Endophytic Fungi as Potential Producers of Anticancer Compounds

Wzrost zainteresowania poszukiwaniem związków przeciwnowotworowych wytwarzanych przez mikroorganizmy nastąpił po odkryciu taksolu [11]. Taksol (paklitaksel), to tetracykliczny diterpenoidowy związek bioaktywny należący do klasy taksanów. Związek ten występuje w każdym gatunku cisu na świecie (Taxus), ale pierwotnie został wyizolowany z Taxus brevifolia (cis pacyficzny). Paklitaksel jest najskuteczniejszym i najczęściej stosowanym chemioterapeutykiem, wykorzystywanym w leczeniu raka sutka, płuca, jajników i raka szyjki macicy. Podstawowy mechanizm działania paklitakselu związany jest ze zdolnością do destabilizacji mikrotubul i zaburzania ich dynamicznej równowagi [23, 71]. Wykazano m.in. silną aktywność cytotoksyczną taksolu izolowanego z Cladosporium oxysporum wobec testowanych in vitro linii komórek ludzkiego raka HCT15 [35] oraz z izolatów grzyba Grammothele lineata wobec linii komórkowej HeLa [23].

Do wyleczenia około pięciuset pacjentów potrzebny jest 1 kg taksolu, do uzyskania którego wymagane jest 10 ton kory cisów, co odpowiada 300 drzewom [91]. Rosnące zapotrzebowanie na chemioterapeutyki i ograni czona podaż naturalnego taksolu ostatecznie podniosły koszt leku. Półsynteza z wykorzystaniem prekursorów taksoli nie jest w stanie zaspokoić globalnej podaży i zwięk szyła potrzebę znalezienia innych moż-liwych sposobów produkcji taksolu [24]. Alternatywa wytwarzania taksolu pojawiła się wraz z odkryciem endofitycznych grzybów Taxomyces andreanae, wyizolowanych z gatunków Taxus brevifolia, których jednym z wytwarzanych metabolitów wtórnych był paklitaksel [86, 91]. W ostatnich kilku latach opublikowano szereg artykułów, w których wykazywano, że niski poziom taksolu można uzyskać z wielu izolowanych grzybów endofitycznych, nie tylko z gatunków Taxus, ale także z innych roślin (Tab. I).

Kamptotecyna (camptothecin – CPT) to pentacykliczny alkaloid pirochinolinowy, który po raz pierwszy wyizolowano z kory Camptotheca acuminata („chińskie szczęśliwe drzewo”) w 1966 r. [46, 85]. W latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku kamptotecyna została zatwierdzona przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration – FDA) do wstępnych badań klinicznych przeciwko rakowi okrężnicy, pomimo braku znajomości mechanizmu jej działania. Z uwagi na fakt, że kamptotecyna powodowała poważne skutki niepożądane, takie jak zahamowanie czynności szpiku kostnego, wspomniane badania kliniczne zostały przerwane. W następnej dekadzie wykazano, iż aktywność przeciwnowotworowa kamptotecyny jest wynikiem hamowania przez nią topoizomerazy I DNA. To odkrycie wzbudziło ponowne zainteresowanie CPT, jako lekiem i zaowocowało opracowaniem metody terapeutycznej z wykorzystaniem kamptotecyny [56, 87]. Poza CPT, rozpuszczalne w wodzie pochodne kamptotecyny – topotekan i irynotekan – zostały zatwierdzone przez FDA i są stosowane w leczeniu różnych nowotworów, głównie jajnika, płuca i jelit. Niestety, ekstrakcja CPT z ograniczonych naturalnych zasobów roślinnych, nie zaspokaja rosnącego zapotrzebowania rynku na ten związek. Ze względu na niską zawartość kamptotecyny w roślinach (około 1 mg/g suchej masy), ponownie istotne staje się poszukiwanie alternatywnych źródeł i opracowanie nowych metod otrzymywania CPT do zastosowań klinicznych [46]. Pierwsze informacje o produkcji kamptotecyny przez grzyby endofityczne zanotowano w 2005 roku [67]. Od tego czasu zwiększyło się zainteresowanie wytwarzaniem CPT i jego pochodnych przez grzyby endofityczne. W literaturze można znaleźć informacje na temat skuteczności działania kampotecyny produkowanej przez endofity względem różnych nowotworów. W badaniach in vitro potwierdzono np. wysoką cytotoksyczność kamptotecyny izolowanej z grzybów endofitycznych Fusarium solani ATLOY-8 względem linii komórkowej reprezentującej raka sutka – MCF-7 [20]. W przypadku kampotecyny izolowanej z Alternaria burnsii cytotoksyczność potwierdzono względem pięciu niezależnych linii komórkowych: MCF7, SKOV3, H1299, HT29 i HEK293T, z których to linii każda reprezentuje inny nowotwór (odpowiednio: rak sutka, rak jajnika, rak płuca, rak jelita grubego) i immortalizowane embrionalne komórki nerki (linia HEK293T) [57]. Zestawienie danych literaturowych z przedstawionego zakresu tematycznego przedstawiono w tabeli II.

Podofilotoksyna (podophyllotoxin – PTOX) to naturalny środek leczniczy, należący do grupy lignanów, występujący w podofilinie, żywicy wytwarzanej przez rośliny z rodzaju Podophyllum. PTOX została po raz pierwszy wyizolowana w 1880 r. z północnoamerykań-skiej rośliny Podophyllum peltatum L., zwanej potocznie amerykańską mandragorą lub majowym jabłkiem. Ten naturalny produkt został również wyizolowany z Podophyllum emodi (Indian podophyllum) [6]. Mechanizm działania podofilotoksyny związany jest z hamowaniem polimeryzacji tubuliny. Podofilotoksyna przyłącza się do tubuliny w domenie kolchicyny, co wpływa hamująco na tworzenie się mikrotubul i powoduje zablokowanie cyklu komórkowego w metafazie. Podofilotoksyna nie jest klinicznie użytecznym lekiem przeciwnowotworowym ze względu na wysoką toksyczność. Półsyntetyczne pochodne PTOX, takie jak etopozyd, tenipozyd i etopofos są natomiast wykorzystywane w leczeniu wielu rodzajów nowotworów, w tym raka szyjki macicy i raka sutka. Wymienione pochodne hamują aktywność topoizomerazy II, która jest niezbędna do replikacji DNA i podziału komórek [7, 98, 100]. Z powodu nadmiernej ekstrakcji i powolnego wzrostu rośliny Podophyllum zalicza się do zagrożonych gatunków roślin. W związku z powyższym, w celu utrzymania stałego zaopatrzenia w podofilotoksyny do wytwarzania cząsteczek przeciwnowotworowych, istnieje pilna potrzeba poszukiwania alternatywnych źródeł do izolacji tego chemioterapeutyku. Wśród dostępnych organizmów badano grzyby endofityczne pod kątem ich potencjału do produkcji podofilotoksyny. He i wsp. określali wpływ podofilotoksyny będącej metabolitem wtórnym grzybów endofitycznych izolowanych z Ginko biloba względem komórek raka szyjki macicy – linii HeLa. Efektem przeprowadzonych badań było wyraźne hamowanie proliferacji komórek HeLa, sprzyjanie ich apoptozie i blokowanie ich migracji [39]. Zdolność produkcji podofilotoksyny potwierdzono dla innych gatunków grzybów endofitycznych. Zestawienie danych źródłowych z tego zakresu przedstawiono w tabeli III.

Winblastyna (vinblastine – VBL) i winkrystyna (vincristine – VCR) należą do terpenoidowych alkaloidów indolowych (terpenoid indole alkaloid – TIA) izolowanych z Catharanthus roseus L., (barwinek różowy) rośliny o silnym znaczeniu leczniczym, należącej do rodziny Apocynaceae [3]. Winblastyna i winkrystyna są ważnymi środkami przeciwnowotworowymi, które są wytwarzane przez dimeryzację alkaloidów pochodzenia roślinnego, katarantyny i windoliny [17]. Ich odkrycie zdefiniowało ważny mechanizm działania przeciwnowotworowego, (obecnie uważanego za najbardziej skuteczny w onkologii), obejmujący hamowanie mitozy poprzez wiązanie tubuliny i hamowanie polimeryzacji mikrotubul. Głównym mechanizmem działania winkrystyny jest wpływ na układ mikrotubularny i na dynamikę powstawania wrzeciona mitotycznego. Formuła winkrystyny ułatwia wiązanie białka tubuliny i zapobiega separacji chromosomów w momencie metafazy, ostatecznie prowadząc do śmierci komórki. W mechanizmie działania przeciwnowotworowego winkrystyny ważne jest również zaburzenie transportu wewnątrzkomórkowego i zmniejszenie przepływu krwi przez tkankę nowotworową, prawdopodobnie z powodu hamowania angiogenezy [4, 18, 38].

Winblastyna jest stosowana w leczeniu ziarnicy złośliwej (choroby Hodgkina), chłoniaków nieziarniczych, raka jąder, raka sutka, płuca i innych typów nowotworów. Winkrystyna natomiast znalazła swoje zastosowanie w terapii ostrej białaczki limfoblastycznej, w leczeniu ziarnicy złośliwej, chłoniaków nieziarniczych, mięsaków i wielu innych rodzajów nowotworów oraz niezłośliwych zaburzeń hematologicznych [13, 18, 38]. Duże znaczenie farmakologiczne omawianych alkaloidów indolowych kontrastuje z ich niewielką zawartością w roślinie (około 0,0005%). Ze względu na znaczenie, wysoką cenę i niewielkie ilości alkaloidów w Catharanthus roseus próby zwiększenia produkcji tych związków doprowadziły do szeroko zakrojonych badań nad tą rośliną. Kładzie się również nacisk na potrzebę izolacji różnorodnych nisz endofitów z barwinka różowego, celem zwiększenia możliwości pozyskiwania terpenoidowych alkaloidów indolowych o działaniu przeciwnowotworowym [48, 99]. Efektem przeprowadzonych badań in vitro było wykazanie dzia-łania cytotoksycznego winkrystyny i winblastyny produkowanych przez grzyby endofityczne, w tym Nigrospora sphaerica względem linii komórkowej raka sutka MDA-MB 231 [9] oraz Alternaria alternata względem linii komórkowych MCF-7 i HepG-2, reprezentujących kolejno: raka sutka i pierwotnego raka wątroby [29]. Literaturowe doniesienia ostatnich lat dotyczące grzybów endofitycznych wytwarzających winblastynę i winkrystynę oraz odpowiadające im rośliny żywicielskie zebrano w tabelach IV oraz V.

Cytochalazyny są częścią dużej grupy metabolitów zwanych cytochalazami i zawierają różnorodne struktury hybrydowe poliketydowo-aminokwasowe o szerokim zakresie charakterystycznych funkcji biologicznych o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, przeciwpaso-żytniczym, przeciwwirusowym i przeciwnowotworowym [32]. Związki te stanowią wtórne metabolity grzybów i jak wykazano w ponad trzech tysiącach publikacji (dane z bazy NCBI PubMed), wywierają one różny wpływ na komórki zdrowe i nowotworowe. Cytochalazyny są toksynami mikogennymi, które wiążą aktynę, blokując w ten sposób polimeryzację. W konsekwencji tworzenie mikrowłókien jest znacznie zahamowane, a to z kolei wpływa na morfologię komórek, zmienia ich cytoszkielet, hamuje procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, zdolność do adhezji, transport wewnątrz- i międzykomórkowy, podziały komórkowe, a nawet indukuje regulowaną śmierć komórek, taką jak apoptoza. Inwazyjność guza i potencjał przerzutowy są ściśle związane z deregulacją cytoszkieletu aktynowego, dlatego cytochalazyny uznaje się za potencjalne leki przeciwnowotworowe. Spośród ponad 60 związków, najszerzej wykorzystywane w badaniach przeciwnowotworowych to cytochalazyny B, D i H [83, 90, 94].

Większość cytochalazyn jest wyposażona w 9 do 15-członowy pierścień makrocykliczny, który czasami może podlegać różnej wewnątrzcząsteczkowej rearan-żacji, tworząc różne układy pierścieniowe Ze względu na występowanie unikalnego rusztowania chemicznego w budowie cytochalazyn ich synteza chemiczna jest bardzo kosztowna [83, 90]. Początkowo doniesienia o występowaniu cytochalazyn ograniczały się do makroskopowych grzybów lądowych [1, 92], jednak w ostatnich latach zwiększyło się zainteresowanie produkcją cytochalazyn przez grzyby endofityczne w aspekcie ich potencjału przeciwnowotworowego [61]. Dotychczasowe osiągnięcia wskazują duże możliwości wykorzystania grzybów endofitycznych do produkcji cytochalazyn. Wykazano aktywność przeciwnowotworową cytochalazyny H izolowanej z Diaporthe phaseolorum-92C względem linii komórkowych reprezentujących raka sutka MDA-MB-231 i MCF-7 [16] oraz cytochalazyn będących metabolitami wtórnymi Xylaria sp. CFL5 skutecznych względem komórek gruczolakoraka żołądka – linii AGS [53]. Wyizolowano także nową cytochalazynę z grzyba endofitycznego Trichoderma harzianum wykazującą działanie cytotoksyczne względem linii komórkowej mysiego chłoniaka (L5178Y) i przeciwko liniom komórkowym ludzkiego raka jajnika (A2780) [19]. Opisane doniesienia literaturowe z lat 2015–2021 dotyczące grzybów endofitycznych produkujących cytochalazyny o działaniu cytotoksycznym zestawiono w tabeli VI.