm z najlepiej poznanym i opisanym systemem N-glikozylacji oraz pierwsza bakteria, której system został w pełni odtworzony w Escherichia coli [112].
C. jejuni jest czynnikiem etiologicznym stanów zapalnych jelit u ludzi. Większość przypadków kampylobakteriozy jest wynikiem spożycia zanieczyszczonego tymi bakteriami, nieodpowiednio przygotowanego mięsa drobiowego. Znacząca część stosunkowo małego genomu (ok. 1,6 Mbp) tego gatunku bakterii związana jest z biosyntezą glikanów, co powoduje, że komórki Campylobacter charakteryzuje dość duży repertuar glikokoniugatów. Na ich powierzchni występują lipooligosacharydy (LOS), z których niektóre imitują budowę ludzkich glikolipidów, peptydoglikan, polisacharydy otoczkowe (CPS) ze złożonymi i nietypowymi cukrami i, jak mówią szacunki, ponad 70 białek, które są potranslacyjnie modyfikowane poprzez przyłączenie N-glikanów [14, 83].
Geny kodujące enzymy uczestniczące w procesie N-glikozylacji są konserwowane i tworzą tzw. locus pgl. U C. coli i C. lari – gatunków najbliżej spokrewnionych z C. jejuni, klaster genów pgl wygląda niemal identycznie. Organizacja tego regionu w genomach C. upsaliensis, C. fetus i C. curvus charakteryzuje większa różnorodność. U gatunków tych pomiędzy pglD i pglE stwierdzono otwarte ramki odczytu (ORF; open reading frame), których produkty prawdopodobnie nie uczestniczą w procesie N-glikozylacji białek. W genomach C. gracilis, C. hominis, C. fetus, C. rectus, C. showae i C. curvus dodatkowe ORF-y kodują prawdopodobnie glikozylotransferazy i enzymy zaangażowane w biosyntezę oligosacharydów. Natomiast niektóre gatunki Campylobacter, np. C. concisus, C. curvus i C. gracilis posiadają dwa ortologi genów pglB, zlokalizowane w obrębie locus pgl (C. concisus, C. curvus) lub poza nim (C. gracilis) [55].
W komórkach C. jejuni struktura glikanu jest formowana w ciągu reakcji katalizowanych przez glikotransferazy, gdzie donorami są cukry związane z urydyno-5’-fosforanem (UDP), a kolejne elementy są przenoszone na Und-PP (difosforanu undekaprenylu) [61]. W pierwszym etapie, w wyniku działania trzech enzymów PglF, PglE i PglD, które przeprowadzają odpowiednio reakcje dehydratacji, transaminacji oraz transacetylacji, z UDP-GlcNAc powstaje 2,4-diacetamino-2,4,6-trideoksy-α-D-glukoza, nazywana inaczej UDP-2,4-diacetaminobacillozaminą (UDP-diNAcBac). Glikozylotransferaza, PglC, przyłącza powstałą UDP-diNAcBac do nośnika lipidowego, zakotwiczonego w błonie wewnętrznej od strony cytoplazmy, w wyniku czego powstaje diNAcBac-α1-PPUnd. Potem następuje seria reakcji przeniesienia GalNAc (N-acetylogalaktozaminy) katalizowanych przez glikozylotransferazy PglA, PglJ i PglH, czego efektem jest wydłużenie łańcucha glikanowego (Und--PP-Bac2,4diNAc-(GalNAc)5) [34]. PglH zachowuje się w tym procesie jak polimeraza, dodając trzy kolejne cząsteczki GalNAc do tworzonego glikanu, łączone wiązaniami 1,4-glikozydowymi. Ostatnim etapem biosyntezy heptasacharydu, katalizowanej przez PglI, jest przyłączenie β-1,3-glukozy do jednej z reszt GalNAc [55, 81]. Schemat procesu N-glikozylacji w komórkach Campylobacter przedstawia Ryc. 2. Powstały oligosacharyd (LLO; lipid-linked oligosaccharide) transportowany jest przez wewnętrzną błonę do przestrzeni peryplazmatycznej przez ATP-zależną flipazę PglK [3, 88]. Za przeniesienie oligosacharydu na docelowe białko odpowiada natomiast transferaza oligosacharydowa PglB [112] – homolog podjednostki Stt3p wchodzącej w skład OST u drożdży [60]. W komórkach Campylobacter modyfikowana jest asparagina występująca w motywach Asp/Glu-X1-Asn-X2-Ser/Thr, gdzie X1 i X2reprezentują dowolny aminokwas z wyjątkiem proliny [63]. Motyw akceptorowy musi jednak znajdować się na powierzchni białka, w regionie nieuporządkowanym. Bakteryjna transferaza oligosacharydowa, w odróżnieniu od eukariotycznej, jest w stanie transportować glikany na pofałdowane białka [62, 70].
Ryc. 2.
Schemat szlaku N-glikozylacji u C. jejuni
Organizmy eukariotyczne przeprowadzają kontrolę jakości N-glikoprotein; glikany są dalej modyfikowane lub przycinane w ER i aparacie Golgiego. Przez długi czas uważano, że taka kontrola i przebudowa nie występują w komórkach organizmów prokariotycznych. W ostatnich latach jednak w komórkach Campylobacter zaobserwowano, że glikan może być modyfikowany przez dołączenie fosfoetanolaminy, który to proces jest katalizowany przez transferazę EptC [22, 96].
Znaczenie procesu N-glikozylacji w komórkach mikroorganizmów nie zostało jak dotąd dokładnie wyjaśnione. Jednak, podobnie jak w przypadku organizmów eukariotycznych, oligosacharydowe grupy mogą wywierać wpływ na strukturę i funkcję białka modyfikowanego przez ich dołączenie. Wyniki wielu badań wskazują, że mogą mieć one znaczenie w interakcji z komórkami gospodarza lub otaczającym środowiskiem – pełnią one rolę determinant antygenowych i uczestniczą w zjawiskach biologicznego rozpoznawania i adhezji. Tak na przykład Campylobacter ze zinaktywowanym locus N-glikozylacji wykazuje obniżoną adhezję i inwazyjność do linii komórek jelitowych. Zaobserwowano również, że brak glikozylacji wpływa na ograniczenie kolonizacji jelit kurcząt [1, 45, 58, 73]. Badania van Sorge’a pokazują, że N-glikozylacja u C. jejuni może prowadzić do zmiany odpowiedzi immunologicznej gospodarza w kontakcie z patogenem. Odkryto, że przyłączony heptasacharyd jest rozpoznawany przez lektynę MGL (macrophage galactose binding lectin). Receptor ten jest zaangażowany w wiązanie glikozylowanych antygenów, ich obróbkę oraz indukcję sygnałów modyfikujących aktywność komórek układu odpornościowego. MGL rozpoznaje zarówno glikoproteiny C. jejuni jak i lipooligosacharydy z przyłączonymi terminalnie podstawnikami GalNAc. Obecność mutantów C. jejuni, które nie produkowały ligandów dla MGL, powodowała wzrost produkcji interleukiny 6 [107]. Dokładne skutki braku tej modyfikacji ustalono w odniesieniu do nielicznych białek. Jednym z nich jest VirB10, komponent systemu sekrecji typu IV u C. jejuni. Glikozylacja tego białka ma zasadnicze znaczenie dla stabilności układu wydzielania i pobierania DNA [66].
Ostatnio przeprowadzona proteomika ilościowa w szczepie C. jejuni z mutacją w genie kodującym transferazę oligosacharydową pglB wykazała znaczną rearanżację proteomu C. jejuni. Usunięcie pglB spowodowało zmianę poziomu 185 białek. W przypadku 137 z nich komplementacja przywróciła poziom obserwowany w komórkach typu dzikiego. Odnotowano zmianę w poziomie białek powiązanych z reakcją na stres (ClpB, GroEL, GroES, GrpE i DnaK), chemotaksją, tworzeniem biofilmu, oddychaniem oraz pozyskiwaniem, wykorzystaniem i wykrywaniem składników odżywczych. Brak N-glikozylacji w komórce doprowadził na przykład do wyższego poziomu PutP/PutA odpowiadających za transport i wykorzystanie proliny, i obniżenie poziomu białek DctA/DctB związanych z importem asparaginianu i eksportem bursztynianu. Konsekwencją było przestawienie metabolizmu z wykorzystania asparaginy na wykorzystanie proliny. Mutanty pglB znacznie gorzej przeżywały szok termiczny i osmotyczny. Stwierdzono również, że N-glikozylacja jest niezbędna do pełnej aktywności reduktazy azotanowej Nap. Zaobserwowano, że mniejsza ilość tego enzymu nie miała jednak związku ze zmianą poziomu ekspresji kodującego ją genu. Na tej podstawie zasugerowano, że N-glikozylacja odgrywa rolę w ochronie białek przed działaniem proteaz [13]. Również badania Abouelhadid i wsp. przeprowadzone w roku 2019 wskazują że zakłócenie N-glikozylacji koreluje ze znacznym wzrostem liczby nie tylko peryplazmatycznych, ale także cytoplazmatycznych białek opiekuńczych i proteaz. W badaniach tych potwierdzono poważne upośledzenie funkcji NapAB i zmniejszenie aktywności pompy efflux CmeABC będące konsekwencją braku glikozylacji [1, 26]. Jednocześnie fakt, że niektóre glikoproteiny są stabilne w komórkach niezdolnych do dołączania glikanów, wskazuje, że grupy cukrowe pełnić mogą odmienne role w różnych proteinach.
W ostatniej dekadzie zainteresowano się możliwością praktycznego wykorzystania bakteryjnych systemów glikozylacji [52, 114]. Z chwilą wprowadzenia genów odpowiadających za tę modyfikację (pgl) do komórek E. coli i uzyskania funkcjonalnych, rekombinowanych glikoprotein, zaczęła intensywnie rozwijać się glikoinżynieria bakteryjna. Osiągnięcie to próbuje się wykorzystać w dwojaki sposób: do produkcji szczepionek polisacharydowych, jak również poprawy farmakokinetycznych właściwości białek terapeutycznych. W wielu szczepach glikozylowane białka pełnią ważną rolę w procesach patogenezy, co czyni je również potencjalnym celem terapeutycznym – część z enzymów tworzących system O-glikozylacji jest nieobecna w komórkach eukariotycznych.
Komórki E. coli zdolne do przeprowadzenia N-glikozylacji uzyskano w 2002 roku. Wacker i wsp. do komórek E. coli, oprócz plazmidu niosącego gen kodujący wytypowane do modyfikacji białko, wprowadzili także plazmid niosący locus biosyntezy heptasacharydu Campylobacter oraz plazmid z transferazą oligosacharydową PglB pochodzącą z tego gatunku [112]. Grupa cukrowa była syntetyzowana w cytoplazmie na nośniku lipidowym, a po przeniesieniu do peryplazmy, PglB przekazywał polisacharyd do sekwencji akceptorowej docelowego białka [21, 102]. Glikozylacja przebiegała więc według schematu opisanego dla Campylobacter. Kolejne badania wykazały, że na terenie glikokompetentnej komórki E. coli, transferaza oligosacharydowa (PglBCj) może przenosić różne glikany, nie tylko te powstające w komórkach Campylobacter [21]. I tak na przykład wykazano, że PglB transportuje polisacharyd O16 w komórkach E. coli tak samo wydajnie jak swój endogenny substrat – heptasacharyd Glc(GalNAc)5Bac u C. jejuni [30] Jedynym ograniczeniem jest wymagana obecność grupy acetylowej przy węglu C2 na redukującym końcu glikanu [111]. Zaobserwowano również, że warunkiem, który musi zostać spełniony by powstająca jednostka cukrowa została przyłączona do białka, jest obecność sekwencji konsensusowej (Asp/Glu--X-Asn-Y-Ser/Thr). W ten sposób uzyskano między innymi glikozylowaną formę podjednostki B toksyny cholery (CtxB) [63]. Białko PglB wykazuje aktywność wobec stosunkowo szerokiej grupy substratów. Jest ono w stanie przenosić glikan nie tylko na dojrzałe białko, ale również krótsze peptydy, o ile zawierają rozpoznawany przez tę transferazę motyw. Technologię tę określa się jako Protein Glycan Coupling Technology (PGCT) [102].
Jednym z potencjalnych zastosowań glikoinżynierii bakteryjnej jest produkcja nowoczesnych szczepionek polisacharydowych. Użycie polisacharydów otoczkowych w charakterze antygenów szczepionkowych wymaga kowalencyjnego przyłączenia do białka nośnikowego, którego przykładem jest CRM197 – nietoksyczna, ale immunogenna wersja toksyny błoniczej Corynebacterium diphteriae. Zapewnia to zdolność do indukowania odpowiedzi związanej z limfocytami T [68], co przekłada się na większą skuteczność szczepionki u dzieci poniżej drugiego roku życia – grupy wiekowej, w której polisacharydy bez białkowego składnika wywołują bardzo słabą odpowiedź immunologiczną [7]. Metodę tę z powodzeniem wykorzystano do opracowania szczepionek przeciwko m.in. Haemophilus influenzae typu b (Hib) [75] i Neisseria meningitidis [12]. Obecnie tworzone są one poprzez chemiczne połączenie białka z polisacharydem wyizolowanym z danego patogenu lub sztucznie zsyntetyzowanym. Podejście to jest jednak kosztowne i czasochłonne, a otrzymane glikany nie mają jednorodnej struktury. Otrzymywanie glikoprotein w układach in vivo np. w E. coli pozwoliłoby na obniżenie kosztów produkcji szczepionek koniugowanych oraz na ujednolicenie przyłączanych łańcuchów cukrowych.
Technologię PGCT wykorzystano m.in. do stworzenia glikoprotein, które mogłyby zostać wykorzystane jako antygen w szczepionce przeciwko brucelozie [50]. Brucella abortus, Brucella melitensis i Brucella suis, wywołujące brucelozę u ludzi mogą również zarażać zwierzęta domowe, powodując poronienia i bezpłodność, a tym samym prowadzić do znacznych strat ekonomicznych [86]. Do białka AcrA C. jejuni dołączono antygen O pochodzący z Yersinia enterocolitica O9, który jest identyczny z antygenem O B. abortus. Syntezy tej dokonano z użyciem transferazy oligosacharydowej PglB C. jejuni. Odpowiedź immunologiczna po podaniu glikoproteiny myszom nie była wystarczająca, by ochronić je przed infekcją wirulentnym szczepem B. abortus. Wykazano jednak jej użyteczność w wykrywaniu infekcji u bydła, ludzi i świń. Do kulek magnetycznych opłaszczonych rekombinowanym białkiem wiązały się przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi O B. abortus obecne w surowicy zainfekowanych zwierząt, co pozwalało odróżnić osobniki chore od zdrowych [20, 50]. W podobny sposób glikoinżynieria została wykorzystana do wykrywania zespołu hemolityczno-mocznicowego (HUS) [78], wywoływanego przez szczepy Escherichia coli wytwarzające toksynę Shiga (STEC). Strategię tą zastosowano również do opracowania szczepionek przeciwko Shigella dysenteriae typ 1 [49, 91], Shigella flexneri typ 2a [57], Burkholderia pseudomallei [33], Francisella tularensis [21], Staphylococcus aureus [113] oraz Campylobacter [80]. Testowanie kilku z nich przyniosło obiecujące wyniki na modelach zwierzęcych [21, 113] a w przypadku szczepionki przeciwko S. dysenteriae rozpoczęto badania kliniczne [48, 92].
Wysiłki zmierzające do opracowania glikokompetentnych E. coli zakończyły się powodzeniem, jednak w dalszym ciągu wyzwaniem pozostaje uzyskanie wysokiej wydajności N-glikozylacji. Na skuteczność tego procesu wpływa wiele czynników, w tym między innymi obecność sekwencji konsensusowej, aktywność transferaz oligosacharydowych (OST), szlaki metaboliczne gospodarza i warunki hodowli. Garcia-Quintanilla i wsp., by uzyskać większą ilość białka zmodyfikowanego polisacharydami Burkholderia pseudomalei, unieczynnili w genomie E. coli geny wecA i waaL [33]. Obecność w komórkach glikokompetentnej E. coli inicjującej glikozylotransferazy (wecA), która przenosi GlcNAc na nośnik lipidowy (difosforan undekaprenylu, Und-PP), zakłócała syntezę na tym samym lipidzie glikanu, będącego przedmiotem badania. Usunięcie ligazy WaaL, która może przenosić substrat na LPS, także pozytywnie wpłynęło na wydajność glikozylacji. Korzystając z wysokoprzepustowych analiz, Ollis i wsp. zidentyfikowali warianty PglB o zmienionej specyficzności wobec substratu białkowego. Szczególnie interesujące warianty rozpoznawały sekwencję N-X-S/T wykorzystywaną przez eukariotyczne OST, co daje możliwość wykorzystania technologii PGCT do produkcji eukariotycznych glikoprotein [84].
Około 70% białek terapeutycznych, zatwierdzonych klinicznie lub będących w fazie opracowania, to glikoproteiny. Przykładem są: erytropoetyna, przeciwciała monoklonalne, tkankowy aktywator plazminogenu czy ludzka DNAza [18, 65]. N-glikozylacja może być zastosowana do poprawy właściwości farmakokinetycznych i biofizycznych białek. Zmiany te mogą prowadzić do opracowania leków o podwyższonej aktywności in vivo, o dłuższym okresie półtrwania, ale także mogą pozytywnie wpływać na stabilność, rozpuszczalność białek czy warunkować odporność na proteolizę. Dzięki glikozylacji białka terapeutyczne mogą być kierowane do konkretnych komórek lub tkanek, bądź może dochodzić do modulowania ich aktywności biologicznej poprzez oddziaływania z określonymi receptorami. Chociaż systemy ekspresyjne ssaków są obecnie preferowanym gospodarzem do wytwarzania glikoprotein terapeutycznych, bakterie mające zdolność do wprowadzania takich modyfikacji pojawiają się jako realna alternatywa w ich produkcji [42]. Więcej informacji na temat możliwości wykorzystania bakteryjnych technik glikoinżynieryjnych przedstawia opracowanie Harding i Feldman z 2019 [42].
Podsumowanie
Glikoproteiny, traktowane początkowo jako specyficzne jedynie dla komórek organizmów eukariotycznych, są szeroko rozpowszechnione zarówno wśród Archaea, jak i Bacteria. W ciągu ostatnich dwóch dekad scharakteryzowano wiele bakteryjnych szlaków glikozylacji. Kluczowe w tych szlakach enzymy – transferazy oligosacharydowe oraz glikozylotransferazy, wykorzystano do projektowania szczepionek glikokoniugatowych. Szlaki biosyntezy glikoprotein, jako że pełnią one wiele funkcji w patogenezie, okazały się także atrakcyjnym celem dla nowych strategii przeciwbakteryjnych. Niewątpliwie rosnąca wiedza na temat glikozylacji białek przyczynia się do powstania narzędzi umożliwiających tworzenie struktur glikanów, które wcześniej były nieosiągalne. A w dłuższej perspektywie manipulacje ścieżkami glikomodyfikacji pozwoli, być może, wytwarzać rekombinowane białka zawierające ludzkie glikany, co z kolei wzmocni ich wartość terapeutyczną.
