Regulation of the thioredoxin-dependent system as an element of pharmacotherapy in redox-impaired diseases

Tioredoksyna jest białkiem zawierającym w centrum aktywnym układ reszt cysteinowych, których grupy tiolowe mogą uczestniczyć w reakcjach redoks. Ze względu na miejsce występowania tego białka w komórce wyróżnia się izoformę cytozolową (Trx1) i izoformę mitochondrialną (Trx2), które występują w różnych tkankach organizmu człowieka (tabela 1). Gen kodujący Trx1 jest umiejscowiony na chromosomie 9 człowieka i składa się z pięciu egzonów, przedzielonych czterema intronami, natomiast Trx2 kodowana jest na chromosomie 22 [34, 52]. Istnieje również specyficzna rodzina tioredoksyn występujących w jądrach i plemnikach mężczyzn zawierająca izoformy SpTrx1, SpTrx2 i SpTrx3 [1].

Tioredoksyna występująca w cytozolu (Trx1) jest białkiem o masie 12 kDa [14]. W wyniku biosyntezy powstaje propeptyd zawierający 105 aminokwasów, z którego – w wyniku aktywacji – odłączona zostaje N-końcowa metionina i aktywna Trx1 zawiera 104 aminokwasy z waliną na N-końcu [1]. Natomiast mitochondrialna izoforma tioredoksyny (Trx2) jest biosyntetyzowana jako białko o masie 18 kDa zbudowane ze 166 aminokwasów, a na N-końcu zawiera sekwencję złożoną z 60 aminokwasów, która odpowiada za kierowanie nowo syntetyzowanej cząsteczki tioredoksyny do mitochondrium. Po osiągnięciu mitochondrium białko ulega hydrolizie z odszczepieniem 60-aminokwasowego peptydu, w wyniku czego otrzymuje się aktywne białko o masie 12,2 kDa [1, 65, 93].

Wszystkie izoformy tioredoksyny zawierają w swojej cząsteczce układ przestrzenny zwany „podstawowym motywem tioredoksyny” składający się z 3 α helis (α2, α3, α4) oraz 4 struktur β (β2-β5). Trx1 oraz fragment cząsteczki Trx2 (z wyłączeniem fragmentu odpowiedzialnego za kierowanie białka do mitochondrium), oprócz podstawowego motywu tioredoksyny, zawierają dodatkową α helisę oraz strukturę β w domenie N-końcowej łańcucha polipeptydowego (ryc. 2; struktury oznaczone kolorem jaśniejszym), natomiast tzw. postać skrócona Trx1 (Trx80) pozbawiona jest struktury β5 oraz helisy α4. W domenie N-końcowej tioredoksyny wyróżnia się trzy struktury β i dwie helisy α, połączone ze sobą w sposób naprzemienny. Domena C-końcowa białka składa się z dwóch połączonych ze sobą struktur β i jednej helisy α, która jest elementem skrajnym. Domeny N-końcowa i C-końcowa połączone są ze sobą za pomocą α helisy [47, 52, 89].

Ryc. 2

Istotnym elementem budowy Trx1 oraz Trx2 jest obecność centrum aktywnego (–Cys³²–Gly–Pro–Cys³⁵) umiejscowionego na końcu struktury β2 oraz na początku długiej helisy α2, która odpowiada za antyoksydacyjne działanie tego białka. Reszty cysteiny z centrum aktywnego są ułożone w taki sposób, że bardziej eksponowana na działanie czynników zewnętrznych jest Cys³² (nazywana cysteiną N-końcową centrum aktywnego), natomiast Cys³⁵ (określana jako cysteina C-końcowa centrum aktywnego) jest ukryta [27]. Takie rozmieszczenie przestrzenne umożliwia działanie redukcyjne tioredoksyny, ponieważ w tworzeniu mostka disiarczkowego między tioredoksyną a redukowanym białkiem bezpośredni udział bierze N-końcowa cysteina, natomiast cysteina z pozycji 35 odpowiada za odłączenie cząsteczki redukowanego białka oraz wytworzenie mostka disulfidowego w obrębie tioredoksyny [77]. Zachowanie konserwatywnej sekwencji aminokwasów w centrum aktywnym jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania białka, a modyfikacja składu centrum aktywnego (np. zastąpienie proliny przez serynę lub treoninę) powoduje zmianę konformacji białka, która obniża stabilność cząsteczki, co znacząco wpływa na możliwości redukujące tioredoksyny [18].

Ważnym elementem odróżniającym Trx1 od Trx2 jest obecność dodatkowych reszt cysteinowych w pozycjach 62, 69 i 73 w formie Trx1. Dzięki temu, w warunkach utleniających, gdy ilość Trx1 może być niedostateczna, do uczestniczenia w reakcjach redukcji mogą być włączane kolejne reszty cysteiny. Działanie takie w pierwszej kolejności prowadzi do wytworzenia drugiego mostka disulfidowego między resztami cysteinowymi w pozycjach 62 i 69, a następnie utworzenia homodimeru z mostkiem disulfidowym między resztami cysteiny w pozycji 73 dwóch cząsteczek Trx1. Wpływa to na zwiększenie zdolności antyoksydacyjnych tioredoksyny [87].

Niezależnie od klasycznej, pełnej izoformy Trx1 w organizmie obecna jest również skrócona tioredoksyna 1 (Trx80), gdyż część Trx1 biosyntetyzowanej w warunkach stresu oksydacyjnego ulega skróceniu na C-końcu, a to prowadzi do wytworzenia Trx80 [1, 50]. Izoforma ta o masie 10 kDa zbudowana jest z 80 lub 84 aminokwasów i nie może redukować mostków disulfidowych innych białek, w przeciwieństwie do pełnej izoformy Trx1. Ilość Trx80 w organizmie nie jest powiązana z ekspresją Trx1 i wykazuje działanie podobne do cytokin prozapalnych oraz może stymulować wydzielanie substancji, takich jak np. czynnik martwicy nowotworu TNF-α czy interleukina-1β. Wydzielanie cytokin odbywa się za pośrednictwem monocytów aktywowanych Trx80 (TAMs – Trx80 Activated Monocytes). TAMs hamują również namnażanie bakterii, wykazując działanie podobne do tego, jakie uzyskuje się przez działanie interferonem-γ. Może to sugerować, że monocyty aktywowane przez Trx80 zwalczają infekcje bakteryjne zanim aktywowana zostanie odpowiedź odpornościowa limfocytów T [19]. Zaobserwowano natomiast, że skrócona postać tioredoksyny w komórkach gleju nie wykazuje działania prozapalnego, jakie obserwuje się w komórkach odpornościowych. Ponadto ilość Trx80 w mózgu ulega obniżeniu w niektórych chorobach neurodegeneracyjnych (np. w chorobie Alzheimera), a w tkance kory czołowej pacjentów z chorobą Alzheimera Trx80 występuje głównie w postaci agregatów o masie około 30 kDa [32].

Najmniej poznanymi izoformami tioredoksyny są występujące tylko w plemnikach oraz męskich narządach płciowych SpTrx1, SpTrx2 i SpTrx3 [41]. SpTrx1 zbudowana z 486 aminokwasów jest białkiem o masie 53 kDa, natomiast SpTrx2 i SpTrx3 mają masę odpowiednio 67 i 15 kDa i wszystkie trzy izoformy odpowiadają za dojrzewanie plemników w procesie spermatogenezy. Te izoformy tioredoksyny mają w swojej strukturze 4 dodatkowe cysteiny, dzięki czemu mogą tworzyć zarówno wewnątrzcząsteczkowe, jak i międzycząsteczkowe mostki disiarczkowe. W tych izoformach elementem niezbędnym do ich aktywności biologicznej jest domena N-końcowa, gdyż jej usunięcie z cząsteczki SpTrx prowadzi do znacznego spadku aktywności antyoksydacyjnej [41]. Najmniejsze z białek (SpTrx3) jest umiejscowione w aparacie Golgiego i przypuszcza się, że uczestniczy w hamowaniu aktywności biologicznej plemników, gdyż zwiększoną ekspresję izoformy tioredoksyny zaobserwowano w plemnikach niepłodnych mężczyzn [1, 41].

Tioredoksyna występuje zarówno w środowisku wewnątrzkomórkowym, jak i zewnątrzkomórkowym i w zależności od umiejscowienia może pełnić różne funkcje. Wewnątrz komórki najwięcej tioredoksyny jest w cytoplazmie, gdzie reguluje warunki utleniająco-redukujące [52]. Jednocześnie Trx reguluje aktywność czynników transkrypcyjnych w sposób bezpośredni (NF-κB) lub pośredni (AP-1 przez oddziaływanie z czynnikiem jądrowym Ref-1) [2]. Pod wpływem stresu oksydacyjnego, zarówno Trx1, jak i NF-κB migrują z cytoplazmy do jądra. Aby móc połączyć się z DNA i rozpocząć biosyntezę białek prozapalnych, czynnik transkrypcyjny musi mieć zredukowaną resztę cysteiny w pozycji 62. Obecna w jądrze Trx1 redukuje cysteinę cząsteczki NF-κB, przez co odgrywa ważną rolę w regulacji biosyntezy białek [52]. Na zewnątrz komórki tioredoksyna wydzielana jest głównie w postaci Trx80 i pełni wtedy funkcję cytokiny chemotaktycznej [50, 56].

Enzymem odpowiedzialnym za redukcję utlenionej postaci tioredoksyny jest reduktaza tioredoksyny (TrxR) obecna w komórkach organizmów żywych. TrxR jest selenoenzymem zaliczanym do grupy flawoenzymów [78]. TrxR, przez redukcję tioredoksyny oddziałującej następnie z peroksydazą tioredoksyny, bierze udział (w sposób pośredni) w redukcji nadtlenków, w tym nadtlenku wodoru i nadtlenków lipidów.

Reduktaza tioredoksyny zawiera grupę prostetyczną FAD, domenę wiążącą NADPH, domenę interfejsu oraz centrum aktywne umiejscowione na C-końcu (ryc. 3). Struktura TrxR człowieka jest podobna do struktury GR, bowiem oba enzymy mają centrum aktywne na N-końcu zawierające motyw złożony z takich samych aminokwasów [12]. W centrum aktywnym TrxR, umiejscowionym na C-końcu jest obecna jedna cysteina oraz jedna selenocysteina (–Gly– Cys⁴⁹⁷–SeCys⁴⁹⁸–Gly–), a w obrębie domeny FAD znajduje się sekwencja –Cys⁵⁹–Val–Asn–Val–Gly–Cys⁶⁴–. Istotnym elementem aktywności reduktazy tioredoksyny jest reszta selenocysteiny obecna w sekwencji na C-końcu enzymu. Ważnym jest również to, że nawet przy niewielkim niedoborze Se aktywność TrxR utrzymuje się na dostatecznym poziomie, podczas gdy inne selenoenzymy, w tym GPx, tracą aktywność biologiczną, co świadczy o znaczeniu TrxR w utrzymania homeostazy redoks [26, 47].

Ryc. 3

Istotnym dla aktywności biologicznej TrxR jest występowanie tego enzymu w postaci homodimeru. Cząsteczki TrxR są ułożone w przestrzeni w taki sposób, że miejsce aktywne na N-końcu jednej cząsteczki sąsiadują z cysteinami obecnymi na C-końcu drugiej molekuły, co jest ważne dla działania enzymu. Taka organizacja struktury przestrzennej enzymu pozwala na swobodny przepływ elektronów podczas reakcji redoks [19, 47].

W organizmie człowieka TrxR występuje w trzech izofor-mach. TrxR1 jest izoformą reduktazy tioredoksyny obecną w cytozolu, zawierającą 499 aminokwasów o masie 55 kDa, natomiast TrxR2 jest jego mitochondrialnym odpowiednikiem zbudowanym z 524 aminokwasów. Różnicą między tymi izoformami jest obecność domeny mitochondrialnej w TrxR2 złożonej z 33 aminokwasów, umiejscowionej na N-końcu enzymu, która odpowiada za mitochondrialną translokację cząsteczek enzymu. Trzecią izoformą reduktazy tioredoksyny jest TrxR3 o masie 65 kDa złożona z 560 aminokwasów. Znajduje się w jądrze i wykazuje zdolność do redukcji zarówno tioredoksyny, jak i glutationu, dlatego jest określana jako reduktaza tioredoksynowo-glutationowa (TGR) [12, 73]. TGR wyróżnia się dodatkową domeną glutaredoksyny na N-końcu enzymu, dzięki czemu może działać jak reduktaza tioredoksyny, reduktaza glutationowa oraz glutaredoksyna, której celem jest redukcja mieszanych disulfidów białek powstających w procesie m.in. glutationylacji [23].

Glutaredoksyny (Grx) są białkami, które podobnie jak tioredoksyna, zawierają dwie cysteiny w centrum aktywnym w układzie –Cys–XXX–XXX–Cys–. Ich głównym zadaniem jest redukcja mieszanych disiarczków białek [31]. Zasadnicza różnica między Grx a Trx polega na tym, że do działania redukującego tioredoksyny niezbędna jest reduktaza tioredoksyny, natomiast glutaredoksyny jako źródło elektronów mogą wykorzystywać zredukowany glutation [31, 72]. Grx może działać w oparciu o mechanizm wymiany disulfid-ditiol lub katalizować redukcję substratów poprzez mechanizm monotiolowy [1, 85]. Istotne jest to, że Grx wykazuje takie działanie w warunkach redukujących, natomiast w warunkach utleniających pełni funkcję katalizatora reakcji glutationylacji białek. Znane są postaci cytozolowe (Grx1 i Grx3) oraz mitochondrialne (Grx2 i Grx5) glutaredoksyn [9].

Pełna skuteczność działania układu zależnego od tioredoksyny zależy od aktywności peroksydazy tioredoksyny (TPx), która z tioredoksyną może redukować nadtlenki lipidów oraz nadtlenek wodoru. TPx należy do rodziny białek nazywanych peroksyredoksynami (Prx), które w swoim centrum aktywnym zawierają cysteinę (Prx-SH) podatną na utlenianie. Cząsteczka peroksyredoksyny w wyniku redukcji nadtlenków przechodzi w postać utlenioną Prx-SOH, która w reakcji z inną zredukowaną cząsteczką peroksyredoksyny tworzy disiarczek (Prx-S-S-Prx) z jednoczesnym wydzieleniem wody. TPx zawiera Cys⁴⁷ i Cys¹⁷⁰, które uczestniczą w redukcji nadtlenków. Tak odległe ułożenie cystein sprawia, że nie jest możliwe wytworzenie wewnątrzcząsteczkowego mostka disulfidowego.

W związku z tym utleniona TPx występuje w postaci dimerów, w których występują dwa międzycząsteczkowe mostki w układzie Cys⁴⁷–Cys¹⁷⁰ [75]. Działanie tego enzymu wymaga obecności zredukowanej tioredoksyny. Zredukowana Trx redukuje reszty cysteinowe TPx, które następnie redukują cząsteczki nadtlenków obecnych w pobliżu enzymu [74, 75]. TPx skutecznie usuwa nadtlenki z komórek, chroniąc w ten sposób inne cząsteczki przed uszkodzeniami, jakie mogą być wywoływane przez ROS [51]. Skuteczność tego enzymu jest porównywalna do peroksydazy glutationowej w usuwaniu nadtlenku wodoru [30].

Do tzw. nadrodziny tioredoksyny zaliczane są również białka, które zawierają charakterystyczną dla tioredoksyny sekwencję centrum katalitycznego z dwiema cysteinami. Białka te oznaczane są jako TRPxx, xx wskazuje na jego masę cząsteczkową. Do tej grupy zalicza się TRP14, białko o masie 14 kDa wyizolowane, z mózgu szczura, które zbudowane jest ze 123 aminokwasów, a w centrum aktywnym zlokalizowanym na początku helisy α2 (podobnie jak w Trx) zawiera sekwencję –Trp–Cys⁴³–Pro–Asp–Cys⁴⁶–.

TRP14 ma w cząsteczce łącznie pięć reszt cysteiny, ale jedynie te obecne w centrum aktywnym, ze względu na przestrzenne ułożenie w białku, są eksponowane i podatne na działanie czynników utleniających. TRP14 nie wykazuje działania redukującego w porównaniu do niektórych typowych dla tioredoksyny substratów (np. Prx, RNR), ale uczestniczy w redukcji nitrozotioli oraz cystyny. Ponadto utleniona TRP14 jest substratem TrxR1 [10, 24, 88].

Innym białkiem powiązanym z Trx jest TRP32 zbudowane z 289 aminokwasów o charakterystycznej masie 32 kDa. TRP32 występuje w cytoplazmie komórek człowieka. W jego strukturze można wyróżnić fragment N-końcowy (100-aminokwasowy), który ma znacznie większe podobieństwo w porównaniu do sekwencji ludzkiej tioredoksyny. TRP32 zawiera również domenę C-końcową o nieznanej funkcji złożoną ze 190 aminokwasów (określaną jako DUF1000 lub PITH) [33].

Analiza DUF1000 wykazuje identyczność (na poziomie 99%) między sekwencją ludzkiego TRP32 a białkiem wyizolowanym od myszy. Zaobserwowano, że skuteczność redukcji mostków disulfidowych za pośrednictwem TRP32 jest znacznie niższa niż analogiczna reakcja z udziałem Trx1. Uważa się, że wynika to z tego, że glicyna występująca bezpośrednio przed centrum aktywnym w Trx1 zastąpiona jest w TRP32 przez tryptofan. Stwierdzono, że TRP32 powoduje redukcję utlenionej fosfatazy regenerującej wątrobę (PRL), która odpowiada za tworzenie przerzutów w procesie nowotworowym. Sugeruje się, że białko TRP32 może być głównym elementem uczestniczącym w procesie przerzutowania [40].

W retikulum endoplazmatycznym (ER) komórek człowieka występują cztery białka transbłonowe (określane jako TMX1, TMX2, TMX3 i TMX4), które w centrum aktywnym zawierają sekwencję podobną do tioredoksyny (–Cys– XXX–XXX–Cys–) [25, 61, 80]. Białka TMX1, TMX3 i TMX4 zawierają domeny transbłonowe, odpowiednio –Cys–Pro–Ala–Cys–, –Cys–Gly–His–Cys– i –Cys–Pro–Ser–Cys– oraz sekwencję sygnałową odpowiadającą za kierowanie biosyntetyzowanego białka do ER [28]. TMX4 jest białkiem transbłonowym, którego domena analogiczna do tioredoksyny skierowana jest w stronę światła ER. W badaniach in vitro potwierdzono, że domena ta jest zdolna do redukcji innych białek, co wskazuje, że TMX4 może pełnić funkcję reduktora w środowisku retikulum endoplazmatycznego [80]. TMX2, podobnie jak TMX1, TMX3 i TMX4 zawiera dwie ostatnie domeny, ale w sekwencji obecnej w centrum katalitycznym w miejscu jednej z cystein obecna jest seryna (–Ser–Asn–Asp–Cys–), w wyniku czego białko to nie działa redukująco, jak wszystkie białka z rodziny tioredoksyny [36, 61, 86].