Istotą funkcji czynników transkrypcyjnych (TFs, transcription factors) jest, specyficzna czasowo i tkankowo, regulacja poziomu syntezy transkryptów poszczególnych genów organizmu. Receptory jądrowe (NRs, nuclear receptors) tworzą szczególną i zarazem największą grupę TFs. Unikalną cechą odróżniającą NRs od innych TFs jest ich zdolność wiązania z małymi hydrofobowymi cząsteczkami zwanymi ligandami [1]. Ze względu na rodzaj wiązanej cząsteczki NRs można podzielić na dwie główne grupy (ryc. 1) [2]. Pierwszą stanowią receptory endokrynne (endocrine receptors), charakteryzujące się wysokim poziomem inicjacji transkrypcji docelowych genów (high transcriptional activity) i stałą dysocjacji (Kd) na poziomie nanomolarnym. W jej skład wchodzą zarówno receptory steroidowe (SHRs, steroid hormone receptors), jak np.: receptor androgenowy (AR, androgen receptor), estrogenowy (ER, estrogen receptor), glukokortykoidowy (GR, glucocorticoid receptor), mineralokortykoidowy (MR, mineralocorticoid receptor), progesteronowy (PR, progesterone receptor) oraz receptory niesteroidowe, jak np.: receptor hormonów tarczycy (TR, thyroid hormone receptor), pochodnej witaminy D – 1,25-dihydroksykalcyferolu (VDR, vitamin D receptor), kwasu całkowicie-
RXR jest członkiem nadrodziny NRs, dla którego odkrycie liganda – kwasu 9-
Receptor kwasu 9-
U ssaków występują trzy podtypy RXR (RXRα, RXRβ oraz RXRγ) kodowane przez różne geny, które mają odmienny profil ekspresji [8]. RXRα występuje głównie w wątrobie, płucach, mięśniach, nerkach, jelicie oraz naskórku. RXRβ jest obecny prawie we wszystkich tkankach, a RXRγ głównie w mięśniach szkieletowych, mięśniu sercowym i mózgu [9]. Ponadto każdy z podtypów RXR posiada co najmniej dwie izoformy, będące wynikiem alternatywnego składania pierwotnego transkryptu lub wykorzystywania podczas transkrypcji alternatywnych promotorów [10]. Warianty RXR różnią się zazwyczaj w rejonie końca N, fragmencie kluczowym dla regulacji tkankowoi komórkowo-specyficznej transkrypcji genów.
RXR kontroluje ekspresję genów tworząc homodimery/ homotetramery lub heterodimery z innymi NRs, przy czym każdy z trzech podtypów jest partnerem dla innych członków nadrodziny NRs [2, 11]. Wśród NRs dimeryzujących z RXR znalazły się zarówno receptory endokrynne (AR, TR, RAR, VDR), receptory związane z regulacją metabolizmu komórki (PPAR, PXR, LXR [liver X receptor], FXR [farnesoid X receptor]), jak i receptory sieroce (Nurr1 [nuclear receptor related 1 protein], CAR [constitutive androstane receptor]). NRs tworzące heterodimery z RXR można podzielić na dwie funkcjonalne grupy. Do pierwszej z nich należą NRs zależne od liganda RXR (permissive), a do drugiej niezależne od liganda RXR (non-permissive) [12, 13]. Przykładami NRs pierwszej grupy są m.in. receptory związane z metabolizmem energetycznym komórki (PPAR, LXR, PXR), charakteryzujące się niewielkim powinowactwem do liganda. Heterokompleksy RXR/PPAR, RXR/LXR i RXR/PXR mogą być aktywowane przez ligand RXR lub jego partnera bądź też synergistycznie przez oba ligandy [14]. Do grupy receptorów zależnych od liganda RXR zalicza się również receptory sieroce – Nurr1 i COUP-TFs. Do grupy receptorów działających niezależnie od liganda RXR należą TR i VDR. Heterokompleksy RXR/ TR i RXR/VDR są aktywowane przez ligand partnera RXR [15]. Receptory te charakteryzują się dużym powinowactwem do liganda. RXR w tych kompleksach pełni rolę tzw. cichego partnera (silent partner). Jednak RXR zachowuje zdolność wiązania liganda i oddziaływania z koaktywatorami. Badania nad heterodimerami umożliwiły wyróżnienie jeszcze jednej grupy receptorów, które w pewnych warunkach są zależne od liganda RXR (conditional permissive partners) [12, 13]; do tej grupy zaliczono RAR [16]. Związanie liganda RXR nie powoduje aktywacji heterodimeru RXR/RAR, a związanie liganda partnera tylko częściową aktywację kompleksu. Do osiągnięcia maksymalnej aktywności transkrypcyjnej potrzebny jest również ligand RXR. W pewnych typach komórek (np. komórki nowotworowe jelita grubego) RXR/ VDR również wykazuje podobny sposób działania [3].
W komórce RXR pozostaje w dynamicznej równowadze między heterodimerami a homodimerami [17] i homotetramerami [18]. Rola homodimerów RXR
Analizy genetyczne wykazały, że RXR jest zaangażowany w wiele procesów związanych z rozwojem i utrzymaniem homeostazy. W celu określenia roli poszczególnych podtypów RXR w okresie płodowym przeprowadzono eksperymenty z wykorzystaniem modeli mysich [22]. Wykazano, że głównym podtypem na tym etapie rozwoju jest
Jak większość NRs, RXR ma budowę modułową, na którą składa się sześć powiązanych funkcjonalnie regionów oznaczonych literami od A do F (ryc. 2A). Na końcu N RXR znajduje się region AB – w tej grupie receptorów wskazanie granicy miedzy regionem A i regionem B nie jest możliwe (ryc. 2A i 2C) [11, 27]. Region AB jest najmniej zachowanym w toku ewolucji fragmentem NRs i wykazuje najmniejszy stopień podobieństwa między poszczególnymi członkami nadrodziny. Różnice wynikają nie tylko z odmiennej sekwencji aminokwasowej, ale także ze znacznej różnicy w długości. Taka różnorodność w obrębie regionu AB pozwoliła na wyróżnienie trzech podtypów RXR (α, β i γ) oraz co najmniej dwóch izoform dla każdego z podtypów receptora [28]. Ma to odzwierciedlenie w aktywności transkrypcyjnej podtypów/ izoform RXR, zależnej od typu komórki oraz sekwencji promotorowej, ponieważ w regionie AB jest umiejscowiona sekwencja odpowiedzialna za autonomiczną, tj. niezależną od liganda, aktywację transkrypcji (AF1; activation function 1). Sekwencja AF1 bierze udział w regulacji transkrypcji głównie przez oddziaływanie białko-białko z koregulatorami i TFs [29, 30], jednak podstawy tych oddziaływań nie są dobrze poznane. Badania nad regionem AB różnych NRs wykazały, że w roztworze charakteryzuje się on brakiem stabilnej struktury drugo- i trzeciorzędowej, przez co może przyjmować różne konformacje [31]. Przypuszcza się, iż takie nieuporządkowanie w obrębie regionu AB umożliwia oddziaływanie z większą grupą białek, niż w przypadku istnienia zdefiniowanej struktury wyższego rzędu. Należy również podkreślić, że oddziaływanie regionu AB z koregulatorami jest selektywne i region ten nie oddziałuje w sposób przypadkowy z białkami. Przyjęcie konkretnej konformacji regionu AB zależy od danego typu komórki oraz od interakcji wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych, w jakie region AB jest zaangażowany, a od formy złożonego kompleksu zależy ostateczna odpowiedź [32]. Związki, które wiążą się z regionem AB (AF1) można by wykorzystać w terapii opartej na NRs. Wykazano, że pochodna bisfenolu A wchodzi w interakcję z AF1 receptora androgenowego (AR) i zakłóca wiązanie koaktywatorów z obszarem AF1, a następnie ekspresję docelowego genu znajdującego się pod kontrolą AR [33].
Region AB ze względu na swój charakter jest częstym celem różnych modyfikacji potranslacyjnych (PTMs, post-translational modifications), takich jak: fosforylacja, metylacja, acetylacja, ubikwitynylacja czy sumoilacja, które wpływają zarówno na strukturę jak i funkcję NR. Obecnie strukturalne i funkcjonalne następstwa modyfikacji w obrębie regionu AB są przedmiotem intensywnych badań [34]. PTM mającą duży wpływ na aktywność transkrypcyjną RXR jest fosforylacja. Wpływ tej modyfikacji został zbadany dla dwóch podtypów RXRα i RXRγ [35, 36]. Kinazy odpowiedzialne za modyfikacje regionu AB RXR należą do grupy kinaz serynowo-treoninowych. Skutek modyfikacji zależy od typu komórki, podtypu receptora oraz warunków eksperymentalnych [29]. Wskazano, że RXRα jest modyfikowany konstytutywnie na S22 przez kinazę należącą do rodziny CDKs (cyclin-dependent kinases) w komórkach COS-1 [37]. Rola tej modyfikacji została szerzej zbadana w mysiej linii komórkowej F9 [38]. Udowodniono, że modyfikacja ta jest istotna dla ekspresji wybranych genów znajdujących się pod kontrolą retinoidów oraz że aktywność transkrypcyjna RXR jest regulowana przez zmianę powinowactwa do koaktywatorów. Fosforylacja S22 jest również niezbędna do odpowiedzi antyproliferacyjnej komórek na retinoidy. Modyfikacja RXR obniżała poziom białek p21CIP i p27KIP, które są zaangażowane w kontrolę cyklu komórkowego. Zauważono również, że liczba miejsc fosforylacji w obrębie regionu AB może zależeć od warunków. W wyniku działania czynników stresowych na komórki COS-1 obserwowano zwiększenie liczby miejsc fosforylacji w regionie AB [37]. Pod wpływem działania promieniowania ultrafioletowego region AB RXRα ulegał modyfikacji na resztach S61, S75 i T87 w wyniku działania kinaz JNKs (c-Jun N-terminal kinases). Wskazano, że hiperfosforylacja nie ma wpływu na aktywność transkrypcyjną homodimerów RXR. Jednak przypuszcza się, że może wpływać na stabilność RXR i chronić receptor przed degradacją lub indukować apoptozę [37]. Istotną modyfikacją aktywności transkrypcyjnej RXR jest również sumoilacja [39]. Przyłączenie białka SUMO (small ubiquitin-related modifier 1) do reszty K108 (w obrębie motywu I
Nowo odkrytą rolą regionu AB RXR jest jego zdolność do promowania separacji faz typu ciecz-ciecz (LLPS, liquid-liquid phase separation) [40]. Jest to proces, w którym z jednorodnej fazy ciekłej zawierającej makrocząsteczki (białka, kwasy nukleinowe) tworzą się dwie oddzielne fazy, jedna bogata w makrocząsteczki (dense phase) oraz druga, w której ich stężenie jest znacznie mniejsze (dilute phase) [41]. Zjawisko to odpowiada m.in., za tworzenie w komórkach tzw. bezbłonowych organelli (MLOs, membraneless organelles), takich jak np. jąderko, plamki jądrowe (nuclear speckles), ciałka P (P-bodies) i ciałka stresowe (stress granules). Rosnąca liczba publikacji wskazuje, że LLPS stanowi niezwykle istotny mechanizm organizacji przestrzeni wewnątrzkomórkowej. Szacuje się, że ponad 30% ludzkiego proteomu jest związane z MLOs [42]. Uważa się, że LLPS leży u podstaw wielu procesów biologicznych, takich jak odpowiedź na stres, regulacja transkrypcji, metabolizm RNA, transport jądrowo-cytoplazmatyczny czy przekazywanie sygnałów [43]. Zaburzenia LLPS w komórkach i organizmach towarzyszą wielu chorobom. Do najczęściej wymienianych należą nowotwory, zaburzenia neurologiczne, takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS, amyotrophic lateral sclerosis) i zanik mięśni (muscular atrophies) [42]. W przypadku TFs głównym elementem odpowiedzialnym za LLPS wydają się domeny aktywacyjne (ADs, activation domains) [44]. Dla wybranych TFs wskazano, że to właśnie ADs poprzez LLPS odpowiadają za oddziaływanie z kompleksami pośredniczącymi (mediator complexes). Stąd LLPS wydaje się istotnym elementem aktywacji transkrypcji. Dla regionu AB
Region C jest najbardziej zachowanym w toku ewolucji fragmentem NRs (ryc. 2). Wraz z końcem N regionu D, tzw. przedłużeniem końca C (CTE, C-terminal extension), tworzy domenę wiążącą DNA (DBD), zaangażowaną bezpośrednio w rozpoznawanie i wiązanie ze specyficznymi sekwencjami regulatorowymi na DNA (HREs) [45]. Rdzeń DBD składa się z około 66 reszt aminokwasowych tworzących globularną domenę, której charakterystyczną cechą jest występowanie dwóch motywów palca cynkowego, gdzie cztery reszty cysteinylowe chelatują Zn2+. Ich rolą jest stabilizacja struktury składającej się z dwóch α-helis ułożonych prostopadle względem siebie, odpowiedzialnych za kontakt i rozpoznanie sekwencji DNA [45]. Na podstawie eksperymentów mutagenezy w regionie C wyróżniono kasetę P (proximal box) oraz kasetę D (distal box) (ryc. 2B) [46]. Kaseta P, obejmująca aminokwasy należące do pierwszego modułu cynkowego, jest częścią helisy I, odpowiadającej za rozpoznanie specyficznych sekwencji DNA. Kaseta D występuje w N-końcowej części drugiego modułu cynkowego i jest związana z zależną od DNA dimeryzacją NRs. Do DBD zaliczany jest również koniec aminowy regionu D, tzw. CTE. CTE odgrywa ważną rolę w oddziaływaniach typu białko-DNA oraz białko-białko. W przeciwieństwie do pozostałej części DBD nie jest to sekwencja konserwowana i przyjmuje różne motywy strukturalne. W obrębie CTE wyróżniono dwie kasety: A i T (ryc. 2B). Kasetę T zidentyfikowano po raz pierwszy w RXRβ jako sekwencję niezbędną w dimeryzacji [47], a następnie potwierdzono jej rolę w tworzeniu płaszczyzny homo- i heterodimeryzacyjnej z RAR [48, 49]. Kaseta A jest odpowiedzialna za rozpoznawanie dodatkowych sekwencji DNA, poza tymi rozpoznawanymi przez moduły cynkowe [47]. W DBD RXR zlokalizowano również dwie ważne sekwencje decydujące o dystrybucji receptora w komórce. W DBD znajduje się zarówno sygnał odpowiedzialny za translokację receptora do jądra komórkowego (NLS, nuclear localization signal) [27], jak również sygnał eksportu jądrowego (NES, nuclear export signal) [50]. RXR ma lokalizację głównie jądrową [51], jednak w nieobecności liganda RXR przemieszcza się między jądrem a cytoplazmą. W cytoplazmie RXR może tworzyć kompleksy z innymi NRs (np. PXR, CAR, VDR i TR) i po pojawieniu się liganda RXR wpływać na zmianę lokalizacji heterodimeru z cytoplazmatycznej na jądrową [52]. Jest to kolejny ważny aspekt mechanizmu regulacji NRs z udziałem RXR.
Region D, zwany również regionem zawiasowym (hinge region) jest odcinkiem łączącym DBD z domeną wiążącą ligand (LBD, ligand-binding domain) (ryc. 2A i 2C) [11, 27]. Jest to drugi region w RXR, w którym występują znaczne różnice w sekwencji aminokwasowej między podtypami/izoformami receptora. Region D wykazuje inherentne nieuporządkowanie strukturalne (IDR, intrinsically disordered region), umożliwia rotację DBD względem LBD, co pozwala RXR na dimeryzację z różnymi partnerami oraz na oddziaływanie z wieloma elementami regulatorowymi.
Region E (LBD) jest drugim, po regionie C, elementem budowy NRs w znacznym stopniu zachowanym w toku ewolucji pod względem sekwencji aminokwasowej (ryc. 2). Region E pośredniczy głównie w procesach indukowanych przyłączeniem liganda [57]. Przyjmuje się, że region ten jest najbardziej złożonym fragmentem receptora pod względem funkcjonalnym. Zawiera sekwencję odpowiedzialną za zależną od liganda aktywację transkrypcji (AF2, activation function 2), ponadto jest zaangażowany w niezależną od DNA dimeryzację, oddziaływanie z koregulatorami oraz często w nieobecności liganda pośredniczy w represji transkrypcji [35]. Spośród wszystkich regionów RXR, region E (LBD) jest przedmiotem największej liczby publikacji. Świadczy o tym liczba rozwiązanych struktur krystalicznych, które przedstawiają LBD zarówno w nieobecności liganda (tzw.
Ważnym czynnikiem mogącym regulować aktywność LBD są PTMs, a zwłaszcza fosforylacja [29]. Kinaza aktywująca MAPK (mitogen-activated protein kinase) (MKK4/SEK1) odpowiada za modyfikacje reszt Y249 i Y397, co jest związane z hamowaniem aktywności transkrypcyjnej
W LBD RXR jest umiejscowiony kolejny sygnał NES [65]; sekwencja ta jest aktywna przy braku liganda. Sygnał NES RXR jest wymagany do eksportu jądrowego receptora sierocego NGFI-B (nerve growth factor-induced protein B) (RXR/NGFI-B) [51]. W oddziaływanie między białkami są zaangażowane DBD obu receptorów. W chwili pojawienia się liganda, sygnał NES RXR zostaje zablokowany, zmienia się płaszczyzna oddziaływania – białka oddziałują przez LBD, a kompleks zostaje przeniesiony do jądra [65].
Region F pozostaje nadal najmniej poznany pod względem funkcjonalnym i strukturalnym (ryc. 2A); nie występuje u wszystkich członków nadrodziny NRs. Do regionu F często zalicza się reszty znajdujące się na końcu karboksylowym receptora, nie występujące w strukturze krystalicznej [58]. W przypadku poszczególnych podtypów/izoform RXR, region ten jest w dużym stopniu zróżnicowany pod względem sekwencji i obejmuje jedynie kilka reszt aminokwasowych. Przypuszcza się, że może mieć znaczenie dla stabilności RXR oraz wpływać na jego aktywność transkrypcyjną [9].
Regulacja transkrypcji z udziałem RXR wymaga specyficznego oddziaływania receptora z sekwencjami regulatorowymi na DNA (HRE), umiejscowionymi w rejonach promotorowych docelowych genów [58]. Sekwencje te wykazują wiele istotnych cech strukturalnych wpływających na specyficzność odpowiedzi hormonalnej. Sekwencje DNA rozpoznawane przez dimery RXR składają się z dwóch powtórzonych kopii pochodnych sekwencji AGGTCA, oddzielonych krótkim fragmentem o długości 1-5 nukleotydów (DR1-DR5) [68]. Homodimery RXR-RXR i heterodimery RXR-PPAR, RAR/ RXR mogą się wiązać z motywem DR1, RXR/RAR z DR2 i DR5, RXR-VDR z DR3, natomiast RXR/TR z DR4. Zarówno sama sekwencja AGGTCA, jej orientacja, sekwencja łącznika, jak również sekwencje otaczające motyw pełnią ważną rolę, gdyż determinują specyficzność wiązania dimerów. Ponieważ RXR jest obligatoryjnym partnerem dla dużej grupy NRs, potencjalna liczba genów znajdująca się pod ich kontrolą jest olbrzymia.
NRs regulują poziom transkrypcji przez wpływ na:
zmianę stopnia upakowania chromatyny,
powstawanie i aktywność kompleksów inicjacyjnych i elongacyjnych [58].
Uważa się, że w pełnienie powyższych funkcji zaangażowane są domeny transaktywacyjne: AF1 (niezależna od obecności liganda) i AF2 (zależna od obecności liganda), które pośredniczą w oddziaływaniach z podstawową maszynerią transkrypcyjną oraz z wieloma białkami zwanymi koregulatorami. Wśród koregulatorów znajdują się białka pełniące funkcje zarówno koaktywatorów, jak i korepresorów transkrypcji [69]. W nieobecności liganda korepresory oddziałują z LBD RXR, który jest związany z partnerem na HRE, co powoduje hamowanie podstawowej aktywności transkrypcyjnej (ryc. 3A) [70]. Zawierają charakterystyczny motyw strukturalny LXXH/IIXXXI/L zwany kasetą CoRNR (corepressor nuclear receptor box). Najlepiej scharakteryzowanymi przedstawicielami korepresorów są kompleksy NCoR (nuclear receptor corepressor) i SMRT (silencing mediator of retinoid and thyroid hormone receptors). Kompleksy te mają aktywność deacetylazy histonów (HDAC, histone deacetylase), która usuwa grupy acetylowe z reszt K w N-końcowych fragmentach białek histonowych [71]. Wywołuje to kondensację chromatyny i represję transkrypcji genów. Korepresory powodują przyłączenie wielkocząsteczkowych kompleksów, które również wykazują aktywność HDAC i odpowiadają za wzrost siły oddziaływań białek histonowych z DNA nukleosomów [61].
Związanie liganda indukuje zmiany w obrębie LBD RXR, wpływając na oddziaływanie z partnerem, jak również na wiązanie z HRE. Związanie liganda pozwala na dysocjację kompleksów korepresorów i związanie koaktywatorów (ryc. 3B). Obszar oddziaływania LBD RXR z korepresorami i koaktywatorami częściowo się pokrywa. Zmiany w obrębie helisy H12 indukowane wiązaniem liganda prowadzą do utworzenia struktury promującej oddziaływania z koaktywatorami. Do koaktywatorów oddziałujących z RXR należy rodzina białek p160, w tym SRC-1, SRC-2 oraz SRC-3 [11]. Zawierają pojedynczy lub obecny w wielu powtórzeniach motyw o sekwencji LXXLL, określany jako kaseta NR (nuclear receptor box) [73]. Jak potwierdziły badania krystalograficzne, motyw LXXLL oddziałuje bezpośrednio ze specyficzną wnęką LBD, która tworzy się w wyniku przemieszczenia helisy H12 pod wpływem związania liganda. Koaktywatory, podobnie jak korepresory, mogą wpływać na strukturę chromatyny. Wykazują aktywność acetylotransferazy histonów (HAT, histone acetyltransferase). Indukowane związaniem liganda werbowanie kompleksu niektórych koaktywatorów przez NRs do rejonów promotorowych powoduje zależną od HAT acetylację histonów, a to obniża powinowactwo histonów do DNA, prowadzi do rozluźnienia struktury chromatyny, ułatwiając dostęp podstawowej maszynerii transkrypcyjnej do rdzenia promotora. Inne koaktywatory, jak np. CARM-1, mają aktywność metylotransferazy histonów (HMT, histone methyltransferase) [11]. Metylacja reszt K i R wpływa na oddziaływanie między histonami a DNA oraz między samymi histonami. Związanie niektórych kompleksów koaktywatorów pozwala na przyłączenie zależnych od ATP czynników rearanżujących chromatynę, jak np. SWI-SNF (switching-defective–sucrose non-fermenting complex). Mimo że rozluźnienie struktury chromatyny jest konieczne, to nie warunkuje inicjacji transkrypcji. Aby umożliwić NRs utworzenie kompleksu preinicjującego (PIC, preinitiation complex), musi dojść do oddysocjowania koaktywatorów i przyłączenia kompleksów pośredniczących (mediator complexes). Kompleks pośredniczący pełni rolę pośrednika między podstawową maszynerią transkrypcyjną i RXR, powoduje bezpośrednie werbowanie polimerazy RNA II wraz z czynnikami transkrypcyjnymi (GTFs, general transcription factors) do rdzenia promotora i do aktywacji transkrypcji (ryc. 3C).
Związki, które wiąże RXR i które są wstanie go aktywować, należą do różnych grup, wśród nich możemy wyróżnić ligandy naturalne, syntetyczne oraz endogenne [74].
Na podstawie badań z lat dziewięćdziesiątych XX w. powszechnie przyjęto, że endogennym ligandem RXR jest kwas 9-
Inną grupą związków endogennego pochodzenia, które mogą aktywować RXR, są nienasycone kwasy tłuszczowe (UFAs, unsaturated fatty acids), takie jak: kwas dokozaheksaenowy (DHA), kwas arachidonowy (AA, arachidonic acid) i kwas oleinowy (OA, oleic acid). DHA (ryc. 4) był jednym z pierwszych opisanych aktywatorów RXR [77]. W badaniach porównujących wpływ UFAs na aktywność transkrypcyjną RXR, stężenie DHA wynosiło 5-10 μM, a OA i AA wymagały wyższych stężeń rzędu 100-1000 μM [78]. Zdolność RXR do wiązania różnorodnych UFAs podkreśla ważną rolę tego receptora w regulacji metabolizmu komórki. Jednak tak jak w przypadku 9
Związkiem, który rozważano jako naturalny ligand RXR, jest kwas fitanowy (phytanic acid) (ryc. 4). Ten metabolit chlorofilu jest dostarczany do organizmu z pożywieniem; występuje m.in. w mięsie przeżuwaczy i wyrobach mleczarskich. Kwas fitanowy odpowiada głównie za aktywację homodimerów RXR [83], choć może pełnić również rolę liganda PPAR [56]. Kwas fitanowy aktywuje RXR w stężeniu 10 μM. Jego średnie stężenie w osoczu u ludzi wynosi 1-6 μM, a u osób stosujących dietę bogatą w mięso może być kilkukrotnie większe (około 5,8 μM). Jednak jest to poziom zbyt niski do aktywacji RXR. Mimo że kwas fitanowy jest ligandem RXR, to jego znaczenie fizjologiczne pozostaje nieznane.
Uwzględniając rolę RXR, jaką pełni w nadrodzinie NRs, identyfikacja specyficznych ligandów dla tego receptora ma podstawowe znaczenie. Wiele związków udało się zidentyfikować jako ligandy RXR, jednak ich stężenie w tkankach było niewystarczające do aktywacji transkrypcji. Obecnie głównym kandydatem do roli endogennego liganda RXR mającego znaczenie fizjologiczne wydaje się kwas 9-
W życiu codziennym żywe organizmy są narażone na działanie związków, które mogą modulować aktywność RXR, w tym: ftalany, plastyfikatory, niektóre herbicydy, organotyny i farmaceutyki. Jednym z dobrze udokumentowanych związków, będącym ligandem RXR, jest metabolit powszechnie używanego insektycydu – metoprenu, kwas metoprenowy (MPA) (ryc. 4). Związek ten jest analogiem hormonu juwenilnego, który kontroluje u owadów procesy komórkowe związane z metamorfozą. MPA selektywnie aktywuje RXR, ale nie RAR, działając jako aktywator transkrypcji zarówno w komórkach owadzich, jak i ssaczych [85].
NRs, jako czynniki transkrypcyjne regulowane przez ligand, są celem leków. Ze względu na mnogość genów kontrolowanych przez pojedynczy NR głównym wyzwaniem jest identyfikacja ligandów o działaniu selektywnym względem danego genu lub grupy genów związanych z konkretną chorobą. Istnieje wiele związków syntetycznych zdolnych do oddziaływania z RXR, jednak obecnie dopuszczonych do użytku klinicznego jest tylko kilka z nich. Zostały podzielone na kilka generacji: związki niemające budowy aromatycznej, np. retinoidy naturalne, określa się mianem retinoidów I generacji (np. tretynoina oraz izotretynoina); związki monoaromatyczne – retinoidów II generacji (np. acytretyna), a związki poliaromatyczne zalicza się do retinoidów III generacji (np. adapalen, tazaroten i beksaroten). Retinoidy normalizują wzrost i różnicowanie komórek skóry i błon śluzowych, ponadto działają immunomodulująco oraz przeciwzapalnie. Stąd w główniej mierze są stosowane w leczeniu chorób skóry np. łuszczycy lub trądziku. Ze względu na wpływ retinoidów na procesy regulujące podziały komórkowe znalazły zastosowanie w terapii niektórych chorób nowotworowych. Beksaroten (ryc. 4) był pierwszym zatwierdzonym w badaniach klinicznych przez Agencję Żywności i Leków (FDA, Food and Drug Administration) oraz Europejską Agencję Leków (EMA, European Medicines Agency) syntetycznym retinoidem do leczenia chorych z zaawansowanym chłoniakiem skórnym z komórek T (CTCL, cutaneous T-cell lymphoma). Związek ten charakteryzuje się dużym powinowactwem do wszystkich trzech podtypów RXR, ale nie RAR [86]. W ostatniej dekadzie badania kliniczne skupiły się na zastosowaniu beksarotenu w kilku innych nowotworach, m.in. niedrobnokomórkowym raku płuc, ostrej białaczce szpikowej, rakach piersi, tarczycy i czerniaku. W części przypadków zaobserwowano korzyści terapeutyczne. Aktywacja RXR wydaje się zatem mieć duży potencjał terapeutyczny w różnych nowotworach [87]. Oprócz rosnącego znaczenia w nowotworach, ligandy RXR są badane pod kątem wykorzystania ich w chorobach neurodegeneracyjnych, zwłaszcza stwardnieniu rozsianym i chorobie Alzheimera [87]. Wykazano, że beksaroten może odwracać procesy neurodegeneracyjne, poprawiać funkcje poznawcze i zmniejszać poziom β-amyloidu u transgenicznych myszy [88].
Większość ligandów RXR nie wykazuje dużej selektywności wobec podtypów/izoform RXR, co jest związane z budową LBP. Wciąż trwają prace nad identyfikacją syntetycznych ligandów RXR mogących selektywnie wiązać dimery RXR (zarówno homodimerów, jak i heterodimerów) i charakteryzujących się mniejszą liczbą działań niepożądanych.
RXR odpowiada za kontrolę ekspresji wielu genów związanych z utrzymaniem homeostazy organizmu [89]. Receptor ten można uznać za swego rodzaju centralny regulator wielu ścieżek sygnałowych w organizmie. Dzięki zdolności do tworzenia heterodimerów z innymi NRs, RXR może być powiązany z wieloma chorobami. Na szczególną uwagę zasługują: cukrzyca i otyłość, choroby nowotworowe oraz neurodegeneracyjne.
RXR odgrywa bardzo ważną rolę w integracji działania NRs, dla których ligandami są oksysterole (LXR), kwasy żółciowe (FXR) i kwasy tłuszczowe (PPAR) [86]. Jest to grupa należąca do NRs zależnych od liganda RXR, biorąca udział w utrzymaniu homeostazy i metabolizmu energetycznego. Otrzymanie selektywnych ligandów dla takich heterodimerów mogłoby mieć szczególne znacznie w leczeniu zespołu metabolicznego. Wykazano, że inaktywacja RXR w wątrobie myszy jest związana z zaburzeniem licznych szlaków metabolicznych, znajdujących się pod kontrolą heterodimerów RXR [90]. Zauważono również, że zwierzęta leczone retinoidami wykazywały znaczące zmiany w poziomie cholesterolu, związane z hamowaniem jego wchłaniania i obniżoną syntezą kwasów żółciowych. W regulacji wchłaniania cholesterolu, jego metabolizmie w wątrobie i dystrybucji do tkanek obwodowych biorą udział heterodimery RXR/LXR i RXR/FXR [91]. Aktywacja RXR/FXR hamuje ekspresję hydrolaz CYP7A1 i CYP7B1, które odgrywają istotną rolę w syntezie kwasów żółciowych i wchłanianiu cholesterolu. Natomiast aktywacja RXR/LXR przez retinoidy lub agonistę LXR indukuje zmiany w nabłonku jelita [92]. W enterocytach oraz makrofagach zwiększona zostaje ekspresja transportera ABC1 (ATP-binding cassette transporter) odpowiedzialnego za usuwanie cholesterolu z komórek [93].
RXR tworzą dimery również z PPAR, które pełnią ważną rolę w kontroli metabolizmu kwasów tłuszczowych i utrzymaniu homeostazy glukozowej [72]. Kompleksy RXR/PPAR mogą być aktywowane przez ligandy obu partnerów, jednak mechanizm ich działania jest odmienny. Glitazony (np. pioglitazon i rosiglitazon) należące do grupy tiazolidydendionów (TZDs), znalazły zastosowanie jako leki zwiększające wrażliwość na insulinę. Ich mechanizm działania polega na aktywacji PPARγ, co prowadzi do zmiany ekspresji genów, których produkty są związane z transportem glukozy – zwiększa się wychwyt glukozy przez komórki, zmniejsza glukoneogeneza w wątrobie, natomiast zwiększa glikoliza [94]. Ponieważ RXR jest partnerem PPARγ, zasugerowano, że retinoidy mogą, podobnie jak TZDs, działać uwrażliwiająco na insulinę. Wykazano, że ligandy RXR zmniejszają insulinooporność u chorych na cukrzycę i otyłych myszy; o ile TZDs miały największy wpływ na ekspresję genów w tkance tłuszczowej, to podstawowe działanie retinoidów obejmowało zmiany w ekspresji genów w wątrobie i mięśniach szkieletowych [89].
Wśród genów wykazujących wzrost ekspresji w mięśniach szkieletowych pod wpływem ligandów RXR znalazły się gen receptora CD36 (cluster of differentiation 36) i desaturazy stearylo-CoA (SCD, stearoyl-CoA desaturase). Zwiększenie poziomu receptora CD36 w mięśniach szkieletowych u zwierząt leczonych retinoidami ma związek ze zwiększeniem wrażliwości na insulinę. Mechanizm, poprzez który SCD reguluje aktywność szlaku insulinowego, nie jest dokładnie wyjaśniony. SCD reguluje przemianę kwasów tłuszczowych i ich poziom w tkankach, jak również odgrywa ważną rolę w regulacji metabolizmu glukozy w mięśniach szkieletowych. Dobrzyn i wsp. [95] wykazali, że SCD ma istotny wpływ na regulację aktywności kinazy białkowej aktywowanej przez AMP (AMPK, AMP-activated protein kinase).
Zidentyfikowano kilka wariantów genów
Oprócz funkcji związanych z regulacją metabolizmu, RXR jest również zaangażowany w liczne ścieżki sygnałowe centralnego układu nerwowego (CNS, central nervous system). We wczesnym stadium rozwoju ssaków heterodimery RAR/RXR zaangażowane są w indukcję różnicowania neuronów, prawidłowy rozwój CNS, stymulację wzrostu aksonów, a w późniejszym etapie biorą udział w zachowywaniu plastyczności neuronów w hipokampie i układzie węchowym [101]. Wykazano, że RARβ oraz RXRγ wpływają na plastyczność synaps w hipokampie i przez to na funkcje kognitywne [102]. Głównym podtypem RXR związanym z prawidłowym funkcjonowaniem układu nerwowego jest RXRγ. Podtyp ten ulega ekspresji na wysokim poziomie w prążkowiu (striatum), gdzie odgrywa ważną rolę w regulacji dopaminergicznej ścieżki sygnałowej, aktywności ruchowej za pośrednictwem dopaminy i w ośrodku nagrody [55]. RXRγ jest również zaangażowany w proces oligodendrogenezy oraz remielinacji, odgrywając rolę pozytywnego regulatora tych procesów. Jego aktywacja stymuluje różnicowanie komórek oligodendrocytów przez nasilenie remielinacji [103]. RXRγ ulega ekspresji na niskim poziomie w komórkach glejowych, lecz jego poziom gwałtownie wzrasta u aktywnych makrofagów, reaktywnych astrocytów i dendrocytów w następstwie uszkodzenia CNS [81, 100]. Wykazano także zwiększony poziom RXRγ w miejscach demielinizacji oraz zmian patologicznych przy stwardnieniu rozsianym, co może sugerować, że wysoki poziom ekspresji receptora jest fizjologicznym sygnałem uszkodzenia mózgu [103].
RXR działa jako główny koordynator w szlakach przekazywania sygnałów z udziałem NRs, które są zaangażowane w kontrolę wzrostu komórek i różnicowanie [35]. Jak opisano wcześniej, ligandy RXR wykazują obiecujące działania chemioprewencyjne i chemioterapeutyczne w kilku badanych typach nowotworów. Zaobserwowano również, iż rzadko dochodzi do utraty ekspresji RXR w komórkach nowotworowych. Jednak mechanizm działania przeciwnowotworowego RXR i jego ligandów nie jest dokładnie poznany. Jednym z kluczowych aspektów regulacji aktywności NRs jest ich dystrybucja wewnątrzkomórkowa. Głównym miejscem funkcjonowania RXR jest jądro komórkowe. Zaobserwowano, że w ludzkiej linii komórkowej raka piersi (MDA-MB-231) lokalizacja RXRα uległa zmianie, podczas gdy poziom ekspresji RXR pozostał niezmieniony [104]. RXRα rozmieszczony był głównie w SFCs (splicing factor compartments), a nie w sposób równomierny w nukleoplazmie. Następstwem tego było zahamowanie aktywności transkrypcyjnej samego receptora, jak również jego heterodimerów.
Zmiany w poziomie ekspresji RXR są stwierdzane w różnych typach nowotworów. Liczne badania wskazują na obniżenie poziomu RXR w wielu nowotworach, takich jak rak prostaty [105], piersi [106], wątroby [107] czy tarczycy [108]. Natomiast w komórkach ludzkiego raka dróg żółciowych (cholangiocarcinoma) poziom RXR był podwyższony [109]. RXR wykazywał umiejscowienie głównie cytoplazmatyczne, a nie jądrowe jak w zdrowych komórkach. Obniżenie poziomu RXR prowadziło do zmiany w poziomie ekspresji m.in. czynników promujących mitozę – cyklin D1 i E, białka PCNA (proliferating cell nuclear antigen) i inhibitora kinaz zależnych od cyklin p21. Knockdown RXR odpowiadał za obniżenie poziomu cykliny D1, co miało związek z hamowaniem szlaku Wnt/β-katenina. Obserwowano również obniżenie poziomu ekspresji białka PCNA i wzrost ekspresji białka p21, co powodowało zatrzymanie proliferacji komórek nowotworowych.
Oprócz zmian w poziomie ekspresji RXR, również zaburzenie jego funkcji może być wiązane z rozwojem nowotworów. Wykazano, że RXRα oddziałuje z białkiem fuzyjnym PML/RARα i ma to duży wpływ na rozwój ostrej białaczki promielocytowej (APL, acute promyelocytic leukemia) u transgenicznych myszy [110]. Białko PML/RARα jest produktem powstałego w wyniku translokacji t(15;17) (q22,q21) fuzyjnego genu
Liczne badania z wykorzystaniem różnych linii komórek nowotworowych, takich jak np. komórki raka wątrobowokomórkowego (HCC, hepatocellular carcinoma), kostniakomięsaka (osteosarcoma) oraz raka prostaty, pozwoliły na zidentyfikowanie w cytoplazmie tych komórek skróconej formy RXRα (tRXRα, truncated RXRα) [111]. Formy tRXRα powstają w wyniku ograniczonej proteolizy receptora pełnej długości (RXR). W procesie tym biorą udział katepsyny L oraz m-kalpainy; miejscem ich działania jest koniec N RXRα. tRXRα wykryto w pierwotnych komórkach nowotworowych, ale nie w komórkach znajdujących się w ich sąsiedztwie czy zdrowych tkankach [112]. tRXRα, ale nie RXR, może pośredniczyć w aktywacji szlaku kinazy 3-fosfatydyloinozytolu i AKT (PI3K/AKT) przez czynnik martwicy nowotworów TNF-α (TNF-α, tumor necrosis factor α), cytokininę związaną z procesem zapalnym [112]. tRXRα w odpowiedzi na działanie TNF-α oddziałuje z jednostką regulatorową PI3K (p85α), co zwiększa aktywność szlaku PI3K/AKT oraz przyczynia się do przeżycia i rozwoju komórek nowotworowych. Ponieważ szlak sygnalizacyjny PI3K/AKT odgrywa istotną rolę w przeżyciu i proliferacji komórek nowotworowych, są prowadzone intensywne badania nad inhibitorami, które mogłyby znaleźć zastosowanie w terapii antynowotworowej. Jednak strategie terapeutyczne wykorzystujące inhibitory szlaku PI3K/AKT są związane z licznymi działaniami niepożądanymi, charakteryzują się dużą toksycznością i brakiem selektywności. Stąd związki hamujące działanie tRXRα mogą się okazać lepszymi celami terapii ze względu na specyficzność i selektywność względem danego typu nowotworu. Wykazano również, że związanie liganda przez tRXRα może wpływać na szlak zewnątrzpochodny apoptozy komórki nowotworowej [112]. Wiązanie niesteroidowego leku przeciwzapalnego (NSAID, nonsteroidal antiinflammatory drug), sulindaku oraz jego analogów z tRXRα prowadziło do aktywacji kaspazy 8 i apoptozy. Przypuszcza się, że aktywacja apoptozy przez NSAIDs jest związana z hamowaniem szlaku PI3K/AKT promującego przeżycie komórek nowotworowych; sulindak i jego analogi hamowały wiązanie tRXRα z p85α (PI3K).
RXR jest unikalnym członkiem nadrodziny NRs, a ze względu na wielość funkcji stanowi bardzo dobry cel wielu terapii. Jednak mechanizmy działania, za pomocą których RXR wpływa na metabolizm, układ nerwowy czy rozwój nowotworów, są bardzo złożone i niedokładnie poznane, co utrudnia wykorzystanie potencjału terapeutycznego RXR.
Jeśli w artykule mowa jest o białku pochodzącym z organizmu konkretnego gatunku, skrót nazwy białka poprzedzono pierwszą literą łacińskiej nazwy rodzajowej właściwego organizmu: