The Role of Selected Virulence Factors in Infections Caused by Enterococcus spp.

Zewnątrzkomórkowe białko powierzchniowe (ang. Enterococcal surface protein, Esp) zostało po raz pierwszy wykryte u E. faecalis i opisane w 1999 roku przez Shankar i wsp (Shankar et al. 1999). Jego masa cząsteczkowa wynosi około 202 kDa. Białko Esp składa się głównie z powtarzających się bloków aminokwasowych, oznaczonych jako A (84 aminokwasy) i C (82 aminokwasy), których liczba w obrębie gatunku może się różnić. W bliskiej odległości od wspomnianych bloków umiejscowiona jest unikatowa białkowa domena N-końcowa, składająca się z 694 aminokwasów, poprzedzona krótką sekwencją sygnałową S (Tendolkar et al. 2005).

Esp jest metaloproteinazą zależną od jonów cynku, która może hydrolizować, m.in., żelatynę, hemoglobinę i kolagen (Zheng et al. 2017). Obecność Esp wiąże się ze zdolnością Enterococcus spp. do wytwarzania biofilmu, stwierdzaną zwłaszcza u szczepów z gatunku E. faecalis (Toledo-Arana et al. 2001, Waar et al. 2002), szczególnie u izolatów wywołujących zapalenie wsierdzia (Heikens et al. 2011). Enzym Esp wykazuje podobieństwo do białek występujących u innych gatunków bakterii np. białko Bap u Staphylococcus aureus i białko Rib u Streptococcus agalactiae, które również biorą udział w tworzeniu biofilmu (Shankar et al. 1999). Białko Esp ma istotną rolę w kolonizacji i wywoływaniu zakażeń układu moczowego m.in. przez tworzenie biofilmu w drogach moczowych oraz na powierzchniach cewników urologicznych (Leendertse et al. 2009, Shankar et al. 2001). Na podstawie swoich badań, Taglialegna i wsp. (2020) wykazali, że domena N-końcowa białka Esp tworzy w środowisku kwaśnym agregaty podobne strukturalnie do amyloidu, dzięki którym może indukować wytwarzanie macierzy biofilmu przez komórki niezdolne do syntezy białka powierzchniowego Esp. Natomiast Ghameshlouei i wsp. (Ghameshlouei et al. 2021) zasugerowali, że zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym i biologicznym oksadiazoli obniża ekspresję genu esp i działa hamująco na formowanie biofilmu przez E. faecalis.

Białko Esp kodowane jest przez gen esp, zlokalizowany w obrębie PAI. Top i wsp. (Top et al. 2013) wykazali, że transkrypcja operonu dla Esp u E. faecium jest regulowana przez białko EbrB, a gen ebrB znajduje się w sekwencji poprzedzającej gen esp. Badane szczepy, u których występowała mutacja sekwencji regulatorowej, wykazywały niższy poziom ekspresji białka Esp, a także mniejszą zdolność tworzenia biofilmu. Bakterie, z mutacją genu ebrB wytwarzały biofilm mniej intensywnie, w porównaniu do szczepów niosących mutację genu esp. Sugeruje to, że ebrB reguluje również geny zaangażowane w tworzenie biofilmu, kodujące lizozym i oksydazę NADH.

Występowanie białka Esp na powierzchni komórek E. faecium jest zróżnicowane pomiędzy szczepami i zależy od warunków wzrostu, tj. temperatury i zawartości tlenu (Van Wamel et al. 2007). Więcej eksponowanych zewnątrzkomórkowo cząsteczek występuje w przypadku hodowli prowadzonej w temperaturze 37°C, w porównaniu z hodowlą w 21°C, oraz w warunkach beztlenowych. Dane te wskazują, że szczepy z gatunku E. faecium reagują na zmieniające się warunki środowiskowe, a większa liczba białek Esp ułatwia kolonizację i przyczynia się do przyspieszenia procesu zakażenia.

Białko Esp jest czynnikiem wirulencji rozpowszechnionym wśród Enterococcus spp. (Nasaj et al. 2016, Strateva et al. 2016), zwłaszcza u szczepów MDR (Eaton i Gasson 2001). Początkowo, w latach 90. ubiegłego wieku, gen ten wykrywano tylko u gatunku E. faecalis (Shankar et al. 1999), obecnie jego występowanie stwierdza się również u przedstawicieli gatunków, tj. E. faecium, E. raffinosus i E. avium (Freitas et al. 2018, Vankerckhoven et al. 2004). Ponadto wykazano korelację między występowaniem genu esp na plazmidach koniugacyjnych, a opornością bakterii na ampicylinę (Vergis et al. 2002). Obecność genu esp stwierdzano częściej u szczepów E. fecium o fenotypie VRE oraz izolowanych z ognisk epidemicznych (Arshadi et al. 2018, Willems et al. 2001). Szczepy z gatunku E. faecium o fenotypie VRE kolonizujące krtań i gardło pacjentów hematoonkologicznych, częściej wykazują obecność genu esp w porównaniu do izolatów z kału, jednak rzadziej chechuje ich zdolność do tworzenia biofilmu. Potwierdza to znaczenie białka Esp w samym procesie kolonizacji pacjentów (Jovanović et al. 2018).

Cytolizyna jest egzotoksyną działającą zarówno wobec komórek eukariotycznych, jak i prokariotycznych (Dong et al. 2015, Van Tyne et al. 2013). Należy do grupy bakteriocyn klasy II zawierających lantioninę, aktywnych wobec wielu gatunków bakterii Gram-dodatnich (Archimbaud et al. 2002). Po raz pierwszy opisano ją w 1934 roku, jako streptolizynę (Todd 1934). Nazywana jest również hemolizyną, ponieważ wywołuje rozpad erytrocytów ludzkich, końskich, bydlęcych i króliczych (Arias i Murray 2012, Basinger i Jackson 1968).

Cytolizyna kodowana jest przez gen cylA, umiejscowiony na chromosomie bakteryjnym bądź na plazmidach zależnych od feromonów. Może występować w obrębie wysp PAI wraz z genami kodującymi substancję agregującą oraz białko powierzchniowe Esp (Shankar et al. 2004). Na operon cytolizyny składają takie geny, jak: cylR1, cylR2, cylL_L, cylL_S, cylM, cylB, cylA i cylI (Jett et al. 1994). Geny kodujące cytolizynę nie występują u wszystkich szczepów Enterococcus spp. Ponadto, ulegają wybiórczej ekspresji (Semedo et al. 2003a).

Wytwarzanie, wydzielanie i aktywność cytolizyny wymaga współudziału wielu białek. Cytolizyna składa się z dwóch peptydów, nazwanych cytolizyną L i S, kodowanych przez geny cylL_S i cylL_L (Arias i Murray 2012). Są one modyfikowane potranslacyjnie dzięki reakcjom katalizowanym przez białko CylM, kodowane przez gen cylM. Proces ten polega na dehydratacji seryny i treoniny oraz powstaniu cząsteczek lantioniny i metylolantioniny. Łączą one odwodnione reszty aminokwasowe z sąsiadującymi grupami tiolowymi cystein (Van Tyne et al. 2013, Dong et al. 2015). Zmodyfikowane peptydy CylL_L i CylL_S, zostają wydzielone na zewnątrz komórki przy udziale CylB – białka wiążącego ATP. Aktywacja uwolnionej cytolizyny następuje przez proteazę serynową, kodowaną przez gen cylA. Oporność komórki bakteryjnej na działanie wydzielonej toksyny zapewnia białko odpornościowe, będące produktem genu cylI (Biswas et al. 2016).

Ekspresja genu cytolizyny, należącej do hemolizyn bakteryjnych, regulowana jest przez układ dwóch białek CylR1/CylR2 (De Vuyst et al. 2003, Shankar et al. 2001, Śledzińska et al. 2009). W przypadku braku komórek docelowych dla cytolizyny, peptydy CylL_L i CylL_S tworzą nierozpuszczalny kompleks, a operon cytolizyny ulega ekspresji na niskim poziomie. W przypadku obecności komórek docelowych za wiązanie się z nimi odpowiada peptyd CylL_L, stanowiący większą podjednostkę toksyny i mający znacznie większe powinowactwo do erytrocytów niż podjednostka CylL_S. Podjednostka CylL_S łączy się ze związanym z błoną peptydem CylR1, co prowadzi do uwalniania białka represorowego CylR2 i skutkuje wysokim poziomem ekspresji operonu cytolizyny. Proces ten docelowo odpowiada za wytworzenie porów w błonie atakowanej komórki (Ali et al. 2017, Arias i Murray 2012, Byers et al. 1998, LaGrow et al. 2017). Dokładny proces transmisji sygnałów pomiędzy kompleksem CylR1/CylR2, a podjednostkami toksynotwórczymi nie został jeszcze w pełni poznany.

Cytolizyna jest obecna zarówno u szczepów wyizolowanych z zakażeń jak i wchodzących w skład mikrobioty osób zdrowych. Infekcje wywołane przez szczepy mające gen cyl cechują się cięższym przebiegiem i wyższym odsetkiem śmiertelności (Chow et al. 1993, Huycke et al. 1991). Cytolizyna wykrywana jest także u szczepów izolowanych od zwierząt i z produktów spożywczych, które również mogą być źródłem ciężkich zakażeń, np. u osób z obniżona odpornością (Ghosh et al. 2011, Semedo et al. 2003a). Geny cytolizyny wykrywane są najczęściej u gatunku E. faecalis (45%), chociaż występują również u gatunków rzadziej izolowanych z zakażeń, np. E. durans (16%) i E. hirae (3%) (Semedo et al. 2003a). LaGrow i wsp. (LaGrow et al. 2017) wykazali, że użycie nanocząsteczkowego modelu krwinek czerwonych w terapii zakażeń gałki ocznej o etiologii E. faecalis neutralizuje aktywność cytolizyny poprzez wiązanie się do nich podjednostki CylL_L.

Białko EfaA ma strukturę wykazującą w wysokim stopniu homologię do białkowych adhezyn umiejscowionych w ścianie komórkowej paciorkowców z rodzaju Streptococcus (Archimbaud et al. 2002). Wyniki badań nad jego funkcją wykazały, że białko to może uczestniczyć w przyleganiu komórek bakteryjnych do komórek mięśnia sercowego (Guzmàn et al. 1989).

Obecność genu efaA, kodującego białko EfaA, stwierdza się u ponad 80% przedstawicieli rodzaju Enterococcus (Semedo et al. 2003b), a jego ekspresja podlega kontroli w czasie szeregu procesów. Gen ten może występować niezależnie od pochodzenia szczepów oraz ich występowania. U szczepów E. faecalis białko EfaA kodowane jest u przez gen efaA_fs. Wśród szczepów klinicznych E. faecalis jego obecność stwierdzono u 86% izolatów (Strateva et al. 2016). Świadczy to o rozpowszechnieniu tego genu u większości szczepów należących do tego gatunku.

Obecność genów kodujących białko EfaA potwierdzono u innych gatunków m.in. E. faecium, E. durans czy E. solitarius (Eaton et al. 2001, Semedo et al. 2003b). U szczepów E. faecium białko kodowane jest przez gen efaA_fm, który wykrywany jest u kilkunastu procent szczepów (Semedo et al. 2003b). W badaniach na szczepach E. faecium wykazano jednocześnie, że gen ten występuje z niższą częstością u szczepów nie tworzących biofilmu – 44,3% w porównaniu do 85,0% u izolatów wytwarzających biofilm (Sieńko et al. 2015).

Samo występowanie genu efaA nie determinuje chorobotwórczości danego szczepu. Dowiedziono bowiem, że obecność genu nie ma wpływu na prozdrowotne, komensalne właściwości szczepu i dlatego nie wyklucza jego wykorzystania w konstrukcji preparatów leczniczych np. preparatu probiotycznego (Mishra i Ghosh 2018).

Pomimo dużego zróżnicowania genetycznego wśród szczepów z rodzaju Enterococcus, obecność białka EfaA, wykazano u wszystkich izolatów wyosobnionych z ran (Heidari et al. 2016). Jego występowanie stwierdza się z wyższą częstością u szczepów klinicznych w porównaniu z izolatami pochodzącymi ze środowiska naturalnego czy z żywności (Semedo et al. 2003b). Jest to szczególnie istotne z punktu widzenia stosowanych procedur diagnostycznych i leczniczych. Wykazano bowiem, że ekspresja genu efaA może być indukowana przez obecność antybiotyku, np. gentamycyny w środowisku bytowania szczepu (Kafil et al. 2016).

Badania opisane w 2018 roku wykazały, że do właściwego działania szeregu czynników wirulencji E. faecalis niezbędne jest uzyskanie odpowiednich warunków, np. pozyskanie przez komórki bakteryjne manganu (Colomer-Winter et al. 2018). Wytwarzanie białka EfaA jest natomiast uzależnione, m.in., od odczynu środowiska i działania pola magnetycznego, co ma znaczenie w tworzeniu technologii procesów dezynfekcji (Fan et al. 2018). Beomidehagh i wsp. (Beomidehagh et al. 2018) wykazali, że środowisko kwaśne nie wpływa na poziom ekspresji genu efaA u szczepów E. faecalis natomiast warunki zasadowe znacznie go obniżają.

Występowanie szczepów posiadających gen efaA wydaje się szczególnie istotne w odniesieniu do zakażeń na tle Enterococcus spp., do których dochodzi w stomatologii (Akbari Aghdam et al. 2017). Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że gen ten występowału 95% izolatów Enterococcus spp. wyosobnionych z materiału klinicznego, pobranego z kanałów korzeniowych od pacjentów z wierzchołkowym zapaleniem przyzębia (Barbosa-Ribeiro et al. 2016).

Jedną z najważniejszych adhezyn występujących u E. faecalis jest białko powierzchniowe Ace. Strukturą i funkcją przypomina białko Cna, determinujące adhezję szczepów S. aureus (Rich et al. 1999). Białko kodowane jest przez gen ace, którego ekspresja jest kontrolowana, m.in., przez czynniki transkrypcyjne z rodziny ArgR (Manias i Dunny 2018). Analiza genomu szczepów Enterococcus spp. pochodzących ze środowiska ludzi i zwierząt wykazała, że aż 89,0% z nich zawierały gen ace (Freitas et al. 2020). Ze względu na powszechne występowanie białka Ace u szczepów E. faecalis, zaproponowano wykorzystanie kodującego je genu do identyfikacji gatunkowej szczepów (Duh et al. 2001).

Cząsteczka białka Ace zawiera krótką sekwencję sygnałową składającą się z 31 aminokwasów na N-końcu. W strukturze białka wyodrębnia się domenę A, składającą się z 335 aminokwasów, która jest odpowiedzialna za wiązanie ligandu w białkach macierzy zewnątrzkomórkowej (ang. extracellular matrix, ECM) komórek gospodarza oraz domenę B o zmiennej liczbie powtórzeń tandemowych. Ostatnim elementem struktury białka Ace jest region C składający się z sekwencji LPXTG (L – leucyna, P – prolina, X – dowolne aminokwasy, T – treonina, G – glicyna) o wysokim powinowactwie do białek ECM (Chajęcka-Wierzchowska et al. 2017).

Właściwości adhezyjne białka Ace ułatwiają bakteriom z rodzaju Enterococcus kolonizację poprzez łączenie się z białkami ECM oraz udział w wiązaniu kolagenu typu I i IV (Nallapareddy et al. 2003, Rich et al. 1999). Białko Ace oraz swoiste dla niego przeciwciała klasy IgG wykrywane są w surowicy aż w 90% przypadków zapalenia wsierdzia o etiologii E. faecalis (Tendolkar et al. 2003). Wykazano, że podawanie szczurom monoklonalnego przeciwciała anty-Ace mAb70 znacząco zmniejsza intensywność wiązania komórek bakteryjnych z kolagenem IV w testach adherencji in vitro, a wstępne leczenie mAb70 anty-Ace znacząco zmniejsza częstość zakażeń zastawek aortalnych (Singh et al. 2018).

Analogiem białka Ace u szczepów E. faecalis jest białko Acm występujące u E. faecium. Kodujące je geny również wykazują w wysokim stopniu homologię do białka Cna występującego u S. aureus. Produkt ekspresji genu acm ma zdolność wiązania kolagenu, jednak tylko typu I (Nallapareddy et al. 2003). Obecność tego genu stwierdzono u 86,6% klinicznych izolatów E. faecium (Arshadi et al. 2018).

W badaniach na szczepach E. faecium wykazano obecność innego białka wiążącego kolagen Scm (ang. second collagen adhesion, kodowanego przez gen scm) (Sillanpää et al. 2008). Szczepy E. faecium posiadające to białko wykazują zdolność wiązania kolagenu typu V oraz fibrynogenu, co pełni istotną funkcję w patogenezie zapalenia wsierdzia o tej etiologii. Ponadto wykazano, że nawet niewielkie zmiany mutacyjne w genach mogą wpływać na zdolność wzrostu izolatów E. faecium oraz ekspresję ich czynników wirulencji, przyczyniając się do zmian patogenetycznych konkretnego szczepu (Somarajan et al. 2014).

Hialuronidaza wytwarzana jest przez szczepy wielu gatunków bakterii Gram-dodatnich, w tym przedstawicieli Enterococcus spp. Wykazuje ona zdolność hydrolizy kwasu hialuronowego, będącego składnikiem tkanek i płynów ustrojowych, np. skóry, chrząstek, mózgu, mięśni czy pępowiny. Jest enzymem kodowanym przez gen hyl, plazmidowo lub chromosomalnie (Basinger i Jackson 1968, Śledzińska et al. 2009).

Udział hialuronidazy w patogenezie zakażeń wywoływanych przez Enterococcus spp. nie jest dostatecznie poznany. Pełni ona funkcje podobne do enzymów wytwarzanych przez S. pyogenes i S. aureus. Uszkadza tkanki i ułatwia rozprzestrzeniane się bakterii oraz ich toksyn w zakażonym organizmie (Śledzińska et al. 2009). Rozkładając kwas hialuronowy, hialuronidaza uwalnia disacharydy, które stanowią składniki odżywcze dla bakterii (Hynes et al. 2000, Kayaoglu i Ørstavik 2004).

Gen hyl wykrywany jest głównie wśród szczepów E. faecium izolowanych od pacjentów hospitalizowanych (Basinger i Jackson 1968, Rice et al. 2003). Znacznie rzadziej stwierdza się go wśród klinicznych szczepów E. faecalis (Soheili et al. 2014). Obecność genu hyl stwierdzano częściej u szczepów o fenotypie VRE (28,7%) w porównaniu do izolatów o fenotypie VSE (ang. Vancomycin Sensitive Enterococci) (5%) (Arshadi et al. 2018). Ważną informację dotyczącą potencjału wytwarzania hialuronidazy wniosły wyniki badania Elmali i Can (2018), którzy wykazali, że wśród 246 izolatów Enterococcus spp. pozyskanych z żywności, żaden nie miał genu hyl. Arias i wsp. (2009) na podstawie swoich badań zasugerowali, że klastry genów warunkujących oporność na wankomycynę są łączone z plazmidem zawierającym gen hyl i mogą być wspólnie transferowane.

Substancja agregująca (ang. aggregation substance, AS) jest białkiem powierzchniowym, którego aktywność zależy od obecności feromonów i surowicy (Sava et al. 2010). Kodowana jest przez geny agg, asa, asa373, prgB, występujące na plazmidach koniugacyjnych pAD1, pCF10, pPD1 (Przybylski 2007, Shiono i Ike 1999, Śledzińska et al. 2009).

Obecność AS wiąże się ze zwiększoną zdolnością bakterii do tworzenia dużych agregatów i przyczynia się do efektywnego przenoszenia między nimi informacji genetycznej (Biswas et al. 2016, Süßmuth et al. 2000). Ponadto ułatwia adhezję do powierzchni komórek gospodarza, takich jak: komórki nabłonkowe, erytrocyty, granulocyty oraz makrofagi (Rakita et al. 1999, Süßmuth et al. 2000, Śledzińska et al. 2009). Szczepy Enterococcus spp. wytwarzające AS są częściej fagocytowane przez makrofagi, ale wykazują wewnątrz nich wyższą przeżywalność niż szczepy niewytwarzające AS (Süßmuth et al. 2000, Śledzińska et al. 2009). Proces ten przyczynia się do translokacji Enterococcus spp. z przewodu pokarmowego do krwiobiegu, układu limfatycznego i innych tkanek organizmu, co umożliwia bakteriom wywoływanie zakażeń o różnej lokalizacji (Arshadi et al. 2018).

Ekspresja białka AS, o masie cząsteczkowej 137 kDa, jest regulowana przez obecność hamującego peptydu iCF10, kodowanego na plazmidzie pCF10, lub alternatywnie przez kompleksy lipidowo-białkowe, które wpływają na aktywność tego peptydu. Afonina i wsp. (Afonina et al. 2018) wykazali, że AS współdziała z białkiem Esp w tworzeniu struktury biofilmu oraz osadzeniu w niej agregatów bakteryjnych. Ponadto udowodniono, że białko AS odpowiada przede wszystkim za wstępną agregację komórek bakterii, a następnie hamowane jest przez wzrost stężenia peptydu iCF10, podczas gdy białko Esp bierze udział w zagęszczeniu struktury biofilmu w późniejszych etapach jego tworzenia.

Białko AS jest ważnym czynnikiem wirulencji, który ma wpływ na wywoływanie przez Enterococcus spp. zapalenia wsierdzia (Chow et al. 1993, Schlievert et al. 1998). Pierwszy przypadek izolacji E. faecalis z takiego zakażenia został opisany w 1899 roku przez Maccallum i Hastings (Maccallum i Hastings 1988). Murray (Murray 1990) w 1990 roku określił, że 5–15% przypadków zapalenia wsierdzia jest wywoływanych przez Enterococcus spp., a choroba ta częściej występuje u mężczyzn w starszym wieku.

Obecność genu białka AS jest wykrywana głównie u szczepów E. faecalis, z niższą częstością u E. faecium, przy czym częściej występuje u izolatów o fenotypie VRE (Biswas et al. 2016, Strateva et al. 2016).

Żelatynaza jest metaloproteinazą wykazującą zdolność hydrolizy żelatyny, kolagenu, kazeiny, hemoglobiny, elastyny (Biswas et al. 2016, Su et al. 1991) oraz rozpuszczania fibryny (Waters et al. 2003). Zdolność ta ułatwia komórkom bakteryjnym rozprzestrzenianie się w warunkach in vivo. Żelatynaza wpływa hamująco na układ immunologiczny, co potwierdziły badania na surowicy ludzkiej krwi i hemolimfie owadów (Park et al. 2007). Inną ważną funkcją żelatynazy jest rozkład nieprawidłowo sfałdowanych, niefunkcjonalnych białek powierzchniowych komórek bakteryjnych (Waters et al. 2003).

Enzym ten kodowany jest przez gen gelE, który po raz pierwszy został zsekwencjonowany w 1991 roku (Su et al. 1991). Ulega on ekspresji jednocześnie z genem sprE, kodującym proteinazę serynową, która stanowi potencjalny czynnik wirulencji Enterococcus spp. uszkadzający tkanki gospodarza. Aktywność proteinazy serynowej stwierdzana jest tylko w połączeniu z aktywnością wytwarzanej jednocześnie żelatynazy.

Ekspresja genów gelE i sprE podlega regulacji dwuskładnikowemu systemowi quorum sensing Fsr. Na locus Fsr składają się geny: fsrA, fsrB, fsrC, fsrD. Udowodniono, że system Fsr reaguje na stężenie feromonu aktywującego GBAP (ang. gelatinase biosynthesis activation pheromone). Jest on cyklicznym peptydem kodowanym przez gen fsrD i mającym pierścień laktonowy (Nakayama et al. 2001). FsrB odpowiada za rozszczepienie proteolityczne i cyklizację FsrD (Nakayama et al. 2006). Akumulacja peptydu GBAP w przestrzeni pozakomórkowej jest prawdopodobnie wykrywana przez kinazę histydynową FsrC, prowadząc do aktywacji regulatora (Nakayama et al. 2001).

Wyniki badań Hancock i wsp. (Hancock i Perego 2004) wykazały, że system Fsr wpływa na tworzenie biofilmu przez szczepy E. faecalis poprzez wytwarzanie żelatynazy. Ustalono, że mutacja w obrębie genów systemu Fsr skutkuje wytwarzaniem biofilmu i żelatynazy na niższym poziomie. Proteinaza ta wpływa również na uwalnianie przez Enterococcus spp. zewnątrzkomórkowego DNA (eDNA), które jest czynnikiem promującym rozwój biofilmu (Thomas et al. 2008). Z kolei SprE wpływa zarówno na uwalnianie eDNA, dojrzewanie biofilmu, jak i hamuje autolizę komórek. Odmienne wyniki w tym aspekcie uzyskali Zheng i wsp. (Zheng et al. 2017), którzy wykazali, że brak genu gelE koreluje z wyższą częstością E. faecalis do tworzenia biofilmu.

Gen gelE może występować na chromosomie bakteryjnym, lecz nie zawsze ulega ekspresji (Eaton et al. 2001, Semedo et al. 2003a). Strzelecki i wsp. (2011) w swoich badaniach wykryli ten gen u 91% izolatów E. faecalis, z czego zaledwie u 53% szczepów wykazano fenotypowo zdolność hydrolizy żelatyny. Przyczyną dysfunkcji tej metaloproteinazy mogą być mutacje w obrębie genów fsr i gelE (Nakayama et al. 2002, Qin et al. 2000). Znaczenie tego procesu nie jest do końca poznane.

Szczepy z rodzaju Enterococcus zawierające gen żelatynazy wykazują większą zdolność adhezji do powierzchni zębiny, co tłumaczy ich udział w zakażeniach endodontycznych (Guneser i Eldeniz 2016). Wytwarzanie żelatynazy nie jest niezbędne do utrzymywania się i wywoływania przez Enterococcus spp. zakażeń w obrębie układu moczowego, gdyż wiele szczepów izolowanych z zakażeń tego układu wykazuje delecję regionów odpowiedzialnych za wytwarzanie tej proteinazy (Nakayama et al. 2002). Hashem i wsp. (2021) dzięki swoim badaniom potwierdzili, że sama obecność genu gelE nie wiąże się z aktywnością żelatynazy, jednak zaobserwowali korelację pomiędzy obecnością w genomie E. faecalis genów gelE i sprE, a intensywnością tworzenia biofilmu. Ponadto zasugerowali, że obecność systemu quorum sensing Fsr może być skutecznym biomarkerem aktywności żelatynazy.

Gen gelE wykrywany jest częściej wśród izolatów klinicznych, w porównaniu do szczepów z przypadków kolonizacji, co potwierdzałoby udział żelatynazy w patogenezie zakażeń wywoływanych przez Enterococcus spp. (Coque et al. 1995, Pillai et al. 2002). Gen kodujący żelatynazę występuje częściej u E. faecalis, niż u E. faecium (Biswas et al. 2016, Eaton i Gasson 2001). Jego obecność potwierdzono również u szczepów E. faecalis izolowanych z żywności (Eaton i Gasson 2001).

W dostępnym piśmiennictwie istnieje niewiele informacji o właściwościach antygenu wydzielniczego SagA (Paganelli et al. 2015, Śledzińska et al. 2009). Jest to białko wykrywane u przedstawicieli gatunku E. faecium i kodowane przez gen saga umiejscowiony w grupie genów niosących podstawowe informacje dotyczące szlaku syntezy ściany komórkowej bakterii. Stąd, postuluje się, że produkt syntezy tego genu może odgrywać ważną rolę w procesie wzrostu i namnażania się komórek E. faecium (Teng et al. 2003). Czyni to zatem sekwencję genu saga, albo aktywność kodowanego przez niego białka, potencjalnym celem w konstrukcji szczepionek, zapobiegającym głównie rozwojowi bakteriemii o etiologii Enterococcus spp. lub tworzenia nowych leków o właściwościach przeciwbakteryjnych (Kropec et al. 2011).

Białko SagA jest podobne do analogicznych cząsteczek występujących u pałeczek Listeria monocytogenes (białek P45 i 60), które u przedstawicieli tego gatunku są odpowiedzialne za inwazję hepatocytów, fibroblastów i makrofagów. Antygen wydzielniczy SagA jest jednocześnie jednym z podstawowych składników budowy biofilmu E. faecium (Paganelli et al. 2015), jednak tylko w odniesieniu do szczepów należących do kladu A1 (zawierającego szczepy izolowane od ludzi) (Geraldes et al. 2022). Ma zdolność wiązania się z proteinami macierzy zewnątrzkomórkowej, m.in., fibrynogenem, kolagenem typu I i IV, lamininą i fibronektyną (Teng et al. 2003). Wpływa to na zdolność adhezji komórek bakteryjnych oraz ułatwia szczepom z gatunku E. faecium kolonizację tkanek i narządów gospodarza oraz nieożywionych powierzchni. W trakcie oceny znaczenia antygenu wydzielniczego SagA wykazano, że jest on w znacznym stopniu wytwarzany przez szczepy izolowane z zapalenia wsierdzia (Śledzińska et al. 2009).

Z badań przeprowadzonych w ostatnich kilku latach wynika, że rola białka SagA polega na modulowaniu zdolności do kolonizacji czy zakażenia bakteriami bezwzględnie patogennymi, co wpływa na formację ludzkiej bariery jelitowej (Paganelli et al. 2015, Pedicord et al. 2016, Rangan et al. 2016). Ponadto przeprowadzone w warunkach laboratoryjnych na modelu zwierzęcym badania wykazały, że obecność antygenu wydzielniczego znacząco wpływa na skład mikrobiomu ich jelit. Stwierdzono, że może on nawet promować tolerancję wobec zakażeń wywołanych przez bakterie chorobotwórcze, np. z rodzaju Salmonella (Rangan et al. 2016).

Mniejsze znaczenie w patogenezie zakażeń przypisuje się właściwościom lipolitycznym szczepów z rodzaju Enterococcus. Wytwarzane przez te szczepy lipazy hydrolizują cząsteczki tłuszczów, co poszerza zakres warunków środowiskowych, w jakich mogą występować. Dzięki właściwościom lipolitycznym Enterococcus spp. mogą optymalizować pH środowiska, a także niszczyć lipidowe komponenty komórek gospodarza (Stehr et al. 2003).

Wśród szczepów Enterococcus spp. wykazano duże zróżnicowanie obecności lipazy. Jej występowanie notuje się w szerokim zakresie od 4% do nawet ponad 35% wśród szczepów wyosobnionych z krwi (Elsner et al. 2000, Śledzińska et al. 2009). Według różnych badaczy aktywność lipolityczna u szczepów klinicznych mieści się w granicach od 7% szczepów wykrytych w zakażonych ranach (Dworniczek et al. 2012) do prawie 24% wśród szczepów o różnej specyfice zakażeń i różnym profilu antybiotykowrażliwości (Biswas et al. 2016, Kowalska-Krochmal et al. 2011). Aktywność lipazy wykrywana jest zdecydowanie częściej wśród szczepów tworzących biofilm (Dworniczek et al. 2014). W badaniach przeprowadzonych przez Komiyama i wsp. (2016) na wytwarzających biofilm izolatach różnych gatunków rodzaju Enterococcus, wykazano aktywność lipolityczną u 92% szczepów. Według Wróblewskiej i wsp. (Wróblewska et al. 2013) aktywność lipolityczną wykazywało 71,1% klinicznych szczepów E. faecium, a dodatkowo stwierdzono różnicę w aktywności lipazy wobec różnych użytych w badaniu estrów kwasowych. Może to sugerować różnice strukturalne oraz biochemiczne enzymów lipolitycznych wytwarzanych przez Enterococcus spp., co przyczynia się do wybiórczej hydrolizy substratów.

Ważnym spostrzeżeniem badaczy przedsatwionym w dostępnym piśmiennictwie jest to, że na aktywność lipazy i zdolność tworzenia biofilmu wpływają różne czynniki, w tym składniki odżywcze. Wojnicz i wsp. (Wojnicz et al. 2016) wykazali, że ekstrakt z żurawiny ma wpływ na wytwarzanie lipazy i tworzenie biofilmu, co może pośrednio redukować zdolność szczepów E. faecalis do wywoływania zakażeń układu moczowego. Może to mieć znaczenie w profilaktyce zakażeń o tej etiologii występujących w tej konkretnej lokalizacji (Wojnicz et al. 2016).

W piśmiennictwie dostępnych jest zaledwie kilka publikacji dotyczących znaczenia hemaglutyniny u szczepów z rodzaju Enterococcus (Carvalho et al. 1995, Elsner et al. 2000). Takiej aktywności nie wykryto u szczepów E. faecium. Natomiast wśród izolatów E. faecalis, stwierdza się jej występowanie u niemal wszystkich izolatów (97%) (Carvalho et al. 1995, Elsner et al. 2000, Śledzińska et al. 2009).

Specyfika zjawiska hemaglutynacji erytrocytów, jakie mogą wykazywać szczepy z gatunku E. faecalis, jest różna i zależy w dużej mierze od modelu badawczego w warunkach in vitro – pochodzenia badanych krwinek, pochodzenia szczepów względem lokalizacji zakażenia czy rodzaju materiału klinicznego, z którego izolowane były badane szczepy (Carvalho et al. 1995, Izumi et al. 2005). Na podstawie wyników przeprowadzonych badań dostrzeżono dwie prawidłowości. Po pierwsze, najwięcej szczepów wykazuje zdolność wywoływania hemaglutynacji erytrocytów króliczych. Po drugie, czynniki odpowiedzialne za tę cechę mogą mieć zarówno typowo białkowy, jak i niebiałkowy charakter (Carvalho et al. 1995).

Według najnowszych badań opartych na technikach biologii molekularnej w genomie szczepów z rodzaju Enterococcus można wykazać grupę genów zawierającą, m.in., operony utworzone z sekwencji genów analogicznych do enzymów-toksyn u bakterii Gram-dodatnich, w tym kodujących hemaglutyninę. Na szczególną uwagę zasługuje operon zawierający rearanżację genów w obrębie sekwencji podobnych do tych, które kodują neurotoksyny u laseczek z gatunku Clostridium botulinum (Brunt et al. 2018).

Zewnątrzkomórkowe nadtlenki zaliczane są do grupy czynników zjadliwości Enterococcus spp. ułatwiających niszczenie tkanek gospodarza, głównie u pacjentów z bakteriemią o tej etiologii. Wpływają one znacząco na uogólnienie zakażenia (Huycke et al. 1996). Stwierdza się, że możliwość wytwarzania reaktywnych form tlenu znacznie częściej notuje się wśród szczepów E. faecalis w porównaniu do E. faecium. Zdolność ich wytwarzania zewnątrzkomórkowo ułatwia przedstawicielom rodzaju Enterococcus przeżycie wewnątrz komórek żernych. Ponadto reaktywne formy tlenu uszkadzają nabłonek przewodu pokarmowego, ułatwiając bakteriom przełamanie bariery jelitowej. Ważnym spostrzeżeniem poczynionym podczas badań w tym zakresie było stwierdzenie różnic w poziomie wytwarzania nadtlenków w grupach szczepów o różnym pochodzeniu. Wyniki badań prowadzonych przez Huycke i wsp. (Huycke et al. 1996) wykazały, że poziom wytwarzania zewnątrzkomórkowych nadtlenków był o 60% wyższy w przypadku szczepów Enterococcus spp. izolowanych z bakteriemii w porównaniu ze szczepami pozyskanymi z przypadków kolonizacji pacjentów.

Ciekawym spostrzeżeniem jest również powiązanie aktywności bakteryjnych nadtlenków z procesem kancerogenezy. Postuluje się bowiem, że zdolność wytwarzania nadtlenków przez szczepy z rodzaju Enterococcus jest związana z indukcją lub progresją procesów nowotworowych w komórkach nabłonkowych jelita grubego (Huycke et al. 2002, Rezasoltani et al. 2018, Wang et al. 2017).