Role Of Two-Component Signal Transduction Systems In Antimicrobial Resistance Of Gram-Negative Pathogens

Typowy dwuskładnikowy system regulacyjny jest zbudowany z kinazy histydynowej oraz regulatora odpowiedzi (Ryc. 1) [107]. Kinaza histydynowa jest multidomenowym białkiem transbłonowym. W jej budowie wyróżniamy domenę N-końcową oraz domenę C-końcową, które są połączone przez domenę łącznikową [41, 97]. Część N-końcowa jest określana jako domena sensorowa, gdyż jej zadaniem jest odbieranie bodźców. Domena ta może być zlokalizowana w peryplazmie, cytoplazmie lub w błonie cytoplazmatycznej. Budowa sensora zależy od rodzaju odbieranych sygnałów. Część C-końcowa białka jest nazywana domeną przekaźnikową, wykazującą aktywność kinazy. W jej budowie wyróżniamy region dimeryzacyjny oraz katalityczny. Część dimeryzacyjna posiada resztę histydynową zlokalizowaną na motywie H-box, która bierze udział w procesie fosfotransferu. Część katalityczna zawiera motywy N-, G1-, F- i G2-box, tworzące strefę wiązania ATP. Funkcją tej części jest katalizowanie reakcji przyłączenia grupy fosforanowej, pochodzącej z ATP, do reszty histydynowej. Kinazy histydynowe funkcjonują w formie dimeru i reakcja autofosforylacji zachodzi na krzyż, tj. domena katalityczna jednej podjednostki fosforyluje His w drugiej. Motywy obecne w obrębie domeny przekaźnikowej występują we wszystkich zidentyfikowanych kinazach histydynowych (jest ona konserwowana ewolucyjnie) [41, 55, 101, 131]. Analizy sekwencji różnych kinaz histydynowych umożliwiły wyróżnienie dwóch klas tych białek, klasy I, która występuje najczęściej oraz klasy II. Klasa I kinaz posiada podstawowy typ budowy, scharakteryzowany powyżej. Przykładowym białkiem tej klasy jest kinaza EnvZ, która bierze udział w osmoregulacyjnej ekspresji genów ompC/ompF, kodujących poryny u E. coli. W klasie I kinaz histydynowych wyróżniamy też kinazy hybrydowe, u których za domeną przekaźnikową (katalityczną) występuje domena regulatorowa (odbiornikowa) z resztą asparaginową. Do skutecznego fosfotransferu z kinazy hybrydowej na domenę odbiornika regulatora odpowiedzi wymagany jest dodatkowy moduł HPt (His-containing phosphotransfer domain). HPt zawiera resztę histydynową, która uczestniczy w transferze grupy fosforanowej, ale nie wykazuje aktywności kinazy ani fosfatazy. W niektórych kinazach moduł HPt jest integralną częścią białka, np. sensorowa kinaza ArcB i taka kinaza nazywana jest niekonwencjonalną (unorthodox) [107]. Wszystkie białka typu HPt zawierają motyw poczwórnej helisy (four-helix bundle). Klasa II kinaz została wyodrębniona w oparciu o strukturę białka CheA, składowej systemu dwuskładnikowego CheA-CheY, regulującego chemotaksję m.in. u E. coli. CheA wyróżnia się budową złożoną z pięciu domen. Domena P1 zawiera resztę histydynową podlegającą fosforylacji. Domena P2 wiąże regulator odpowiedzi. Domena P3 uczestniczy w dimeryzacji i przyłączeniu grupy fosforanowej do P1. Domena P4 (katalityczna) wiąże ATP, domena P5 reguluje aktywność kinazy w odpowiedzi na bodziec [14, 41, 131]. Tak więc, charakterystyczna dla kinazy CheA lokalizacja reszty His podlegającej fosforylacji (P1) w stosunku do katalitycznej domeny (P4) różni się od tej w klasie I kinaz histydynowych.

Ryc. 1.

Regulatory odpowiedzi to cytoplazmatyczne białka znajdujące się na końcu szlaku fosfotransferu (Ryc. 1). Aktywowane (ufosforylowane) białka funkcjonują jako efektory adaptacyjnej odpowiedzi komórki na dany czynnik [131]. Regulatory odpowiedzi są zwykle zbudowane z dwóch domen: ewolucyjnie konserwowanej regulatorowej (odbiornikowej) domeny N-końcowej oraz efektorowej domeny C-końcowej, wykazującej dużą zmienność w zakresie swojej budowy u różnych gatunków bakterii. Domena regulatorowa z reguły współdziała z ufosforylowaną histydyną kinazy i katalizuje transfer grupy fosforanowej na własny asparaginian, dodatkowo może katalizować reakcję autodefosforylacji, limitując w ten sposób czas swojej aktywacji. Fosforylacja domeny regulatorowej pociąga za sobą jej zmianę konformacyjną, dzięki czemu może występować w dwóch formach strukturalnych. Poprzez możliwość występowania w dwóch formach konformacyjnych, domena regulatorowa działa jako przełącznik aktywności regulatora odpowiedzi, przykładowo, nieufosforylowana domena regulatorowa białka NarL blokuje dostęp domeny efektorowej do DNA. Fosforylacja reszty asparaginowej powoduje zmianę konformacyjną domeny regulatorowej, która dzięki temu odsłania ulokowany na domenie efektorowej strukturalny motyw wiązania DNA. Istnieją różne sposoby kontroli domen efektorowych przez spokrewnione domeny regulatorowe. Obejmują one m.in. inhibicję domeny efektorowej przez nieufosforylowaną domenę regulatorową oraz aktywację allosteryczną domeny efektorowej przez ufosforylowaną domenę regulatorową [41, 131]. Domena efektorowa posiada zdolność wiązania się z regionami promotorowymi DNA (DNA-binding domain), regulując transkrypcję genów umożliwiających adaptację do zmiennych czynników środowiskowych, jednakże istnieją przypadki, w których jej celem jest białko [41, 101, 131]. Tylko kilka regulatorów odpowiedzi zawiera domenę C-końcową funkcjonującą jako enzym, np. fosfodiesteraza białka RegA u Dictyostelium discoideum [111]. Donorem grup fosforanowych mogą być również małe molekuły, takie jak acetylofosforan (CH₃COPO₄ ^2–), jednakże stopień tego typu fosfotransferu jest niski. Do stworzenia wydajnego szlaku transferu grup fosforanowych konieczne są oba białka systemu dwuskładnikowego. Homologia regionów domen efektorowych wiążących się z DNA posłużyła do wyodrębnienia trzech grup/rodzin regulatorów odpowiedzi: OmpR/PhoB, NarL/FixL i NtrC. Razem stanowią one prawie 60% wszystkich regulatorów odpowiedzi. Rodzina białek OmpR to czynniki transkrypcyjne. Posiadają możliwość wiązania się z DNA oraz interakcji z polimerazą RNA w celu aktywacji lub represji transkrypcji (OmpR funkcjonuje jako aktywator i represor transkrypcji w odróżnieniu od PhoB, innego białka zaliczanego do tej klasy, które działa tylko jako aktywator). Ponadto białka te cechują się motywem uskrzydlona helisa-skręt-helisa (winged helix-turn-helix), którym wiążą się z DNA. OmpR, reprezentatywne białko całej grupy, zostało pierwotnie zidentyfikowane u E. coli [44, 57, 62, 76]. Białka z grupy NarL stanowią czynniki transkrypcyjne mogące aktywować lub hamować transkrypcję kontrolowanych przez siebie genów. Wyróżniają się motywem poczwórnej helisy (four-helix domain), który zawiera typowy układ wiązania do DNA: helisa-skręt-helisa. NarL reguluje m.in. transkrypcję genów E. coli związanych z metabolizmem azotanów i azotynów [9, 31]. Trzecia rodzina reprezentowana jest przez białko NtrC, które jest wzmacniaczem ekspresji genów niezbędnych w metabolizmie azotu u Salmonella enterica sv. Typhimurium. Część efektorowa białek tej rodziny składa się z dwóch domen: domeny helisa-skręt-helisa oraz ATP-azy. W przypadku NtrC, pod wpływem fosforylacji dochodzi do oligomeryzacji, a następnie do połączenia się z podjednostką σ⁵⁴ polimerazy RNA oraz hydrolizy ATP lub GTP. Uwolniona energia służy do uformowania kompleksu aktywującego transkrypcję [99].

Transfer grupy fosforanowej w obrębie systemu dwuskładnikowego zależy od jego budowy. Najczęściej występujące systemy dwuskładnikowe mają prostą budowę, złożoną z jednej kinazy histydynowej i jednego regulatora odpowiedzi. W takim przypadku odebranie bodźca przez domenę sensorową HK powoduje autofosforylację domeny przekaźnikowej. Następnie grupa fosforanowa jest przenoszona na regulator odpowiedzi, który wywołuje pożądaną odpowiedź [41, 115, 131]. Oczywiście w obrębie tego prostego szlaku fosfotransferu mogą występować różne wariacje. Jedna kinaza histydynowa może regulować kilka regulatorów odpowiedzi lub odwrotnie, kilka kinaz histydynowych reguluje ten sam regulator odpowiedzi, przykładowo pojedyncza kinaza CheA fosforyluje dwa regulatory odpowiedzi, CheY oraz CheB u E. coli [14]. W bardziej skomplikowanych systemach dwuskładnikowych spotykamy się ze sztafetowym transferem grupy fosforanowej [115]. Przykładem czteroetapowego systemu sztafetowego transferu grupy fosforanowej jest system KinA-Spo0F-Spo0B-Spo0A, który reguluje inicjację sporulacji Bacillus subtilis [6]. Powszechnie występujący „cross-talk” między różnymi systemami dwuskładnikowymi sprawia, że działanie poszczególnych systemów należy rozpatrywać pod kątem różnorodnych interakcji w złożonej sieci oddziaływań wewnątrzkomórkowych. Tylko wtedy możliwe jest precyzyjne określenie całkowitego wkładu konkretnego dwuskładnikowego systemu regulacyjnego w obrębie interaktomu komórki bakteryjnej.

W dobie dynamicznie rozwijających się badań genomicznych powiększa się lista TCS u bakterii, w tym u wielu gatunków bakterii chorobotwórczych. Lista kinaz histydynowych i regulatorów odpowiedzi (udowodnionych oraz potencjalnych) zidentyfikowanych w genomach 555 gatunków bakterii i archeonów jest dostępna w bazie danych [86]. Lista jest uzupełnieniem do pracy „Interplay of heritage and habitat in the distribution of bacterial signal transduction systems” [45].

Organizacja genów kodujących białkowe komponenty TCS bywa różna. Genom P. aeruginosa PA01 koduje 127 białek systemów dwuskładnikowych (64 regulatorów odpowiedzi i 63 kinaz histydynowych). Najczęstszy typ organizacji genów (29 systemów TCS) zawiera gen regulatora odpowiedzi zlokalizowany powyżej genu partnerskiej kinazy sensorowej. Prawie wszystkie operony z tą organizacją zawierają regulator odpowiedzi typu OmpR, i prawdopodobnie systemy te koewoluowały poprzez duplikację wyjściowej pary genów ompR-envZ [27]. Dwadzieścia jeden systemów zawiera gen kinazy sensorowej przed genem kodującym regulator odpowiedzi (geny oddzielone są trzema lub mniejszą liczbą genów). Regulatory odpowiedzi typu NarL funkcjonują zarówno z klasycznym, hybrydowym jak i niekonwencjonalnym sensorem, dlatego prawdopodobnie ewoluowały rekrutując białka dla konkretnej funkcjonalnej pary białek [27]. Geny kolejnych 13 sensorów i 15 regulatorów to tzw. geny „sieroce”, które nie są fizycznie powiązane z żadnymi innymi genami systemu dwuskładnikowego. Taka lokalizacja genów utrudnia identyfikację pary funkcjonalnej białek.

Antybiotyki zaliczane do różnych klas działają na komórkę bakteryjną poprzez odmienne mechanizmy prowadząc do śmierci komórki (efekt bakteriobójczy) lub hamując jej podział (działanie bakteriostatyczne). Wszystkie antybiotyki zanim dotrą do miejsca działania muszą pokonać zewnętrzną strukturę komórki bakterii Gram-ujemnych, którą jest błona zewnętrzna (OM, outer membrane). Wiele antybiotyków działa bezpośrednio na OM lub proces biogenezy błony, co prowadzi do jej destabilizacji i w konsekwencji do śmierci komórki. Silnie dodatnio naładowane antybiotyki, takie jak polimyksyna B, kolistyna, aminoglikozydy, a także kationowe peptydy przeciwdrobnoustrojowe (CAMPs, cationic antimicrobial peptides) wykorzystują ujemny ładunek netto OM. System pobierania polimyksyny B, kolistyny i CAMPs wykorzystuje mechanizm autopromowania, w którym antybiotyki oddziałują z OM tworząc neutralne łatki (patches), co prowadzi do pęknięcia błony i umożliwia w ten sposób przejście leku lub peptydu do peryplazmy. Tutaj amfipatyczna część kationowych cząsteczek interkaluje do błony cytoplazmatycznej, tworząc pory, co prowadzi do rozpadu błony i śmierci komórki. Taka insercja leku może dotyczyć także błony zewnętrznej [8, 51]. Aminoglikozydy aby przejść przez błonę i osiągnąć swój cel, którym jest rybosom bakteryjny wykorzystują różnicę ładunku [59]. Anionowa natura OM wynika z obecności lipopolisacharydu (LPS), który zawiera ujemnie naładowaną cząsteczkę lipidu A. Bakterie mogą odwrócić ten stan poprzez kowalencyjną modyfikację lipidu A, w wyniku czego OM zostaje naładowana dodatnio, co prowadzi do zmniejszenia lub zniesienia działania antybiotyku. Do trzech najczęstszych modyfikacji lipidu A należy dodanie: (1) 4-aminoarabinozy (4-AA), (2) fosfoetanoloaminy (PEtN) lub (3) kwasu palmitynowego, który w tym przypadku nie wpływa na ładunek OM tylko zmniejsza płynność błony [94, 104]. TCS odgrywają główną rolę w modyfikacji lipidów A błony zewnętrznej. Dwa najbardziej znane i najlepiej scharakteryzowane TCS, PhoP-PhoQ i PmrA-PmrB występują u wielu gatunków bakterii Gram-ujemnych, w tym między innymi u Salmonella enterica, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii i Yersinia pestis [2, 4, 10, 11, 22, 47, 48, 79, 83, 106, 140]. Wreszcie w kilku organizmach Gram-ujemnych, w tym gatunkach E. coli i Salmonella, TCS Rcs również znany jako system fosfoprzekazywania Rcs, reguluje ekspresję genu ugd, którego produkt jest niezbędny do syntezy i włączenia 4-AA do lipopolisacharydu [29, 50, 84, 106]. Ponadto u E. coli wykazano, że system Rcs zwiększa ekspresję pagP w dojrzałym biofilmie, co prowadzi w efekcie do zwiększenia palmitoilacji lipidu A, a w konsekwencji do zwiększenia oporności na leczenie dodatnio naładowanymi antybiotykami [118].

Bakterie regulują procesy wejścia i wyjścia wielu cząsteczek poprzez modulowanie ekspresji poryn i pomp wyrzutu (efflux pump) [28, 40]. Poryny są to białka błony zewnętrznej (OMPs), o strukturze β-baryłki, które pozwalają na pasywną dyfuzję cząsteczek. Antybiotyki hydrofilowe, takie jak β-laktamy, aminoglikozydy i fluorochinolony mogą wnikać do komórek przez poryny, a zatem obniżenie poziomu syntezy poryn może zmniejszyć przenikanie antybiotyków [69, 95].

Pompy wyrzutu to aktywne białka transportowe, występujące we wszystkich typach bakterii, niezbędne do utrzymania homeostazy bakteryjnej poprzez wydalanie toksycznych substancji. Oczywiście bakterie wykorzystują je również do usuwania antybiotyków i dlatego często lekooporność jest wynikiem zwiększonej ekspresji lub aktywności pomp wyrzutu [28, 117]. Niektóre typy pomp transportują szeroką gamę związków różniących się strukturalnie, i to one powodują powstanie oporności na wiele leków (MDR, Multi Drug Resistance). Zwiększona ekspresja pomp wyrzutu jest często pierwszym krokiem do wystąpienia wysokiego poziomu oporności, ponieważ pozwala bakteriom poradzić sobie z niskim lub średnim poziomem antybiotyku, tym samym dając szansę na selekcję mutantów o zwiększonej oporności [40]. Zidentyfikowano wiele pomp wyrzutu aktywowanych przez TCS wśród wielu gatunków bakterii typu MDR [54, 90].

Mechanizm oporności na antybiotyki, z którym klinicyści spotkali się wkrótce po wprowadzeniu do terapii medycznej penicyliny, polega na syntezie enzymów działających na cząsteczkę antybiotyku. β-laktamazy są to enzymy, które inaktywują antybiotyki β-laktamowe w wyniku hydrolizy pierścienia β-laktamowego. Obecnie β-laktamazy dzieli się na wiele podklas, w tym między innymi penicylinazy, cefalosporynazy czy karbapenemazy [21, 58]. Inne typy enzymów dezaktywują antybiotyki w wyniku bezpośredniej modyfikacji cząsteczki, należą do nich acetylotransferazy aminoglikozydowe i chloramfenikolowe [108].

Jak wykazały badania u P. aeruginosa TCS CreBC aktywuje ekspresję chromosomowego genu ampC kodującego β-laktamazę, a kinaza sensorowa CreB bezpośrednio wykrywa aktywność β-laktamu [139]. System BlrAB Aeromonas spp. aktywuje trzy β-laktamazy: cefalosporynazę, penicylinazę i karbapenemazę [119]. Innym przykładem jest udział kinazy sensorowej AarG w oporności wielolekopornego (MDR) patogenu szpitalnego Providencia stuartii na aminoglikozydy. Mechanizm oporności opiera się na regulacji ekspresji genu kodującego acetylotransferazę aminoglikozydową. Co więcej, mutacja w genie kinazy aarG dała początek kilku dodatkowym naturalnym opornościom na tetracyklinę, chloramfenikol i ciprofloksacynę. Fenotyp MDR jest prawdopodobnie efektem derepresji genu aarP, kodującego globalny regulator transkrypcji genów związanych z MDR [105].

Dwuskładnikowe systemy regulacyjne PhoP-PhoQ (PhoPQ) oraz PmrA-PmrB (PmrAB) są jednymi z najlepiej scharakteryzowanych TCS i odgrywających główną rolę w modyfikacji lipidu A lipopolisacharydu, zlokalizowanego w OM. Systemy te zidentyfikowano u wielu bakterii Gram-ujemnych, m.in. P. aeruginosa, S. Typhimurium, A. baumannii czy Yersinia spp., chociaż szlak prowadzący do modyfikacji lipidu A jest różny w zależności od gatunku [47]. Oba te systemy u P. aeruginosa uczestniczą w adaptacyjnej odpowiedzi na niskie stężenie jonów Mg²⁺ oraz warunkują oporność na antybiotyki i CAMPs [46]. PhoQ i PmrA to kinazy zlokalizowane w błonie wewnętrznej podlegające autofosforylacji w środowisku o niskim stężeniu Mg²⁺. Aktywowane kinazy sensorowe fosforylują partnerskie regulatory odpowiedzi PhoP i PmrA, które z kolei pozytywnie regulują transkrypcję swoich operonów, jak również operon arnBCADTEF (w literaturze opisywany także jako pmrHFIJKLM) (Ryc. 2) [46].

Ryc. 2.

Szlak ArnBCADTEF modyfikuje lipid A poprzez dodanie 4-aminoarabinozy (4-deoksy-4-amino-L-arabinozy), redukując ładunek ujemny LPS. Efektem tej modyfikacji jest zmniejszenie przenikania przez błonę zewnętrzną CAMPs, polimyksyny B czy aminoglikozydów (m.in. streptomycyny, kanamycyny i amikacyny), co prowadzi do zwiększenia oporności na te związki [46, 72, 73, 78, 83]. I odwrotnie, w warunkach wysokiego stężenia Mg²⁺ regulatory PhoP i PmrA są defosforylowane i uznaje się je za nieaktywne. Wydaje się jednak, że niskie stężenie Mg²⁺ nie jest jedynym sygnałem środowiskowym, który ma wpływ na aktywację/fosforylację PhoP. Badania wykazały, że regulator PhoP, w obecności spermidyny, ale niezależnie od stężenia Mg⁺² jest niezbędny do zwiększenia oporności P. aeruginosa na polimyksynę B, kolistynę, aminoglikozydy i chinolony [46].

System PhoPQ obecny w S. Typhimurium jest aktywowany podczas procesu fagocytozy bakterii przez makrofagi. Poza tym, czynnikami aktywującymi kinazę PhoQ i szlak fosfotransferu z kinazy na białko regulatora PhoP jest małe stężenie Mg²⁺, niskie pH i niektóre peptydy przeciwdrobnoustrojowe (Ryc. 3) [47]. System PhoPQ S. Typhimurium pełni rolę w modulowaniu procesu wirulencji u zwierząt (w tym człowieka), ale też w oporności na peptydy antybakteryjne oraz warunkuje przeżywalność bakterii wewnątrz makrofagów. Razem z systemem PmrAB uczestniczy w modyfikacji LPS przez dodanie 4-aminoarabinozy do lipidu A. Regulator PhoP aktywuje transkrypcję genów pag w fagosomach makrofagów, których produkty są niezbędne w warunkowaniu oporności na kationowe peptydy przeciwdrobnoustrojowe. Gen pagB koduje palmitoilotransferazę, która modyfikuje lipid A poprzed dodanie kwasu palmitylowego [106]. Ponadto PhoP kontroluje TCS PmrAB w wyniku regulacji ekspresji genu pmrD [47, 48]. Dwuskładnikowy system regulacyjny PmrAB jest kodowany przez geny pmrA (regulator odpowiedzi, PmrA) oraz pmrB (kinaza histydynowa, PmrB), które razem z genem pmrC (fosfotransferaza fosfoetanoloaminowa; pEtN) tworzą operon pmrCAB. PmrAB reguluje ekspresję ponad 20 genów, których liczba prawdopodobnie jest znacznie większa i może wynosić nawet około 100. Wśród nich znajdują się geny odpowiadające za wirulencję oraz oporność na antybiotyki (polimyksynę B) i peptydy antybakteryjne [47, 49, 75]. System PmrAB może być aktywowany w sposób bezpośredni lub pośredni. Sygnałami bezpośrednio odbieranymi przez domenę sensorową kinazy histydynowej PmrB są jony żelaza (Fe³⁺), glinu (Al³⁺), niskie pH oraz proces fagocytozy bakterii przez makrofagi. Wszystkie wymienione czynniki prowadzą do aktywacji (autofosforylacji) białka PmrB, rozpoczynając tym samym proces transdukcji sygnału (fosforylację regulatora PmrA), w wyniku czego dochodzi do regulacji ekspresji odpowiednich genów [136]. Pośrednia aktywacja systemu PmrAB zachodzi na drodze aktywacji genu pmrD przez system PhoPQ. W wyniku ekspresji tego genu powstaje 9,6 kDa białko PmrD, które wiążąc się do regulatora odpowiedzi PmrA stabilizuje jego ufosforylowaną formę (zapobiega defosforylacji) (Ryc. 3) [47, 61]. UfosforylowanyPmrA aktywuje ekspresję operonu pmrCAB, a ponadto może hamować transkrypcję pmrD, tworząc układ regulatorowy oparty na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego [36]. Możliwość współdziałania systemów PhoPQ z PmrAB poprzez białko PmrD jest unikatowe dla Salmonella. Przykładowo, białko PmrD znajdujące się w E. coli jest zupełnie odmienne, bowiem nie wykazuje zdolności do pośredniczenia w aktywacji PmrAB [132]. Modyfikacje LPS, w których pośredniczą oba TCS, pomagają przeżyć bakteriom w komórkach gospodarza jak i w środowisku zewnętrznym.

Ryc. 3.

Y. pseudotuberculosis posiada siedmiogenowy operon pmrF (pmrHFIJKLM), który wykazuje homologię z odpowiednikiem występującym u S. Typhimurium [74]. Operon ten jest odpowiedzialny za addycję 4-aminoarabinozy do lipidu A, skutkującą wzrostem oporności Y. pseudotuberculosis na polimyksynę B oraz cekropinę B. Genetyczne podstawy ekspresji operonu pmrF są inne u S. Typhimurium i Y. pseudotuberculosis. Podczas gdy regulacja jego ekspresji u Salmonella zachodzi z udziałem systemów PmrAB oraz PhoPQ, tak u Y. pseudotuberculosis jest kontrolowany bezpośrednio przez dwuskładnikowy system PhoPQ. System PmrAB obecny u Y. pseudotuberculosis nie uczestniczy w kontroli operonu pmrF. Białka tego systemu wykazują niskie podobieństwo z odpowiednikami u S. Typhimurium, ponadto nie tworzą one operonu z genem pmrC, który nie występuje w jej genomie [74].

Adams i wsp. [2] wykazali, że dwuskładnikowy system regulacyjny PmrAB jest zaangażowany w kontrolę oporności na kolistynę u bakterii A. baumannii. Potwierdzono doświadczalnie, iż mutacja w genie pmrA prowadzi do jego konstytutywnej ekspresji, w rezultacie warunkując obserwowaną oporność. W genomie A. baumannii nie stwierdzono obecności zarówno genów phoPQ, jak i pmrD, ponadto brak jest genów odpowiedzialnych za biosyntezę i addycję 4-aminoarabinozy do lipidu A. Sugeruje to, że mechanizm działania PmrAB A. baumannii jest inny od analogów obecnych u P. aeruginosa oraz S. Typhimurium. Molekularny cykl przemian aktywowanych działaniem PmrAB pozostaje nieznany [2].

Oporność wielolekowa jest poważnym problemem w leczeniu infekcji P. aeruginosa, stąd coraz częściej w praktyce klinicznej stosowane są polimyksyna B i kolistyna. Jak wykazują badania, w odpowiedzi na stres selekcyjny, jakim jest ekspozycja bakterii na niskie, subinhibitorowe stężenia polimyksyn i niektórych peptydów antydrobnoustrojowych może dojść do wykształcenia mechanizmów warunkujących zmniejszoną wrażliwość na te czynniki antybakteryjne. Wiadomo, że modyfikacja lipidu A lipopolisacharydu jest kluczowym składnikiem adaptacyjnej oporności na peptydy antydrobnoustrojowe, ale mechanizm leżący u podstaw tej regulacji u P. aeruginosa długo pozostawał nieznany. Dwuskładnikowe systemy PhoP-PhoQ i PmrA-PmrB, które u Salmonella kontrolują modyfikację LPS w warunkach niskiej zawartości Mg²⁺ i w obecności CAMPs nie odgrywają istotnej roli w tej adaptacyjnej oporności P. aeruginosa. Dopiero w 2010 roku zidentyfikowano i scharakteryzowano nowy dwuskładnikowy system wpływający na oporność adaptacyjną P. aeruginosa na polimyksynę, tj. system ParR-ParS [39]. System ParR-ParS (ParRS) w odróżnieniu od systemów PhoPQ i PmrAB P. aeruginosa reagujących na niskie stężenie Mg²⁺, jest aktywowany w obecności subinhibitorowych stężeń polimyksyny, kolistyny czy indolicydyny. Oporność na polimyksynę B i kolistynę oraz peptydy antybakteryjne jest skutkiem modyfikacji LPS na drodze addycji 4-aminoarabinozy do lipidu A, a jej molekularny mechanizm polega na kontroli aktywacji operonu arnBCADTEF przez ufosforylowany regulator odpowiedzi ParR [39]. Operon ten wydaje się warunkować oporność P. aeruginosa na wiele związków antybakteryjnych, co znajduje potwierdzenie w jego regulacji aż przez trzy dwuskładnikowe systemy. Odkrycie molekularnych podstaw oporności na kolistynę i polimyksynę B stanowi przełom w leczeniu pacjentów chorych na mukowiscydozę, którzy wykazują objawy zakażenia P. aeruginosa. Wyniki badań sugerują, że system ParRS może modulować także oporność na aminoglikozydy, fluorochinolony i β-laktamy na drodze zahamowania ekspresji genu oprD oraz aktywacji operonu mexXY [85, 130]. Represja oprD skutkuje obniżeniem ilości poryny OprD, przez którą do komórki dostają się karbapenemy. Ekspresja mexXY umożliwia syntezę dwóch białek: MexX i MexY, które wraz z kodowanym oddzielnie białkiem OprM tworzą pompę MexXY/OprM usuwającą aminoglikozydy, fluorochinolony i cefepim (Ryc. 4) [85].

Ryc. 4.

Wśród dwuskładnikowych systemów regulacyjnych występujących u P. aeruginosa odkryto dwa, które warunkują krzyżową oporność na metale ciężkie oraz antybiotyki. Są nimi system CzcR-CzcS (CzcRS) oraz CopR-CopS (CopRS) [23, 100]. System CzcRS nadaje oporność na jony cynku oraz antybiotyk imipenem z grupy karbapenemów [127]. Jego aktywacja w obecności Zn²⁺ prowadzi do transkrypcji operonu czcRS, którego produkty z kolei aktywują ekspresję operonu czcCBA kodującego pompę wyrzutu. Dzięki niej bakterie wykazują wysoką tolerancję na jony cynku. Jednocześnie regulator odpowiedzi CzcR wpływa negatywnie na ekspresję genu oprD kodującego porynę, przez którą wnikają do komórki karbapenemy [100]. Z kolei, system CopRS indukuje oporność na jony miedzi, cynku oraz imipenem. W obecności Cu²⁺ dochodzi do aktywacji tego systemu, który może wpływać na spadek ilości poryny OprD lub aktywować ekspresję operon czcRS, wywołując efekt oporności na cynk oraz imipenem [23].

Dwuskładnikowy system PprB-PprA (PprBA) jest odpowiedzialny za kontrolę przepuszczalności błony zewnętrznej P. aeruginosa. Geny kodujące kinazę histydynową PprA oraz regulator odpowiedzi PprB tworzą operon pprAB. Zmniejszona przepuszczalność osłon komórkowych powoduje dużą oporność na antybiotyki aminoglikozydowe (wliczając w to kanamycynę, streptomycynę, gentamycynę, amikacynę i tobramycynę). Antybiotyki te ze względu na hamowanie translacji białek poprzez łączenie się z podjednostką 30S rybosomu są stosowane w szerokim zakresie wobec różnych infekcji bakteryjnych. Zwykle u P. aeruginosa oporność na aminoglikozydy jest dodatkowo warunkowana przez aktywność pompy wyrzutu MexXY/OprM. Molekularny mechanizm kontroli przepuszczalności błony warunkujący oporność jest nieznany [129]. Badania ostatnich lat wykazały, że system PprA-PprB reguluje poziom syntezy pilusów typu IV, adhezyny BapA i fimbrii CupE, zaangażowanych w tworzenie biofilmu oraz, że w warunkach głodu węglowego dochodzi do indukcji ekspresji pprB, a także genów regulonu PprB [128].

Dwuskładnikowy system CbrB-CbrA (CbrBA) jest przede wszystkim powiązany z metabolicznym wykorzystaniem węgla i azotu przez P. aeruginosa. Yeung i wsp. [138] wykazali, że dodatkowo uczestniczy on w procesie wirulencji oraz kilku innych powiązanych procesach fizjologicznych, takich jak formowanie biofilmu, cytotoksyczność, ruch rozpełzliwy oraz oporność na antybiotyki. Analizy funkcjonalne kinazy sensorowej CbrA u P. putida KT2440 dowiodły, że CbrA posiada kilka domen, silnie konserwowanych we wszystkich gatunkach Pseudomonas. Na N-końcu białka zlokalizowana jest nietypowa dla kinaz TCS domena transbłonowa o funkcji transportera (symportera), która prawdopodobnie pełni funkcję ko-sensora [82, 134].

W regulacji oporności na antybiotyki, kinaza histydynowa CbrA najprawdopodobniej nie współdziała z powiązanym regulatorem odpowiedzi CbrB, lecz pośredniczy w transferze grupy fosforanowej na inne regulatory odpowiedzi (cross-talk). W ten sposób CbrA reguluje ekspresję wielu genów, w tym operonów phoPQ, prmAB oraz arnBCADTEF, które są odpowiedzialne za oporność na peptydy antybakteryjne i antybiotyki (m.in. polimyksynę B, kolistynę, ciprofloksacynę i tobramycynę). Dotychczas nie dokonano jednoznacznej analizy powiązania białka CbrA z potencjalnymi regulatorami odpowiedzi [138].

Oporność bakterii na antybiotyki β-laktamowe wynika najczęściej z produkcji β-laktamaz, enzymów które hydrolizując cząsteczkę antybiotyku prowadzą do jego inaktywacji. U wielu organizmów obecność w chromosomie genów β-laktamaz jest naturalna, a ich ekspresja jest indukowana w obecności cząsteczki β-laktamu, tj. wtedy gdy synteza peptydoglikanu ulega zahamowaniu. Klasycznym mechanizmem regulującym produkcję β-laktamaz u bakterii Gram-ujemnych jest system AmpR, zidentyfikowany u wielu przedstawicieli rodziny Enterobacteriaceae [53]. Głównym regulatorem w tym systemie jest białko AmpR, czynnik transkrypcyjny z rodziny LysR aktywujący lub hamujący transkrypcję genu β-laktamazy w zależności od obecności aktywatorów (anhydro-muramylo-tri, tetra lub pentapeptydy – produkty degradacji peptydoglikanu) oraz represora (UDP-muramylo-pentapeptyd – intermediat w szlaku biosyntezy peptydoglikanu). System AmpR nie funkcjonuje u przedstawicieli rodzaju Aeromonas, syntetyzujących różne rodzaje β-laktamaz [126]. W większości gatunków zidentyfikowano trzy odrębne enzymy, tj. karbapenemazy klasy B (CphA lub Imi), cefalosporynazy klasy C (Cep) oraz penicylinazy klasy D hydrolizujące oksacyliny i kloksacylina (Amp). Wszystkie trzy typy enzymów znajdują się pod kontrolą dwuskładnikowego systemu regulacyjnego BlrA-BlrB (BlrAB) [91]. Badania przeprowadzone na A. hydrophila wykazały, że kinaza histydynowa BlrB nie wyczuwa cząsteczki β-laktamu bezpośrednio (podobnie jak to ma miejsce w systemie AmpR) a jest najprawdopodobniej aktywowana przez ligand akumulujący się w peryplazmie w wyniku hamowania przez β-laktam białek wiążących penicylinę (penicillin binding proteins; PBPs), [119]. Białka PBP to grupa enzymów biorących udział w syntezie, modyfikacji i dojrzewaniu peptydoglikanu (PG). Wielkocząsteczkowe PBP są transglikozylazami, wiążącymi disacharydopentapeptydy (podstawowe jednostki budulcowe PG) oraz transpeptydazami, które uczestniczą w tworzeniu peptydowych wiązań poprzecznych pomiędzy pentapeptydami podjednostek budulcowych (tworzenie wiązania pomiędzy D-alaniną, czwartym aminokwasem w peptydzie donorowym a kwasem diaminopimelinowym (DAP), tj. trzecim aminokwasem w peptydzie będącym akceptorem, co skutkuje usunięciem końcowej D-alaniny (piąty aminokwas w peptydzie donorowym). Nie wszystkie pentapeptydy uczestniczą w tworzeniu wiązań krzyżowych ponieważ w wyniku aktywności karboksypeptydaz, niskocząsteczkowych PBP, usuwana jest terminalna D-alanina w pentapeptydzie, a powstający tetrapeptyd nie jest substratem dla transpeptydaz. Tak więc zahamowanie aktywności PBP skutkuje akumulacją disacharydopentapeptydów, które reagując z kinazą BlrB prowadzą do jej autofosforylacji. Następnie grupa fosforanowa jest przenoszona na regulator odpowiedzi BlrA, który aktywowany (ufosforylowany) wiąże się do specyficznej sekwencji w obszarze promotorowym genów kodujących β-laktamazy Amp, Cep i Imi aktywując ich transkrypcję. Skutkuje to zwiększoną produkcją enzymów oraz wydzieleniem ich na zewnątrz komórki (Ryc. 5) [119].

Ryc. 5.

Archetypem prostego szlaku sygnałowego TCS, składającego się z pary białek uczestniczących w transdukcji sygnału ze środowiska, jest szlak sygnałowy OmpR-EnvZ. Po raz pierwszy opisany u niepatogennej E. coli K-12 stał się modelowym obiektem badań nad procesami fosforylacji i defosforylacji białek TCS, a także osmoregulacją ekspresji genów białek porynowych OmpC i OmpF [5]. System ten składa się z transbłonowej kinazy histydynowej EnvZ, która odbierając sygnał ze środowiska (zmiany w osmolarności, pH, temperatury, obecności substancji odżywczych) przenosi go w postaci grupy fosforanowej na partnerskie białko cytoplazmatyczne – regulator odpowiedzi OmpR. Ufosforylowane białko OmpR wiąże się z regionem promotorowym genów i w sposób pozytywny lub negatywny reguluje ich transkrypcję. Funkcja systemu OmpR-EnvZ w regulacji ekspresji genów jest od lat przedmiotem intensywnych badań u różnych gatunków bakterii [26]. Wyniki sugerują, że białko OmpR może regulować transkrypcję wielu genów, często specyficznych dla określonego gatunku bakterii i tym samym modulować różne funkcje fizjologiczne. System OmpR-EnvZ scharakteryzowano u różnych gatunków bakterii chorobotwórczych, w tym S. enterica, A. baumannii [33, 121] oraz patogennych gatunków Yersinia (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis i Y. enterocolitica) [20]. Badania wykazały, że obniżony poziom produkcji OmpC i OmpF prowadzi do zwiększenia oporności na β-laktamy u E. coli i S. enterica. Wyniki badań dowiodły także znaczenia białek błony zewnętrznej (poryn OmpC i OmpF) w oporności Y. enterocolitica na antybiotyki β-laktamowe i tetracyklinę [16, 19]. Analiza parametrów przepuszczalności OM, jak i badania w sztucznej dwuwarstwie lipidowej (black lipid bilayers), wykazały znaczenie obu poryn OmpC i OmpF jako kanałów dyfuzyjnych dla niskocząsteczkowych antybiotyków β-laktamowych oraz jonów [17, 18]. Prace nad osmotyczną regulacją ekspresji poryn OmpC i OmpF Y. enterocolitica, dowiodły, że w podłożu o niskiej osmolarności preferencyjnie syntetyzowana jest poryna OmpF, podczas gdy w warunkach wysokiej osmolarności w OM dominuje OmpC [17, 19]. Modulacja poziomu syntezy poryny OmpC i OmpF jest klasycznym przykładem odpowiedzi adaptacyjnej komórki, gdyż zwiększenie syntezy poryny OmpC (o mniejszej średnicy) w warunkach wysokiej osmolarności (np. jelita) i zmniejszenie równocześnie OmpF (poryna o większej średnicy) pozwala na ograniczenie dyfuzji substancji szkodliwych do wnętrza komórki. Wyniki doświadczeń przeprowadzonych z dzikim szczepem Y. enterocolitica oraz jego izogenicznym mutantem defektywnym w produkcji OmpR (ΔompR) dostarczyły danych wskazujących na znaczenie regulatora OmpR w regulacji poryn, a także w procesie tworzenia biofilmu [20, 87]. Dalsze analizy genetyczne i proteomiczne wykazały, że AcrB, białkowy składnik pompy wyrzutu typu MDR AcrAB-TolC znajduje się pod pozytywną kontrolą OmpR, który ponadto negatywnie reguluje expresję genu acrR kodującego represor operonu acrAB [103]. OmpR działając jako represor acrR oraz aktywator acrAB uczestniczy w pozytywnej regulacji ekspresji genów kodujących komponenty pompy wielolekowej AcrAB-TolC, odpowiedzialnej za wypływ z komórki bakteryjnej wielu antybiotyków, soli żółciowych oraz detergentów (Ryc. 6). Otrzymane dane pozwoliły na wysunięcie wniosków o konsekwencjach funkcjonalnych wynikających z aktywności OmpR i przyczyniły się do zrozumienia molekularnych mechanizmów, które mają wpływ na wrażliwość Y. enterocolitica na związki antybakteryjne.

Ryc. 6.