Pertussis and the Red Queen Effect

Gatunek B. pertussis jest najbardziej rozpoznawanym przedstawicielem bakterii z rodzaju Bordetella. Jedynym znanym rezerwuarem tego patogenu jest człowiek, przy czym od takiej osoby bakterie można wyizolować jedynie w początkowych etapach zakażenia, w fazie kataralnej [8].

Analiza filogenetyczna wykazała, że niesłychanie szybkie rozprzestrzenienie się pałeczek krztuśca w po- pu lacji ludzkiej nastąpiło w ciągu ostatnich 500 lat. Szczepy, które obecnie krążą w populacji można przyporządkować do dwóch znacznie różniących się między sobą rozgałęzień. Do rozgałęzienia I zaliczana jest niewielka liczba szczepów, natomiast rozgałęzienie II zawiera 97,3% szczepów. Istnieją dwie koncepcje, których autorzy próbują wyjaśnić to nierównomierne zróżnicowanie. Według jednej z teorii, około 2000 lat temu dwie linie uległy rozdzieleniu, z kolei według drugiej hipotezy zaadaptowały się niezależnie od siebie do populacji ludzkiej z nieznanego rezerwuaru [5]. Zmienność genetyczna B. pertussis jest ekstremalnie niska (π = 0,004%) co sugeruje, że pałeczki B. pertussis jako gatunek doświadczyły efektu „wąskiego gardła” (gdy liczebność gatunku zmniejszyła się na skutek katastrofy co ograniczyło pulę genową) lub/i szybkiej klonalnej ekspansji [41]. Wielkość genomu B. pertussis wynosi w przybliżeniu ~ 4 000 kilo par zasad, czyli w porównaniu z innymi bakteriami z rodzaju Bordetella genom jest mniejszy o 10%. Prawdopodobnie w trakcie adaptowania się do pasożytniczego trybu życia bakterie B. pertussis utraciły część genomu, aby móc skolonizować niszę i przetrwać w nowych warunkach środowiskowych [84].

Drugim gatunkiem (według częstości izolacji) z rodzaju Bordetella, który wywołuje krztusiec, jest B. parapertussis. Krztusiec wywoływany przez B. parapertussis ma znacznie łagodniejszy przebieg i nazywany jest parakrztuścem [6].

Najbardziej rozpowszechnionym gatunkiem patogennym i środowiskowym jest B. bronchiseptica. Bakterie te nie są ograniczone tylko do jednego typu gospodarza. Mają zdolność do wywoływania zakażenia u wielu gatunków ssaków, szczególnie zwierząt towarzyszących człowiekowi, zwierząt gospodarskich, ale także dzikich, u których wywołuje infekcje dróg oddechowych. Pałeczki B. bronchiseptica izolowane są często od kotów, psów, królików, świń, koni a nawet kawii domowych. W miejscach o dużym zagęszczeniu zwierząt (schroniska, gospodarstwa rolne) bakterie te mogą się szybko rozprzestrzeniać zwłaszcza, że zakażenie u zwierząt może być przewlekłe oraz bezobjawowe [26]. Pierwszych izolacji B. bronchiseptica dokonano u psów z infekcjami dróg oddechowych. W niektórych przypadkach, również człowiek może zostać zakażony. Najczęściej dotyczy to osób mających codzienny kontakt ze zwierzętami np. w gospodarstwie [94]. Infekcje są również częste u osób z osłabionym układem odpornościowym, pacjentów immunosupresyjnych [18, 94], pacjentów z chorobą nowotworową [69], czy po przeszczepieniach narządów [51]. Badania filogenetyczne wskazują, że przodek B. bronchiseptica może być również wspólnym przodkiem B. pertussis oraz B. parapertussis [96].

Pałeczki B. holmesii (Ryc. 1) początkowo zostały opisane jako bakterie wywołujące zakażenia u pacjentów immunosupresyjnych po resekcji śledziony [87], a dopiero później zostały wyizolowane od pacjentów z objawami przypominającymi krztusiec [95]. B. holmesii nie jest typowym przykładem patogennych ssaczych Bordetellae. Około 66% genów współdzieli z B. pertussis oraz B. parapertussis. Na podstawie analiz sekwencji 16S rRNA początkowo ustalono, że pałeczka B. holmesii jest blisko spokrewniona z B. pertussis [4, 87], jednak szersze analizy całego genomu wskazują, że jest to dalsze pokrewieństwo [41]. Biorąc pod uwagę zawartość genomu jest on bardziej zbliżony do genomów B. avium oraz B. petrii. Przodkiem B. holmesii były prawdopodobnie ptasie Bordetellae [16]. W przypadku B. holmesii dość łatwo zachodzi poziomy transfer genów. Aż 400 genów (ok. 12,5%) opisanych w różnych izolatach B. holmesii nie występuje u innych gatunków bakterii z rodzaju Bordetella. Każdy szczep posiada od 24 do 114 unikalnych genów, a jeden z wykrytych genów został zidentyfikowany także w genomie Escherichia coli. Pałeczki B. holmesii poprzez horyzontalny transfer genów mogły uzyskać zdolność do wywoływania parakrztuśca od B. pertussis [30]. Różnorodność genetyczna B. holmesii jest jeszcze mniejsza niż różnorodność B. pertussis, co również sugeruje jej niedawne przystosowanie do ludzkiego gospodarza [41].

Ryc. 1

Pałeczki B. holmesii przenoszą się prawdopodobnie drogą kropelkową [35]. Bakterie te początkowo izolowano od pacjentów z podejrzeniem krztuśca, na poziomie ok. 0,4% [28]. Późniejsze wyniki badań wskazują, że B. holmesii rozprzestrzenia się po całym świecie. Wykry-wane są w 20% próbek pobranych od dorosłych pacjentów we Francji [54], czy do 29% w Ohio (Stany Zjednoczone) diagnozowanych w kierunku krztuśca [63]. Obecnie zakażenia o etiologii B. holmesii nie wydają się być zbytnim powodem do obaw i zagrożeniem dla zdrowia publicznego. Jednak ich hipotetyczna zdolność do zwiększania chorobotwórczości przez horyzontalny transfer czynników wirulencji może być przyczyną częstszego pojawiania się ostrych infekcji [58].

Pozostałe gatunki bakterii z rodzaju Bordetella również są zdolne do kolonizacji układu oddechowego i wywołania infekcji oskrzeli oraz płuc, zakażenia ran [70, 77, 80], a także posocznicy [66]. Duże znaczenie ekonomiczne dla hodowców ptaków ma B. avium. Jest głównym czynnikiem etiologicznym kataru u indyczych piskląt [36]. Z dróg oddechowych drobiu izolowane są również pałeczki B. hinzii, które czasami ulegają prze-niesieniu z ptaka na człowieka [78]. Szczepy blisko spokrewnionego gatunku B. pseudohinzii są izolowane z dróg oddechowych myszy laboratoryjnych [33]. Od pacjentów chorych na mukowiscydozę czasami izolo-wane są B. flabillis, B. bronchialis oraz B. sputigena [79]. Gatunki takie jak B. trematum [77] oraz B. ansorpii [38] związane są z infekcjami ran oraz ucha. Pierwszym opisanym środowiskowym gatunkiem z rodzaju Bordetella jest B. petrii wyizolowana z osadu rzecznego [92]. Stwierdzono też obecność B. petrii w materiałach pobranych z zakażonej tkanki kostnej [23, 68], czy u pacjentów z mukowiscydozą [67]. Do nowoodkrytych gatunków niepatogennych należą B. tumbae, B. tumulicola i B. muralis wyizolowane z malowideł naściennych w starożytnych chińskich grobowcach [72].

Wiele gatunków Bordetellae jest szeroko rozpowszechnionych i izolowanych z różnych nisz środowiskowych [20, 53, 72, 80, 92]. Pałeczki B. bronchiseptica oraz B. hinzii zachowały zdolność do wzrostu na ekstrakcie glebowym, pomimo przystosowania do zwie- rzęcego i ludzkiego gospodarza [29]. Sugeruje to, że gleba może być naturalnym środowiskiem dla Bordetellae. Istnieje możliwość, że wiele innych, niepoznanych jeszcze, patogennych Bordetella spp. może bytować w środowisku glebowym.

Gatunek B. pertussis należy do bakterii o dużych wymaganiach wzrostowych, pod względem warunków hodowlanych. Wzrost uzyskuje się na podłożu Bordeta-Gengou, Regan-Lowe lub alternatywnie na agarze węglowym wzbogaconym odwłóknioną krwią baranią w temperaturze 37°C, w czasie 3 do 7 dni, w warunkach tlenowych. Kolonie pałeczek krztuśca pojawiające się po około 3 dniach są drobne, gładkie, wypukłe i perłowe. Ze względu na kolor określa się je mianem „kropli Merkurego”. Jednak dalsze obserwacje wskazały, że kolor kolonii bakteryjnych zależy od fazy wzrostu B. pertussis. Typowe kolonie fazy I (faza wzrostu „logarytmicznego”) są małe i lśniące. Kolonie B. parapertussis pojawiają się wcześniej i ze względu na wytwarzanie barwnika mogą być bardziej brązowe. Oba gatunki w fazie I wykazują zdolność do hemolizy krwinek obecnych w podłożu hodowlanym. Kolonie fazy II i III nie zmieniają wyglądu, ale z czasem tracą właściwości hemolityczne. W fazie IV kolonie zmieniają się na bardziej białe i płaskie [88]. Kolonie pałeczek B. holmesii również są niewielkich rozmiarów, ale pojawiają się po ok. 2 dniach i w kolejnych 2–3 dniach hodowli bakterie wytwarzają brązowy barwnik. W hodowli płynnej bakterie z klastra B. bronchiseptica uwalniają do syntetycznej pożywki Stainer-Scholte słomkowo-żółty barwnik, który zidentyfikowano jako ryboflawinę (witamina B2). W warunkach niskiej gęstości pałeczki B. pertussis w I i II fazie wzrostu wytwarzają ryboflawinę, która stymuluje ich namnażanie do optymalnego poziomu [55]. Dodatkowo zarówno B. parapertussis jak i B. holmesii po 48 godzinach hodowli w obecności jonów żelaza wytwarzają niezidentyfikowany jeszcze brązowy barwnik.

Pałeczki krztuśca wytwarzają wiele czynników zjadliwości. Toksyna krztuścowa (pertussis toxin, PT) jest jednym z najważniejszych czynników wirulencji biorących udział w patogenezie krztuśca i w zinaktywowanej formie jest najbardziej istotnym komponentem szczepionek przeciwkrztuścowych. Egzotoksyna PT, wytwarzana jest wyłącznie przez B. pertussis, ale to nie jedyny gatunek z rodzaju Bordetella, który posiada geny kodujące PT. Geny te u B. parapertussis oraz B. bronchi-septica są transkrypcyjnie nieaktywne i w efekcie PT nie jest wytwarzana [2]. Wśród pozostałych czynników chorobotwórczości istotne są hemaglutynina włókienkowa (filamentous hemagglutinin adhesin, FHA), pertaktyna (pertactin, PRN) oraz fimbrie (fimbriae, FIM), które mogą być składnikami szczepionek. Pozostałe antygeny takie jak toksyna dermonekrotyczna (dermonecrotic toxin, DNT), cyklaza adenylanowa (adenylate cyclase toxin, ACT), cytotoksyna tchawicza (tracheal cytotoxin, TCT), białko BrkA (Bordetella resitance to killing A) oraz endotoksyna (lipopolisacharyd, LPS) nie są składnikami szczepionek podjednostkowych, ale są komponentami obecnymi w szczepionkach pełnokomórkowych [27].

Zazwyczaj krztusiec diagnozowany jest na podstawie wystąpienia patognomonicznego objawu – kaszlu przypominającego pianie koguta. Objawy krztuśca u nastolatków oraz dorosłych są jednak mało specyficzne i charakterystyczny kaszel może w ogóle nie występować. Podstawą rozpoznania krztuśca jest prze- prowadzenie badań mikrobiologicznych, serologicznych oraz coraz częściej badań molekularnych [88].

Klasyczna diagnostyka krztuśca polega przede wszystkim na hodowli kolonii bakteryjnych na odpowiednim podłożu. W standardowej diagnostyce w kierunku B. pertussis do podłoża hodowlanego Bordeta-Gengou dodawany jest antybiotyk cefaleksyna. Jednak dodatek tego antybiotyku hamuje wzrost B. holmesii, co zafałszowuje wynik badania mikrobiologicznego [46]. B. pertussis należy do bakterii długo rosnących, dlatego coraz powszechniejsze stają się badania mole-kularne oparte o real-time PCR wykrywające DNA bakteryjne. W porównaniu do hodowli kolonii bak- teryjnych (typowy czas wzrostu dla izolatu to 7 dni) jest to metoda znacznie szybsza i bardziej czuła, nie- stety dosyć kosztowna.

Najczęściej wykorzystywaną sekwencją do identyfikacji bakterii w diagnostyce krztuśca jest sekwencja IS481. Występuje ona w genomie B. pertussis w liczbie 50–200 kopii [25]. Obecna jest również w genomie B. holmesii (8–10 kopii) oraz niektórych szczepów B. bronchiseptica (< 5 kopii) [71]. Drugą najczęściej stosowaną sekwencją w diagnostyce molekularnej jest sekwencja IS1001 charakterystyczna dla B. parapertussis (~ 20 kopii). Na podstawie jej braku można wyeliminować krztusiec wywoływany przez B. pertussis, nie pozwala natomiast na odróżnienie B. parapertussis od B. bronchiseptica, które również posiadają kilka kopii (1–7 kopii) tej sekwencji [74, 96]. Na podstawie obecności homologicznej sekwencji h-IS1001 (1 kopia) identyfikowane są pałeczki B. holmesii [70]. Podobne znaczenie potwierdzające zakażenie B. holmesii pełni sekwencja recA [45]. Na wykluczenie zakażenia B. holmesii pozwala sekwencja IS1002, która obecna jest w genomie B. parapertussis (9 kopii), B. pertussis (4–9 kopii) oraz kilku szczepów B. bronchiseptica (1 kopia) [96]. B. pertussis, jako jedyny gatunek z rodzaju Bordetella wytwarza toksynę krztuścową, dlatego wydawałoby się, że najbardziej odpowiednią sekwencją pozwalającą zidentyfikować pałeczki krztuśca byłaby sekwencja ptxS1, która koduje podjednostkę S1 toksyny krztuścowej. Jednakże u B. parapertussis oraz B. bronchiseptica geny kodujące toksynę krztuścową są obecne, ale na skutek mutacji w regionie promotorowym uległy wyciszeniu [71]. Sekwencja promotorowa ptxP (1 kopia) jest swoistym markerem identyfikującym B. pertussis [88]. Wadą stosowania sekwencji jednokopijnej ptxP jest niska czułość diagnostyczna testu. Do identyfikacji poszczególnych gatunków wywołujących krztusiec potrzebny jest algorytm oparty o zestaw różnych sekwencji, aby móc właściwie zinterpretować wyniki.

W laboratoriach mikrobiologicznych coraz bardziej powszechna staje się metoda identyfikacji bakterii oparta o spektrometrię mas (mass spectrometry, MS). Jest to technika polegająca na pomiarze stosunku masy do ładunku (m/z) jonów wytworzonych w trakcie jonizacji analizowanych cząsteczek. Jako metodę jonizacji stosuje się desorpcję/jonizację laserem wspomaganą matrycą (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI). Biotypowanie techniką MALDI-TOF MS (time of flight, TOF) polega na analizie uzyskanych bakteryjnych profili białkowych, charakterystycznych dla danego gatunku. Wygenerowane widma masowe porównuje się z wzorami referencyjnymi zamieszczonymi we wciąż rozbudowywanych bazach danych. Przykładowymi systemami stosowanymi w biotypowaniu bakterii są Biotyper (Bruker) i Vitek MS (bioMérieux, Inc.). Do przeprowadzenia analizy wystarczy niewielka ilość materiału (zwykle 1 kolonia), a całe biotypowanie można przeprowadzić w krótkim czasie kilkunastu minut od momentu pobrania kolonii, co jest istotną zaletą w porównaniu do standardowych metod biochemicznych. Biotypowanie sprawdza się również w przypadku zakażeń mieszanych i nadaje się do identyfikacji klasycznych Bordetellae [98], ale nie jest powszechnie przyjętą metodą w diagnostyce mikrobiologicznej krztuśca.

Pierwszym typem szczepionki wprowadzonym do powszechnego użytku była szczepionka pełnokomórkowa skojarzona (whole-cell pertussis; wP, DTwP, DTP) przeciwko błonicy (Diphtheria), tężcowi (Tetanus) oraz krztuścowi (Pertussis) zawierająca toksoid błoniczy, toksoid tężcowy oraz inaktywowane bakterie wybranych szczepów B. pertussis. Do produkcji szczepionki pełnokomórkowej wykorzystuje się bakterie B. pertussis hodowane na syntetycznym płynnym pod-łożu. Bakterie są zabijane chemicznie lub/i termicznie i po dostosowaniu do odpowiedniej gęstości, adsorbo-wane na solach glinu [34].

Drugim typem wprowadzonej szczepionki jest szczepionka bezkomórkowa (acellular pertussis; aP, DTaP), która zawiera toksoid błoniczy, toksoid tężcowy oraz kilka wybranych, wyizolowanych i oczyszczonych antygenów bakteryjnych B. pertussis. Antygenami są: toksyna krztuścowa (PT), hemaglutynina włókienkowa (FHA), pertaktyna (PRN) oraz fimbrie (FIM2 i FIM3). W zależności od producenta skład i proporcje antygenów białkowych różnią się.

Ryc. 2

W wielu krajach, szczepionki acelularne (DTaP) częściowo lub całkowicie zastąpiły szczepionki DTwP. Głównym powodem było to, że szczepionki DTwP są reaktogenne. W miejscu podania szczepionka DTwP może wywołać bolesność, zaczerwienienie i obrzęk. Miejscowe odczyny poszczepienne są krótkotrwałe, ale mogą powodować pewien dyskomfort. Najczęściej do ogólnych obserwowanych odczynów należy wzrost temperatury powyżej 38°C, senność, wymioty i uporczywy płacz [21]. Za reaktogenność szczepionek DTwP odpowiedzialny jest lipopolisacharyd, który jest integralnym składnikiem błony zewnętrznej bakterii i jego zawartość w szczepionce jest zmienna. Ilość tego antygenu waha się w granicach 0,9–2,8 µg/ml, z czego większość to LPS uwolniony do roztworu. LPS jest uwalniany z komórki bakteryjnej wraz z upływem czasu przechowywania szczepionki. Po około sześciu miesiącach nawet 80% LPS może zostać uwolnione [32].

Szczepionki DTaP nie zawierają LPS, a więc są znacznie mniej reaktogenne i ewentualne odczyny poszczepienne są rzadziej obserwowane [13]. Jednakże wraz z podaniem kolejnej dawki i z wiekiem dziecka, reaktogenność szczepionki DTaP wzrasta pomimo braku LPS w składzie [7]. Dla starszych dzieci i dorosłych rekomendowane są szczepionki dTap z obniżoną zawartością antygenów błoniczych i krztuścowych (pisane małymi literami dla odróżnienia od szczepionki DTaP). W przypadku kolejnych dawek miejscowe odczyny poszczepienne są słabsze [65] lub różnice pomiędzy odczynami nie są znaczące [83].

Przechorowanie krztuśca nie gwarantuje dożywotniej ochrony przed ponownym zakażeniem. W zależ-ności od szczepów krążących w populacji, maksymalny czas ochrony może trwać ~ 20 lat. Jednak zazwyczaj okres ochronny jest znacznie krótszy, dlatego tak istotne jest doszczepienie nastolatków i dorosłych. Dzia łanie ochronne po immunizacji szczepionką peł-nokomórkową DTwP jest dłuższe niż po immunizacji szczepionką DTaP i może trwać nawet do 12 lat [86]. Ochrona po zaszczepieniu szczepionką bezkomórkową DTaP zanika dość szybko i po upływie ok. 8 lat chronionych pozostaje jedynie 10% dzieci [47]. Najkrótszy efekt ochronny zaobserwowano dla szczepionek dTap, który to obniża się już po 4 latach z poziomu 68,8% do 8,9% [37]. Po przeanalizowaniu wielu wyników badań nad skutecznością wszystkich rodzajów szczepionek określono ich efektywność na poziomie 94% dla DTwP, 85% dla DTaP [24] oraz 67% dla dTap [63].

Pomimo zaprojektowania dwóch rodzajów szczepionek przeciwkrztuścowych wiele antygenów nie zostało jeszcze zidentyfikowanych i nie do końca również wiadomo, które są kluczowe w aktywacji danego typu odpowiedzi immunologicznej. Trudność w prowadzonych badaniach sprawia zidentyfikowanie antygenów wywo-łujących odpowiedź immunologiczną i ustalenie czy działając niezależnie, czy w synergii z innym antygenem są w stanie zapewnić zadowalający poziom ochrony. Typ wywoływanej odpowiedzi jest główną cechą, odróżniającą szczepionki bezkomórkowe od komórkowych. W modelu badań przeprowadzonych na szympansach wykazano, że naturalne zakażenie oraz w mniejszym stopniu zaszczepienie DTwP indukuje odpowiedź typu Th17 oraz Th1, a zaszczepienie DTaP indukuje powstawanie limfocytów pomocniczych Th1 oraz Th2 [81]. Brak aktywacji komórek Th17 na błonach śluzowych nosogardła przez szczepionkę DTaP jest jej główną wadą. Na modelu zwierzęcym wykazano, że DTaP chroni przed rozwojem choroby, ale w przeciwieństwie do szczepionki pełnokomórkowej nie zapobiega transmisji i infekcji B. pertussis [82]. W wyniku zaszczepienia DTaP w górnych drogach oddechowych nie powstają rezydentne komórki pamięci (tissue-resident memory T cells, TRM), które zachowują pamięć immunologiczną na powierzchni błon śluzowych i są w stanie jako pierwsze zareagować na zakażenie i zrekrutować komórki odpowiedzi wrodzonej i humoralnej [91].

Skład szczepionki DTaP jest ściśle zdefiniowany i zawiera 3–5 antygenów białkowych. Natomiast zawartość różnych antygenów B. pertussis w szczepionkach DTwP nie jest do końca określona i obejmuje ponad 3 000 antygenów, z czego więcej niż 20 może mieć właściwości ochronne [11]. W zależności od warunków hodowli lub / i od szczepu liczba oraz ilość poszczególnych antygenów może ulegać zmianom.

Uważa się, że możliwe odczyny poszczepienne poja- wiające się po zaszczepieniu szczepionką DTwP były głównym czynnikiem, który zadecydował o zmianie szczepionki pełnokomórkowej na bezkomórkową w programach szczepień wielu krajów [93]. Najnowsze analizy wskazują na wiele innych czynników, które miały zasadniczy wpływ na podjęcie decyzji o tej zmianie. W badanych europejskich krajach (Dania, Szwecja, Francja, Wielka Brytania) były to czynniki, które można przypisać do 3 grup: naukowych, socjologicznych i pragmatycznych. W Wielkiej Brytanii głównym powodem zamiany DTwP na DTaP w programie szczepień, była nie obawa o skutki uboczne, ale epidemia poliomyelitis. Preparat szczepionki bezkomórkowej dodatkowo zawierał inaktywowane wirusy polio i to był decydujący argument o zmianie typu szczepionki przeciwkrztuścowej. We Francji głównym powodem były preferencje lekarzy w stosowaniu szczepionki DTaP i w konsekwencji względy pragmatyczne w utrzymaniu tylko jednej linii produkcyjnej szczepionki. Polska jest jedynym krajem w Unii Europejskiej, który kontynuuje szczepienia podstawowe szczepionką pełnokomórkową DTwP [93]. Obowiązujący kalendarz szczepień przewiduje czterokrotne zaszczepienie dziecka szczepionką DTwP (w 2, 3–4, 5–6 i 16–18 miesiącu życia) oraz dawką przypominającą w 6 roku życia szczepionką DTaP. Szczepionki pełnokomórkowe DTwP stosowane są w krajach o niskim i średnim dochodzie. W 2018 roku GPI wydało rekomendacje, aby kraje te, nie zmieniały rodzaju szczepionki w programie szczepień noworodków, a dążyły do standaryzacji preparatów [22].

Pomimo powszechności szczepień przeciwkrztuścowych na całym świecie notuje się trend wzrostu zachorowań. Może to być wywołane kilkoma czynnikami. Pierwszym jest naturalnie zanikająca odporność. Z upływem czasu maleje ilość ochronnych przeciwciał, ale utrzymanie ich odpowiedniego poziomu może być kontrolowane poprzez szczepienia dawkami przypominającymi. Drugim powodem wzrostu zachorowań jest stosowanie szczepionek bezkomórkowych. Liczba antygenów stosowanych w szczepionkach DTaP została ograniczona do maksymalnie 5 białek. Co prawdopodobnie spowodowało wystąpienie mutacji w allelach genów kodujących antygeny (dryf antygenowy). Sekwencjonowanie genów kodujących PT, w różnych szczepach krążących na przestrzeni kilkudziesięciu lat ujawniło polimorfizm tych genów (ptx1, ptx2, ptx3) oraz polimorfizm w regionie promotora (ptxP), który obniża poziom ekspresji toksyny [50]. W efekcie wyewoluowały szczepy bakteryjne, które wytwarzają antygeny szczepionkowe w zmienionej formie lub w ogóle ich nie wytwarzają. Dotyczy to wszystkich antygenów szczepionkowych, ale najczęściej obserwowane są zmiany w ekspresji pertaktyny. Do tego stopnia, że szczepy niewytwarzające PRN dominują w niektórych krajach stosujących tylko szczepionkę bezkomórkową DTaP [56]. Podobne zmiany w wolniejszym tempie obserwuje się również w krajach, które stosują szczepionkę pełnokomórkową np. w Polsce [59].

Obecnie stosowane szczepionki nie są jednak idealne. Globalnie dostępne bezkomórkowe szczepionki przeciwkrztuścowe nie zapewniają ochrony przeciwko B. holmesii. Pałeczki B. holmesii nie wytwarzają PT, FHA, PRN i FIM, które są antygenami szczepionkowymi obecnymi w szczepionce DTaP [64]. Poliklonalne przeciwciała indukowane szczepionką DTaP, rozpoznają tylko jeden nieokreślony antygen z niską efektywnością, a przeciwciała indukowane szczepionką pełnokomórkową DTwP rozpoznają jedynie antygeny o masie niższej niż 60 kDa [97]. Jedynym znanym wspólnym antygenem białkowym B. holmesii i B. pertussis jest białko BipA, którego sekwencja aminokwasowa wykazuje 59% homologii i 89% podobieństwa [64]. W badaniach na modelu mysim wykazano jego właściwości ochronne przeciwko infekcji B. holmesii. Jednak głównym problemem w zastosowaniu tego białka, jako antygenu szczepionkowego jest jego wysoka niestabilność [64]. Brak wspólnych antygenów białkowych B. holmesii oraz B. pertussis jest przyczyną braku efektywności rekomendowanej dla dorosłych szczepionki dTap (36%) [63].

Dane o antygenach ochronnych Bordetellae są skąpe i trudno ustalić, które są kluczowe, jako składniki szczepionek podjednostkowych. Podejmowane są próby zwiększenia skuteczności szczepionek bezkomórkowych poprzez uzupełnienie ich składu o dodatkowe antygeny białkowe jak cyklaza adenylowa i białko BrkA, które jednak pojedynczo nie indukują wytwarzania ochronnych przeciwciał. Jedynie w obecności pozostałych antygenów są w stanie zwiększyć efektywność szczepionki bezkomórkowej [10]. Efektywność zwiększana jest również poprzez dodanie adiuwantu. We wszystkich szczepionkach bezkomórkowych DTaP jako adiuwant stosowany jest wodorotlenek glinu lub jego sole. W szczepion- kach pełnokomórkowych rolę dodatkowego adiuwantu pełni endotoksyna. Ze względu na dużą reaktogenność natywna pełna cząsteczka LPS nie może być stosowana jako adiuwant. Centrum toksyczności endotoksyny stanowi lipid A, który warunkuje aktywność biologiczną poprzez oddziaływanie z kompleksem receptorów dla LPS. Pochodna lipidu A, czyli monofosforylowany lipid A (MPL) charakteryzuje się znacznie mniejszą toksycznością i stosowany jest, jako adiuwant w szczepionkach przeciw HPV oraz WZW B [10].

Lipopolisacharyd jest integralnym składnikiem błony zewnętrznej. W wyniku immunizacji pełnymi komórkami bakteryjnymi produkowane są swoiste i często bakteriobójcze przeciwciała skierowane przeciwko LPS [60]. Dlatego LPS wydaje się być ideal-nym źródłem antygenów polisacharydowych. Szczepionki polisacharydowe rozwijane są od ponad 50 lat, ale ich główną wadą jest to, że sam polisacharyd jest antygenem T – niezależnym. Wywołana przez niego odpowiedź immunologiczna jest słaba i krótkotrwała. Zwiększenie immunogenności polisacharydu następuje po jego koniugacji z silnie immunogennym białkiem np. toksoidem tężcowym lub błoniczym. Powstały glikokoniugat nabiera cech antygenu T – zależnego [43]. Powszechnie stosuje się szczepionki skoniugowane, które zawierają polisacharydy otoczkowe Streptococcus pneumoniae, Neiseria meningitidis oraz Haemophilus influenzae typu b [85]. Oprócz lipidu A, który ze względu na toksyczność nie może zostać składnikiem szczepionki, drugim najbardziej stabilnym ewolucyjnie regionem LPS jest region oligosacharydu rdzenia.

Oligosacharyd (OS) B. pertussis jest nonasacharydem, który w zależności od szczepu może być podstawiony pojedynczą podjednostką. OS z przyłączonym dystalnym trójcukrem jest dodekasacharydem [9]. Struktury OS rdzenia innych bakterii z rodzaju Bordetella oraz pałeczki B. holmesii wykazują duże podobieństwo [75], dlatego OS i jego pochodne wydają się być odpowiednimi kandydatami na antygeny szczepionkowe. Glikokoniugaty OS z toksoidem tężcowym indukują powstawanie specyficznych przeciwciał, rozpoznających epitopy LPS na powierzchni komórek bakteryjnych [43]. Metodą deaminacji z lipooligosacharydu B. pertussis 186 wyi- zolowano pentasacharydowy fragment zawierający dystalny trójcukier, który ze względu na immunodominujący charakter jest istotnym elementem glikokoniugatu [52]. Glikokoniugaty pentasacharyd-PT i OS-PT, w których jako białko nośnikowe zastosowano toksynę krztuścową, indukują powstawanie przeciwciał o właściwościach bakteriobójczych [39]. W Instytucie Butantan (Brazylia) opracowana została alternatywna szczepionka pełnokomórkowa „wPlow”. W wyniku chemicznego pro- cesu ze szczepionki DTwP usunięto LPS, który jest najbardziej reaktogennym antygenem. Względy ekonomiczne były głównym motywatorem modyfikacji szcze- pionki DTwP, w kierunku mniejszej reaktogenności. Koszt wyprodukowania szczepionki DTaP jest ponad 300-krotnie wyższy niż szczepionki DTwP [14]. W pierw- szej fazie badań klinicznych udało się obniżyć reaktogenność przy zachowaniu podobnego poziomu immunogenności i ochrony poszczepiennej w porównaniu ze standardowo stosowaną szczepionką DTwP [15]. Szczepionka „wPlow” musi przejść dodatkowe badania kliniczne przed wprowadzeniem do kalendarza szczepień, ale wiele wskazuje na to, że w Brazylii zastąpi szczepionkę DTwP. Dodatkową korzyścią jest wyprodukowanie, w trakcie procesu pozbawiania B. pertussis LPS, silnego szczepionkowego adiuwantu – MPL [61].

Zespół prof. Lochta opracował szczepionkę BPZE1, która naśladuje naturalne zakażenie pałeczkami B. pertussis. Wybrany szczep bakteryjny został genetycznie zmodyfikowany. Modyfikacjom zostały poddane geny kodujące toksyny. W efekcie tych modyfikacji B. pertussis nie wytwarza toksyny dermonekrotycznej, obniżono poziom produkcji cytotoksyny tchawiczej, a główny antygen, czyli toksyna krztuścowa jest nieaktywna. Zmieniona została również metoda podania szczepionki na donosową, aby imitować sposób rozprzestrzeniania się pałeczki krztuśca. W szczepionce BPZE1 bakterie zostały atenuowane [48]. W badaniach przeprowadzonych na szympansach wykazano wysoką skuteczność szczepionki BPZE1, która chroniła przed infekcją i kolonizacją górnych dróg oddechowych oraz przed rozwojem krztuśca [42]. W połowie 2020 roku zakończona została druga faza badań klinicznych. Jedna dawka szczepionki BPZE1 indukuje odpowiedź typu Th1, podobnie jak szczepionka pełnokomórkowa. W porównaniu ze szczepionką bezkomórkową wywołuje powstawanie przeciwciał o szerszym zakresie działania [40]. Obecnie trwają prace nad otrzymaniem stabilnego preparatu w formie liofilizatu aby można było dopuścić szczepionkę do dalszych badań i komercjalizacji [73].

Nowością jest również projekt szczepionki bezkomórkowej podawanej donosowo opartej o pęcherzyki zewnątrzbłonowe (outer mem brane vesicles, OMVs) wydzielane przez B. pertussis. Pęcherzyki zawierają większość powierzchniowych antygenów wytwarzanych przez pałeczkę krztuśca w ich natywnej formie. Zapewniają podobny poziom ochrony jak szczepionki pełnokomórkowe [62]. Szczepionka OMV w przeciwieństwie do bezkomórkowej szczepionki DTaP zapobiega kolonizacji bakterii w płucach i jest skuteczna nawet dla szczepów nie wytwarzających pertaktyny [99].