Somatic Coliphages as an Indicator in Drinking Water Quality Assessment

Systematyczna kontrola wskaźników zanieczyszczenia kałowego, takich jak Escherichia coli czy enterokoki kałowe jest jednym z głównych elementów zapewnienia odpowiedniej jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi pod względem mikrobiologicznym [10, 15, 51, 66]. W zanieczyszczonych wodach ze względu na obecność w dużej liczbie bakterii E. coli, w więk szości przypadków monitoring tego parametru powinien zapewniać wysoki stopień bezpieczeństwa wody oraz wiarygodności co do jej jakości [66]. Jednak wyniki niektórych badań wskazują również na niedoskonałości wykorzystania E. coli jako organizmu wskaźnikowego między innymi względem wirusów chorobotwórczych, czy pierwotniaków pasożytniczych. Wirusy i pierwotniaki są bardziej odporne na warunki środowiskowe i konwencjonalne technologie uzdatniania, w tym filtrację i dezynfekcję, a tym samym mogą być obecne w uzdatnionej wodzie do picia pomimo niewykrywalności bakterii E. coli [15, 29, 66]. Stąd prowadzone są poszukiwania wskaźników wzmacniających kontrolę i podnoszących bezpieczeństwo wody. Jednocześnie pojawiają się zalecenia ekspertów, aby podejmować działania w kierunku włączenia nowych parametrów mikrobiologicznych do rutynowych badań wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi [67]. Jednym z proponowanych rozwiązań jest rozszerzenie wykonywanych badań o analizy w kierunku wykrywania wirusów bakteryjnych (bakteriofagów, w skrócie fagów) w wodzie. Mogą one być użyteczne jako wskaźniki zanieczyszczenia kałowego oraz „organizmy” modelowe przydatne w ocenie skuteczności usuwania z wody wirusów chorobotwórczych, za pomocą procesów filtracji lub efektywności procesów dezynfekcji [7, 8, 15, 18, 48, 54, 65, 66]. Wśród licznej grupy przedstawicieli fagów bakteryjnych, duże zainteresowanie w zakresie ich wykorzystania do powyższych celów wzbudzają colifagi, w tym colifagi somatyczne oraz F-specyficzne bakteriofagi RNA [16, 17, 18, 19, 21, 27, 29, 46]. Znalazło to również potwierdzenie w dyrektywie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2020/2184 z dnia 16 grudnia 2020 r., która wprowadza colifagi somatyczne jako nowy parametr operacyjny oznaczany w wodzie surowej, w celu kontrolowania skuteczności procesów uzdatniania, w odniesieniu do ryzyka mikrobiologicznego [10].

Bakteriofagi infekujące E. coli, jak również inne rodzaje bakterii należące do grupy coli określane są jako colifagi [15, 46, 66]. Wśród nich, dwie podstawowe grupy brane są pod uwagę jako wskaźniki jakości wody: colifagi somatyczne oraz F-specyficzne bakteriofagi RNA. Te dwie grupy różnią się między sobą przede wszystkim rodzajem kwasu nukleinowego, z którego zbudowany jest genom oraz mechanizmem infekowania komórki E. coli. Colifagi somatyczne posiadają genom w postaci dsDNA lub ssDNA i infekują komórki bakteryjne (komórki gospodarza) poprzez wiązanie się z receptorami występującymi na powierzchni komórki. Natomiast F-specyficzne bakteriofagi RNA (colifagi F-RNA) posiadają genom w postaci ssRNA i wywołują zakażenie poprzez adhezję do fimbrii płciowych E. coli, które wytwarzane są tylko przez bakterie będące nosicielami plazmidu płciowego F [46, 66]. Fagi te podzielono na grupy serologiczne I–IV, których genotypy identyfikowane są przy użyciu technik molekularnych [66]. Ze względu na wskaźnikowy charakter wykorzystania obu grup, wskazuje się również na podobieństwa colifagów somatycznych do adenowirusów, a F-specyficznych bakteriofagów RNA między innymi do enterowirusów, astrowirusów, czy wirusów zapalenia wątroby typu A i E [27]. Colifagi somatyczne to przedstawiciele licznych rodzin bakteriofagów (Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Microviridae) wykazujące różne typy morfologiczne [21, 27]. W przeciwieństwie do nich, F-specyficzne bakteriofagi RNA tworzą grupę podobnych morfologicznie fagów należących do rodziny Leviviridae (Tabela I).

Colifagi są niepatogenne dla ludzi i wydalane z kałem przez zwierzęta stałocieplne [8, 15, 18, 27]. Colifagi somatyczne namnażają się w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt, ale nie tylko, ponieważ w naturalnych środowiskach wodnych do replikacji mogą wykorzystywać jako gospodarzy inne bakterie niż E. coli, m.in. bakterie z rodzaju Klebsiella spp., Shigella sp. [18, 21]. W odróżnieniu od nich, replikacja colifagów F-RNA zachodzi głównie w przewodzie pokarmowym zwierząt stałocieplnych, a nie ma miejsca w warunkach środowiskowych [18, 29].

Bakteriofagi są jedną z najliczniejszych grup organizmów występujących na Ziemi. Ich obecność była wykrywana w wodach głębinowych, powierzchniowych, ściekach oraz w glebie [8, 22, 26, 35, 62]. Colifagi somatyczne są wydalane z kałem przez większość ludzi i zwierząt [8, 15, 18, 29, 66]. F-specyficzne bakteriofagi RNA wydalane są natomiast przez ludzi i zwierzęta w różnym, zwykle niższym, odsetku [8, 66]. Colifagi F-RNA z grupy I i IV wykrywano dotychczas wyłącznie w odchodach zwierząt (głównie bydła), natomiast fagi z grupy III wykrywane były w odchodach ludzkich. Fagi z grupy II wykrywano zasadniczo tylko w odchodach ludzkich, poza przypadkiem stwierdzenia ich w 28% próbek kału świń [8, 66]. Colifagi somatyczne mogą występować w dużych ilościach w ściekach i zanieczyszczonych środowiskach wodnych [15]. Liczba cząstek colifagów somatycznych w ściekach może wynosić nawet 10⁶–10⁸ na litr [4, 18, 36]. Według niektórych autorów liczba colifagów somatycznych w ściekach i wodzie surowej może 2–5-krotnie przewyższać liczbę colifagów F-RNA i około 500-krotnie liczbę ludzkich wirusów patogennych [18, 27]. Zarówno colifagi somatyczne jak i F-specyficzne bakteriofagi RNA wykrywane są w wodach jezior i rzek w liczbie do 10⁵ cząstek na litr [18].

Badania nad częstością występowania bakteriofagów, w tym colifagów w środowisku wodnym prowadzone są od wielu lat [8, 17, 18, 21, 22, 26, 29, 37, 68]. Niestety dane nie są spójne, między innymi ze względu na wiele czynników, które wpływają na występowanie, zdolność przetrwania i rozwój fagów w różnych środowiskach wodnych. Wśród tych czynników, należy wymienić liczebność komórek gospodarza, jak i samych wirusów, zdolność wirusów do adhezji do cząstek stałych, obecność zwłaszcza materii organicznej, która wpływa na aktywność metaboliczną bakterii, promieniowanie słoneczne, temperaturę, pH, stężenie i rodzaj jonów w wodzie oraz aktywność metaboliczną mikroorganizmów innych niż bakterie gospodarza [61].

Wpływ czynników środowiskowych na zdolność przetrwania fagów była badana w warunkach laboratoryjnych oraz środowiskowych [22]. Danych uzyskanych w warunkach środowiskowych jest jednak znacznie mniej. Wpływ temperatury, światła słonecznego, zasolenia, pH na colifagi w dużej mierze związany jest z ich morfologią. Wykazano, że takie cechy jak obecność ogonków, duże kapsydy i brak otoczki wpływają na ich większą odporność na czynniki zewnętrzne [22]. Przy czym z powodu wielu zmiennych, które wpływają na zdolność przetrwania i replikację fagów, trudno jest usystematyzować i przewidzieć występowanie oraz zachowanie fagów w środowisku wodnym.

Colifagi somatyczne są przez wielu autorów uznawane jako organizmy użyteczne w celu oceny skuteczności procesów oczyszczania wody i ścieków [15, 19, 50]. Colifagi, lepiej niż kałowe bakterie wskaźnikowe naśladują utrzymywanie się patogennych wirusów w środowisku i podczas procesu oczyszczana wody oraz ścieków. Redukcja wirusów jelitowych człowieka oraz colifagów może przebiegać w podobny sposób na różnych etapach procesu oczyszczania ścieków [15, 19, 50, 64]. Według wielu doniesień, colifagi somatyczne przewyższają liczbą colifagi F-RNA w ściekach nieoczyszczonych oraz oczyszczonych [3, 14, 17, 18]. Ze względu na złożoność i wieloetapowość procesu oczyszczania ścieków, trudno jest wyciągnąć wnioski na podstawie publikowanych wyników badań, które nie dostarczają informacji co do specyfiki badanej matrycy oraz o warunkach procesu (np. pH, temperatura, dawka UV, stężenie lub forma stosowanego chloru itp.). Według danych z piśmiennictwa oczyszczanie ścieków z wykorzystaniem osadu czynnego pozwala na redukcję liczby colifagów somatycznych o 2–2,4 log₁₀ [3, 50]. Natomiast stosując filtrację (m.in. z użyciem filtrów piaskowych, antracytowych czy antracytowo-piaskowych) odnotowano redukcję o ok. 0,5 log₁₀. Dezynfekcja ścieków środkami na bazie chloru oraz stosowanie promieniowania UV skutkowała redukcją o ok. 0,5 log₁₀ [50]. Porównując poziom redukcji liczby (log₁₀) na różnych etapach oczyszczania ścieków, colifagi (w tym somatyczne), wykazywały wartości bliskie enterowirusom (ok. 3–4 log₁₀), podczas gdy bakteryjne wskaźniki zanieczyszczenia kałowego redukowane były na poziomie 5–6 log₁₀ [50]. Według raportu z badań przeprowadzonych przez Rose i wsp. (2004), poziom zanieczyszczenia colifagami i wirusami w próbkach pobranych ze ścieków wpływających do sześciu analizowanych oczyszczalni nie był znacząco różny. Z kolei poziom zanieczyszczenia colifagami w próbkach ścieków wypływających z oczyszczalni, różnił się w zależności od stosowanych w danej oczyszczalni technologii [50]. Chociaż nie zaobserwowano korelacji między stężeniem colifagów i enterowirusów w oczyszczonych próbkach, autorzy stwierdzili, że w oparciu o poziom colifagów można wykluczyć obecność enterowirusów. Poziomy poniżej 10 pfu/100 ml (zarówno colifagów F-RNA lub colifagów F-RNA w połączeniu z colifagami somatycznymi) wskazywały, że w próbkach tych nie były wykrywane enterowirusy [50].

Wirusy są obligatoryjnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi i mogą replikować się tylko w żywych komórkach gospodarza, powodując ich lizę. Właściwość ta leży u podstawy metod hodowlanych do oznaczania bakteriofagów, w tym colifagów somatycznych. Metody hodowlane są powszechnie stosowane ze względu na łatwość wykonania, niezawodność, niskie koszty i brak konieczności posiadania szczególnego wyposażenia laboratorium. Wadą ich jest to, że są pracochłonne, a wynik otrzymywany jest w czasie dłuższym niż jeden dzień roboczy. Dodatkowo badania próbek wody o dużych objętościach oraz próbek o niskiej liczbie fagów mogą wymagać przeprowadzenia dodatkowego etapu – zatężania. Alternatywnie możliwe jest zastosowanie coraz bardziej powszechnych szybkich testów, które są mniej pracochłonne, nie wymagają wstępnego zatężania próbek i umożliwiają uzyskanie wyników w krótszym czasie.

Największe ryzyko zagrożenia dla zdrowia ludzi związane z wodą pochodzi od patogenów kałowych, przenoszonych na skutek nieodpowiednich warunków sanitarnych, braku higieny i ochrony ujęć wody. Patogeny bytujące w wodzie (m.in. wirusy, bakterie, pierwotniaki) mogą powodować poważne i długotrwałe skutki zdrowotne. Głównym celem stosowania wskaźników mikrobiologicznych do oceny jakości wody, jest wskazanie na obecność organizmów patogennych, przede wszystkim pochodzenia kałowego. Obecnie ocena jakości wody do picia pod względem mikrobiologicznym oparta jest przede wszystkim na analizie parametrów bakteriologicznych [29]. O ile wskaźniki bakteryjne takie jak E. coli oraz enterokoki spełniają swoją rolę w stosunku do oceny występowania w wodzie bakterii chorobotwórczych, to w przypadku oceny występowania patogennych wirusów jelitowych nie dają już takiej pewności [8, 18, 28, 66]. Wirusy znacznie różnią się od bakterii zarówno pod względem budowy, przeżywalności w środowisku wodnym, odporności na środki dezynfekcyjne czy procesy uzdatniania wody [22, 66]. Okres infekcyjny u większości wirusów jelitowych w wodzie o temperaturze 20°C jest długi i wynosi ponad 1 miesiąc, z kolei w przypadku występujących w wodzie bakterii chorobotwórczych okres ten jest zwykle krótki, do 1 tygodnia lub średni od 1 tygodnia do 1 miesiąca [22, 66]. Wiele gatunków wirusów jest mniej wrażliwych niż bakterie, na konwencjonalne technologie uzdatniania wody, w tym filtrację i dezynfekcję [8, 19, 66]. W związku z powyższym wirusy chorobotwórcze mogą być obecne w uzdatnionej wodzie do picia, mimo nie wykrycia standardowo stosowanego wskaźnika bakteryjnego jakim jest E. coli. Retrospektywne badania występowania epidemii, których źródłem była woda do picia wykazały, że opieranie się jedynie na założeniach związanych z wykrywalnością bakterii E. coli nie zapewnia bezpieczeństwa wody jeżeli chodzi o patogeny należące do innych grup mikroorganizmów, w tym wirusów jelitowych. Stało się to podstawą opinii, że E. coli jest wskaźnikiem niewystarczającym oraz bodźcem do poszukiwania organizmów innych niż bakterie, które byłyby użyteczne jako modele lub zastępcze wskaźniki do oceny zachowania wirusów jelitowych w środowisku wodnym oraz ich wrażliwości na procesy uzdatniania i dezynfekcji wody [15, 27, 66, 67].

Przeprowadzona analiza wyników badań opublikowanych w latach 1999–2019, potwierdziła korelację między występowaniem w wodzie wirusów jelitowych i colifagów somatycznych lub colifagów F-RNA [27]. Wśród analizowanych badań, między innymi praca Skraber i wsp. (2004) potwierdziła korelację między obecnością colifagów somatycznych, a występowaniem enterowirusów i norowirusów w wodzie powierzchniowej. Podobnie Mocé-Llivina i wsp. (2005) wykazali korelację między obecnością colifagów somatycznych i enterowirusów w próbkach wody pobranych z rzek, zanieczyszczonych ściekami. Również Lodder i wsp. (2010) w badaniach prowadzonych na ujęciach wody do picia opartych na rzekach, wskazał na korelację między występowaniem enterowirusów oraz colifagów somatycznych i colifagów F-RNA. W przypadku tych badań nie stwierdzono jednak takiej zależności pomiędzy colifagami somatycznymi a innymi wirusami jelitowymi (reowirusami, norowirusami, czy też rotawirusami).

Wśród najważniejszych cech colifagów somatycznych jako organizmów wskaźnikowych można wymienić: podobieństwo do kontrolowanych patogenów (m.in.: budowa, występowanie, wrażliwość na procesy uzdatniania i środki dezynfekcyjne), brak zdolności do namnażania się w wodzie i dostępność prostych metod badawczych, pozwalających uzyskać wiarygodne wyniki w krótkim czasie [8, 11, 13, 14, 18, 66].

Colifagi somatyczne, przypominają ludzkie wirusy jelitowe pod względem pochodzenia i uwalniania się do środowiska. Podobnie jak wirusy jelitowe mogą replikować się tylko w komórkach gospodarza [8]. W przypadku colifagów są to komórki bakterii E. coli, a w przypadku wirusów jelitowych są to komórki ludzi i innych zwierząt stałocieplnych. Optymalne warunki do replikacji zarówno wirusów jelitowych, jak i colifagów somatycznych, występują w przewodzie pokarmowym tych organizmów [8, 27]. Colifagi somatyczne, podobnie jak ich gospodarz E. coli, mogą występować w prawidłowej mikroflorze układu pokarmowego ludzi i zwierząt, nie powodując zachorowań [66]. Ludzkie wirusy jelitowe są uwalniane do środowiska prawie wyłącznie z przewodu pokarmowego, podobnie jak colifagi somatyczne, infekujące bakterie jelitowe, jakimi są E. coli. Colifagi somatyczne można wykrywać przy użyciu prostych metod badawczych opartych na hodowli na podłożach agarowych, a wyniki dostępne są w czasie 24–48 godzin [11, 13, 14, 22]. Powyższe cechy colifagów somatycznych sprawiają, że wydają się one być lepszym wskaźnikiem wirusów chorobotwórczych niż bakterie E. coli. W związku z tym mogą znaleźć zastosowanie w monitoringu prowadzonym w ramach nadzoru oraz weryfikacji poprawności działań, jako wskaźnik zanieczyszczenia kałowego ujęć wody [10, 27, 63]. Warto jednak zaznaczyć, że colifagi somatyczne, podobnie jak wskaźniki bakteryjne, nie są idealne. Jak opisują niektórzy badacze nie zawsze istnieje bezpośrednia korelacja między liczbą bakteriofagów E. coli a wirusów jelitowych, co nie czyni ich bezwzględnie wiarygodnym wskaźnikiem. Potwierdzono to, izolując wirusy jelitowe z próbek uzdatnionej wody do picia poddanej dezynfekcji, w których standardowe oznaczenia colifagów dawały wynik ujemny [66].

Zapewnienie odpowiedniej ochrony ludzi przed patogenami jelitowymi, w szczególności wirusami i pierwotniakami pasożytniczymi, które mogą występować w wodzie do picia wiąże się z koniecznością wprowadzenia dodatkowych wymagań do zaleceń i przepisów prawnych dotyczących tego obszaru. Na ten aspekt zwracają uwagę również eksperci WHO w rekomendacjach z 2017 r., które są wsparciem dla przeglądu załącznika I do dyrektywy Rady 98/83/WE w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi [67]. Opracowanie to wskazuje na potrzebę włączenia innych mikroorganizmów, między innymi takich jak bakteriofagi (colifagi somatyczne, F-specyficzne bakteriofagi RNA) jako bardziej odpowiednich do identyfikacji zagrożeń mikrobiologicznych, które mogą być nie wykryte przez dotychczas stosowane wskaźniki.

Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2020/2184 z dnia 16 grudnia 2020 r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi, wprowadza colifagi somatyczne jako dodatkowy wskaźnik do programu monitoringu operacyjnego, przy czym zwraca uwagę, że powinno to następować w odniesieniu do lokalnych okoliczności i wiedzy naukowej. Okoliczności takie mogą obejmować na przykład wykorzystywanie wody z ujęć zanieczyszczonych wirusami jelitowymi i pasożytami lub przypadki podejrzenia wystąpienia tego typu zanieczyszczenia na skutek dopływu ścieków zawierających odchody ludzkie lub ścieków pochodzących od zwierząt hodowlanych. Wartość dopuszczalna dla colifagów somatycznych w wodzie surowej wynosi 50 pfu w 100 ml. Według zapisów w dyrektywie parametr ten powinien być oznaczany w uzasadnionych przypadkach wynikających z oceny ryzyka. W przypadku wykrycia colifagów somatycznych w wodzie surowej w stężeniach powyżej 50 pfu/100 ml, wskazane jest przeprowadzenie analizy procesów na kolejnych etapach uzdatniania, aby oznaczyć wartość logarytmiczną usuwania colifagów przez występujące bariery oraz ocenić, czy ryzyko przedostania się wirusów chorobotwórczych zostało w wystarczającym stopniu zredukowane [10].

Wprowadzenie badań colifagów somatycznych w wodzie powinno stanowić uzupełnienie informacji pozyskanych w oparciu o wyniki badań parametrów bakteryjnych i dawać dodatkowe potwierdzenie, że procesy uzdatniania oraz dezynfekcji spełniają swoją rolę. Jednocześnie oznaczanie tego dodatkowego parametru może być istotnym krokiem w zwiększeniu bezpieczeństwa wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi.