Polarization of microglia and macrophages in the selected degenerative and inflammatory diseases of the nervous system

Makrofagi są jednymi z najważniejszych komórek uczestniczących zarówno w odpowiedzi wrodzonej jak i nabytej. W odpowiedzi wrodzonej zaangażowane są zarówno w jej inicjację jak i wyciszenie, co wiąże się z ich niezwykłą plastycznością fenotypową [1]. Stała się ona podstawą podziału makrofagów na te spolaryzowane klasycznie (M1), które wykazują aktywność prozapalną i te spolaryzowane alternatywnie (M2), które pełnią głównie funkcję regulatorową i sprzyjają regeneracji tkanek. W drugiej populacji komórek wyróżniono ponadto kilka subpopulacji: M2a, M2b, M2c i M2d (zwane też TAM, tumor associated macrophages). Innymi proponowanymi podziałami są np., oparty na funkcji fenotypów, podział zaproponowany przez Mossera i Edwardsa [1], który wydziela makrofagi służące obronie gospodarza, gojące rany i regulatorowe lub oparty na kombinacjach markerów zaproponowany przez Murraya [2].

Do istotnych cech zjawiska polaryzacji należy to, że jest ono wywołane sygnałami z otaczającej tkanki i jest, poza niektórymi sytuacjami, odwracalne. Zmiana fenotypu wynika ze zmiany w ekspresji białek, które można traktować jako markery, ale przede wszystkim decyduje to o cechach i aktywności danej komórki. W związku z tym zmienia się jej wpływ nie tylko na inne leukocyty, ale też komórki otaczającej tkanki. Najprawdopodobniej in vivo ma się do czynienia ze spektrum fenotypów, które obejmuje nie tylko wymienione wcześniej fenotypy, ale też fenotypy pośrednie łączące ich cechy [3]. Może to wynikać z występowania w tkance jednocześnie różnych sygnałów.

Charakterystyczna dla fenotypu M1, który wywołany jest interferonem-γ (IFN-γ) i obecnością bakteryjnego liganda TLR (Toll-like receptor) np. lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnej (LPS), jest duża aktywność indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS, inducible nitric oxide synthase) i wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS, reactive oxygen species). Takie komórki wydzielają także cytokiny prozapalne, w tym interleukiny (IL-1β, -6, -12 i -18), czynnik martwicy nowotworów (TNF-α, tumor necrosis factor α) oraz wiele chemokin np. CCL15, CCL20, CXCL8. Komórki te mają też zwiększoną ekspresję MHC II (główny układ zgodności tkankowej klasy II, major histocompatibility complex) i cząsteczek kostymulujących CD80 i CD86 [1, 4].

Natomiast fenotyp M2 może być podzielony według różnych czynników wywołujących polaryzację. Fenotyp M2a wywołany jest przez IL-4 lub IL-13 i szczególnie charakterystyczna dla niego jest stymulacja regeneracji tkanki. Jest to osiągane przez wytwarzanie czynników wzrostu, wpływ na fibroblasty, zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej wywołane wydzielaniem fibronektyny, metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP, matrix metalloproteinase) i ich inhibitora (TIMP, tissue inhibitor of metalloproteinases) oraz fagocytozę obumarłych komórek [1, 5]. Fenotyp M2b jest wywołany obecnością kompleksów immunologicznych w połączeniu z IL-1β lub ligandem TLR, a podtyp M2c różnymi sygnałami, takimi jak IL-10, TGF-β (transforming growth factor β) lub glikokortykoidy. Te dwie subpopulacje pełnią głównie funkcje regulatorowe i wytwarzają duże ilości przeciwzapalnej IL-10 i niskie IL-12. Nie wytwarzają cytokin prozapalnych i tylko niektóre z nich zachowują zdolność prezentacji antygenu. Podobne cechy wykazują makrofagi TAM, które powstają pod wpływem mikrośrodowiska nowotworu.

Do ogólnych cech polaryzacji alternatywnej należą: wydzielanie TGF-β, IL-10, wysoka ekspresja arginazy 1 (Arg-1), receptora IL-4, białka Fizz1 (found in inflammatory zone 1), receptorów PPARγ i δ (peroxisome proliferatoractivated receptor γ, δ) oraz białek podobnych do chitynaz (Ym1, Ym2). Markerami tego fenotypu są także receptor mannozowy (CD206) i receptor białka stymulującego makrofagi (CD136) i niektóre receptory zmiatacze (ryc. 1) [1, 6].

W centralnym układzie nerwowym makrofagami tkankowymi jest mikroglej. Najnowsze badania wykazują, że komórki te pochodzą z pęcherzyka żółtkowego i powstają w wyniku prymitywnej hematopoezy oraz żeta populacja co do zasady nie jest uzupełniana przez monocyty z krwiobiegu [7]. Jednak wiele sytuacji patologicznych wiąże się z wystąpieniem stanu zapalnego i rozszczelnieniem bariery krew–mózg (BBB, blood–brain barrier), co umożliwia napływ do mózgu leukocytów obwodowych w tym monocytów, które przekształcają się w makrofagi i infiltrują tkankę. Na podstawie morfologii można rozróżnić mikroglej spoczynkowy (o długich i cienkich wypustkach, który patroluje określony obszar) i aktywowany o amebowatym kształcie, migrujący w stronę sygnału o zagrożeniu [8]. Zagadnieniem, które nadal jest dyskusyjne, jest polaryzacja mikrogleju. Brak jest pełnych dowodów na to, że mikroglej ulega polaryzacji tak samo jak makrofagi obwodowe i tak samo zmienia się jego aktywność. Wiadomo natomiast, że reaguje na sygnały z najbliższego środowiska, takie jak białka wytwarzane przez neurony i na docierające do mózgu z obwodu cytokiny prozapalne, że wykazuje ekspresję niektórych markerów fenotypu M1 (MHC II, CD86 i receptora fragmentu Fc przeciwciał IgG (FcγR)) oraz wytwarza ROS. Mikroglej może także wykazywać ekspresję markerów polaryzacji M2, w tym Arg-1, Ym1, Fizz1, CD163 i TREM2 (triggering receptor expressed on myeloid cells 2). Warto jednak wspomnieć, że tylko ekspresja CD163 i TREM2 została potwierdzona na mikrogleju człowieka, natomiast obecność dwóch pierwszych markerów na tych komórkach wciąż jest dyskusyjna. Niektórzy autorzy proponują więc stosowanie określeń mikroglej M1-podobny, M2-podobny (M1- and M2-like) [8, 9].

Rycina 1

Mimo tych wątpliwości można zaobserwować wiele zjawisk związanych z polaryzacją makrofagów w centralnym układzie nerwowym. To zagadnienie jest istotne w chorobach neurodegeneracyjnych, regeneracji tkanki nerwowej po urazie mechanicznym lub udarze, a także w chorobach o podłożu autoimmunologicznym, takich jak stwardnienie rozsiane [10]. Takie sytuacje patologiczne są często związane z reakcją układu odpornościowego, a obecność komórek M1 lub M2 może mieć istotny wpływ na kondycję tkanki nerwowej, w tym na przeżywalność neuronów, ich morfologię, procesy związane z mielinizacją czy szczelność bariery krew–mózg. W związku z tym wysunięto ogólną tezę, że makrofagi o fenotypie M2 mają działanie neuroprotekcyjne, a makrofagi o fenotypie M1 działają neurotoksyczne, a więc ich działanie jest niepożądane. Jest to jednak pewne uogólnienie, ponieważ jest niewykluczone, że to czy dany fenotyp jest korzystny, czy też nie, może zależeć od badanej choroby i jej etapu. Badanie mikrogleju i makrofagów pod kątem ich polaryzacji może więc pogłębić naszą wiedzę o ich wpływie na tkankę nerwową, bardziej niż gdy ograniczamy się jedynie do stosowania podziału na mikroglej spoczynkowy i aktywowany.

W artykule opisano wybrane choroby centralnego układu nerwowego, w których przebiegu występuje neurodegeneracja, w związku z polaryzacją makrofagów. Przedstawiono choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera i stwardnienie zanikowe boczne, neurodegeneracja związana z uszkodzeniem tkanki nerwowej podczas udaru niedokrwiennego i krwotocznego mózgu oraz urazu rdzenia kręgowego, a także stwardnienie rozsiane jako przykład choroby o podłożu autoimmunologicznym.

Uszkodzenie tkanki nerwowej wywołane zaburzeniami naczyniowymi, jakim jest udar mózgu, niesie ze sobą poważne zagrożenie dla życia i jest też główną przyczyną niepełnosprawności wśród dorosłych. Może powstać przez wynaczynienie krwi (udar krwotoczny) lub przez zablokowanie naczynia krwionośnego (udar niedokrwienny) [11]. Ich wystąpienie jest powiązane z neurodegeneracją i reakcją mikrogleju i makrofagów obwodowych. Ważnym zagadnieniem jest więc wpływ tych komórek i stanu zapalnego na zjawisko wtórnej neurodegeneracji, a także na zdolność tkanki do regeneracji.

Podczas udaru niedokrwiennego powstaje strefa martwicy, do której nie dopływa krew, oraz strefy penumbry, do której częściowo dociera krew przez naczynia krwionośne z sąsiednich okolic. W czasie niedokrwienia dochodzi do śmierci neuronów z powodu niedoboru tlenu i glukozy. Dochodzi także do obumierania komórek śródbłonka, co powoduje rozszczelnienie BBB [12]. Po wystąpieniu uszkodzenia następuje aktywacja mikrogleju, który zmienia swoją morfologię, w zależności od umiejscowienia względem lezji i wystąpienia reperfuzji [13, 14]. Komórki te proliferują i migrują otaczając strefę niedokrwienia [15]. Mikroglej wydziela cytokiny prozapalne i fagocytuje obumierające komórki, w tym neurony [16]. Prowadzi to do dalszego rozszczelnienia BBB przez cytokiny, takie jak IL-1β i IL-6, TNF-α i chemokiny. Między innymi te zjawiska umożliwiają migrację leukocytów [17, 18]. Najwcześniej tkankę infliltrują neutrofile, potem monocyty (kilka pierwszych dni, maksimum około 48 h po udarze), a także limfocyty. Rozwój stanu zapalnego i napływ tych komórek uznaje się za jedno ze zjawisk odpowiedzialnych za zwiększenie obszaru wtórnego uszkodzenia [17]. Jest to jednak zjawisko złożone i wieloetapowe i niektóre jego elementy mogą być niezbędne do regeneracji tkanki [18]. Leukocyty wraz z mikroglejem wpływają na tkankę nerwową przez wydzielane cytokiny, chemokiny i aktywność enzymów, przede wszystkim iNOS (tworzony przez nią NO działa neurotoksycznie) i MMP. Cytokiny prozapalne (IL-1β i IL-6, TNF-α) mogą także regulować fagocytozę w mikrogleju/makrofagach. Wpływ tego procesu na regenerację nie jest do końca poznany, jest jednak istotnym etapem służącym usunięciu powstałych szczątków komórkowych [19, 20]. Cytokiny mogą też sprzyjać apoptozie, nekrozie i pyroptozie neuronów [21]. Mogą również wpływać na leukocyty, jak w przypadku IL-23 wydzielanej przez mikroglej/makrofagi, aktywującej limfocyty Th17, które wydzielają IL-17 zwiększając napływ do tkanki neutrofili [22].

Warto wspomnieć, że podczas udaru makrofagi obwodowe i mikroglej różnią się umiejscowieniem. Stwierdzono bowiem, że tylko makrofagi obwodowe można znaleźć w strefie martwicy, co jest związane z ich zdolnością do funkcjonowania w warunkach niedotlenienia. Zdolności takiej nie ma mikroglej, który podczas udaru lokuje się wokół strefy niedokrwienia [23, 24]. Liczba makrofagów i mikrogleju w strefie objętej udarem zmienia się też w czasie. Zauważono bowiem, że po około 72 h po udarze liczba komórek mikrogleju maleje, a monocytów/makrofagów rośnie [25]. Zauważono także, że makrofagi obwodowe mają bardziej negatywny wpływ na neurony niż mikroglej, co prawdopodobnie wiąże się z tym, że makrofagi wytwarzają więcej cytokin prozapalnych i intensywniej fagocytują [26, 27]. Inne badania wskazują, że w strefie objętej udarem makrofagi wydzielają więcej ROS i TNF-α, a mikroglej więcej IL-1β [25]. Różnica jest niezależna od polaryzacji komórek; pojawiły się jednak prace, które sugerują, że obecność makrofagów obwodowych po udarze jest korzystna. Zaobserwowano bowiem, że zablokowanie ich migracji obniżało długoterminową poprawę funkcjonalną i poziom markerów polaryzacji alternatywnej [28].

W czasie udaru krwotocznego również zachodzi aktywacja mikrogleju i jego migracja do strefy otaczającej krwiak [29]. Składniki krwi, takie jak hemoglobina, hem i methemoglobina, są odbierane przez te komórki jako sygnały o uszkodzeniu, czyli tzw. wzorce DAMP (damage/danger associated molecular patterns) nasilając stan zapalny [20]. Podobnie jak w udarze niedokrwiennym również tutaj mikroglej i napływające makrofagi obwodowe wytwarzają wiele cytokin prozapalnych (IL-1β, IL-6, TNF-α), które wpływają na otaczające komórki i na nie same [30]. Zauważono np., że IL-1β i TNF-α obniżają zdolność do fagocytozy elementów krwiaka przez mikroglej/ makrofagi przez obniżenie ekspresji CD36 (receptor zmiatacz typu II) [31].

W badaniach na modelach zwierzęcych po wystąpieniu udaru niedokrwiennego jak i krwotocznego obserwuje się charakterystyczne zmiany liczby makrofagów/mikrogleju M1 i M2. Perego i wsp., [14] zaobserwowali, że po udarze niedokrwiennym występuje gradient czasowy pojawiania się odpowiednio spolaryzowanych komórek, z początkową przewagą komórek M2. Badając ekspresję markerów związanych z fenotypem M2, takich jak CD206 i Ym1, zauważyli, że ich ekspresja rośnie w krótkim czasie po udarze, osiągając maksimum około 24 h, a następnie maleje. Podobne wyniki uzyskali Hu i wsp. [32]. Stwierdzili, że ekspresja markerów M2 (Arg-1, IL-10, TGF-β, CD206, Ym1/2 i CCL22) wzrasta, osiągając maksimum między 3 i 5 dniem po udarze, a następnie spada, osiągając w 14. dniu poziom wyjściowy. Natomiast ekspresja markerów M1 (iNOS, CD32, CD16, CD86 i CD11b) rosła stopniowo, aż do ostatniego mierzonego dnia (14. dzień po udarze). Badania gryzoni w różnym wieku wykazały bardzo podobny obraz, z maksimum ekspresji CD206 (marker M2) w 7. dniu po udarze i CD16 i CD32 (markery M1) w 14. dniu [33].

Zauważono też pewne wzorce przestrzenne rozmieszczenia mikrogleju i makrofagów w strefie martwicy, penumbry i poza nią. Stwierdzono, że znajdujące się w tych regionach komórki różnią się morfologią, a komórki wykazujące ekspresję poszczególnych markerów mają charakterystyczną lokalizację. Na przykład wspomniane komórki CD206+ i Ym1+ były wykrywane w pierwszym tygodniu po udarze jedynie w strefie martwicy. Jednak wyciąganie wniosków o polaryzacji tych komórek jest utrudnione, ponieważ poszczególne markery tylko częściowo ulegają w nich kolokalizacji [14].

W krwotoku śródmózgowym zauważono odwrotny gradient czasowy rozmieszczenia komórek M1 i M2 niż w udarze niedokrwiennym. Najwyższą ekspresję markerów M1 stwierdzono po 12 h od udaru, a poziom markerów M2 rósł stopniowo przez 14 dni. Wykazano, że zjawisko to jest zależne od receptora chemokinowego CX3CR1 wiążącego fraktalkinę (CX3CL1). Stwierdzono również, że pozbawiony tego receptora mikroglej nie przechodzi tej zmiany, co ma związek z mniejszą poprawą funkcjonalną w 14. dniu po udarze [34].

Na polaryzację mikrogleju, oprócz mikrośrodowiska tkanki, wpływają także czynniki bardziej ogólne. Należą do nich płeć, ponieważ u samic myszy obserwuje się wyższą ekspresję markerów M2 [35], i wiek zwierząt, gdyż u starszych osobników wykazano mniejszą polaryzację M2, co koreluje ze słabszą poprawą stanu ich zdrowia [33].

Nie wiadomo, co odpowiada za zmiany fenotypu mikrogleju/makrofagów po udarze. Jedna z hipotez zakłada, żeta polaryzacja mogłaby zależeć od neuronów i wydzielanych przez nie substancji. Eksperymenty in vitro wskazują bowiem, że pożywka hodowlana z hodowli neuronów pozbawionych tlenu i glukozy (OGD, oxygen-glucose deprivation) stymuluje klasyczną polaryzację mikrogleju. Takie komórki zwiększają ekspresję iNOS i CD16, wytwarzanie NO i TNF-α, ale słabiej fagocytują [32]. Inna, jeszcze niepotwierdzona, hipoteza zakłada, że poddane ischemii neurony stymulują polaryzację alternatywną w sposób zależny od lipokaliny-2, IL-4 lub rozpuszczalnej formy fraktalkiny. Wykazano, że podczas ischemii uwalniana z nekrotycznych neuronów IL-4 stymuluje fagocytozę i naprawę tkanki, co przypisano promowaniu fenotypu M2 [36]. W procesie polaryzacji zwraca się też uwagę na szlaki sygnalizacyjne zależne od czynników STAT (signal transducer and activator of transcription) lub receptorów PPARγ oraz czynników regulatorowych interferonu (IRF, interferon regulatory factor) i miRNA [20, 32, 37]. Istotny może być również wpływ innych leukocytów np. limfocytów T regulatorowych lub monocytów Ly6C^high [38].

Analizując wpływ mikrogleju/makrofagów po udarach mózgu przyjmuje się, że fenotyp M1 działa neurotoksycznie, a M2 protekcyjnie i stymuluje regenerację. Mimo że nie jest to zjawisko dokładnie zbadane, to wiele przykładów świadczy na korzyść tej hipotezy. W badaniach in vitro wykazano bowiem, że wpływ mikrogleju na neurony zależy od ich fenotypu. Komórki M2 działały neuroprotekcyjnie po dodaniu ich do hodowli neuronów, a komórki M1 działały neurotoksycznie nawet w przypadku dodania do hodowli neuronów samej pożywki z ich hodowli. Oznacza to, że wpływ komórek M1 jest wywierany też przez czynniki rozpuszczalne [32]. Wykazano także, że komórki M2 mogą stymulować neurogenezę, remodeling aksonów, angiogenezę, powstawanie oligodendrocytów i remielinizację [37]. Mikroglej/makrofagi spolaryzowane alternatywnie przyspieszają także usuwanie uszkodzonych komórek, wpływając pozytywnie na kondycję tkanki [20]. Wpływ komórek M1 i M2 zaobserwowano też na modelach innych chorób i uszkodzeń w centralnym układzie nerwowym. Zauważono, że makrofagi/mikroglej M1 hamują wzrost neurytów, a subpopulacja makrofagów (ale mikrogleju prawie nie), która wykazuje ekspresję IL-10 i onkomoduliny, stymuluje ten wzrost [37]. Pośredni wpływ polaryzacji makrofagów na remielinizację wykazano w modelach in vitro – pożywka z hodowli makrofagów M1 przyspieszała wywołaną hipoksją śmierć oligodendrocytów [39]. Makrofagi M1 hamują też, w sposób zależny od TNF-α, powstawanie oligodendrocytów, a M2 działają przeciwnie za pośrednictwem insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF-1, insulin-like growth factor) [37]. Natomiast makrofagi M2 wpływają na angiogenezę m.in. za pośrednictwem VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, vascular endothelial growth factor) i IL-8/CXCL8 i MMP-9 (ryc. 2) [37].

Na podstawie różnego wpływu komórek M1 i M2 na regenerację tkanki nerwowej, wnioskuje się, że modulacja polaryzacji mikrogleju i makrofagów w stronę fenotypu M2 miała działanie terapeutyczne. W tym celu bada się wpływ takich substancji jak minocyklina – antybiotyk, który wprawdzie hamuje polaryzację M1, degradację IκBα (inhibitora ważnego szlaku prozapalnego zależnego od NF-κB), ale hamuje też kinazy MAP (mitogen-activated protein kinases), ERK (extracellular signal-regulated kinase) i JNK (c-Jun N-terminal kinase) [40]. Stwierdzono, że podanie minocykliny przynosi poprawę w modelach zwierzęcych i daje wstępnie obiecujące wyniki w badaniach na ludziach [41]. Rosiglitazon (agonista PPARγ) czy malibatol A (antyoksydant pochodzenia roślinnego, promujący polaryzację M2 i zwiększający lokalizację jądrową i aktywność PPARγ [42]) wykazywały terapeutyczne działanie w zwierzęcych modelach udaru. Po ich użyciu obserwowano poprawę funkcjonalną i zmniejszenie obszaru martwicy [42, 43]. Innym podejściem są próby terapii polegających na transplantacji komórek M2 polaryzowanych ex vivo. W badaniu na modelu zwierzęcym nie okazało się ono jednak skuteczne [44]. Podstawowe wątpliwości budzi zagadnienie, czy makrofagi nie są komórkami zbyt plastycznymi i nie zmieniają swojej polaryzacji na inną, kiedy już napotkają sygnały z uszkodzonej tkanki.

Wydaje się, że ważnym czynnikiem w tego typu badaniach jest czas podania substancji, gdyż najprawdopodobniej taka terapia jest skuteczna tylko w pewnym oknie czasowym i nie jest wykluczone, że zastosowana za wcześnie lub za późno wywiera odwrotny od zamierzonego wpływ na tempo regeneracji tkanki. Istotnym materiałem do przyszłych badań jest poszukiwanie substancji działających tylko na populację makrofagów napływających z krwią, a nie na mikroglej, który do tej pory wydaje się mieć wpływ bardziej neuroprotekcyjny [20].

Rycina 2

Rdzeń kręgowy po przerwaniu wywołanym urazem mechanicznym (SCI, spinal cord injury) ma niewielką zdolność do regeneracji, a nerwy obwodowe mogą się regenerować w znacznym stopniu. Jest wiele czynników, które mogą być odpowiedzialne za tę różnicę, w tym przede wszystkim inne komórki odpowiedzialne za mielinizację [45]. Zauważono też, że o ile w regeneracji większości tkanek organizmu po urazie, po pierwszej reakcji zapalnej związanej z obecnością makrofagów M1, po pewnym czasie następuje wyciszenie zapalenia i nasilenie procesów odbudowy związane z aktywnością makrofagów M2, to w urazie rdzenia kręgowego reakcja zapalna trwa długo i nie występuje wyraźna zmiana polaryzacji komórek w stronę M2. Skłania to do rozważenia wpływu polaryzacji makrofagów/mikrogleju i ich aktywności na zdolność regeneracji neuronów i możliwości wykorzystania tego wpływu w przyspieszeniu regeneracji po urazie nerwu obwodowego lub umożliwieniu odnowy rdzenia kręgowego [46, 47].

W urazie rdzenia kręgowego wyróżniamy dwie fazy: ostrą i wtórną. Pierwsza ma związek z bezpośrednimi skutkami urazu mechanicznego, a druga z jego następstwami, takimi jak: ischemia, krwotok, ekscytotoksyczność i reakcja zapalna oraz związana z nimi apoptoza, nekroza i zwyrodnienie Wallera (zanik dystalnej części przeciętego aksonu). W przypadku rdzenia kręgowego w reakcji układu odpornościowego główną rolę odgrywają napływające z obwodu neutrofile i makrofagi oraz mikroglej. Neutrofile i mikroglej naciekają miejsce uszkodzenia w pierwszych dwóch dniach po uszkodzeniu, natomiast obecność makrofagów obserwuje się tam po 3–7 dniach po uszkodzeniu. Stan zapalny może się przyczyniać do dalszego uszkadzania macierzy zewnątrzkomórkowej i śmierci komórek, ale ma też regeneracyjne znaczenie dzięki usuwaniu uszkodzonych komórek [48].

Kigerl i wsp. [47] zauważyli, że ekspresja markerów M1 i M2 wzrasta natychmiast po urazie, ale poziom ekspresji genów kodujących markery M2 szybko maleje, osiągając wyjściowy poziom już w 7. lub 14. (Arg-1 i CD206) dniu po udarze. Podobnie maleje poziom iNOS, ale nie pozostałych markerów M1, których poziom rośnie z czasem aż do ostatniego mierzonego dnia (28. dzień po SCI). Autorzy sprawdzali też liczbę komórek wykazujących ekspresję markerów typowych dla M1 i M2. Zauważono, że zaraz po urazie ich liczba jest podobna i niektóre komórki wykazują ich jednoczesną ekspresję. Natomiast w kolejnych dniach, aż do 28. dnia po urazie, proporcja M1 do M2 rosła, aby ostatecznie komórki M1 prawie całkowicie dominowały wśród obecnych w uszkodzonej tkance makrofagów. Autorzy potwierdzili też hipotezę, że za utrzymanie polaryzacji M1 w SCI są odpowiedzialne sygnały z uszkodzonej tkanki. W eksperymencie przeszczepiali spolaryzowane in vitro makrofagi M2 w różne miejsca rdzenia kręgowego. Komórki wszczepione do miejsca lezji lub w jej pobliże traciły swój fenotyp w 20-40% przypadków, co nie działo się, gdy znajdowały się w tkance zdrowej [47]. Sugeruje się, że za promowanie zmiany fenotypu tych makrofagów w kierunku M1 odpowiedzialna może być uszkodzona mielina [49]. Natomiast do ogólnych czynników wpływających na polaryzację makrofagów w SCI należy stan zdrowia, infekcje, stopień uszkodzenia, ale też wiek pacjentów [48].

Również w SCI sugeruje się, że fenotyp makrofagów i mikrogleju może wpływać na zdolność odnowy rdzenia, w tym na demielinizację i remielinizację, wzrost aksonów i obumieranie neuronów. Powszechnie uznaje się, że fenotyp M1 działa niekorzystnie na przeżywalność neuronów, co jest prawdopodobnie związane z wysoką ekspresją iNOS i interakcjami z innymi komórkami utrzymującymi stan zapalny. Wykazano także, że makrofagi o fenotypie M1 i M2 w różny sposób wpływają na wzrost aksonów. Zaobserwowano bowiem, że aksony neuronów hodowane z dodatkiem pożywki znad makrofagów M2 miały dłuższe neuryty niż te hodowane w obecności pożywki pochodzącej z hodowli makrofagów M1 [47]. Innym czynnikiem, który być może wpływa na hamowanie wzrostu aksonów w rdzeniu, jest kilkanaście razy wyższa w makrofagach M1 ekspresja proteoglikanów z siarczanem chondroityny, który jest składnikiem blizny glejowej mającym istotny wpływ na wzrost neurytów [50]. Zaletą obecności makrofagów M1 podczas SCI jest ich duża aktywność fagocytarna i prozapalna, która sprzyja usuwaniu uszkodzeń i ewentualnych patogenów krótko po urazie. Natomiast wytwarzane przez mikroglej i makrofagi cytokiny prozapalne, takie jak IL-1β i TNF-α, wpływają negatywnie na aksony w rdzeniu [8]. Komórki o fenotypie M2, oprócz promowania wzrostu aksonów, wpływają też pozytywnie na remielinizację (ryc. 3) [48].

Korzystny wpływ alternatywnej polaryzacji makrofagów po SCI potwierdzają też liczne prace, opisujące wpływ substancji modulujących zmianę fenotypów makrofagów na kondycję tkanki i poprawę jej funkcjonowania. Do badanych substancji należą m.in. higenamina, azytromycyna, reduktaza aldozy i melatonina [48, 51]. Także terapie oparte na przeszczepie mezenchymalnych komórek macierzystych i zwiększeniu dostępności tlenu (HBO therapy, hyperbari coxygen therapy) są związane m.in. ze zmianą polaryzacji makrofagów w stronę M2. Nie można jednak jednoznacznie stwierdzić, w jakim stopniu substancje te działają przez wpływ na makrofagi, gdyż często działają na wiele różnych typów komórek np. limfocyty T lub mają inny, bardziej bezpośredni wpływ na przeżywalność neuronów [8, 48].

Choroba Alzheimera (AD, Alzheimer’s disease) jest chorobą otępienną, w której wieloletnim przebiegu występują objawy obejmujące postępujące zaburzenia i utratę pamięci i funkcji poznawczych oraz w późniejszych stadiach objawy neuropsychiatryczne. W mózgu choroba objawia się postępującym zanikiem neuronów kory mózgowej, obecnością płytek starczych, czyli agregatów białka amyloidowego β (Aβ) i splątków neurofibrylarnych hiperfosforylowanego białka tau (NFT, neurofibryllary tangles). Te zjawiska, wraz z towarzyszącym chorobie stanem zapalnym, są głównymi elementami patogenezy AD, choć wciąż nie jest pewne, który z nich jest pierwotną przyczyną schorzenia [52]. Ogólnym problemem w badaniu wpływu stanu zapalnego na rozwój AD jest odróżnienie wpływu stanu zapalnego wywołanego w mózgu od stanu zapalnego w reszcie organizmu wywołanego przebiegiem innej, towarzyszącej choroby. Taki stan zapalny może powodować nasiloną reakcję prozapalną mikrogleju na złogi Aβ w tkance [53].

W trakcie AD w mózgu dochodzi do aktywacji astrocytów i mikrogleju. Aktywowany mikroglej proliferuje oraz otacza płytki starcze, ale nie może ich efektywnie fagocytować [54]. Przyjmuje się, że dochodzi również do indukcji stanu zapalnego, który potęguje neurodegenerację przez czynniki takie jak cytokiny prozapalne, NO i ROS. Obserwacje ekspresji cytokin jednak nie potwierdzają przewidywania [55]. W AD ważnym problemem jest również napływ do mózgu, przeznieszczelną BBB, makrofagów obwodowych. W tym wypadku rozszczelnienie BBB wynika prawdopodobnie z rozwoju stanu zapalnego i związanego z wiekiem osłabienia szczelności tej bariery. Występowanie i istotność tego procesu są jednak nadal przedmiotem dyskusji. W nowszych artykułach autorzy skłaniają się jednak ku twierdzeniu, że jest to proces marginalny.

Rycina 3

Uważa się natomiast, że obie populacje fagocytów obecne w mózgach pacjentów z AD mogą się różnić właściwościami. Na przykład migrujące do płytek starczych makrofagi obwodowe są skuteczniejsze w ich fagocytozie, a mikroglej wydaje się w mniejszym stopniu zdolny do infiltracji i pochłaniania płytek, może za to wytwarzać czynniki wzrostu chroniące neurony lub cytokiny działające neurotoksycznie [8, 56]. Wydaje się więc, że wpływ samego mikrogleju w AD może być wieloraki [57, 58].

Stan zapalny i nieefektywna fagocytoza złogów Aβ wskazywałyby na dominowanie w trakcie AD fenotypu M1 mikrogleju. Jednak badania nie zawsze to potwierdzają. Colton i wsp. [55] zauważyli w próbkach pozyskanych ze zwierzęcych modeli AD i od pacjentów z tą chorobą większy wzrost ekspresji markerów polaryzacji M2 niż M1. U ludzi zaobserwowano wzrost ekspresji Arg-1, Chi3L1, Chi3L2 (białka chitynazopodobne) i TNF-α, ale nie MR, iNOS i IL-1β. Wcześniejsze badania prozapalnej reakcji mikrogleju z różnym skutkiem próbowały dowieść wytwarzania cytokin prozapalnych przez mikroglej otaczający złogi Aβ. Autorzy zasugerowali więc hipotezę, że mikroglej przybiera fenotyp pośredni, co wynika ze specyficznego dla tej choroby bodźca lub też, że w mózgu mamy do czynienia z mozaiką fenotypów, wśród których M1 dominuje wokół płytek starczych, ale obecna jest też duża ilość mikrogleju M2. Innym możliwym wyjaśnieniem, wartym wzięcia pod uwagę, jest możliwość zmiany dominującej polaryzacji w zależności od stadium choroby [59]. Sygnałem z tkanki wpływającym na polaryzację mogą być tutaj złogi Aβ, które in vitro powodują, że mikroglej prezentuje fenotyp M1 [55].

Na mieszany charakter polaryzacji mikrogleju podczas AD wskazują też obserwacje Blalock i wsp. [60], że w AD dochodzi do podwyższenia poziomu MHC II, IFN-γ, IL-18, ale też receptorów przeciwzapalnych IL-6 i IL-10 [60]. Wspomnieć jednak należy, że są również badania wskazujące na podniesie u tych pacjentów tylko ekspresji MHC II [61] lub ekspresji IL-1β oraz białek związanych ze szlakiem NF-κB, co wskazuje na dominację fenotypu M1 [62]. Chociaż są też prace wskazujące na wzrost poziomu cytokin przeciwzapalnych, takich jak TGF-β [63]. Trudno wyjaśnić tę rozbieżność i wysnuć wspólny wniosek co do prozapalnej lub przeciwzapalnej aktywności mikrogleju w AD.

Niezależnie jednak od tych rozbieżności wykazano, że mikroglej M1 negatywnie wpływa na przebieg choroby Alzheimera. Sugeruje się, że podniesienie poziomu IL-1, TNF-α i CCL3 przyspiesza degradację neuronów i odkładanie Aβ [58]. Wskazano także, że IL-6, IL-1 i CX3CL1 promują hiperfosforylację białka tau i formowanie NFT [64]. Mikroglej M1 jest też nieskuteczny w usuwaniu złogów Aβ. Może to być wynikiem wpływu cytokin prozapalnych, a działa zależnie od NF-κB, a może być zniwelowane przez traktowanie mikrogleju IL-4, IL-13, TGF-β i IL-10 lub niesteroidowymi lekami przeciwzapalnymi [65]. Autorzy wskazują jednak, że same w sobie cytokiny przeciwzapalne nie powodują wzrostu pochłaniania Aβ. Chociaż w innym badaniu wykazano, że cytokiny, takie jak TNF-α i IFN-γ hamowały pochłanianie i degradację peptydu Aβ, a przyspieszanie jego degradacji następowało po podaniu IL-10, TGF-β i IL-4 [66]. Dodatkowym wyjaśnieniem tego zjawiska jest obniżona ekspresja receptorów błonowych, takich jak receptory zmiatacze SR-A (scavenger receptor A) oraz receptorów RAGE (receptor for advanced glycation end products), które mogłyby wykrywać Aβ. Ponadto stwierdzono, że w AD dochodzi do obniżenia w mikrogleju ekspresji enzymu rozkładającego insulinę (IDE, insulin degrading enzyme), który oprócz wymienionej w nazwie insuliny rozkłada też Aβ [65, 67]. Mikroglej o fenotypie M2 wydaje się więc skuteczniejszy w eliminowaniu płytek starczych. Wpływa także neuroprotekcyjnie przez wytwarzanie IL-10 i TGF-β, czynników neurotroficznych, takich jak NGF (nerve growth factor), i hamowanie wydzielania substancji potencjalnie neurotoksycznych (np. kwasu glutaminowego) [58]. Polaryzacja M2 hamuje też przenoszenie oligomerów Aβ między neuronami in vitro [68]. Dzięki tym zdolnościom mikroglej M2 może hamować rozwój choroby w pewnym jej aspekcie, co dzieje się w jej bardzo wczesnym stadium. Nowsze badania nad rozwojem AD również wskazują na istotną rolę mikrogleju w rozprzestrzenianiu złogów zarówno Aβ jak i NFT. Pierwsze są roznoszone przez wytwarzanie skupisk białka ASC (ASC specks, apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain specks), powstających w wyniku aktywacji inflamasomu, które mogą być wydzielane na zewnątrz komórki [69]. Nie ma wprawdzie jeszcze badań potwierdzających ścisły związek między aktywacją inflamasomu a polaryzacją mikrogleju, ale istnieją pewne przesłanki, by sądzić, że jest to zjawisko związane z fenotypem M1. Przede wszystkim IL-1β i IL-18 wytwarzane w wyniku aktywacji inflamasomu są charakterystyczne tylko dla fenotypu M1 mikrogleju. W modelach urazu rdzenia kręgowego hamowanie aktywacji inflamasomu wiąże się z promowaniem polaryzacji M2 [70]. Natomiast białko tau jest przenoszone przez wytwarzanie egzosomów (ryc. 4) [71].

Rycina 4

Nie dziwi więc to, że w przypadku AD również zwrócono uwagę na potencjalne terapeutyczne wykorzystanie różnic we wpływie mikrogleju M1 i M2. Leku promującego polaryzację M2 szuka się m.in. wśród agonistów PPARγ, które hamują gromadzenie się Aβ i rozwój choroby, a podnoszą poziom markerów M2 [72]. Potencjalnymi lekami mogą być też inhibitory szlaku związanego z kinazą mTOR, inhibitory szlaku kinazy związanej z białkiem Rho, jak np. fasudil, ale też inhibitory szlaku NF-κB [58]. Pod tym kątem badane jest także białko TREM2, którego nadekspresja działa terapeutycznie. Co jest związane z promowaniem polaryzacji M2 mediowanym przez hamowanie kinazy GSK-3β (glycogen synthase kinase) i CDK5 (cyclin-dependent kinase 5). Receptor ten wpływa również na proces fagocytozy i ma działanie przeciwzapalne [58, 73]. Wśród innych badanych terapii można wymienić podanie mezenchymalnych komórek pnia wydzielających rozpuszczalną postać receptora RAGE (sRAGE, soluble RAGE), których obecność zwiększa proporcję M2 do M1 [74].

Stwardnienie zanikowe boczne (ALS, amyotrophic lateral sclerosis) to choroba neurodegeneracyjna charakteryzująca się zanikiem motoneuronów w korze mózgowej, rdzeniu przedłużonym i rdzeniu kręgowym. Do rozpatrywanych hipotetycznych mechanizmów jej rozwoju należą m.in.: podatność motoneuronów na ekscytotoksyczność wywołaną glutaminianem, zaburzenia pracy mitochondriów, stres oksydacyjny, agregacja białek cytoszkieletu, niedobór czynników wzrostu oraz stan zapalny i nieprawidłowa aktywność mikrogleju [75].

Wiele wskazuje na to, że mikroglej odgrywa istotną rolę w rozwoju ALS; są to m.in. obserwacje aktywacji mikrogleju w przebiegu tej choroby, jego proliferacji i migracji oraz wytwarzanie czynników prozapalnych i ROS w obszarach uszkodzonych [8]. Samo podanie płynu mózgowordzeniowego od pacjentów z ALS do hodowli mikrogleju powoduje jego prozapalną aktywność i zwiększenie ekspresji IL-6, TNF-α, iNOS, cyklooksygenazy-2 (COX2), a także wzrost poziomu prostaglandyny PGE2. Zabieg taki obniża natomiast ekspresję czynników wzrostu np. VEGF [76]. Badania nad ALS przeprowadza się na modelach zwierzęcych, które oparte są na wprowadzeniu do genomu zwierzęcia ludzkiego zmutowanego genu kodującego dysmutazę ponadtlenkową 1 (mSOD1). Mutacja enzymu wywołuje objawy nie przez utratę jego pierwotnej funkcji, ale przez zyskanie nowej, nieznanej funkcji [77]. SOD1 ulega ekspresji zarówno w neuronach, astrocytach jak i mikrogleju. Obniżenie poziomu ekspresji mSOD1 w mikrogleju w modelu transgenicznym spowalnia późny etap choroby, co wskazuje na rolę tych komórek w jej przebiegu [78]. Sama hodowla in vitro motoneuronów ze stymulowanym LPS mikroglejem transfekowanym mSOD1 zwiększa śmierć neuronów i zmniejsza liczbę aksonów w porównaniu do hodowli motoneuronów z mikroglejem kontrolnym [79]. Taki mikroglej reaguje też silniej na podanie LPS i IFN-γ, wydziela więcej NO i ROS, co może odpowiadać za jego działanie neurotoksyczne [8, 79]. Za tą wzmocnioną odpowiedź prozapalną obserwowaną w ALS być może odpowiadają też inne mutacje występujące w rodzinnych postaciach tej choroby, takie jak TDP-43, która podnosi ekspresję oksydazy NADPH 1 (NOX-1, NADPH oxidase 1), IL-1β i TNF-α [80]. Innym białkiem, którego mutacja może powodować chorobę, jest TBK1 (TANK-binding kinase 1). Jest to białko uczestniczące w procesach autofagii i wpływające na ekspresję IFN-α i β [81].

Według części badaczy polaryzacja mikrogleju w przebiegu ALS zmienia się z czasem i obejmuje spektrum fenotypów. Ta zmiana jest bardzo wyraźna i istotna przy badaniu wpływu potencjalnych terapii, które działają tylko w wybranych fazach choroby. Na początku choroby i przed pojawieniem się pierwszych objawów dominują cechy i markery fenotypu M2 (np. Ym1, BDNF [brain-derived neurotrophic factor], CD163), a w późnej fazie cechy fenotypu M1 (np. podwyższona ekspresja NOX-1) [82, 83].

Badania wpływu tych wyizolowanych komórek na motoneurony in vitro wskazują raczej na neuroprotekcyjny wpływ pierwszej (M2) populacji mikrogleju, co objawia się brakiem różnicy w przeżywalności neuronów i w ich morfologii w porównaniu z kontrolą. Dodanie do takiej hodowli astrocytów zwiększa przeżywalność neuronów i wzrost długości ich neurytów [83]. Te najwcześniejsze populacje mikrogleju wytwarzają duże ilości BDNF, GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) i cytokin przeciwzapalnych, takich jak IL-4 i IL-10 [82, 84]. Populacja z późnego stadium choroby, czyli komórki M1, mają natomiast właściwości neurotoksyczne. Dodanie ich do hodowli motoneuronów zwiększało bowiem ich obumieranie i zmniejszało liczbę neurytów. Komórki miały krótsze neuryty i mniejszy kadłub, a efekt nie był modulowany przez dodanie astrocytów [83]. Cytowane tu badanie Liao i wsp., choć wyraźnie wykazuje różny wpływ mikrogleju M1 i M2 na neurony, nie ukazuje całości interakcji między komórkami w tym zwierzęcym modelu ALS, bo tylko stosowany mikroglej zawierał zmutowane SOD1 (ryc. 5).

Inne badania sugerują, że mikroglej w modelu ALS z mSOD1 prezentuje wyjątkowy i charakterystyczny fenotyp będący mieszanką cech komórek M1 i M2 [76]. Do jego charakterystycznych cech należy nadekspresja działającego neuroprotekcyjnie IGF-1 [85]. Nieco niepasującym elementem tej układanki jest stopniowy spadek ekspresji IL-6 i wzrost poziomu antagonisty receptora IL-1 (IL-1Ra, interleukin-1 receptor antagonist) [86]. Także ekspresja Arg-1 (klasycznego markera M2) i iNOS (markera M1) wzrasta w czasie ALS i koreluje z aktywacją mikrogleju [87]. Charakterystyczna dla rozwoju ALS jest też nadekspresja COX-2 [88]. Podobnie wskazują wyniki analizy transkryptomu mikrogleju z mSOD1, w których obserwuje się wzrost ekspresji IGF-1, progranuliny i TREM2, które biorą udział w szlakach przeciwzapalnych, ale też genów klasycznych cytokin prozapalnych i MMP-12, które mogą być potencjalnie neurotoksyczne. Zdaniem autorów charakterystyka tego transkryptomu jest podobna do innych chorób neurodegeneracyjnych, np. AD [85]. Być może te dwie hipotezy nie wykluczają się i w tym modelu ALS występuje zarówno nietypowy fenotyp będący wynikiem mutacji SOD1 i mikrośrodowiska tkanki charakterystycznego dla tej choroby, jak i występuje gradient czasowy, w którym początkowy neuroprotekcyjny i przeciwzapalny fenotyp zastępowany jest prozapalnym i neurotoksycznym.

Rycina 5

Ważnych obserwacji dostarczają też badania potencjalnych leków modulujących polaryzację mikrogleju. Na przykład badania wpływu minocykliny w zwierzęcych modelach z mSOD1 wykazują, że jeśli lek podawany jest przed pojawieniem się objawów choroby, opóźnia jej pojawienie się, zmniejsza śmiertelność i osłabia aktywację mikrogleju. Podawany w późnych stadiach choroby nie działa terapeutycznie, a nawet nasila reakcję zapalną i aktywację mikrogleju i astrocytów [80, 89]. Kolejną badaną substancją jest BBG (Brilliant Blue G), która jest antagonistą receptora purynergicznego typu 2 P2X7. Receptor ten uczestniczy w reakcji zapalnej, a jego nadmierną aktywację opisano w modelach zwierzęcych ALS i u osób chorych. Stwierdzono, że podanie BBG działa terapeutycznie w modelach zwierzęcych tylko przy podaniu w fazie tuż przed rozwojem objawów choroby, co wiąże się ze wzrostem ekspresji markerów polaryzacji M2 i obniżeniem ekspresji markerów M1. Podanie go wcześniej wpływa na ekspresję markerów M1, ale nie powoduje wzrostu ekspresji markerów M2 i nie daje poprawy, co wskazuje na istotność neuroprotekcyjnego wpływu M2 w hamowaniu rozwoju choroby [80]. Podobne wyniki otrzymano w badaniach leków antyhistaminowych, takich jak klemastyna, która również moduluje polaryzację na korzyść M2, ale daje efekt terapeutyczny tylko wtedy, gdy jest podawana w fazie przedobjawowej, ale nie gdy jest podawana począwszy od tej fazy do końca choroby [90].

Stwardnienie rozsiane (MS, multiples sclerosis) jest chorobą zapalno-zwyrodnieniową o podłożu autoimmunologicznym, powodującą zapalne zmiany wieloogniskowe polegające na degeneracji osłonek mielinowych i uszkodzeniu aksonów. W trakcie choroby dochodzi do uszkodzenia BBB, migracji leukocytów i powstawania okołonaczyniowych nacieków komórkowych, wspomnianego uszkodzenia mieliny, aksonów i oligodendrocytów oraz wtórnego przerostu astrogleju. Informacji na temat MS dostarcza zwierzęcy model tej choroby – doświadczalne autoimmunizacyjne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE, experimental autoimmune encephalomyelitis). Wiadomo, że główną rolę w mechanizmie tego modelu, ale też najprawdopodobniej w rozwoju choroby u ludzi, odgrywają autoreaktywne limfocyty Th17 i Th1 [91, 92]. Ważna jest także rola innych leukocytów, w tym makrofagów i mikrogleju [92].

Badania wykazują, że brak aktywowanego mikrogleju hamuje rozwój EAE, co wskazuje na jego istotność w patogenezie choroby [93]. Ponadto zaobserwowano, że mikroglej i makrofagi w pobliżu lezji zawierają sfagocytowane fragmenty mieliny i markery fagocytozy, takie jak CD68, co wskazuje, że mogą brać aktywny udział w procesie demielinizacji [94]. Ze względu na autoimmunizacyjny charakter choroby, ważne są możliwe interakcje makrofagów z limfocytami T. Wiadomo, że podczas choroby mikroglej/ makrofagi wykazują wyższą niż normalnie ekspresję MHC II oraz cząsteczek kostymulujących CD80 i CD86 oraz że w modelu zwierzęcym znajdują się w pobliżu limfocytów Th nawet przed pojawieniem się objawów [95]. Może to sugerować istotność tych komórek w prezentowaniu antygenów w początkowych fazach choroby [96]. Takie interakcje komórek (za pośrednictwem cząsteczek kostymulujacych CD80, CD86) mogłyby się też przyczyniać do proliferacji i różnicowania limfocytów Th, a także do wytwarzania cytokin prozapalnych przez makrofagi/mikroglej (przez oddziaływanie cząsteczek CD40-CD40L) [8]. Makrofagi/mikroglej wydzielają również IL-12 i IL-23, które stymulują limfocyty Th, odpowiednio Th1 i Th17 [8]. Komórki te mogą się przyczyniać do rozwoju MS również przez wytwarzanie cytokin prozapalnych, takich jak IL-6 oraz TNF-α, co podnosi wytwarzanie wielu chemokin. Jednak badania na zwierzętach sugerują, że wpływ TNF-α na przebieg choroby zależy od jej fazy [97], co może wynikać ze skutków wiązania tej cytokiny do różnych receptorów (odpowiednio TNFR1 i TNFR2) [8]. W MS większe jest też wytwarzanie IL-1β, co prawdopodobnie, podobnie jak w innych sytuacjach patologicznych, sprzyja rozszczelnieniu BBB [8]. Mikroglej i makrofagi mogą się też przyczyniać do demielinizacji przez wydzielanie ROS i NO, glutaminianu oraz cząsteczek TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) i liganda Fas (FasL). Czynniki te mogą m.in. powodować śmierć oligodendrocytów [8]. ROS, NO, glutaminian i cytokiny prozapalne mogą również sprzyjać neurodegeneracji [8].

Dominująca polaryzacja makrofagów i mikrogleju zmienia się w czasie choroby, co przebadano w EAE. W ostrej fazie choroby dominuje fenotyp M1, który jest rozpoznawany dzięki ekspresji TNF-α i iNOS [92]. Podniesiona ekspresja iNOS ma negatywny wpływ na nasilenie objawów choroby, a inhibitory iNOS i endotelialnej NOS (eNOS) hamują rozwój objawów EAE i obniżają infiltrację mózgu przez leukocyty obwodowe [98]. Stopniowo w czasie trwania choroby, aż do jej największego nasilenia, liczba komórek M2 rośnie, a M1 maleje. W końcowych fazach choroby makrofagi i mikroglej M2 utrzymują się na podniesionym poziomie i wydzielają przeciwzapalne cytokiny, takie jak: IL-4, IL-10, TGF-β, IL-13 i IL-33, które hamują rozwój choroby [99]. Wzrasta również poziom Arg-1 i aktywiny A – cytokiny wytwarzanej przez limfocyty Th2 i promującej polaryzację alternatywną. Ich ekspresja wzrasta w czasie EAE i maleje po ustaniu objawów, podobnie jak iNOS, choć trzeba zauważyć, że całościowo liczba makrofagów w tkance maleje po ustaniu ostrej fazy choroby. Co jednak istotne, drastycznie zmienia się proporcja makrofagów wykazujących ekspresję markera M1 (iNOS) i M2 (Arg-1), choć niewielka część komórek wykazuje ich jednoczesną ekspresję [100]. Potencjalna pozytywna rola M2 w MS to też stymulowanie odpowiedzi Th2-zależnej i limfocytów Treg, a hamowanie aktywności limfocytów Th1 i Th17 (ryc. 6) [92].

Ponieważ wydaje się, że alternatywna polaryzacja makrofagów może być pomocna w łagodzeniu przebiegu choroby, warto się zastanowić nad pochodzeniem tych komórek. Za hipotezą, że napływające z krwią, początkowo spolaryzowane klasycznie, makrofagi z czasem zmieniają swój fenotyp, przemawia obserwacja występowania komórek o fenotypie pośrednim (wykazujących obecność iNOS i Arg-1) [100]. Inną hipotezą jest napływanie już spolaryzowanych makrofagów M2 z krwi w trakcie choroby, a jeszcze inną powstawanie komórek M2 z mikrogleju, o którym wiadomo, że proliferuje w czasie EAE [99]. Na korzyść tej ostatniej hipotezy przemawiają obserwacje wykazujące wysoką ekspresję IL-4 i zależne od niej podniesienie ekspresji Ym1 w mikrogleju w szczycie choroby. Nie obserwuje się natomiast zwiększonego wytwarzania NO przez te komórki. Jeśli uznamy je za prezentujące fenotyp M2, to stanowi on aż 99% aktywowanego mikrogleju. Inaczej dzieje się w tym czasie z fenotypami makrofagów pochodzącymi z krwi, które wytwarzają NO, ale też wysoki poziom białka Ym1, co może znów wskazywać na ich fenotyp pośredni [101].

Modulowanie proporcji makrofagów M1 i M2 może mieć duży potencjał w hamowaniu rozwoju choroby. Próby podania spolaryzowanych makrofagów M2 w modelach zwierzęcych MS okazały się obiecujące i przynosiły poprawę [102, 103]. Innymi badanymi metodami była delecja astroglejowej chemokiny CCL2, zmniejszająca liczbę komórek M1 w tkance [104], lub podawanie estrogenu lub progesteronu, co promowało polaryzację alternatywną makrofagów. W tym ostatnim procesie stosowanie estrogenu powodowało również pojawienie się limfocytów B regulatorowych [105]. Innym sposobem zwiększania polaryzacji alternatywnej in vivo było podanie kompleksów immunologicznych, które przynosiło poprawę w EAE [106]. Obiecujące mogą być również badania nad miRNA, ponieważ podanie egzogennego miRNA-124 hamuje rozwój choroby w modelu zwierzęcym [99]. To miRNA jest charakterystyczne dla mózgu, reguluje ekspresję wielu genów, w tym tych w mikrogleju. Jego obecność hamuje aktywację mikrogleju przez bezpośrednie hamowanie czynnika transkrypcyjnego C/EBP-α (CCAAT/enhancerbinding protein-α) i jest związane z promowaniem polaryzacji M2 [107]. Warto w tym miejscu wspomnieć, że w ostatnich latach wiele prac opisuje możliwe zastosowanie egzosomów lub innych nośników zawierających microRNA w terapii różnych chorób układu nerwowego [108, 109].

Rycina 6

Jedną z substancji, które są badane na modelu EAE i których działanie może być związane ze zmianą polaryzacji makrofagów, jest antyoksydant roślinny resveratrol. Wpływa na makrofagi prawdopodobnie przez deacetylazę SIRT1 (sirtuin 1), która dezaktywuje czynnik NF-κB, przez wpływ na ścieżkę zależną od białka SOCS3 (suppressor of cytokine signaling-3) lub przez wpływ na szlak związany z PPARγ [42, 110]. Wykazano, że resveratrol zmniejsza także wytwarzanie cytokin prozapalnych. Mechanizm tego zjawiska jest jednak nadal słabo poznany [111].

Kolejną badaną w terapii MS substancją jest neuropeptyd Y, który działa na makrofagi przez receptory Y1 i hamuje stymulowanie przez nie limfocytów T [112]. A spermidyna to poliamina, która w makrofagach powoduje zmianę ekspresji markerów polaryzacji (spadek wytwarzania IL-1β i IL-12, a wzrost ekspresji Arg-1) [113]. Kwas walproinowy, który prawdopodobnie oddziałuje na wiele szlaków wewnątrzkomórkowych, w EAE obniża poziom mRNA m.in. IL-1β, TNF-α i iNOS, a zwiększa ekspresję IL-4, co również wskazuje, że jego działanie jest związane ze zmianą fenotypu makrofagów [114]. Natomiast, fasudil i jego pochodna FSD-C10, będące inhibitorami kinazy związanej z białkiem Rho, to leki, które powodują zmiany w polaryzacji makrofagów, w tym w modelach EAE. Wiadomo, że działają przez hamowanie szlaku NF-κB, choć mechanizm ten nie jest dokładnie poznany [115]. Również badany na modelu EAE tuftsin za pośrednictwem neuropiliny-1, wpływając na receptor 1 TGF-β, uruchamia szlak sygnalizacyjny prowadzący do polaryzacji M2 i wytwarzania TGF-β. Peptyd ten stymuluje też fagocytozę [116, 117].

Oceniając badania nad polaryzacją makrofagów, nie można nie zauważyć potencjału, jaki niosą ze sobą w poszukiwaniach nowych terapii w chorobach neurodegeneracyjnych, medycynie regeneracyjnej związanej z uszkodzeniami centralnego układu nerwowego i łagodzeniu przebiegu chorób autoimmunologicznych. Zagadnienie to pozwala również spojrzeć wnikliwiej na wpływ mikrogleju na tkankę nerwową oraz przeanalizować jego aktywność i jej skutki lepiej, niż gdy stosuje się jedynie podział na mikroglej aktywowany i spoczynkowy. Zbadanie czy mikroglej ulega polaryzacji tak jak makrofagi obwodowe oraz jak zmiana fenotypu, rozpoznawanego po ekspresji markerów, wiąże się ze zmianą w jego aktywności, pozostaje nadal podstawowym wyzwaniem. Polaryzacja makrofagów również wymaga dalszych badań i ustalenia powszechnie akceptowanej klasyfikacji fenotypów i populacji komórek, która dobrze oddawałaby zjawiska zachodzące in vivo. Mimo bazowania na tych nieco niepewnych podstawach, udało się ustalić zarys wielu zjawisk zachodzących w chorej tkance, a nawet zaproponować w oparciu o te odkrycia nowe terapie i leki.

Należy wziąć pod uwagę, że wiele badań in vitro wyraźnie wskazuje na neuroprotekcyjny charakter polaryzacji alternatywnej, która sprzyja również różnym aspektom regeneracji tkanki. To, że w przypadku udarów mózgu pojawia się spójny obraz gradientu czasowego polaryzacji makrofagów i jest to zmiana przewagi fenotypu M2 na M1 w pierwszym tygodniu w udarze niedokrwiennym i prawdopodobnie odwrotny gradient przy udarze krwotocznym, pozwala przypuszczać, że po udarze mogłoby być skuteczne zastosowanie w odpowiednich oknach czasowych leków promujących polaryzację M2. Taka postać terapii mogłaby ograniczać wtórne uszkodzenia i umożliwiać szybsze odzyskanie funkcji. W przypadku uszkodzenia rdzenia kręgowego zaobserwowano przedłużającą się polaryzację M1, która może być jednym z elementów hamujących regenerację aksonów. Fenotyp mikrogleju prawdopodobnie ma też znaczenie w chorobie Alzheimera, która wiąże się z obecnością stanu zapalnego. Wiele wskazuje na to, że fenotyp M2 jest skuteczniejszy w usuwaniu i degradowaniu Aβ, co mogłoby mieć istotne znaczenie protekcyjne przynajmniej na niektórych etapach choroby. Nowe badania nad rolą mikrogleju w rozprzestrzenianiu złogów Aβ mogą w przyszłości wskazać na dodatkowe znaczenie polaryzacji tych komórek w rozwoju AD. W stwardnieniu zanikowym bocznym wnioski co do polaryzacji mikrogleju są mało spójne. Część badań wskazuje na gradient czasowy z początkową przewagą komórek M2, która szybko ustępuje przewadze M1. Inne badania skłaniają się ku stwierdzeniu, że choroba ta wiąże się z nietypowym, charakterystycznym dla siebie fenotypem pośrednim makrofagów. Jednak wyniki badań in vitro wskazujące na neurotoksyczny wpływ makrofagów M1 i neuroprotekcyjny makrofagów M2, pozwalają sądzić, że polaryzacja alternatywna chroni przed rozwojem choroby, co do pewnego stopnia potwierdzają badania na modelach zwierzęcych. Polaryzacja makrofagów może mieć również znaczenie w chorobach autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane. Badania na modelach zwierzęcych wskazują, że początek fazy ostrej choroby jest związany z polaryzacją M1, a jej ustępowanie poprzedzone jest zmianą proporcji makrofagów na korzyść fenotypu M2. Istotnym pytaniem pozostaje, co odpowiada za tę zmianę proporcji i czy zjawisko to można wykorzystać do hamowania postępu choroby.