How high-risk HPV induces an optimal environment for own replication in the differentiating epithelium

Wirusy brodawczaka ludzkiego (HPV, human papillomaviruses) to małe wirusy DNA, które infekują nabłonek skóry lub błon śluzowych w różnych miejscach anatomicznych człowieka, w tym drogi odbytowo-płciowe i jamę ustną [1]. Spośród ponad 220 zidentyfikowanych dotychczas typów HPV około 48 infekuje błonę śluzową lub skórę człowieka. Typy skórne najczęściej powodują brodawki, które rzadko są związane ze zmianą nowotworową [1, 2, 3]. Natomiast te, które wykazują tropizm do błon śluzowych człowieka, mają różne znaczenie kliniczne, a Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem (IARC, International Agency for Research on Cancer) rekomenduje ich podział na trzy grupy:

Typy niskiego ryzyka powodują łagodne brodawki narządów płciowych i rzadko prowadzą do nowotworu. Do typów prawdopodobnie wysokiego ryzyka zalicza się te, dla których związek z onkogenezą nie został jednoznacznie potwierdzony. Grupa wysokiego ryzyka obejmuje onkogenne typy HPV, spośród których HPV16, 18, 31 i 45 są związane prawie z 99% wszystkich raków macicy [2] i około 30% raka jamy ustnej i gardła (głównie HPV16) [6]. Szacuje się, że rak jamy ustnej i gardła związany z HPV wkrótce może przewyższyć raka szyjki macicy jako wiodący nowotwór związany z HPV [1, 7]. Wprawdzie tylko niewielka frakcja infekcji HPV przechodzi w zmianę nowotworową, to jednak przetrwałe infekcje HR-HPV są przyczyną 5% wszystkich ludzkich nowotworów złośliwych.

Przetrwała infekcja typami wysokiego ryzyka jest uznana za czynnik niezbędny, ale też i niewystarczający do rozwoju raka. Wskazuje to, że oprócz infekcji HPV również czynniki interakcji wirus–gospodarz mogą się przyczyniać do wywołanego przez HPV procesu nowotworowego [7]. W zakażonej komórce białka wirusowe oddziałują z wieloma czynnikami gospodarza, które przyczyniają się do replikacji wirusa [1, 3]. Wiadomo też, że wirus rozwinął mechanizmy włączania szlaków naprawy DNA komórki gospodarza. Jednak sposób, w jaki te szlaki naprawcze są aktywowane, nie jest w pełni poznany [1].

Szczepionki skutecznie chronią przed początkową infekcją typami HR-HPV, ale nie działają terapeutycznie przeciwko istniejącym infekcjom [8]. Zwalczanie infekcji HR-HPV opiera się nadal jedynie na zabiegach chirurgicznych i chemio/radioterapii [9]. Efektywny cykl replikacyjny HR-HPV zależy od różnicowania nabłonka i aktywacji szlaków naprawy DNA gospodarza, które często odgrywają główną rolę w rozwoju wielu nowotworów. Zrozumienie mechanizmów związanych z replikacją i cyklem rozwojowym HPV jest potrzebne do ustalenia właściwej terapii do zwalczania rozprzestrzeniania się HPV i chorób z nim związanych.

Wirusa HPV charakteryzuje ikosahedralny, bezosłonkowy kapsyd zbudowany z 72 kapsomerów złożonych z białek L1 i L2. Materiał genetyczny w postaci kolistej, dwuniciowej cząsteczki DNA składa się z około 8000 pz. Wewnątrz cząstki wirusa genom jest związany z histonami gospodarza, tworząc swoistą chromatynę [1, 10]. W architekturze genomu występują wyraźnie wyróżnione trzy regiony:

Wczesne białka są niestrukturalne i uczestniczą w różnych funkcjach regulatorowych. Białko E1 jest helikazą zależną od ATP, która również rekrutuje komórkowe czynniki replikacji DNA do wirusowego miejsca startu replikacji [13]. Białko E2 współdziała z E1 w celu ułatwienia inicjacji replikacji genomu wirusa, a także reguluje ekspresję genów wirusowych od wczesnego promotora i odgrywa rolę w rozdzielaniu genomów wirusa do komórek potomnych [15]. E6 i E7 są onkoproteinami dla typów HR-HPV i pełnią wiele różnych funkcji, takich jak: manipulacja cyklem komórkowym, hamowanie apoptozy czy też unikanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza [16, 17]. E4 usprawnia replikację wirusowego DNA i ułatwia uwalnianie wirionów [18]. Białko E5 zapobiega apoptozie, a także wykazuje aktywność stymulującą proliferację i może brać udział w transformacji komórek [19]. L1 i L2 są późnymi białkami strukturalnymi, które tworzą kapsyd wirusowy. Białko E8^E2 (krótsza forma E2) jest kodowane przez składany alternatywnie transkrypt i moduluje zarówno replikację jak i transkrypcję wirusa. Wykazano, że jest niezbędne do utrzymania trwałej, nieproduktywnej fazy infekcji i prawdopodobnie infekcji latentnej [20].

Rycina 1

Cykl rozwojowy HPV jest ściśle zależny od różnicowania komórek wielowarstwowego nabłonka. HR-HPV i LR-HPV inicjują infekcję, uzyskując dostęp do proliferujących komórek podstawnych nabłonka w wyniku urazu [5]. W początkowym przyłączeniu HPV do komórek uczestniczy białko kapsydowe L1, które wiąże się z receptorem pierwotnym, proteoglikanem siarczanu heparanu (HSPG, Heparan Sulfate ProteoGlycan), na powierzchni komórki warstwy podstawnej nabłonka lub na błonie podstawnej [3]. Związanie HSPG zmienia konformacyjnie strukturę kapsydu i stopniowo proteolitycznie rozszczepia białka L1 i L2, a to umożliwia wiązanie z wtórnym receptorem wychwytującym na powierzchni błony plazmatycznej komórki docelowej. HPV dostaje się do komórek w procesie endocytozy i w pęcherzyku transportowym zachodzi oddzielenie białek L1 od L2 [3]. Genom wirusa pozostaje w kompleksie z białkiem L2 i w tej postaci przemieszcza się do sieci trans-Golgiego [21]. Białko L2 jest też wymagane do efektywnego przemieszczenia genomu wirusowego do jądra komórki [22]. Dostarczenie kompleksu L2/DNA HPV do jądra wymaga progresu cyklu komórkowego do wczesnej mitozy i dezintegracji błony jądrowej [23]. Wewnątrz jądra, L2 pośredniczy w kotwiczeniu genomu wirusa do domeny jądrowej 10 (ND10, nuclear domain 10), zwanej również ciałem białaczki promielocytowej (PML, promyelocytic leukaemia). Takie umiejscowienie jądrowe jest powszechnie wykorzystywane przez wirusy DNA do inicjacji transkrypcji [24]. Jednak w przeciwieństwie do wielu wirusów DNA, które zaburzają strukturę PML po infekcji jądrowej, HPV prawdopodobnie wymaga integralności PML do ustalenia infekcji jądrowej i wczesnej replikacji [1, 24].

HPV nie ma własnej polimerazy DNA i replikacja jego genomu jest zależna od komórkowych czynników replikacji i transkrypcji. Wirusowy cykl rozwojowy obejmuje trzy fazy replikacji:

Wczesna faza infekcji polega na utrzymaniu stałej liczby kopii episomalnych genomów HPV (około 50–100 kopii) w zakażonych komórkach. Po wniknięciu DNA wirusa do jądra komórkowego rozpoczyna się wczesna transkrypcja genów wirusa [26]. Wczesna ekspresja białka E2, jako wirusowego czynnika transkrypcyjnego, umożliwia uruchomienie z wirusowego wczesnego promotora ekspresji białek regulatorowych E6 i E7. Te onkogenne białka są ukierunkowane na inhibicję i degradację kluczowych supresorów nowotworu – p53 i pRb, prowadząc do promowania proliferacji komórkowej [26]. E2 pełni też funkcję czynnika inicjacji replikacji wirusa [27]. W LCR E2 działa jako moduł montujący i stabilizujący helikazę E1, aby ułatwić wiązanie E1 z miejscem startu replikacji [12]. Helikaza E1 wiąże i rozwija DNA, aby umożliwić dostęp komórkowym czynnikom replikacji do wirusowego DNA [25, 27]. Replikacyjne białka wirusa oddziałują z wieloma czynnikami gospodarza, w tym z polimerazą DNA, topoizomerazą 1 i replikacyjnym białkiem A wiążącym jednoniciowe DNA (RPA, replication protein A). Pierwsza faza replikacji genomu HPV jest najważniejsza do zainicjowania trwałej infekcji [25, 27]. W zakażonych komórkach podstawnych episomalne genomy wirusowe są replikowane wspólnie z replikacją komórkowego DNA i równo rozdzielane do komórek potomnych dzięki kotwiczeniu genomów wirusa do chromosomów gospodarza przez E2 związane z wirusowym LCR i białkami wiążącymi chromatynę [20, 25]. Wykazano, że ograniczona amplifikacja genomu wirusowego jest kontrolowana przez białko E8^E2 (krótsza forma E2) za pośrednictwem komórkowego kompleksu NCoR/SMRT (nuclear receptor corepressor/silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptor) [20]. W zakażonych komórkach podstawnych białka wirusowe ulegają ekspresji na niskim poziomie, aby uniknąć aktywacji miejscowej odpowiedzi odpornościowej [28]. Wirus osiąga to przez represję transkrypcji E2 z wczesnego promotora (P97 u HPV16) w wyniku zahamowania dostępu czynnikom transkrypcyjnym do promotora i przez zmianę konformacji chromatyny [29].

Rycina 2

Podział zakażonej komórki podstawnej nabłonka może wytwarzać komórkę, która jest zdolna do różnicowania. Komórki te, przemieszczając się do górnych warstw, niosą ze sobą wirusowe genomy. Ten etap cyklu rozwoju wirusa to faza utrzymywania infekcji, liczba kopii genomu wirusa pozostaje na poziomie 50–100 na komórkę [5].

O ile czynniki replikacji są łatwo dostępne do stabilnego utrzymania episomów wirusa w niezróżnicowanych komórkach, to różnicowanie nabłonka zwykle powoduje wyjście komórek z cyklu komórkowego, ograniczając wirusowi dostęp do czynników replikacji w komórkach postmitotycznych [5]. HPV wykorzystuje liczne mechanizmy do obalenia głównych ścieżek regulacyjnych, które kierują replikacją komórkową, i wykształcił strategię zapobiegania zatrzymaniu cyklu komórkowego i sygnałom apoptozy. Działanie białek wirusowych zmusza różnicujące się komórki do ponownego wejścia w cykl komórkowy i przejścia do fazy G2, podczas której genomy HPV są replikowane do tysięcy kopii na komórkę w procesie nazywanym fazą amplifikacji produktywnej cyklu replikacyjnego wirusa [5, 30]. Podczas replikacji produktywnej onkoproteiny E6 i E7 odgrywają ważną rolę, utrzymując inaktywację p53, pRb, a to zapewnia zróżnicowanym komórkom aktywne trwanie w cyklu komórkowym i zapobiega apoptozie. Wydajna replikacja wirusowego DNA, w fazie amplifikacji, wymaga wysokiego poziomu białek E1 i E2, które ulegają ekspresji w wyniku aktywacji późnego promotora. Białka E4 i E5 przyczyniają się do wydajnej produktywnej replikacji [18, 19]. Białka L1 i L2 ulegają ekspresji z mRNA, które są inicjowane z późnego promotora w zróżnicowanych keratynocytach warstwy powierzchniowej [5].

Wykazano, że w przypadku HR-HPV (HPV16 i 31) ekspresja białek kapsydu jest opóźniana do czasu, aż zainfekowane komórki nie dotrą do warstwy powierzchniowej nabłonka. Takie opóźnienie i ograniczenie ekspresji immunogennych białek kapsydu do najwyższej warstwy nabłonka, pozwala wirusowi uniknąć odpowiedzi immunologicznej gospodarza [31]. Zrozumienie związku między różnicowaniem komórkowym a ekspresją białek kapsydu może wspomóc zaprojektowanie takiego leku przeciwwirusowego, który zakłóci opóźnioną ekspresję L1 i L2, doprowadzając do jej indukcji w dolnych warstwach nabłonkowych, a to umożliwiłoby aktywację silnej przeciwwirusowej odpowiedzi immunologicznej.

Białka E4 (określane też jako E1^E4) HPV16 i 18 mogą regulować aktywności białka E2, co sugeruje możliwość centralnego regulowania zależności między replikacją i transkrypcją wirusów. Badania z wykorzystaniem organotypowych modeli nabłonka potwierdziły, że E4 może się bezpośrednio przyczyniać do amplifikacji genomu wirusa w produktywnej fazie cyklu replikacji przez stabilne utrzymywanie cyklu komórkowego w fazie G2 [18, 32] i aktywację kinaz komórkowych z rodziny MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases; ERKs, JNK/SAPKs i p38 MAPKs) [33]. Ponadto zdolność E4 do zatrzymywania komórek w fazie G2 może przeciwdziałać działaniu, jakie wywiera białko E7, stymulując przejście z fazy G1 do fazy S [32, 33]. E4 HPV16 wykazuje zdolność do wiązania helikazy RNA DEAD box, która może się przyczyniać do potranskrypcyjnej kontroli ekspresji genów wirusowych [33, 34]. Ważną rolą E4 jest restrukturyzacja filamentów cytokeratyny, aby ułatwić uwalnianie nowych wirionów ze złuszczanych komórek nabłonka [18, 34].

E5 jest transbłonowym białkiem rezydującym w retikulum endoplazmatycznym (ER) [19], które może stabilizować receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR, Epidermal Growth Factor Receptor) i stymulować aktywność MAPK, co sugeruje, że może kontrolować podział komórek [19]. To, że genomy HPV zawierające inaktywujące mutacje w ORF E5 mają niższy poziom amplifikacji genomu wirusowego niż typ dziki, może być związane z interakcją E5 z sygnalizacją komórkową i możliwością regulowania apoptozy [19]. Ponadto E5 pomaga wirusowi unikać odpowiedzi immunologicznej przez represję prezentacji wirusowych peptydów w związku z MHC (major histocompatibility complex) [35]. Wykazano też, że E5 HPV16 jest zdolne do tworzenia wiroporyny, która prawdopodobnie wykazuje aktywność kanału jonowego w zakażonych komórkach, co może się wiązać ze wzmocnieniem aktywności EGFR przez E5 [36].

HPV do realizacji cyklu replikacji wymaga dostępu do komórkowych czynników replikacji DNA, co wiąże się z akumulacją czynników gospodarza zaangażowanych w zatrzymanie cyklu komórkowego i apoptozę. Wirus blokuje sygnały przeciwproliferacyjne przez skoordynowane działania onkoprotein E6 i E7, aby zapewnić zakażonym komórkom trwanie w aktywnym cyklu komórkowym i replikację własnego DNA. W zakażonych komórkach białko E7 zawsze występuje razem z białkiem E6 z powodu bicistronowej natury regionu kodującego E6 i E7 w genomie HPV [28, 37]. Badania wykazały podwyższony poziom mRNA kodującego białka E6 i E7 w niezróżnicowanej i różnicującej się warstwie nabłonka oraz obniżoną ekspresję w zróżnicowanych warstwach [38]. Sugeruje to, że aktywność E6 i E7 może być najważniejsza we wczesnej fazie replikacji wirusa w podstawnych komórkach nabłonka, aby utrzymać zdolności proliferacyjne komórek i zapobiegać apoptozie [39, 40].

Białko E7, w różnicujących się komórkach HPV-dodatnich, aktywuje ponowne wejście w cykl komórkowy przez wiązanie, inaktywację i degradację białek należących do rodziny siatkówczaka (RB, retinoblastoma). Rb wraz z p107 i p130 kontrolują przełączanie między fazami G1 i S cyklu komórkowego, regulując aktywność czynników transkrypcyjnych E2F [41]. Rodzina białek E2F kontroluje transkrypcję genów zaangażowanych w replikację fazy S, postęp cyklu komórkowego, różnicowanie, naprawę uszkodzeń DNA, proliferację i apoptozę. Rb, tworząc kompleks z E2F, tłumi transkrypcję z promotorów zależnych od E2F. Podczas zakażeń HR-HPV, E7 wiąże Rb i ukierunkowuje jego degradację przez szlak ubikwityny proteasomalnej. Prowadzi to do konstytutywnej ekspresji genów reagujących na E2F, w tym genów wymaganych do syntezy nukleotydów (reduktaza dihydrofolianowa i kinaza tymidynowa), replikacji DNA (polimeraza DNA i cdc6) oraz postępu cyklu komórkowego (cyklina A i E, cdc2 i c-Myc) i umożliwia syntezę wirusowego DNA [41]. Aktywność białka E7 rozszerza w ten sposób przedział komórek nabłonkowych aktywnych w replikacji DNA [42]. E7 może także oddziaływać bezpośrednio z czynnikiem transkrypcji E2F, co stymuluje aktywność promotorów genów kontrolujących wzrost [41]. Wykazano też wiele możliwych stymulujących i hamujących aktywności E7 na inne komórkowe czynniki transkrypcyjne, takie jak STAT1, NF-κB, IRF1, SMAD2/3, TBP, Miz 1, B-Myb, c-Myc, c-Jun, c-Fos, E2F1 i E2F6 [39, 41]. Obserwacje te wskazują na istotny potencjał E7 do dokonywania znaczących zmian transkrypcyjnych w zainfekowanych komórkach.

Niezakażone komórki reagują na każde nieplanowane zdarzenie proliferacji indukowaniem apoptozy. Jednym z następstw indukowanej przez E7 degradacji Rb jest wzrost poziomu supresora nowotworu i głównego regulatora apoptozy, białka p53 [42]. Aby zapobiec aktywowaniu apoptozy w komórkach replikujących HR-HPV, wirusowe białka E6 wiążą p53 i rekrutują komórkowe białko E3 związane z ligazą ubikwityny E6 (E6-AP, E6 associated protein) do jego ubikwitynacji i proteasomowej degradacji [43]. E6 HR-HPV hamują również funkcję p53 przez wiązanie acetylotransferaz histonowych, p300 i CBP (białko wiążące CREB, CREB-binding protein), które są koaktywatorami aktywności p53 [10]. Powodują też zmianę konformacji p53 i jego sekwestrację w cytoplazmie [44]. Interakcje te destabilizują p53, umożliwiając komórkom kontynuowanie cyklu komórkowego w celu replikacji wirusa. Ponieważ p53 jest głównym regulatorem zarówno postępu cyklu komórkowego jak i reakcji na stres środowiskowy, jego inaktywacja przez E6 sprzyja również niestabilności genomu zakażonych komórek i zwiększa ryzyko raka [44, 45].

Dodatkowe elementy mechanizmów apoptotycznych gospodarza, z którymi wiąże się E6, obejmują białko Bak, receptor czynnika martwicy nowotworów 1 (TNF R1, tumor necrosis factor receptor 1), adaptorową cząsteczkę domeny śmierci Fas (FADD, Fas-associated protein with death domain) i kaspazę 8 [45, 46]. Wykazano też, że E6 HPV16 wywołuje proteasomalną degradację tuberiny i wiąże się z paksyliną, białkiem, które odgrywa istotną rolę w strukturalnej organizacji komórki [46, 47, 48].

Białka E6 są zdolne do oddziaływania i degradacji białek zawierających domeny PDZ (PSD95/hDlg/ZO-1), które kontrolują sygnalizację komórkową, kształt i biegunowość komórki. Białka E6 HR-HPV zawierają C-końcową domenę PBM (PDZ domain binding motif) umożliwiającą wiązanie z białkami PDZ. Wykazano, że obecność motywu PBM w cząsteczce E6 jest wymagana zarówno do utrzymywania formy episomalnej genomu jak i amplifikacji HR-HPV. Motyw PBM może być również wymagany do aktywacji cyklu komórkowego w zakażonych HPV komórkach i hamowania apoptozy przez NF-κB (nuclear factor-kappa B) [40, 47, 49]. PBM E6 umożliwia także regulacyjną interakcję z sortazą SNX27 (nexina 27, sorting nexin family member 27), która kontroluje transport endosomalny, pozyskiwanie składników odżywczych i proliferację komórek [46]. Wykazano, że E6 HPV16 wiąże się z IRF-3 (czynnik regulacyjny 3 interferonu (IFN), interferon regulatory factor 3) i znosi aktywność transkrypcyjną promotora IFN-β [48]. E6 zakłóca również szlak sygnalizacji z udziałem IFN-α, doprowadzając do zahamowania aktywacji genów reagujących na IFN [44].

HPV16 E6 i E7 zapobiegają też ekspresji TLR9 (receptor podobny do Toll 9, Toll like receptor 9), który rozpoznaje dwuniciowe DNA (dsDNA, double stranded DNA) w zainfekowanej komórce w celu aktywacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Ponadto zarówno E6, jak i E7 hamują cytokiny, takie jak TNF-α (czynnik martwicy nowotworu α, tumor necrosis factor α), TGF-β (transformujący czynnik wzrostu β, transforming growth factor β) i IFN, zmieniając sygnalizację cytokin i wrodzoną odporność. E6 HR-HPV hamuje IFN-κ przez metylację DNA, aby znieść odpowiedź komórkową na infekcję wirusową. Ponadto E6 kontroluje IL1-β (interleukina-1 beta, interleukin 1 beta) poprzez E6-AP i degradację za pośrednictwem p53 [46, 47, 48, 49].

Oprócz wspomnianych wyżej białek E6 istnieją też inne izoformy tego białka, które wykryto w próbkach od pacjentów HPV-dodatnich. Region genu E6E7 genomu HPV16 powoduje powstanie co najmniej czterech alternatywnie składanych form mRNA (E6 pełnej długości (E6fl), E6*I, E6*II, E6*III [zwany także E6*X]) [50]. Białka kodowane przez izoformy E6 nie zostały jeszcze dostatecznie zbadane, ale mogą być ważne zarówno dla cyklu replikacji wirusa, jak i postępu rozwoju nowotworów związanych z HPV [51].

Wyjaśnienie roli różnych białek wirusowych w replikacji wirusa jest dość złożone i wynika z kilku przyczyn, takich jak:

Jak już omówiono, E1 i E2 oddziałują z wirusowym miejscem startu replikacji, aby zainicjować replikację wirusa [12]. Jednak wykazano również, że E2 jest wiązane przez L1, L2, E6, E6*I, E7 i E4. Wiązanie E2 z L2 do domen ND10 w jądrach zainfekowanych komórek wydaje się odgrywać rolę w fazie ustanawiania infekcji w podstawnych komórkach nabłonka [52]. Ponadto L2 może hamować transaktywację transkrypcyjną E2, ale nie replikację wirusowego DNA indukowaną przez E2 [53]. Zatem L2 może działać jako sensor przełączania między aktywacją wczesnej transkrypcji wirusowej a ograniczoną replikacją genomu wirusowego w fazie ustanawiania infekcji. E2 może rekrutować E7 do mitotycznych chromosomów w późnej mitozie. Sugerowano, że oligomery E2-E7 mogą spowodować zniesienie represji wywoływanej przez E2 na ekspresję E6 i E7, aby przyczynić się do progresji nowotworu związanego z HR-HPV [54]. Oddziaływanie między izoformami E2 i E6 zmienia wewnątrzjądrowe umiejscowienie białek, a to może zmieniać ich funkcje komórkowe [55]. Podobnie E2 po związaniu z E4 ulega relokacji i stabilizacji cytoplazmatycznej [32], ale rola E2 w cytoplazmie nie została jeszcze zbadana. E2 i L1 łączą się w ciałkach jądrowych PML podczas składania wirionów [53]. Nie można wykluczyć, że współpracujące kompleksy białek wirusowych mogą pełnić dodatkowe, niepoznane jeszcze funkcje.

Stale wzrasta zainteresowanie rolą małych niekodujących RNA (mikro-RNA) w zakażeniach HPV. Mikro-RNA (miRNA) – to cząsteczki wielkości 22–25 nukleotydów, które kontrolują ekspresję wielu genów docelowych na poziomie potranskrypcyjnym, wpływając na stabilność i translację mRNA [56].

Zidentyfikowano i zwalidowano kilka miRNA kodowanych przez HR-HPV [57, 58]. Jednak z powodu ich niskiej ekspresji, zarówno w kulturach organotypowych jak i w różnych próbkach klinicznych HPV-dodatnich, ich charakterystyka jest niepełna. Sugeruje się, że mogą mieć znaczenie w ustalaniu latencji wirusa i unikaniu odporności [59, 60].

Wiadomo jednak, że infekcja HR-HPV prowadzi do dużych zmian i zróżnicowanej ekspresji szerokiego zakresu komórkowych miRNA w porównaniu do komórek niezainfekowanych. W komórkach HR-HPV dodatnich, miRNA są regulowane przez białka E6 i E7, przez ich wpływ na poziomy białek p53 i pRB. W związku z tym powszechnie przyjmuje się pogląd, że w infekcji HPV wszystkie miRNA regulowane przez czynniki sygnalizacyjne szlaków p53 i pRB są modulowane przez te onkoproteiny [61]. Jednoznacznie potwierdzono, że białko E6 kontroluje ekspresję komórkowych miRNA, takich jak: miR-23b, miR-218 i miR-34a. Wykazano, że miR-34 jest kontrolowany przez p53, a jego degradacja za pośrednictwem E6 zahamowuje ekspresję genów związanych z apoptozą [62]. Stwierdzono też, że miR-203 pozostaje pod kontrolą negatywną białka E7 podczas amplifikacji genomu wirusa. miR-203 kontroluje ekspresję czynnika transkrypcyjnego Np63, którego poziom wzrasta w wyniku zahamowania aktywności miR-203 przez E7, co wydłuża aktywny cykl komórkowy w różnicujących się keratynocytach [63]. Wykazano też, że oddziaływanie białek E7 z E2F zwiększa poziomy ekspresji miR-15a i miR-16-1 [64]. W rzeczywistości E6 i E7 kontrolują wiele komórkowych czynników transkrypcyjnych, przez co mają wiele możliwości zmian ekspresji licznych miRNA transkrybowanych przez polimerazę II, w tym także takich, które mogą być zaangażowane w cykl replikacji wirusów. Przykładem są badania Wang i wsp., którzy wykorzystując analizę mikromacierzy i sekwencjonowanie (miRNA seq) dokonali analizy profilu miRNA odpowiadających na obecność białek E6 i E7 HPV31 w organotypowych hodowlach keratynocytów. Uzyskane wyniki ujawniły wzrost poziomu ekspresji dla miR-16, miR-25, miR-92a, miR-93, miR-106b, miR-210, miR-224, miR-378 i miR-22, miR-24, miR-27a, miR-29 i miR-100 w porównaniu z niezainfekowaną kulturą [65]. Badania Honegger i wsp. ujawniły znaczny wzrost ekspresji miR-143-3p, miR-23a-3p, miR-23b-3p, miR-27b-3p oraz znaczny spadek ekspresji miR-17-5p, miR-186-5p, miR-378a-3p, miR- 378, miR-629-5p i miR-7-5p po wyciszeniu genu E6/ E7 w komórkach HeLa i SiHa, co było skorelowane ze wzrostem komórek i hamowaniem apoptozy [66]. Zaznaczyć warto, że wirus może modulować ekspresję komórkowych miRNA w celu kontrolowania swojego cyklu replikacyjnego. Na przykład miR-145 oddziałuje z określonymi regionami sekwencji genów E1 i E2 HPV31 i jego nadekspresja wpływa na utrzymywanie ograniczonej liczby kopii genomu wirusa we wczesnej fazie cyklu replikacyjnego wirusa [67]. Profil miRNA jest uważany za swoisty odcisk palca stanu komórkowego. Możliwość ustalenia odpowiednich algorytmów profili miRNA w chorobach związanych z HPV stanowi obiecujące narzędzie o dużych możliwościach w diagnostyce i medycynie spersonalizowanej.

Ogniska replikacji HPV zwykle tworzą się w pobliżu typowych kruchych miejsc chromosomów gospodarza. Typowe kruche miejsca to obszary chromosomów o zwiększonej częstości pęknięć lub złamań w obrębie chromatyd, przez co są podatne na stres związany z replikacją i rekrutują czynniki naprawy DNA w celu utrzymania stabilności genomowej [103, 104]. HPV może preferencyjnie replikować się w sąsiedztwie kruchych miejsc ze względu na łatwy dostęp do czynników naprawy DNA, co ułatwia wirusowi replikację ukierunkowaną na rekombinację. Indukcja DSBs i RS podczas produktywnej replikacji genomu wirusa [105] w pobliżu kruchych miejsc, również podatnych na DSBs, sprzyja integracji genomu HPV z DNA gospodarza [97]. Proces integracji genomu wirusa najczęściej zachodzi z przerwaniem ciągłości sekwencji w obrębie ORF E2 i/lub E1 genomu i prawie zawsze powoduje zwiększenie ekspresji onkogenów E6 i E7 [106]. Dysfunkcja wirusowych białek replikacyjnych (E1 i/lub E2) sprawia, że integracja jest równoznaczna z zakończeniem produkcji nowych wirusów, a deregulacja ekspresji E6 i E7 sprzyja proliferacyjnemu i klonalnemu wzrostowi komórek zawierających zintegrowane wirusowe DNA. Ścisłe powiązanie ognisk replikacji HPV z obszarami uszkodzenia DNA komórki zwiększa ryzyko przypadkowej integracji genomu wirusa i wyjaśnia tendencję HPV do integracji w typowych kruchych miejscach DNA gospodarza [107]. Badania w laboratorium Galloway wykazały, że białka E6 i E7 wysokiego ryzyka osłabiają naprawę komórkowych DSB w wyniku HR. Choć prawdopodobnie zapewnia to większą dostępność czynników HR do replikacji wirusów, to jednak obecność trwałych, nienaprawionych pęknięć DNA komórkowego prawdopodobnie i tak zwiększa szansę na integrację genomu wirusa [108]. Te zdarzenia integracyjne mogą się przyczynić do onkogenezy HPV przez indukowanie niestabilności genomowej za pośrednictwem E6 i E7. W nowotworach związanych z HR-HPV wirusowe DNA często jest zintegrowane z DNA gospodarza w obszarze typowych kruchych miejsc [106, 109, 110].

Szlaki naprawy DNA gospodarza odgrywają złożoną rolę w cyklu replikacyjnym HPV, a utrata ich funkcji może upośledzać replikację wirusa i promować rozwój nowotworów związanych z HPV. Niedokrwistość Fanconiego (FA) to genetycznie heterogeniczne zaburzenie spowodowane mutacją w jednym lub większej liczbie genów szlaku FA. Pacjenci z FA są bardziej podatni na raka płaskonabłonkowego (SCC, squamous cell carcinoma), szczególnie jamy ustnej i okolic odbytu, obszarów odpowiadających preferowanym miejscom zakażenia HPV. DNA HPV wykryto w ponad 80% SCC od pacjentów z FA w porównaniu do 36% od pacjentów kontrolnych, co sugeruje, że utrata aktywności szlaku FA może promować transformację wirusową [111]. Badania molekularne wykazały, że białko E7 HR-HPV reguluje w górę transkrypcję genów FA mechanizmem zależnym od Rb [112, 113]. Ponadto E7 HR-HPV, ale nie LR-HPV, jest wystarczające do aktywacji szlaku FA i stymuluje rekrutację zarówno FANCD2, jak i BRCA2 do chromatyny [111]. Utrata FANCD2 lub FANCA, głównych składowych szlaku FA, prowadzi do potranskrypcyjnej akumulacji E7 i stymuluje hiperplastyczny wzrost w komórkach HPV-dodatnich. Ekspresja E7 powoduje też wzrost niestabilności chromosomów w fibroblastach z niedoborem FA i zwiększa podatność do SCC głowy i szyi u myszy z nokautem FANCD2 [114, 115]. Pomimo tych ustaleń i korelacji między utratą aktywności szlaku FA a rakiem związanym z HPV, dokładna rola szlaku FA w cyklu replikacyjnym HPV nadal nie jest w pełni poznana [116]. Wykazano, że FANCD2 umiejscawia się w ogniskach replikacji wirusa HPV31 i wiąże się z kilkoma miejscami wzdłuż genomu wirusowego. Wiązanie to występuje zarówno w niezróżnicowanych jak i zróżnicowanych komórkach, ale zmniejsza się po różnicowaniu, co sugeruje, że szlak FA może być zaangażowany przede wszystkim w replikację genomów HPV w niezróżnicowanych komórkach [116]. Ponadto zahamowanie aktywności FANCD2 doprowadza do spadku utrzymywania episomalnej formy genomów wirusa w niezróżnicowanych komórkach, co może promować ich integrację z DNA gospodarza i może wyjaśnić zwiększoną podatność na nowotwory związane z HPV u pacjentów z FA [116]. Chociaż niewiele wiadomo na temat roli szlaku FA w fazie amplifikacji produktywnej HPV, to pewne obserwacje wskazują na prawdopodobny udział FA w promowaniu HR jako mechanizmu naprawy DNA. Wykazano, że FANCD2-Ub pośredniczy w rekrutacji czynników HR, w tym BRCA1, BRCA2 i PALB2 do miejsc uszkodzenia i uczestniczy w formowaniu ognisk RAD51 [117]. Ponadto uszkodzenie FANCD2 stymuluje fosforylację kinazy DNA-PK związanej z NHEJ. Komórki z niedoborem FA wykazują wyższe wskaźniki mikrodelecji i insercji, co często wskazuje na nadczynność naprawy NHEJ [118]. Możliwe, że HPV aktywuje szlak FA bezpośrednio lub pośrednio przez szlak ATR i rekrutuje FANCD2 do genomu wirusa w celu rekrutacji białek HR do wirusowego DNA podczas replikacji [117]. Pełne zrozumienie roli szlaku FA w cyklu replikacyjnym wirusa HPV wymaga jeszcze dogłębnych badań.

Wirus HPV, aby zapewnić sobie optymalne środowisko do replikacji, wykorzystuje specyficzne szlaki komórki gospodarza, które regulują różnicowanie nabłonka, proliferację komórek oraz ułatwiają naprawę uszkodzonego DNA. Ograniczenie wysokiego poziomu ekspresji genów wirusowych, replikacji jak i wytwarzania wirionów do najwyższych warstw nabłonka, chroni komórki zakażone HPV przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Taka czasowa regulacja ekspresji genów HPV jest możliwa dzięki różnemu wykorzystywaniu wczesnych i późnych promotorów i miejsc poliadenylacji oraz przez alternatywne składanie transkryptów. Współdziałanie białek E6, E7, E1, E2, E4 i E5 podczas różnicowania nabłonka umożliwia HPV stworzenie środowiska wspierającego produktywną replikację w niedzielących się komórkach. Białka E6 i E7 odgrywają ważną rolę w promowaniu replikacji wirusa i ułatwiają mu przetrwanie, modulując wrodzoną odpowiedź immunologiczną. Stale rośnie zakres poznania mechanizmów wykorzystywanych przez HPV do regulacji fazy produktywnej wirusowego cyklu replikacji, w tym szczególnie sposobów aktywacji i wykorzystywania ścieżek naprawy DNA do amplifikacji genomów wirusowych. Jednak wciąż wiele pytań pozostaje bez odpowiedzi. Nadal nie wiadomo, w jaki sposób HR-HPV manipulują szlakami komórkowymi w celu ułatwienia replikacji wirusa oraz jak podporządkowanie tych szlaków wirusowi może wpłynąć na integralność genomu komórki. Pełne zrozumienie mechanizmów, dzięki którym HPV ustanawia kompetentne środowisko replikacji w całym cyklu rozwojowym wirusa, jest ważne, aby zidentyfikować cele komórkowe, które mogłyby być wykorzystywane terapeutycznie w chorobach związanych z HPV.