This work is licensed under the Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
Wprowadzenie
Intensywne badania nad zjawiskiem antagonistycznego oddziaływania pomiędzy populacjami mikroorganizmów doprowadziły do opisania szeregu substancji przeciwdrobnoustrojowych. W latach dwudziestych ubiegłego wieku odkryto pierwszy antybiotyk i pierwszą bakteriocynę, toksyny produkowane przez drożdże opisano prawie 40 lat później [80]. Fenotyp killerowy po raz pierwszy został scharakteryzowany przez Bevana i Makowera w 1963 roku w odniesieniu do szczepu drożdży Saccharomyces cerevisiae, wyizolowanego jako zanieczyszczenie mikrobiologiczne w browarze [9]. Intensywne badania nad zjawiskiem killerowym potwierdziły jego występowanie wśród drobnoustrojów pochodzących z różnych naturalnych siedlisk, w tym wśród szczepów drożdży wyizolowanych z winogron i innych owoców, szczepów winiarskich, ale i mikroorganizmów pochodzących z laboratoryjnych kolekcji kultur. Obecnie wiadomo, że fenotyp killerowy występuje wśród drożdży z rodzajów: Pichia, Wickerhamomyces, Saccharomyces, Debaryomyces, Williopsis, Kluyveromyces, Mrakia, Zygosaccharomyces, Torulopsis, Metschnikowia, Cryptococcus, Candida, co wskazuje na znaczną częstotliwość jego występowania [80, 46]. Zjawisko killerowe może stanowić model biologicznego współzawodnictwa w pewnym stopniu analogiczny do syntezy bakteriocyn przez bakterie.
Toksyny killerowe to cytotoksyczne białka, zwykle glikoproteiny, produkowane przez niektóre drożdże, działające bójczo w stosunku do komórek drożdży wrażliwych. Początkowo przeważał pogląd, że toksyny są aktywne jedynie wobec drożdży należących do tego samego co producent lub spokrewnionego gatunku. Obecnie wiadomo, że niektóre szczepy drożdży wydzielają białka killerowe, które zabijają również komórki drożdży, należące do innych rodzajów, a nawet wykazują aktywność killerową wobec grzybów strzępkowych.
Najlepiej opisane toksyny killerowe: K1, K2 i K28, produkowane przez szczepy należące do gatunku S. cerevisiae, wykazują dość wąskie spektrum działania, ograniczone do drożdży z rodzaju Saccharomyces, natomiast szeroki zakres aktywności killerowej również w stosunku do mikroorganizmów niespokrewnionych z producentem toksyny, obserwowano u drożdży z rodzajów: Pichia, Wicerhamomyces, Williopsis czy Kluyveromyces [17]. Dość szerokie spektrum aktywności bójczej przejawia również najpóźniej opisana toksyna killerowa S. cerevisiae – Klus, która działa letalnie nie tylko na drożdże Saccharomyces, ale także na Candida albicans i Kluyveromyces lactis [68].
Drożdże killerowe są oporne na własne toksyny, ale pozostają wrażliwe na toksyny wydzielane przez inne gatunki [80]. W zależności od zdolności do syntezy białek killerowych oraz wrażliwości na nie wyróżnia się trzy fenotypy: killerowy (K), wrażliwy (S) oraz neutralny (N) [55]. W literaturze można znaleźć także odniesienie do dwóch innych fenotypów: „superkillerowego”, związanego z nadprodukcją toksyny, oraz „samobójczego”, w którym obserwuje się uwrażliwienie na własne białko killerowe [98].
Biosynteza i budowa toksyn killerowych
Geny kodujące toksyny, których producentami są gatunki: S. cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii oraz Ustilago maydis, zlokalizowane są w dwuniciowym RNA (dsRNA). Geny toksyn killerowych, wydzielanych przez gatunki: K. lactis, Pichia acaciae, P. inositovora oraz Debaryomyces robertsiae, znajdują się w liniowym, plazmidowym dsDNA. Natomiast informacja genetyczna dotycząca kodowania białek killerowych przez gatunki takie jak: Pichia farinosa, P. membranifaciens, P. kluyveri, Wickerhamomyces anomalus oraz Williopsis saturnus zapisana jest w genomie jądrowym [7, 8].
Najlepiej poznanymi i scharakteryzowanymi toksynami killerowymi są te produkowane przez drożdże S. cerevisiae (K1, K2, K28). W przypadku wspomnianego gatunku drożdży, jak również Z. bailii i U. maydis, fenotyp killerowy jest determinowany obecnością w cytoplazmie cząstek VLP (Virus Like Particles), często określanych jako cząstki wirusopodobne. Wirusy te straciły zdolność pozakomórkowej transmisji i ich rozprzestrzenianie zachodzi jedynie na skutek wegetatywnego lub płciowego rozmnażania się drożdży [80, 98]. Produkcja toksyn K1, K2, K28 oraz najpóźniej opisanej toksyny Klus jest związana z obecnością w cytoplazmie satelitarnego M-dsRNA (M1, M2, M28, Mlus), zamkniętego w cząstkach wirusopodobnych (VLP). M-dsRNA (1,5–1,9 kpz) odpowiedzialny jest za syntezę białek killerowych oraz za oporność komórki na własne toksyny [51]. Natomiast replikacja i funkcjonowanie zainfekowanych komórek zależne są od obecności innych wirusów, określanych pomocniczymi L-A, które należą do rodziny Totiviridae [80, 81]. Wirusy pomocnicze są zdolne do samodzielnego powielania się w komórkach gospodarza, bez obecności satelitarnego M-dsRNA. Dojrzała cząstka wirusa L-A zawiera dsRNA o wielkości 4,6 kpz, który powiązany jest z aktywnością odwrotnej transkryptazy. Nić RNA o dodatniej polaryzacji (L-A(+) ssRNA), służąca jako mRNA dla syntezy białek wirusowych, zawiera dwie otwarte ramki odczytu (ORF), które nakładają się na siebie fragmentem o długości 130 nukleotydów. Pierwsza z nich koduje białko kapsydu – Gag (76 kDa), natomiast druga fuzyjne białko Gag-Pol (180 kDa), niezbędne do replikacji zarówno L-A-dsRNA, jak i M-dsRNA. W odróżnieniu od L-A, każdy z trzech genomów M-dsRNA zawiera pojedynczą ramkę odczytu kodującą preprotoksynę (pptox) – prekursor białka killerowego [7].
Najlepiej poznana preprotoksyna K1, kodowana przez M1-dsRNA, jest polipeptydem o masie cząsteczkowej 35 kDa, złożonym z 316 reszt aminokwasowych. Zbudowana jest z N-końcowej sekwencji liderowej, złożonej z 44 reszt aminokwasowych i zawierającej peptyd sygnałowy. W dalszej kolejności można wyróżnić sekwencję podjednostki α, zbudowaną z 103 reszt aminokwasowych (pozycje 45 do 147) oraz podjednostki β, złożonej z 83 reszt aminokwasowych (pozycje 234 do 316), które są oddzielone od siebie fragmentem γ (pozycje 148 do 233). Region γ zawiera trzy potencjalne miejsca N-glikozylacji [51]. Po wniknięciu preprotoksyny do retikulum endoplazmatycznego, dochodzi do rozszczepienia łańcucha polipeptydowego i usunięcia peptydu sygnałowego. Następuje glikozylacja fragmentu γ oraz powstają mostki disiarczkowe [65]. Protoksyna jest następnie transportowana do aparatu Golgiego i ulega przekształcaniu w dojrzałą toksynę K1. Wspomniana transformacja odbywa się poprzez hydrolizę co najmniej trzech wiązań peptydowych [51]. Endopeptydaza Kex2p kodowana przez gen KEX2 jest odpowiedzialna za fragmentację protoksyny, oddzielenie regionu pro, poprzedzającego podjednostkę α i usunięcie fragmentu γ. Karboksypeptydaza Kex1p, kodowana przez gen KEX1, hydrolizuje C-końcowy dipeptyd [51]. Opisane powyżej modyfikacje prowadzą do wydzielenia dojrzałej toksyny K1 – heterodimeru, połączonego trzema mostkami disiarczkowymi. Podjednostka α jest odpowiedzialna za cytotoksyczne działanie toksyny, natomiast podjednostce β przypisuje się istotną rolę podczas wiązania do ściany komórkowej drożdży wrażliwych [7].
W przypadku toksyny K2 prekursor białka ma masę cząsteczkową 38,7 kDa i jest złożony z 362 reszt aminokwasowych. Podczas procesu dojrzewania, peptyd sygnalny zostaje usunięty, istotną rolę odgrywają również endopeptydaza Kex2p, hydrolizująca wiązania pomiędzy podjednostkami α i β. Najprawdopodobniej w preprotoksynie K2 nie jest obecna domena γ, a łańcuch α (170 reszt aminokwasowych) i β (140 reszt aminokwasowych) są nieco większe niż w toksynie K1. Podjednostka α jest N-glikozylowana w pozycjach 177 i 214 [51].
Prekursor toksyny killerowej K28 (preprotoksyna K28) ma masę cząsteczkową 37,6 kDa i jest polipeptydem zbudowanym z 345 aminokwasów. Zawiera N-końcową sekwencję sygnałową, niezbędną do transportu do retikulum endoplazmatycznego, która poprzedza sekwencje podjednostek α i β (w dojrzałej toksynie mają masy cząsteczkowe odpowiednio 10,5 oraz 11 kDa). Wspomniane podjednostki oddzielone są od siebie fragmentem γ, którego glikozylacja następuje w retikulum endoplazmatycznym. W aparacie Golgiego następuje usunięcie N-glikozylowanej sekwencji γ przez endopeptydazę Kex2p, natomiast karboksypeptydaza Kex1p usuwa C-końcowy dipeptyd, co prowadzi do wydzielenia heterodimerycznej, dojrzałej toksyny K28, zbudowanej z podjednostek α i β, połączonych jednym mostkiem disiarczkowym pomiędzy α-Cys56 i β-Cys340 [80, 81].
Biosynteza toksyn killerowych w komórkach K. lactis stanowi przykład najlepiej opisanego systemu killerowego opartego na plazmidowym DNA. Fenotyp killerowy drożdży K. lactis związany jest z obecnością dwóch liniowych, cytoplazmatycznie dziedziczonych plazmidów DNA – pGKL1 (8,9 kpz) i pGKL2 (13,5 kpz). W mniejszym plazmidzie zlokalizowane są 4 otwarte ramki odczytu (ORF). ORF 2 (3,4 kpz) i ORF 4 (4,8 kpz) kodują prekursory podjednostek toksyny killerowej, ORF 3 (1,3 kpz) nadaje oporność komórce gospodarza, podczas gdy ORF 1 (1,3 kpz) koduje polimerazę DNA [51]. Natomiast większy z plazmidów (pGKL2) zawiera 10 genów i jest niezbędny do replikacji pGKL1. Toksyna killerowa K. lactis, zwana zymocyną, zbudowana jest z trzech podjednostek: α (99 kDa), β (30 kDa) i γ (27,5 kDa). ORF 2 koduje prekursor podjednostek α i β, o masie cząsteczkowej 128 kDa, zawierający N-końcowy peptyd sygnałowy. Prekursor kierowany jest do retikulum endoplazmatycznego, gdzie podlega glikozylacji, a następnie jest transportowany do aparatu Golgiego i modyfikowany z udziałem peptydazy. N-końcowy peptyd sygnałowy podlega hydrolizie po stronie karboksylowej Arg29. Oddzielnie kodowany jest prekursor podjednostki γ (ORF 4), zawierający N-końcowy peptyd sygnałowy, odcinany przez peptydazę podczas procesu dojrzewania toksyny [51].
Drożdże należące do gatunku Williopsis mrakii są przykładem mikroorganizmów, u których informacja genetyczna niezbędna do ujawnienia fenotypu killerowego zapisana jest w genomie jądrowym. Drożdże W. mrakii wytwarzają toksynę HM-1 (oznaczaną również jako HMK). Gen chromosomalny hmk koduje prekursor, zbudowany z 125 reszt aminokwasowych, zawierający 37-aminokwasową, N-końcową sekwencją sygnałową, hydrolizowaną przez endopeptydazę Kex2. Dojrzała toksyna jest nieglikozylowanym białkiem o masie cząsteczkowej 10,7 kDa, zbudowanym z 88 reszt aminokwasowych [49].
Mechanizm odporności drożdży na produkowane przez siebie białko killerowe jak dotąd został poznany jedynie dla szczepów drożdży S. cerevisiae, wytwarzających toksynę K28. Po internalizacji dojrzałej, aktywnej toksyny do cytozolu tworzy ona kompleks z nieprzetworzonym prekursorem K28, zanim zostanie skierowany do retikulum endoplazmatycznego. W obrębie kompleksu, podjednostka β dojrzałej toksyny oraz ta sama podjednostka jej prekursora podlegają poliubikwitynacji (procesowi przyłączenia cząsteczek ubikwityny w celu oznaczenia białka, które będzie podlegać proteolizie), po której następuje degradacja przez proteasom. Proteasomy to wielkocząsteczkowe kompleksy enzymatyczne, odpowiedzialne za proteolityczną degradację niefunkcjonalnych, nieprawidłowo zbudowanych lub uszkodzonych białek komórkowych.
Preprotoksyny K28, które pozostały w cytozolu niezwiązane i nie uległy ubikwitynacji, są kierowane do szlaku wydzielniczego w celu dalszej obróbki enzymatycznej, prowadzącej do powstania dojrzałych, biologicznie aktywnych toksyn [7].
Właściwości białek killerowych
Występowanie zjawiska killerowego wśród drożdży ma istotny związek z konkurencją szczepów o substancje odżywcze. Toksyny killerowe produkowane są przez rosnące komórki, a także wykazują największą aktywność wobec komórek w tej samej fazie rozwoju, gdy ilość dostępnych składników pokarmowych jest wystarczająca, a pH niskie. Uważa się, że owoce są szczególnie ważnym siedliskiem drożdży killerowych, ponieważ charakteryzują się one niskim pH i wysoką zawartością cukrów. Jedna czwarta szczepów drożdży izolowanych z owoców ma fenotyp killerowy [51].
Każda toksyna killerowa ma unikatowe właściwości, które różnią się w zależności od wytwarzającego ją rodzaju i gatunku drożdży. Różnice te dotyczą lokalizacji genów, które kodują toksyny, mechanizmów działania, jak również masy cząsteczkowej, która w przypadku białek killerowych mieści się w przedziale od kilku do ponad 100 kDa [55].
W większości, toksyny killerowe są stabilne i aktywne jedynie w niskim pH (4–4,6) i w niskich temperaturach. Takie warunki środowiska występują podczas fermentacji winiarskiej. Comitini i wsp. [20] badali zastosowanie dwóch toksyn – Kwkt z Kluyveromyces wickerhamii DBVPG 6077 oraz Pikt, wydzielanej przez W. anomalus DBVPG 3003, do hamowania wzrostu niepożądanych mikroorganizmów podczas dojrzewania i przechowywania wina. Analizowane toksyny wykazywały maksymalną aktywność przy pH równym 4,4, przy czym białko Pikt było nieco bardziej odporne na podwyższoną temperaturę niż Kwkt. Ograniczenie rozwoju drożdży Dekkera bruxellensis w winie po zastosowaniu toksyn Pikt i Kwkt, obserwowano przez okres 10 dni, co wskazuje na utrzymanie aktywności killerowej toksyn w tym przedziale czasowym [20].
Nawet toksyny killerowe produkowane przez drożdże izolowane ze środowiska morskiego działają najlepiej w środowisku kwaśnym. Aktywność bójcza oczyszczonej toksyny produkowanej przez K. siamensis HN12-1, przeciwko patogennym drożdżom Metschnikowia bicuspidata WCY, była najwyższa w pH 4 [12]. Podobny efekt stwierdzono w przypadku białka killerowego wytwarzanego przez Mrakia frigida 2E00797, gdzie antagonizm wobec M. bicuspidata WCY był najbardziej wyraźny przy pH 4,5 [35]. Zbliżone rezultaty otrzymano także drożdży killerowych W. saturnus WC91-2 izolowanych ze środowiska morskiego; optymalne warunki działania oczyszczonej toksyny przeciwko patogennym drożdżom M. bicuspidata WCY to pH 3–3,5 i temperatura 16°C [96].
Niektóre z toksyn killerowych o właściwościach wyjątkowych jak na tego typu białka, pozostają aktywne również w środowisku zasadowym. Jedna z najbardziej stabilnych toksyn killerowych – HM-1, produkowana przez W. mrakii (Hansenula mrakii), zachowuje aktywność biologiczną ogrzewana przez 10 min w temperaturze 100°C i jest stabilna w zakresie pH 2–11 [49]. Wyjątkową stabilność HM-1 można wyjaśnić obecnością w jej strukturze 10 reszt cysteinowych, które tworzą mostki disiarczkowe [49]. Do grupy toksyn o wyjątkowych właściwościach zalicza się również białko killerowe wydzielane przez W. saturnus, stabilne w szerokim zakresie pH, wynoszącym 3–11 i aktywne po godzinnej inkubacji w temperaturze 80°C [55]. Znaczną stabilnością, wykraczającą poza typowy dla toksyn killerowych zakres pH, charakteryzuje się również białko killerowe produkowane przez Tilletiopsis albescens, które zachowuje aktywność biologiczną przy pH 3,5–8 [55].
Poza kwestią kwasowości środowiska i temperatury, kolejnym istotnym czynnikiem wpływającym na aktywność niektórych toksyn jest obecność NaCl. Aktywność killerowa drożdży halofilnych i halotolerancyjnych może być warunkowana zasoleniem środowiska, w którym te drożdże bytują. U drożdży izolowanych z produktów o wysokim zasoleniu, aktywność killerowa zwykle wzrasta wraz ze zwiększeniem stężenia chlorku sodu w podłożu, a niekiedy obecność NaCl jest czynnikiem niezbędnym do ujawnienia się ich aktywności bójczej [98]. W badaniach szczepów drożdży killerowych, wyizolowanych z solanki po fermentacji oliwek, wykazano, że ich aktywność była wyższa w obecności soli, a spektrum bójczego działania wobec wrażliwych szczepów rosło wraz ze wzrostem stężenia soli [48]. Odnotowano, że dodatek NaCl zwiększał wrażliwość testowanych szczepów na działanie toksyn, nie stwierdzono jednak znaczącego wpływu soli na produkcję toksyn [48]. Fenotyp silnie stymulowany obecnością NaCl opisano także u halotolerancyjnych drożdży killerowych Candida nodaensis [26]. Autorzy wysunęli hipotezę, że NaCl zwiększa aktywność toksyny CnKT, produkowanej przez C. nodaensis, prawdopodobnie poprzez stabilizację jej struktury. Podobną zależność pomiędzy aktywnością killerową a obecnością NaCl obserwowano dla szczepu halotolerancyjnych drożdży P. farinosa KK1, które produkują toksynę SMK, wykazującą maksymalną aktywność przy stężeniu NaCl wynoszącym 2 M [87]. Toksyna ta, zbudowana z dwóch podjednostek (α i β), jest stabilna jedynie w środowisku kwaśnym. W środowisku o odczynie obojętnym i zasadowym łańcuch α ulega precypitacji, dochodzi do dysocjacji podjednostek, co skutkuje utratą aktywności killerowej [87]. Zależność aktywności killerowej od obecności NaCl jest także wyraźnie widoczna u drożdży killerowych izolowanych ze środowiska morskiego. Aktywność toksyny produkowanej przez szczep M. frigida 2E00797 wobec patogennych drożdży M. bicuspidata WCY była najwyższa w obecności NaCl w stężeniu 3% [35, 47]. Podobne rezultaty otrzymano w przypadku toksyny wytwarzanej przez szczep killerowy W. saturnus WC91-2, której aktywność wobec M. bicuspidata WCY była najwyższa w środowisku zawierającym 10% NaCl [96].
Mechanizm działania toksyn killerowych
Toksyny działają dwuetapowo, pierwszy etap obejmuje szybkie wiązanie białka killerowego z receptorem zlokalizowanym w ścianie komórkowej drożdży wrażliwych, nie wymaga nakładu energii i jest zależny od pH. Dla toksyn wytwarzanych przez S. cerevisiae (K1, K2), Hanseniaspora uvarum oraz P. membranifaciens receptorem pierwszego rzędu jest β-1,6-D-glukan, dla toksyny K2, produkowanej przez S. cerevisiae, a także toksyny wydzielanej przez Z. bailii – 1,3-mannoproteina. Receptorem może być również chityna, która wiąże toksyny wytwarzane przez P. acaciae oraz K. lactis [72]. Drugi etap działania toksyn jest nieodwracalny i zależny od energii i, przebiega w różny sposób w zależności od rodzaju toksyny killerowej i jej stężenia.
W przypadku toksyny K1, dochodzi do jej translokacji do błony cytoplazmatycznej, a następnie interakcji z receptorem drugiego rzędu, którym jest glikoproteina Kre1p [11, 29]. Powstają kanały jonowe, błona komórkowa staje się przepuszczalna dla jonów i cząsteczek ATP, a to prowadzi do śmierci wrażliwej komórki. Badania Bartunek i wsp. [6] wykazały, że efekt cytotoksyczny wywołany działaniem toksyny K1 zależy od fazy cyklu komórkowego, w której znajdują się komórki drożdży wrażliwych. Największą opornością cechują się komórki w fazie M (podziału komórkowego), natomiast najbardziej wrażliwe są te w fazie S (syntezy DNA), cechujące się małymi pączkami [6]. W zbliżony sposób do toksyny K1, działa zygocyna – toksyna wytwarzana przez osmotolerancyjne drożdże Z. bailii. Struktura i mechanizm biologicznej aktywności zygocyny przypominają właściwości strukturalne i funkcjonalne peptydów przeciwdrobnoustrojowych wyższych eukariontów [97]. Białko killerowe łączy się z receptorem znajdującym się z błonie cytoplazmatycznej, co prowadzi do powstania kanałów oraz zwiększonej przepuszczalności metabolitów [97]. Podobną sekwencję zdarzeń opisano również dla toksyny produkowanej przez drożdże P. kluyveri [55, 61] oraz toksyny kFC-1, wytwarzanej przez drożdże Filobasidium capsuligenum [40].
Zbliżony mechanizm działania ma toksyna PMKT, wydzielana przez drożdże P. membranifaciens CYC 1106. Toksyna ta oddziałuje z błoną cytoplazmatyczną komórki wrażliwej poprzez interakcję z receptorem drugiego rzędu – białkiem Cwp2p [75], co prowadzi to do zaburzenia gradientu elektrochemicznego i homeostazy komórki wrażliwej. Powstają kanały, przez które wypływają jony takie jak: K+, Na+, protony oraz metabolity o niskiej masie cząsteczkowej (np. glicerol). Te zmiany pH i stężeń jonów generują odpowiedź transkrypcyjną przez aktywację ścieżki HOG (High Osmolarity Glicerol), co w konsekwencji powoduje śmierć komórek wrażliwych [70, 71, 73].
Kolejnym często opisywanym mechanizmem działania toksyn killerowych jest blokowanie cyklu komórkowego. W ten sposób toksyna killerowa K28 wywiera efekt cytotoksyczny. Po związaniu się z receptorem drugiego rzędu, toksyna K28 podlega translokacji do retikulum endoplazmatycznego. Podjednostka β ulega ubikwitynacji, a następnie zostaje skierowana do proteasomu i ulega degradacji, natomiast podjednostka α, przedostaje się do cytozolu, gdzie wysłany zostaje sygnał do jądra komórkowego komórki wrażliwej, w wyniku czego następuje zahamowanie syntezy DNA oraz zatrzymanie cyklu komórkowego we wczesnej fazie S [46, 55, 81].
Zbliżony mechanizm działania opisano również dla zymocyny, produkowanej przez drożdże K. lactis. Białko to zbudowane jest z trzech podjednostek. Podjednostka α ma aktywność chitynazy, funkcją kolejnej, hydrofobowej podjednostki β jest ułatwienie transportu podjednostki γ, która z kolei wywiera efekt cytotoksyczny na komórki docelowe. Polega on na rozszczepianiu transportującego RNA. Podjednostka γ hydrolizuje antykodon UUC tRNA, w wyniku czego następuje zahamowanie modyfikacji posttranslacyjnych oraz zatrzymanie cyklu komórkowego u drożdży wrażliwych w fazie G1 [38, 50, 55].
Klassen i Meinhardt [42] przeprowadzili badania dotyczące mechanizmu działania toksyny killerowej PaT, wytwarzanej przez P. acaciae, na drożdże wrażliwe należące do gatunku S. cerevisiae. Po około 4-godzinnej inkubacji obserwowano zmniejszoną żywotność komórek drożdży wrażliwych oraz zatrzymanie cyklu komórkowego we wczesnej fazie S. Kolejny, wyraźny spadek żywotności komórek wrażliwych nastąpił po około 10 h. Obserwowano znaczne zmiany morfologiczne komórek wrażliwych, w tym fragmentację DNA, prowadzące do apoptozy komórek drożdży S. cerevisiae [42]. Do zablokowania cyklu komórkowego w fazie syntezy DNA dochodzi również w przypadku aktywności toksyny PMKT2, wydzielanej przez P. membranifaciens CYC 1086 [70].
Kolejnym często opisywanym mechanizmem działania toksyn killerowych jest hydroliza β-1,3-D-glukanów. Izgü i Altinbay [36] wykazali, że toksyna (panamykocyna) produkowana przez W. anomalus (Pichia anomala), charakteryzuje się aktywnością egzo-β-1,3glukanazy. Mechanizm cytotoksycznego działania tego białka prawdopodobnie polega na hydrolizie β-1,3-Dglukanu – podstawowego składnika ściany komórkowej drożdży. Prowadzi to do wycieku cytoplazmy i śmierci komórki wrażliwej. Panamykocyna wykazuje aktywność bójczą szczególnie wobec tych drożdży, których ściany komórkowe charakteryzują się dużą zawartością β-1,3-D-glukanu, tj. C. albicans, Torulaspora delbrueckii oraz Kluyveromyces marxianus [36].
Podobny mechanizm działania, wiązany z aktywnością hydrolityczną wobec głównego składnika ściany komórkowej drożdży wrażliwych, opisali Guyard i wsp. [33] dla toksyny WmKT, produkowanej przez W. saturnus ser. mrakii MUCL 41968. Ponieważ sekwencja aminokwasowa toksyny WmKT wykazywała znaczne podobieństwo do sekwencji glukanaz, badano wpływ kastanosperminy (inhibitora glikozydaz) na aktywnośćtej toksyny. Kastanospermina całkowicie hamowała aktywność toksyny WmKT. Przy zastosowaniu skaningowej mikroskopii elektronowej zobrazowano zmiany morfologiczne komórek wrażliwych po działaniu toksyny, świadczące o częściowej degradacji ściany komórkowej. Podobny efekt stwierdzono stosując zymoliazę – enzym hydrolizujący glukany [33].
Analogiczny sposób działania opisano dla toksyny killerowej KpKt, wydzielanej przez Tetrapisispora phaffii (Kluyveromyces phaffii). Toksyna ta działa na ścianę komórkową drożdży wrażliwych, powodując zmiany morfologii komórek. Zastosowanie kastanosperminy doprowadziło do zahamowania aktywności biologicznej toksyny KpKt. Na tej podstawie wysunięto hipotezę, że KpKt wykazuje aktywność hydrolityczną w stosunku do β-glukanów, znajdujących się w ścianie komórek docelowych. Koncepcję tę potwierdza brak wiązania i interakcji toksyny ze sferoplastami [21].
Selektywne blokowanie syntezy β-1,3-glukanu przypisuje się toksynie HM-1, produkowanej przez szczep drożdży Williopsis saturnus ser. mrakii IFO 0895. Inne polisacharydy wchodzące w skład ściany komórkowej, takie jak mannan i chityna, powstają w niezmieniony sposób [88].”
Odmienny mechanizm działania zaproponowano dla toksyny KP4, produkowanej przez U. maydis. Wysunięto hipotezę, że ta toksyna hamuje wzrost i podział komórki poprzez blokowanie szlaków transdukcji sygnałów, regulowanych jonami wapnia [28, 46].
Mechanizm działania toksyn jest zależny nie tylko od rodzaju toksyny killerowej, ale i jej stężenia. Reiter i wsp. [67] udowodnili, że w przypadku trzech toksyn – K1, K28 i zygocyny, kodowanych przez geny zlokalizowane w cytoplazmatycznym dsRNA, białko killerowe w niskim i umiarkowanym stężeniu (< 1 pM) indukuje apoptozę komórki wrażliwej za pośrednictwem kaspazy drożdżowej Yca1p i reaktywnych form tlenu (ROS). Procesowi towarzyszy fragmentacja DNA, kondensacja chromatyny oraz translokacja fosfatydyloseryny na zewnątrz błony cytoplazmatycznej [82]. Białko killerowe w wysokim stężeniu (>10 pM) powoduje nekrozę komórki wrażliwej na drodze typowej dla danej toksyny [82], poprzez przerwanie integralności błony komórkowej albo oddziaływanie z białkami komórki gospodarza zaangażowanymi w cykl komórkowy i/lub syntezę chromosomalnego DNA. Dwoistość mechanizmu działania, w tym programowaną śmierć komórki wrażliwej przy niskich stężeniach toksyny, obserwowano również dla białek killerowych PMKT i PMKT2 kodowanych chromosomalnie, bez obecności cząstek wirusopodobnych [8]. Wydaje się, że w naturalnym środowisku, toksyny killerowe występują w niskich stężeniach i właśnie indukcja apoptozy może odgrywać kluczową rolę w skutecznej eliminacji drożdży wrażliwych za pośrednictwem wydzielanych przez drożdże killerowe toksyn [67, 82].
Zastosowanie drożdży killerowych i ich toksyn
W tabeli 1 przedstawione zostały podstawowe informacje dotyczące wybranych szczepów drożdży killerowych, produkowanych przez nie toksyn oraz zakresu ich aktywności, a także przykłady ich potencjalnego zastosowania.
Wybrane szczepy drożdży killerowych i ich potencjalne zastosowanie
Jednym z obszarów przemysłu spożywczego, w którym drożdże killerowe i produkowane przez nie toksyny mogą znaleźć potencjalne zastosowanie jest przemysł fermentacyjny. Rozwój drożdży dzikich w moszczu gronowym oraz winie jest poważnym problemem dla producentów, gdyż może skutkować zaburzeniem procesu fermentacji. Drożdże killerowe są obiektem badań pod kątem zastosowania ich do ograniczenia rozwoju niepożądanych mikroorganizmów i poprawy cech jakościowych produktu.
Drożdże killerowe należące do gatunku S. cerevisiae, zastosowane jako kultury starterowe podczas fermentacji moszczów gronowych, mogą korzystnie wpłynąć na proces produkcji wina i jego jakość. Ograniczeniem stosowania toksyn K1, K2 i K28, produkowanych przez S. cerevisiae, jest wąskie spektrum aktywności antagonistycznej do wrażliwych szczepów Saccharomyces [17]. Jedynie szczepy drożdży S. cerevisiae, produkujące toksynę Klus, mogą także eliminować drożdże należące do innych gatunków niż producent toksyny, takie jak C. albicans oraz K. lactis [68]. Drożdże Hanseniaspora/ Kloeckera dominują na powierzchni winogron oraz w świeżo wytłoczonym soku. Wzrost tych drożdży ogranicza się w niesterylnym środowisku, np. w moszczu gronowym, przez stosowanie ditlenku siarki. Jedną z alternatyw dla chemicznych środków może być użycie toksyn killerowych wykazujących aktywność wobec Hanseniaspora/Kloeckera [17]. Toksyną potencjalnie użyteczną w kontrolowaniu wzrostu Hanseniaspora/ Kloeckera w świeżym moszczu i podczas pierwszego etapu fermentacji jest toksyna Kpkt, wytwarzana przez T. phaffii DBVPG 6076. Wyniki badań Ciani i Fatichenti [17] wskazały, że efekt bójczy lub mykostatyczny toksyny Kpkt względem niepożądanych drożdży uzależniony był od jej stężenia. Działanie toksyny Kpkt w moszczu gronowym było porównywalne do skuteczności działania SO2 [17].
Poważnym problemem w winiarstwie są zanieczyszczenia drożdżami z rodzaju Brettanomyces/Dekkera, które przekształcają hydrokwasy do lotnych fenoli, takich jak: 4-etylofenol, 4-etylogwajakol i 4-etylokatechol. Prowadzi to do pojawienia się w winie niepożądanych aromatów (określanych jako „apteczne”, ziemiste, kojarzone ze stajnią, końską derką), zarówno pod koniec fermentacji, jak i podczas późniejszego dojrzewania. Drożdże z rodzaju Brettanomyces/Dekkera dobrze adaptują się do warunków panujących w środowisku, jakim jest wino, charakteryzującym się wysokim stężeniem etanolu, wysoką kwasowością, niskim stężeniem cukrów oraz dużą zawartością związków polifenolowych. Wciąż poszukiwane są skuteczne sposoby zapobiegania rozwojowi Brettanomyces/Dekkera (w szczególności D. bruxellensis) w winie. Zastosowanie związków chemicznych (kwasu benzoesowego lub sorbowego), jak również metod fizycznych (np. filtracji) okazuje się niewystarczająco efektywne. Dodatek SO2 niekorzystnie wpływa na organizm człowieka, dlatego Światowa Organizacja Zdrowia podkreśla konieczność ograniczenia stosowania tego środka przeciwdrobnoustrojowego w produktach spożywczych [17, 20]. Jednym ze sposobów eliminowania zanieczyszczeń Brettanomyces/ Dekkera może być użycie toksyny killerowej KwKt, produkowanej przez K. wickerhamii DBVPG 6077. Dodatek oczyszczonej toksyny w stężeniu 40 i 80 mg·l–1 skuteczne przeciwdziałał wzrostowi niepożądanych drożdży. W winie nie stwierdzono etylofenoli, produkowanych przez Brettanomyces/Dekkera. Dodatek toksyny Kwkt może być skuteczną biologiczną metodą zwalczania drożdży Brettanomyces/Dekkera podczas fermentacji, dojrzewania i przechowywania wina [19].
Labbani i wsp. [44] wyizolowali białko killerowe Pkkp, wydzielane przez P. kluyveri DBVPG 5826, które wykazywało aktywność wobec wielu mikroorganizmów skażających żywność i napoje. Aktywność bójcza toksyny Pkkp względem D. bruxellensis była wielokrotnie wyższa niż powszechnie stosowanego w winiarstwie pirosiarczynu potasu. Nie odnotowano synergizmu działania Pkkp w połączeniu z pirosiarczynem potasu, sorbinianem potasu lub etanolem [44]. Skuteczność działania innego białka, toksyny PMK2, względem D. bruxellensis została udokumentowana w badaniach Santosa i wsp. [76]. Obiecujące wyniki otrzymano także w badaniach toksyn CpKT1 oraz CpKT2, wytwarzanych przez Candida pyralidae. Białka te wykazywały aktywność killerową wobec D. bruxellensis w warunkach fermentacji winiarskiej. Aktywność toksyn CpKT1 oraz CpKT2 nie malała w obecności etanolu i cukru (glukozy i fruktozy w stosunku 1:1), w zakresie stężeń typowych dla wina oraz moszczu gronowego. Ponadto toksyny te nie wpływały negatywnie na rozwój drożdży S. cerevisiae oraz bakterii kwasu mlekowego [57]. Antagonistyczne działanie tych toksyn wobec D. bruxellensis polega na uszkodzeniu ściany komórkowej wrażliwych drożdży [56].
Szczep killerowy T. delbrueckii NPCC 1033, produkujący toksynę TdKT, jest kolejnym przykładem drożdży działających antagonistycznie w stosunku do mikroorganizmów niepożądanych w winiarstwie. Szczep ten i syntetyzowana toksyna wykazują aktywność killerową wobec D. bruxellensis i H. uvarum oraz niektórych szczepów M. guilliermondi i P. membranifaciens, jednocześnie nie hamują rozwoju drożdży szlachetnych S. cerevisiae. Badania prowadzone przez Villalba i wsp. [91] dowiodły, że w obecności toksyny TdKT, po trzygodzinnej inkubacji dochodzi do nekrozy, a po dłuższej, trwającej 24 h, do apoptozy komórek wrażliwych [91]. Drożdże T. delbrueckii mogą być wprowadzane do fermentacji winiarskiej w celu poprawy niektórych specyficznych cech wina. W badaniach Velázqueza i wsp. [90] do produkcji białych win stołowych użyto nowch szczepów killerowych T. delbrueckii Kbarr [66], które wykazują aktywność antagonistyczną również wobec S. cerevisiae. Sekwencyjna inokulacja niejałowego moszczu, najpierw kulturą T. delbrueckii, a następnie S. cerevisiae, nie zapewniła dominacji szczepów T. delbrueckii ani poprawy jakości wina. Tylko w przypadku moszczu, który inokulowano równocześnie T. delbrueckii i S. cerevisiae, w proporcji 9:1, szczepy killerowe T. delbrueckii zdominowały środowisko fermentacyjne i uzyskano produkt o zawartości etanolu ponad 11%.
Nie stwierdzono istotnych różnic w końcowym wyniku oceny sensorycznej otrzymanych win. Jednak wina, gdzie szczepy S. cerevisiae dominowały były preferowane w porównaniu z winami, gdzie dominowały drożdże T. delbrueckii, ponieważ te pierwsze miały intensywniejsze aromaty świeżych owoców, podczas gdy te drugie charakteryzowały się mniej intensywnymi, ale również ocenianymi jako przyjemne aromatami suszonych owoców [90].
Toksyna PMKT, wytwarzana przez P. membranifaciens i aktywna jak większość białek killerowych w środowisku o niskim pH oraz w niskiej temperaturze, może znaleźć potencjalne zastosowanie w winiarstwie do zwalczaniu drożdży z rodzaju Zygosaccharomyces, które są odporne nie tylko na wysokie stężenia cukru, ale także na dodatek sorbinianu potasu. Drożdże Zygosacchromyces stanowią zagrożenie szczególnie w produkcji win słodkich, gdzie powodują wtórną fermentację. Z przeprowadzonych badań przez Alonso i wsp. [2] wynika, że toksyna PMKT działa synergistycznie z pirosiarczynem potasu, umożliwiając skuteczne hamowanie rozwoju drożdży Zygosaccharomyces [2].
Badano również wpływ obecności drożdży W. anomalus CBS 1982 i W. anomalus CBS 5759 na skład chemiczny i cechy sensoryczne win jabłkowych. Niepasteryzowane i pasteryzowane moszcze jabłkowe inokulowano kulturą mieszaną tych drożdży i S. cerevisiae. Dodatek szczepów killerowych do niepasteryzowanych moszczów znacząco zmienił kinetykę fermentacji i korzystnie wpłynął na skład chemiczny win jabłkowych. W pasteryzowanych moszczach jabłkowych obecność szczepów killerowych skutkowała wzrostem wydajności fermentacji oraz zwiększeniem poziomu polifenoli. Zastosowanie szczepów W. anomalus wraz z drożdżami S. cerevisiae w formie kultury mieszanej poprawiło skład chemiczny i cechy sensoryczne win jabłkowych [78]. Otrzymane wina charakteryzowały się wyżej ocenianą barwą, łagodniejszym smakiem i przyjemniejszym aromatem.
Sprawdzono również czy dodatek białek killerowych nie zaburzy fermentacji, prowadzonej przez S. cerevisiae i nie wpłynie niekorzystnie na skład chemiczny wina. W tym celu badano wpływ preparatów częściowo oczyszczonych toksyn typu K8, K4 i K7 (wydzielanych przez szczepy drożdży W. anomalus CBS 1981, W. anomalus CBS 5759 oraz P. membranifaciens CBS 7373) na przebieg procesu fermentacji i skład chemiczny win jabłkowych. Dodatek toksyn do moszczów jabłkowych, uprzednio inokulowanych kulturami starterowymi drożdży Saccharomyces, nie zmienił w znaczący sposób kinetyki fermentacji, w większości otrzymane wina jabłkowe charakteryzowały się nieco wyższą zawartością alkoholu etylowego. Dodatek toksyn w niewielkim stopniu wpłynął na profil związków lotnych [10].
Potencjalne zastosowanie w medycynie
W próbach praktycznego zastosowania toksyn killerowych należy brać pod uwagę, że ich działanie w znacznym stopniu ograniczone jest do środowiska o stosunkowo niskim pH oraz niskiej temperaturze. Udowodniono, że wiele toksyn, m.in. HM-1, PaKT, zygocyna, w badaniach in vitro wykazuje aktywność przeciwmikrobiologiczną względem patogennych drożdży, takich jak C. albicans oraz Cryptococcus neoformans [8, 51, 92, 97]. Toksyny te mogłyby być użyteczne w zwalczaniu infekcji wywołanych przez chorobotwórcze grzyby, jednak ich zastosowanie jest ograniczone ze względu na niestabilność w fizjologicznym pH i temperaturze panującej w organizmie ludzkim [8]. Jedynie niektóre toksyny killerowe, np. wytwarzane przez Williopsis, charakteryzujące się znaczną jak na tego typu białka stabilnością, mogą być wykorzystane do celów terapeutycznych [13]. Próby użycia preparatów zawierających stabilne toksyny na zainfekowaną skórę, powierzchnię błon śluzowych lub jako dodatek do roztworów buforowych wydają się być obiecujące [8].
Drożdże z rodzaju Candida licznie występują w mikro biomie jelita człowieka, ale również zasiedlają jamę ustną i płuca [53]. Rodzaj Candida obejmuje około 150 gatunków, ale tylko 9 z nich uznaje się za patogenne dla człowieka [69]. Banjara i wsp. [5] przeprowadzili badania nad redukcją liczby patogennych drożdży Candida przez zastosowanie drożdży killerowych D. hansenii. 42 szczepy D. hansenii, wyizolowane z 22 próbek różnych rodzajów serów dojrzewających, oceniono pod kątem aktywności wobec drożdży Candida sp. Dwadzieścia trzy szczepy wykazywały aktywność killerową w stosunku do C. albicans i C. tropicalis w środowisku o pH < 6,5 i w temperaturze ≤ 35°C. Preparat nieoczyszczonej toksyny, wytwarzanej przez szczep D. hansenii Dh-237, redukował wzrost C. albicans w temperaturze 35°C przez okres 24 h. Natomiast szczep killerowy zawarty w próbce sera Romano zachowywał aktywność killerową, zarówno przeciwko C. albicans, jak i C. tropicalis, przez okres 10 dni w temperaturze 37°C. Na podstawie tych obserwacji autorzy pracy wysnuli przypuszczenie, że szczepy killerowe D. hansenii zawarte w serze mogą wpływać na populację drożdży Candida w jelitach [5].
Obiecujące wyniki uzyskano w przypadku szczepu drożdży W. anomalus Wa1F1 wyizolowanego z muchy piaskowej Phlebotomus perniciosus. Toksyna killerowa produkowana przez ten szczep została oczyszczona i scharakteryzowana, a jej aktywność przeciwdrobnoustrojowa była testowana in vitro przeciwko zarówno wrażliwym, jak i opornym na flukonazol, izolatom klinicznym i szczepom laboratoryjnym C. albicans i C. glabrata oraz ich mutantom. W temperaturze 25°C toksyna nie wykazywała aktywności killerowej wobec referencyjnego szczepu C. albicans SC5314, wrażliwych na flukonazol izolatów klinicznych (C. albicans DSY347 i DSY544) oraz mutanta DSY775 opornego na flukonazol, pochodzącego od szczepu C. albicans DSY544. Toksyna była aktywna w stosunku do mutanta DSY289 opornego na flukonazol, wywodzącego się od szczepu C. albicans SY347, a także wobec wszystkich użytych w badaniu, wrażliwych i opornych na flukonazol, izolatów klinicznych C. glabrata i ich mutanów [30].
Jedne z badań prowadzonych w ostatnich latach wskazują, że toksyny killerowe również mogą znaleźć zastosowanie w walce z malarią. Malaria jest chorobą tropikalną, wywoływaną przez pierwotniaki z rodzaju Plasmodium i przenoszoną przez samice komarów z rodzaju Anopheles. Programy zwalczania malarii obejmują leczenie farmakologiczne, które jednak może powodować skutki uboczne, nie zawsze jest skuteczne, a także kosztowne. Przy braku skutecznych szczepionek, stosuje się środki owadobójcze w celu zmniejszenia liczebności populacji owadów stanowiących wektory przenoszące pierwotniaki. Cappelli i wsp. [15] wykazali, że szczep W. anomalus WaF17.12 znajdowany w gonadach oraz w jelitach samic komarów Anopheles stephensi produkuje toksynę killerową WaKT. Toksyna ta działa antagonistycznie wobec zarodźca Plasmodium berghei w warunkach in vitro. Obserwowano zahamowanie wzrostu pierwotniaków poddanych działaniu toksyny WaKT sięgające nawet 90% [15, 89].
Nieliczne badania sugerują, że toksyny killerowe mogą również wykazywać działanie przeciwbakteryjne. Szczepem drożdży, któremu przypisuje się taki potencjał jest Pichia kudriavzevii RY55. Bajaj i wsp. [4] odnotowali, że produkuje on toksynę killerową, która wykazuje aktywność bójczą w stosunku do bakterii: Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Klebsiella sp., Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Pseudomonas alcaligenes. Według autorów, toksyna produkowana przez P. kudriavzevii RY55 może zostać użyta podczas opracowywania nowych środków przeciwbakteryjnych, także do konserwowania żywności oraz jako składnik kultur starterowych dla przemysłu fermentacyjnego [4]. W innych badaniach wykazano natomiast, że wyizolowany z owoców cytrusowych szczep killerowy Kazachstania exigua 120 hamuje rozwój bakterii P. aeruginosa, E. coli i Klebsiella pneumoniae [60].
Hu i wsp. [34] wskazują, że drożdże killerowe mogą również hamować rozwój komórek nowotworowych w warunkach in vitro. Autorzy badali wpływ filtratów pohodowlanych drożdży killerowych z rodzaju Barnettozyma oraz Pseudozyma na linię komórek nowotworowych HepG2. Stwierdzono, że filtraty zawierają związki, które indukują apoptozę komórek nowotworowych, bez uszkadzania komórek zdrowych [34]. Ponieważ w badaniu nie zostały użyte oczyszczone białka killerowe, nie można jednoznacznie stwierdzić, że za obserwowany efekt cytotoksyczny odpowiadają toksyny killerowe, a nie inne związki wchodzące w skład filtratów.
Nadal istnieje potrzeba opracowania nowych, profilaktycznych oraz terapeutycznych strategii przeciwzakaźnych. Przeciwciała naśladujące aktywność biologiczną toksyn (KTAbs), które w swej strukturze zawierają wewnętrzny obraz centrum aktywnego toksyny, hamują funkcje, które są krytyczne dla przeżycia mikroorganizmów, wywierając w ten sposób działanie przeciwmikrobiologiczne [52]. Toksyna killerowa PaKT, produkowana przez drożdże W. anomalus ATCC 96603, charakteryzuje się szerokim spektrum aktywności przeciwdrobnoustrojowej i może także znaleźć zastosowanie w zwalczaniu pneumocystozy – choroby płuc, wywoływanej przez grzyby Pneumocystis jiroveci (Pneumocystis carinii). Choroba ta dotyka głównie pacjentów z obniżoną odpornością, np. zakażonych wirusem HIV, chorujących na białaczki, chłoniaki, jak również leczonych immunosupresyjne. Stwierdzono, że toksyna PaKT w badaniach in vitro skutecznie ogranicza rozwój P. jiroveci. Ponieważ ta toksyna killerowa nie może być stosowana bezpośrednio jako środek leczniczy, dlatego też opracowano podstawy nowej strategii terapeutycznej z zastosowaniem antyidiotypowych przeciwciał przypominających toksynę PaKT oraz naśladujących jej aktywność przeciwgrzybiczą [83, 84]. Konstruując przeciwciała opierano się na założeniu, że interakcja pomiędzy toksyną killerową (KT) a specyficznymi przeciwciałami zdolnymi do neutralizacji jej aktywności może odzwierciedlać oddziaływanie toksyny ze specyficznymi receptorami ściany komórki wrażliwej. Przeciwciało monoklonalne anty-PaKT (mAb KT4) wytworzone zostało metodą fuzji splenocytów myszy, które uprzednio immunizowano PaKT, z komórkami szpiczaka. Otrzymane przeciwciało mAb KT4 neutralizowało aktywność bójczą PaKT przeciwko referencyjnemu szczepowi C. albicans [52]. Kiedy mAb KT4 zastosowano do immunizacji królików przez szczepienie idiotypowe, uzyskano antyidiotypowe KAbs, które były w stanie konkurować z PaKT o wiązanie z mAb KT4 i, co istotne, hamować wzrost referencyjnego szczepu wrażliwego C. albicans, tym samym naśladując aktywność PaKT [52].
Skonstruowano poliklonalne, monoklonalne i rekombinowane przeciwciała antyidiotypowe naśladujące aktywność biologiczną toksyn, które w badaniach in vitro wykazały szerokie spektrum działania bójczego przeciwko C. albicans [63] oraz innym gatunkom drożdży z rodzaju Candida [54], P. jiroveci [83, 84], Aspergillus fumigatus [16], jak również wobec bakterii patogennych, w tym Mycobacterium tuberculosis o oporności wielolekowej [23], opornych na antybiotyki Gram-dodatnich ziarniaków [24], paciorkowców izolowanych z jamy ustnej [25] oraz pierwotniaków: Leishmania major, Leishmania infantum [79] i Acanthamoeba castellanii [27].
Podjęto również próby zastosowania drożdży killerowych do szybkiej identyfikacji patogennych szczepów Nocardia asteroides [64]. W oparciu o 4 szczepy drożdży killerowych (Candida maltoza G7A, D. hansenii P41, W. saturnus DBVPG 3127 i W. saturnus DBVPG 3671) opracowano procedurę pozwalającą na odróżnienie C. albicans od innych gatunków z rodzaju Candida [14].
Zwalczanie chorób grzybowych roślin
Owoce i warzywa podczas wzrostu i przechowywania są narażone na choroby wywoływane przez pleśnie. Konsekwencją występowania chorób grzybowych jest zmniejszenie zbiorów i pogorszenie ich jakości. Straty owoców, np. jabłek, podczas przechowywania, wywołane przez grzyby fitopatogenne sięgają nawet 25% początkowej ilości [39]. Oprócz strat ekonomicznych, wzrost pleśni w artykułach spożywczych, może mieć niebezpieczne konsekwencje dla zdrowia ludzi w związku z produkcją mikotoksyn oraz wytwarzaniem konidiów, które mogą powodować alergie [18]. Aby zapobiec chorobom grzybowym stosuje się fungicydy, których zaletami są wysoka skuteczność i łatwość stosowania. Jednak zwalczanie pozbiorowych chorób grzybowych przez stosowanie środków chemicznych niesie wiele skutków. Pozostałości fungicydów mogą negatywnie wpływać na bezpieczeństwo zdrowotne konsumentów. Stosowanie fungicydów powoduje zanieczyszczenie środowiska i może prowadzić do wzrostu oporności fitopatogenów na czynniki chemiczne oraz redukcji liczebności pożytecznych organizmów. Nadal poszukuje się nowych rozwiązań, a biologiczne metody ochrony roślin cieszą się dużym zainteresowaniem. Biokontrola chorób roślin pochodzenia grzybowego może obejmować stosowanie drożdży antagonistycznych. Drożdże killerowe mają właściwości, które pozwalają uznać je za potencjalną, bezpieczną alternatywę dla środków chemicznych. W warunkach konkurencyjnych fenotyp killerowy daje przewagę szczepom drożdży killerowych w stosunku do innych, wrażliwych mikroorganizmów zasiedlających tę samą niszę ekologiczną [80]. Jednak produkcja toksyn killerowych jest tylko jednym ze sposobów antagonistycznego działania drożdży wobec patogenów grzybowych. Innymi są m.in. konkurencja o przestrzeń i składniki odżywcze (np. źródło węgla, azotu, kationy żelaza), wytwarzanie enzymów degradujących ściany komórkowe (np. chitynaz i glukanaz), produkcja metabolitów lotnych, indukcja odporności gospodarza i tworzenie biofilmu [43, 58, 85].
Aloui i wsp. [3] badali możliwość zastosowania powłok otrzymanych z alginianu sodu lub mączki chleba świętojańskiego, zawierających drożdże killerowe W. anomalus BS 91, do kontroli wzrostu Penicillium digitatum na powierzchni owoców pomarańczy. Powłoki wzbogacone o drożdże killerowe W. anomalus hamowały rozwój pleśni P. digitatum na owocach o ponad 73% po 13 dniach ich przechowywania w temperaturze 25°C. Dodatkowo, bioaktywne powłoki ograniczały utratę wody i pozwalały na utrzymywanie jędrności owoców w czasie ich przechowywania. W innych badaniach Platania i wsp. [62] odnotowali, że szczep killerowy W. anomalus BS91 hamował wzrost P. digitatum na owocach pomarańczy do 10 dnia przechowywania. Poza produkcją toksyn killerowych szczepy drożdży należące do gatunku W. anomalus mogą wytwarzać β-glukanazy, które degradują ścianę komórkową i powodują lizę komórek grzybów [62]. W innej pracy odnotowano również, że panamykocyna, toksyna killerowa W. anomalus NCYC 434 o aktywności β-glukanazy, zastosowana na powierzchnię owoców cytryny, uprzednio mechanicznie uszkodzonych i skażonych pleśniami P. digitatum oraz P. italicum, redukowała psucie się owoców i wydłużała okres ich trwałości. Toksyna ta w stężeniu 16 μg ∙ ml–1 całkowice hamowała rozwój wspomnianych pleśni przez okres 7 dni [37]. Badania przeprowadzone przez Pereza i wsp. [60] wykazały, że mikroorganizmami, które skutecznie przeciwdziałały rozwojowi P. digitatum oraz P. italicum na powierzchni cytryn, poza drożdżami z rodzajów Pichia i Wickerhamomyces, są również K. exigua (Saccharomyces exiguous), uznawane jako organizmy GRAS [60].
Lima i wsp. [45] badali skuteczność antagonistycznego działania dwóch szczepów killerowych, W. anomalus 422 oraz Meyerozyma guilliermondii 443, wobec Colletotrichum gloeosporioides, fitopatogenu wywołującego antraknozę papai i innych owoców tropikalnych. Otrzymano obiecujące wyniki wskazujące, że szczepy W. anomalus i M. guilliermondii redukowały częstość występowania antraknozy na owocach odpowiednio o 24,62% i 20,68% podczas przechowywania przez 6 dni.
Santos i wsp. [77] wykazali, że stosowanie szczepu killerowego P. membranifaciens CYC 1106 skutecznie ograniczało rozwój pleśni B. cinerea CYC 20010. Drożdże killerowe, w ilości około 106 komórek w 1 ml, całkowicie zahamowały wzrost B. cinerea na uszkodzonych mechanicznie i uprzednio skażonych jabłkach. Ograniczenie rozwoju B. cinerea uzyskano także stosując oczyszczoną toksynę killerową PMKT, produkowaną przez P. membranifaciens CYC 1106. Mniejsze hamowanie wzrostu patogenu obserwowane po zastosowaniu oczyszczonej toksyny w porównaniu z aplikacją szczepu killerowego potwierdziło, że dodatkowe mechanizmy były zaangażowane w antagonistyczne działanie P. membranifaciens CYC 1106 [77]. Mechanizmami tymi mogą być współzawodnictwo o składniki odżywcze lub wydzielanie enzymów degradujących ścianę komórkową B. cinerea [77]. W innych badaniach oceniano wpływ drożdży killerowych P. membranifaciens i oczyszczonej toksyny PMKT na rozwój B. cinerea na skażonych liściach Vitis vinifera [74]. Również w tym przypadku obserwowano całkowite zahamowanie wzrostu fitopatogenu, gdy użyto aktywnych komórek P. membranifaciens CYC 1106, natomiast gdy stosowano oczyszczoną toksynę ograniczenie rozwoju B. cinerea wynosiło 80%. Obserwacja ta potwierdza występowanie dodatkowych, poza produkcją białek killerowych, mechanizmów antagonistycznej aktywności P. membranifaciens, takich jak produkcja enzymów hydrolizujących ścianę komórkową B. cinerea lub rywalizacja o składniki pokarmowe. Wyniki te wskazują, że drożdże killerowe P. membranifaciens i ich toksyny mogą być brane pod uwagę przy opracowaniu preparatów służących skutecznej kontroli rozwoju B. cinerea.
Badano również antagonistyczne oddziaływanie szczepów killerowych Debaryomyces hansenii KI2a, D. hansenii MI1a i W. anomalus BS91 wobec Monilinia fructigena i M. fructicola. Spośród testowanych drożdży najwyższą aktywnością przeciwgrzybiczą in vitro cechowały się D. hansenii KI2a i W. anomalus BS91 poprzez produkcję toksyn killerowych, enzymów hydrolitycznych i lotnych związków organicznych (VOCs – Volatile Organic Compounds). Wspomniane szczepy skutecznie hamowały występowanie brązowej zgnilizny na owocach brzoskwiń i śliw uprzednio inokulowanych fitopatogenami M. fructigena i M. fructicola [31]. Antagonistyczne szczepy D. hansenii i W. anomalus mogą być użyteczne jako składniki aktywne podczas opracowania biofungicydów przeciwko grzybom z rodzaju Monilinia.
Transgeniczne rośliny wytwarzające toksyny killerowe
Jedną z prób rozwiązania problemu chorób grzybowych roślin jest transgeniczna ekspresja peptydów przeciwgrzybiczych. Toksyny killerowe KP4 i KP6, produkowane przez gatunek U. maydis, okazały się skuteczne w uodpornieniu uprawy tytoniu oraz kukurydzy na choroby grzybowe. Dzięki zastosowaniu inżynierii genetycznej geny kodujące toksyny KP4 i KP6 zostały przeniesione do komórek tytoniu za pomocą promotora konstytutywnego wirusa mozaiki kalafiora. Transgeniczna roślina wytwarzała znaczne ilości toksyny KP4, która miała tą samą masę cząsteczkową oraz wykazywała identyczną specyficzność działania, co toksyna KP4, produkowana przez U. maydis. Poziom ekspresji toksyny KP4 w transgenicznym tytoniu był co najmniej 500 razy wyższy niż KP6. Transgeniczne rośliny wydzielające toksynę KP4 były odporne na grzyby patogenne, których antagonistą jest toksynotwórczy szczep U. maydis [41, 59]. Otrzymano również transgeniczną kukurydzę wytwarzającą aktywną toksynę KP4 w ilości wystarczającej do zahamowania rozwoju grzybów patogennych. Ponadto, nie stwierdzono negatywnego wpływu tej toksyny na wzrost roślin transgenicznych [1].
Zastosowanie drożdży killerowych w środowisku morskim
Podejmuje się również próby wykorzystania drożdży killerowych w środowisku wodnym. Choroby zwierząt morskich wywołane przez mikroorganizmy występujące w środowisku wodnym przynoszą znaczne straty ekonomiczne. Patogenem odpowiedzialnym za mleczne zabarwienie tkanek krabów portuników (Portunus trituberculatus) i ich znaczną śmiertelność jest M. bicuspidata WCY. Zastosowanie nystatyny, związku o działaniu przeciwgrzybiczym, skutecznie hamuje wzrost patogenu, jednak nawet w niskich stężeniach jest ona toksyczna dla krabów. Stosowanie kosztownego antybiotyku na otwartym morzu wydaje się również mało racjonalnym postępowaniem z ekonomicznego punktu widzenia [46, 94].
Organizmem antagonistycznym w stosunku do M. bicuspidata WCY jest szczep drożdży W. anomalus YF07b, wyizolowany z jelit żachw (Ascidia). Produkuje on dwa białka killerowe, jedno o masie cząsteczkowej 47 kDa [95], a drugie o masie 67 kDa [32], które są aktywne w obecności chlorku sodu. Szczep drożdży Kluyveromyces siamensis HN12-1 również wykazuje aktywność killerową wobec M. bicuspidata WCY, a optymalne warunki do produkcji toksyny HN12-1 to pH równe 4, temperatura 25°C oraz 0,5% chlorku sodu. Oczyszczona toksyna nie była aktywna wobec protoplastów drożdży patogennych, co sugeruje, że pierwszy etap działania białka najprawdopodobniej polega na oddziaływaniu z receptorami znajdującymi się w ścianie komórkowej drożdży wrażliwych [12]. Psychrotolerancyjny szczep drożdży M. frigida 2E00797, wyizolowany z osadów morskich, produkuje toksynę killerową o masie cząsteczkowej 55,6 kDa, której aktywność killerowa jest najwyższa w środowisku o pH 4,5 oraz w obecności chlorku sodu w stężeniu 6%. Białko to nie tylko działa na patogenne grzyby, wywołujące choroby krabów, lecz jest także cytotoksyczne w stosunku do patogenów człowieka – C. tropicalis oraz C. albicans [35, 47]. Kolejnym szczepem drożdży killerowych o interesujących cechach i potencjalnym zastosowaniu jest W. anomalus HN1-2, wyizolowany z ekosystemu lasu namorzynowego. Odnotowano, że białko killerowe produkowane przez ten szczep działa cytotoksycznie wobec komórek wielu grzybów szeroko rozpowszechnionych w środowisku naturalnym: M. bicuspidata, C. albicans, M. guilliermondii, Lodderomyces elongisporus, Yarrowia lipolytica oraz Kluyveromyces aestuarii [86]. Do grupy toksyn, których producent bytuje w środowisku morskim należy również białko killerowe, wydzielane przez W. saturnus WC91-2, wykazujące antagonistyczne działanie w stosunku do szeregu patogenów: M. bicuspidata WCY, C. albicans, C. tropicalis, Cryptococcus aureus, Y. lipolytica, L. elongisporus. Optymalne warunki środowiska, zapewniające wysoką stabilność tej toksyny to pH w zakresie 3–3,5 i 8% NaCl [93, 96]. Środowisko morskie charakteryzuje się temperaturą i zawartością soli, które są odpowiednie dla zapewnienia wysokiej aktywności killerowej wielu toksyn produkowanych przez drożdże, izolowane ze środowiska wodnego. Lekko zasadowy odczyn wody wykracza poza optymalny zakres pH dla większości toksyn killerowych.
Podsumowanie
Nadal opisywane są nowe szczepy drożdży killerowych, a niektóre z nich (szczególnie należące do rodzajów Wickerhamomyces i Pichia) charakteryzują się szerokim zakresem aktywności antagonistycznej wobec wielu szczepów drożdży i grzybów strzępkowych. Stosunkowo niska stabilność toksyn killerowych, ograniczona do wąskiego zakresu pH i temperatury, zmniejsza możliwości ich potencjalnego zastosowania jedynie do środowisk, które zapewniają odpowiednie warunki fizyko-chemiczne. Użycie toksyn killerowych na szerszą skalę może być również ograniczone z powodu wysokich kosztów izolacji oraz oczyszczania. Prostsze i znacznie tańsze wydaje się stosowanie aktywnych szczepów drożdży, będących ich producentami. Drożdże killerowe i ich toksyny mogą znaleźć potencjalne zastosowanie w wielu dziedzinach, m.in.: w przemyśle fermentacyjnym, jako czynniki biologiczne kontroli chorób roślin, w biotypowaniu szczepów drożdży, a także podczas projektowania nowych środków przeciwgrzybiczych.
Nadal wiele zagadnień związanych ze strukturą toksyn killerowych, mechanizmami ich działania, a także odpowiedzią komórkową mikroorganizmów wrażliwych wymaga poznania. Wyjaśnienie tych wątpliwości pozwoli na opracowanie skuteczniejszych strategii zwalczania niepożądanych mikroorganizmów i stworzy podstawy do szerszego stosowania drożdży killerowych i ich toksyn.
