: What do We Know about the Most Enigmatic Pathogen of the 21 Century?

Zakażenia grzybicze stanowią narastający problem współczesnej medycyny [34]. Mimo, iż drobnoustroje należące do rodzaju Candida stanowią ważny składnik ludzkiego mykobiomu, kolonizując powierzchnię skóry i błon śluzowych, m.in., układu oddechowego, pokarmowego i moczowego, są one jednocześnie wiodącymi patogenami związanymi z zakażeniami szpitalnymi o etiologii grzybiczej, i czwartą, co do częstości występowania, przyczyną wszystkich zakażeń związanych ze środowiskiem szpitalnym [2, 34]. Zmianie z komensalnego do inwazyjnego trybu życia tych drobnoustrojów sprzyja przede wszystkim osłabienie sprawności układu immunologicznego organizmu gospodarza [2, 94].

Kliniczne objawy zakażeń drożdżakami z rodzaju Candida są różnorodne i mogą przyjmować zarówno postać zakażeń powierzchniowych, obejmujących skórę i błony śluzowe, jak i inwazyjnych, przebiegających pod postacią zakażeń narządowych i kandydemii [2, 34]. W skali globalnej, rocznie raportowanych jest około 400 000 przypadków kandydemii, wywoływanych przez ten rodzaj grzybów, zaś śmiertelność związana z ich przebiegiem przekracza 40% [34].

Coraz częstsze występowanie zakażeń wywoływanych przez Candida spp. można wiązać ze stosowaniem szerokozakresowych antybiotyków, wykonywaniem inwazyjnych procedur medycznych oraz z rosnącą populacją osób znajdujących się w stanie immunosupresji i krytycznie chorych, w przypadku których, zakażenia o etiologii Candida spp. stanowią główną przyczynę zachorowalności i śmiertelności [27].

Co więcej, inwazyjne zakażenia grzybicze, w tym zakażenia wywoływane przez drożdżaki z rodzaju Candida, stanowią obecnie jedno z kluczowych powikłań COVID-19 u pacjentów hospitalizowanych. Pomimo zaburzeń immunologicznych notowanych w przebiegu COVID-19, nie stwierdzano znaczących defektów w funkcjonowaniu komórek immunologicznie czynnych, takich jak neutrofile i monocyty/makrofagi, odgrywających kluczową rolą w przebiegu odpowiedzi immunologicznej wobec Candida spp. [2]. Uznano, że do istotnych czynników ryzyka związanych z tymi zakażeniami należą: długotrwała (> 7 dni) hospitalizacja na oddziale intensywnej terapii (OIT), mechaniczna wentylacja (sprzyja kolonizacji dróg oddechowych przez grzyby), monitorowanie hemodynamiczne, stosowanie centralnych wkłuć dożylnych, wcześniejsza antybiotykoterapia, stosowanie kortykosteroidów [2, 52, 59, 77, 78, 93]. Nierozwiązaną pozostaje kwestia, czy nadkażenie Candida spp. w przebiegu COVID-19 skutkuje większą śmiertelnością, czy pozostaje ono jedynie wyznacznikiem ciężkiego przebiegu zakażenia wirusowego, co czyni koniecznym kontynuowanibadań epidemiologicznych, by ocenić znaczenie inwazyjnej kandydozy u pacjentów zakażonych koronawirusem [2].

Mimo, iż C. albicans pozostaje wiodącym gatunkiem z rodzaju Candida odpowiedzialnym za zakażenia, notowane jest także rosnące kliniczne znaczenie gatunków określanych jako non-albicans Candida, w tym C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis i C. krusei. Uważa się, że jest to w dużej mierze spowodowane profilaktycznym stosowaniem leków przeciwgrzybiczych u pacjentów wysokiego ryzyka. Gatunki Candida non-albicans mają potencjał do wywoływania zakażeń inwazyjnych, w tym kandydemii. Są one również nierzadko przyczyną niepowodzeń terapeutycznych, wynikających z naturalnej oporności na leki przeciwgrzybicze i/lub szybko nabywanej antybiotykooporności. Szczególnie niepokojący jest stwierdzony w ostatnich latach trend rosnącej oporności na flukonazol wśród szczepów C. parapsilosis i C. tropicalis [2, 27].

Etiologia zakażeń wywoływanych przez Candida spp. uległa zmianie w 2009 roku, kiedy po raz pierwszy opisano w piśmiennictwie medycznym nowy gatunek – Candida auris. Jego znaczenie kliniczne systematycznie wzrasta w ostatnich latach, czego dowodem jest uznanie C. auris za jedno z największych zagrożeń dla zdrowia publicznego [33].

Przypadki inwazyjnych zakażeń C. auris o charakterze ognisk epidemicznych i wysokiej śmiertelności, notowane u pacjentów z COVID-19 leczonych na OIT, dodatkowo wzbudzają uzasadniony niepokój [24, 31, 70, 51, 75, 77, 93]. Oprócz wymienionych wyżej czynników ryzyka predysponujących do nadkażeń grzybiczych w tej grupie chorych, Prestel i wsp. [75] zwrócili uwagę na używanie przez personel medyczny, zwłaszcza w pierwszym okresie pandemii COVID-19, wielu warstw środków ochrony osobistej oraz noszenie ich przez całą zmianę (rękawiczki, fartuchy, okulary ochronne, maseczki ochronne N95, czepki, ochraniacze na buty), niewłaściwe mycie i dezynfekcję sprzętu medycznego oraz uchybienia w przestrzeganiu obowiązujących procedur dotyczących higieny rąk.

C. auris, ze względu na zdolność do przeżycia na powierzchniach nieożywionych i kontaminacji środowiska szpitalnego oraz, co odróżnia ten gatunek od innych grzybów – wysoki potencjał j transmisji w środowisku i horyzontalnej (pomiędzy pacjentami) [52] – może z łatwością rozprzestrzeniać się w tych warunkach [75]. Efektywna transmisja tego drożdżaka pomiędzy ludźmi pozostaje wyjątkowa w porównaniu z innymi przedstawicielami rodzaju Candida. Kandydoza jest zazwyczaj wywoływana przez gatunki stanowiące w warunkach fizjologicznych składnik ludzkiego mikrobiomu, a częstym źródłem zakażenia jest przewód pokarmowy. C. auris nie jest jednak w stanie efektywnie kolonizować układu pokarmowego, czego prawdopodobnym wytłumaczeniem jest słaby wzrost tego gatunku w warunkach beztlenowych w jelicie grubym [73]. Co więcej, jest to też jedyny poznany dotychczas gatunek grzyba, mogący wykazywać naturalną oporność na trzy główne grupy leków przeciwgrzybiczych stosowane w praktyce klinicznej: azole, polieny oraz na echinokandyny [45]. Analiza profilów antybiotykowrażliwości izolatów C. auris pochodzących z różnych części świata wykazała, że niemal w 40% są to szczepy wieloantybiotykooporne (ang. multidrug resistant MDR), w tym szczególnie często stwierdzana jest oporność na flukonazol (90%) i amfoterycynę B (30–40%). Dodatkowo, szczepy oporne na flukonazol, często wykazują wysokie wartości MIC (ang. minimal inhibitory concentration) dla worikonazolu i innych azoli nowej generacji, co przemawia za brakiem skuteczności tej grupy leków. Oporność na echinokandyny wykazuje 5–10% izolatów C. auris [1, 28]. Zdarzają się także szczepy oporne na wszystkie dostępne obecnie leki przeciwgrzybicze, co sprawia, że śmiertelność w przebiegu zakażeń wywołanych przez C. auris sięga nawet 60% [95].

Podsumowując, najważniejsze aspekty dotyczące zagrożeń związanych z C. auris dotyczą [1, 27, 28]:

szybkiego rozprzestrzeniania się szczepów tego gatunku w skali globalnej,

wysokiego potencjału epidemicznego i zdolności utrzymywania się w środowisku szpitalnym, którą umożliwia, m.in., oporność na środki dezynfekcyjne (np. czwartorzędowe związki amoniowe i aktywne względem powierzchni związki kationowe),

transmisja horyzontalna,

kontaminacja i długotrwałe (do 2 tygodni) utrzymywanie się na powierzchniach nieożywionych

możliwa długotrwała (nawet > 1 roku) kolonizacja pacjenta,

zdolność do wywoływania zakażeń inwazyjnych (np. fungemia)

trudności związane z laboratoryjną identyfikacją opartą na reakcjach biochemicznych

wieloantybiotykooporność,

konieczność wdrażania restrykcyjnych i kosztownych strategii kontroli i prewencji zakażeń w przypadku izolacji C. auris.

Candida auris – charakterystyka gatunku

C. auris należy do gromady Ascomycota i klasy Saccharomycetes. Genom gatunku jest haploidalny. Genetyczna analiza porównawcza wykazała pokrewieństwo pomiędzy C. auris, a kladem C. haemulonii, obejmującym gatunki o sporadycznie stwierdzanym znaczeniu klinicznym i częstej wieloantybiotykooporności. Identyczność nukleotydowa osiąga poziom 88% pomiędzy genomem C. auris, a genomami drożdżaków należących do wymienionego kladu i reprezentujących gatunki: C. haemulonii, C. duobushaemulonii i C. pseudohaemulonii [72]. Kladem spokrewnionym z powyższą grupą gatunków jest C. lusitaniae. Genetyczne pokrewieństwo C. auris ze znacznie częściej izolowanymi od ludzi gatunkami, takimi jak C. albicans, C. glabrata jest dużo bardziej odległe [4, 72]. Niemniej jednak, C. auris, podobnie jak C. albicans, jest gatunkiem zaliczanym do kladu CTG, w którym kodon CTG ulega translacji na serynę, a nie na leucynę [25]. W genomie C. auris wykryto ortologi genów obecnych w genomie C. albicans, których produkty determinują grzybiczą zdolność do adaptacji do organizmu gospodarza i inwazji, w tym oligopeptydowe białka transportujące, wydzielnicze proteazy, włączając enzymy SAP (ang. secreted aspartic proteases), transferazy mannozylowe, czy geny związane z tworzeniem biofilmu. Chattergee i wsp. [17] zidentyfikowali białka transportujące, stanowiące determinanty wieloantybiotykooporności poprzez ich rolę wyrzucie (ang. efflux) leków z komórek grzybiczych, a ich zwiększona ekspresja może tłumaczyć niską naturalną wrażliwość tego gatunku na leki przeciwgrzybicze. Białka te należą do rodzin ABC (ang. ATP binding cassette) i MFS (ang. major facilitator superfamily). Punkty uchwytu dla poszczególnych grup leków przeciwgrzybiczych są konserwatywne u C. auris, włączając demetylazę 14alfa lanosterolu/ERG11 (miejsce uchwytu azoli), syntazę beta-1,3-glukanu/FKS1 (miejsce uchwytu echinokandyn), transferazę fosforybozylo-uracylu/FUR1 (miejsce uchwytu flucytozyny). Mutacje punktowe związane z antybiotykoopornością u innych gatunków Candida spp. wykrywane są w wielu klinicznych izolatach C. auris i związane są z genetycznymi kladami. Niedawno zidentyfikowano mutacje w genie ERG11 (Y132F i K143R) C. auris, które prowadzą do zwiększonej oporności na flukonazol [72]. Analiza porównawcza genomów reprezentujących cztery klady C. auris oraz trzech spokrewnionych gatunków należących do kladu C. haemulonii, mapowanie wewnątrz- i międzygatunkowych rearanżacji genetycznych w obrębie 7 chromosomów, wykazały, m.in., rozszerzony zakres białek transportujących i lipaz, mogących mieć związek z wirulencją C. auris oraz mutacje i obecność wariantów z różną liczbą kopii genu ERG11. Analiza ekspresji genów pozwoliła na identyfikację transporterów i metabolicznych regulatorów specyficznych dla C. auris oraz konserwatywnych w odniesieniu do spokrewnionych gatunków, co może z kolei mieć związek z różnicami dotyczącymi odpowiedzi na leczenie przeciwgrzybicze w obrębie tego kladu [72].

2.1.

Epidemiologia Candida auris

Gatunek C. auris (łac. auris – ucho) został po raz pierwszy wyizolowany w Japonii, z wydzieliny kanału ucha zewnętrznego w przebiegu stanu zapalnego u 70-letniej pacjentki hospitalizowanej w tokijskim szpitalu [84].

Kolejne publikacje związane z opisem zakażeń wywo-łanych przez C. auris dotyczyły przypadków zapalenia ucha środkowego w Korei [60] oraz szpitalnej kandydemii w Korei Południowej [66], Indiach [16, 20, 22], południowej Afryce [71], Kuwejcie [35] i Wenezueli [14]. Pierwsze ognisko epidemiczne C. auris w Europie pojawiło się w 2015 roku w londyńskim szpitalu kardiochirurgicznym [86], wkrótce potem w szpitalu w Hiszpanii [44]. Ogniska epidemiczne wywołane przez C. auris i opisane dotychczas w piśmiennictwie zostały zebrane i wymienione w pracy przeglądowej autorstwa Desaubeuaux i wsp. [33] z 2022 roku. Warto przy tym zaznaczyć, że jedynie w Portugalii, Irlandii oraz krajach skandynawskich (z wyjątkiem Norwegii) spośród krajów zachodnioeuropejskich nie pojawiły się dotychczas informacje na temat izolacji C. auris. Krajem o największej jak dotąd liczbie potwierdzonych lub prawdopodobnych przypadków zakażeń (n = 1157) i kolonizacji (n => 3043) C. auris pozostają Stany Zjednoczone [33].

Rycina 1 przedstawia dane opublikowane przez amerykańskie Centrum ds. Kontroli i Zapobiegania Chorobom (ang. Center for Disease Control and Prevention, CDC) na temat występowania C. auris na świecie (aktualne na dzień 15 lutego 2022 r.). Od tej daty mapa nie jest aktualizowana, ze względu na ogromne rozpowszechnienie występowania tego drobnoustroju [https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/tracking-c-auris.html].

Występowanie C. auris na świecie (oznaczone kolorem niebieskim)

Źródło: CDC [https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/tracking-c-auris.html] sprawdzone: 27.09.2022.

W raporcie CDC z 2019 roku, gatunek C. auris został zaliczony do największych zagrożeń związanych z antybiotykoopornością drobnoustrojów wraz z pałeczkami Enterobacterales i Acinetobacter baumannii opornymi na karbapenemy, Clostridioides difficile i Neisseria gonorrhoeae. C. auris przewyższa w tym względzie tak istotne klinicznie patogeny, jak pałeczki Enterobacterales wytwarzające beta-laktamazy typu ESBL (ang. extended spectrum beta-lactamases), metycylinooporne szczepy Staphylococcus aureus (ang. methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA), czy wieloantybiotykooporne szczepy Pseudomonas aeruginosa [https://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/threats-report/2019-ar-threats-report-508.pdf].

Początkowe trudności związane z identyfikacją C. auris zainspirowały badaczy do wykonania badań retrospektywnych wśród dostępnych kolekcji szczepów grzybiczych. Re-analiza ponad 20 000 izolowanych z zakażeń inwazyjnych szczepów Candida spp. pochodzących z czterech kontynentów i wyizolowanych w latach 1997–2016 (badanie SENTRY), pozwoliła na identyfikację zaledwie 6 szczepów C. auris, z najwcześniejszą izolacją w 2009 roku [74]. Najstarszy znany izolat C. auris pochodzi z 1996 roku. Był on czynnikiem etiologicznym kandydemii u pacjenta pediatrycznego w Korei Południowej [66]. Dane te wskazują, że coraz częstsze wykrywanie C. auris w środowisku szpitalnym ma najprawdopodobniej związek z jego niedawnym pojawieniem się w populacji, nie wynika zaś bezpośrednio z usprawnienia postępowania diagnostycznego i identyfikacji laboratoryjnej [https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-candida-auris-outbreak-healthcare-facilities-northern-italy].

Pochodzenie C. auris oraz ustalenie niszy ekologicznej, z której się wywodzi, nadal pozostaje niewyjaśnione. Wyniki sekwencjonowania genomów izolatów wyhodowanych od 54 zakażonych pacjentów z Pakistanu, Indii, południowej Afryki, Wenezueli i Japonii na przełomie lat 2012–2015, wskazują na niemalże równoczesne i niezależne pojawienie się odmiennych klonalnych populacji tego drożdżaka na trzech kontynentach. Fakt, że izolaty pochodzące z południowej, wschodniej Azji, południowej Ameryki i południowej Afryki różniły się między sobą ogromną liczbą polimorfizmów pojedynczych nukleotydów, wykazując jednocześnie minimalną genetyczną różnorodność w obrębie danego regionu geograficznego, czyni powyższą hipotezę wysoce prawdopodobną. Mimo, że przyczyny tego zjawiska pozostają niejasne, pojawienie się nowej lub rosnącej presji selekcyjnej obecnej w środowisku, w organizmach ludzi lub zwierząt powinno być wzięte pod uwagę w sposób szczególny [68]. Udział czynników antropogeniczych, w tym stosowanie azoli w lecznictwie i rolnictwie należy do najczęściej sugerowanych przykładów powyższej presji selekcyjnej [23]. Pojawiają się opinie poddające w wątpliwość stosowanie leków azolowych jako bezpośredniego wytłumaczenia ekspansji tego drobnoustroju, biorąc pod uwagę jego nagłe pojawienie się w różnych częściach świata. Casadevall i wsp. [15] zaproponowali tezę, łączącą globalne ocieplenie klimatu ze zdolnością niektórych grzybów, bytujących naturalnie w środowisku, do rozwoju termicznej tolerancji i adaptacji do temperatury ciała człowieka, ze względu na malejący gradient pomiędzy temperaturą otoczenia a średnią temperaturą ciała ssaków, możliwe związane z tym procesem (np. w wyniku wyższego poziomu promieniowania UV) mutacje genetyczne, czy nawet nabycie pewnych cech warunkujących wirulencję poprzez transfer DNA od innych patogennych dla ludzi gatunków Candida w kontekście zmieniających się nisz ekologicznych. Autorzy ci sugerują, że C. auris może być grzybem pochodzenia środowiskowego, w tym saprofitem roślin. O jego niedawno nabytej termotolerancji może świadczyć preferencyjna kolonizacja powierzchni skóry (nie zaś charakteryzującego się wyższą temperaturą światła jelita) oraz początkowo stwierdzany związek z zakażeniem ucha (którego temperatura jest niższa niż wewnątrz ciała). W procesie domniemanej adaptacji możliwy jest także udział gospodarza pośredniego – ptaków – biorąc pod uwagę zdolność C. auris do wzrostu w temperaturze 42°C. Ptaki mogą mieć udział w transmisji C. auris z ekosystemów środowiskowych do obszarów wiejskich, gdzie ludzie i ptaki pozostają w bliskim kontakcie, a następnie do miast, w tym do środowiska szpitalnego. Niedawna izolacja C. auris ze środowiska, obejmująca zarówno izolaty wrażliwe, jak i wieloantybiotykooporne na jednej z plaż na wyspach Andaman (Indie), stanowi pierwsze naukowe potwierdzenie istnienia środowiskowej niszy (morski ekosystem) dla tego gatunku, będąc jednocześnie wsparciem dla wspomnianej wyżej hipotezy, łączącej proces globalnego ocieplenia z pojawieniem się tego drobnoustroju w ludzkiej populacji [4].

Do tej pory zidentyfikowano 5 genetycznie odmiennych kladów C. auris, [19, 33]. Cztery z nich (klad I–IV) są ze sobą w dużym stopniu spokrewnione genetycznie (98,7% średniej identyczności par nukleotydów) [72]:

klad I, południowo-azjatycki, obejmujący szczepy wykryte w Indiach i Pakistanie,

klad II, wschodnio-azjatycki, obejmujący szczepy wykryte w Japonii i Korei

klad III, południowo-afrykański, obejmujący szczepy wykryte w południowej Afryce,

klad IV, południowo-amerykański, obejmujący szczepy wykryte w Kolumbii i Wenezueli,

klad V, wykryty w 2019 roku w Iranie, u 14-letniej pacjentki z otomykozą, która nigdy nie podróżowała za granicę; szczep różnił się od pozostałych kladów > 200 000 polimorfizmów pojedynczych nukleotydów [18].

W niektórych krajach (m.in., w Kanadzie, Kenii, Stanach Zjednoczonych, Niemczech, Wielkiej Brytanii) zidentyfikowano izolaty należące do różnych kladów, co wskazuje na filogeograficzne ich „wymieszanie się”, wynikające z przemieszczania się ludzi, w tym osób mających wcześniejszy kontakt z ośrodkami leczniczymi [11, 19, 49]. Wszystkie klady, z wyjątkiem II, łączono już z ogniskami epidemicznymi zakażeń inwazyjnych. Klad II wydaje się wykazywać tendencję do wywoływania zakażeń ucha [19].

Chow i wsp. [19] wysunęli tezę o globalnym kontekście filogeografii C. auris, struktury populacyjnej i mechanizmów związanych z opornością tego drożdżaka na leki przeciwgrzybicze. Ustalono, że pochodzenie każdego z czterech analizowanych (lata 2004–2018) kladów C. auris nie przekracza ostatnich 360 lat, zaś epidemiczne grupy szczepów należące do kladów I, III i IV pojawiły się najprawdopodobniej 36–38 lat temu. Informacja ta zbiega się w czasie (lata 80. XX wieku) z rozpoczęciem stosowania azoli w lecznictwie, rolnictwie (fungicydy, które mogą ulegać akumulacji w glebie) oraz początkiem epidemii AIDS, która doprowadziła do zwiększonego stosowania leków przeciwgrzybiczych w przebiegu towarzyszących rozwojowi AIDS nadkażeń grzybiczych.

2.2.

Wirulencja Candida auris

Rozwój zakażenia grzybiczego uwarunkowany jest zarówno charakterystycznym dla danego szczepu potencjałem patogennym związanym z wytwarzaniem czynników wirulencji, jak i zdolnością organizmu gospodarza do kontroli nad wzrostem potencjalnego patogenu [102].

C. auris wykazuje szereg przystosowań warunkujących adaptację zarówno do nisz środowiskowych, jak i obecnych w organizmie gospodarza, co wpływa jednocześnie na potencjał patogenny tego gatunku. Przeprowadzone do tej pory badania nad wirulencją C. auris obejmowały różne modele, począwszy od badań prowadzonych w warunkach in vitro, przez wykorzystanie zwierząt doświadczalnych (in vivo), w tym myszy, nicieni (Caenorhabditis elegans), owadów (Galleria mellonella, Drosophila melongaster) i ryb (Danio rerio), po doświadczenia przeprowadzane w warunkach ex vivo (modele ustne, skórne). Wyniki tych badań nierzadko różnią się w zależności od zastosowanego modelu, wskazują także na różnice dotyczące wirulencji w kontekście badanego szczepu, co sprawia, że wiele aspektów związanych z wirulencją tego drożdżaka nadal oczekuje na naukowe wyjaśnienie [33, 45].

2.2.1.

Zmienność morfologiczna

Plastyczność morfologiczna postrzegana jest jako jeden z kluczowych determinantów warunkujących szybką adaptację do zmieniających się warunków środowiskowych i wpływających na zwiększenie wirulencji patogenów grzybiczych.

Początkowo uważano, że gatunek C. auris jest niezdolny do wzrostu w postaci grzybni prawdziwej/pseudogrzybni, który jest kluczowy dla inwazji tkanek gospodarza [34, 101]. Yue i wsp. [101] dowiedli istnienia trzech typów komórek wytwarzanych przez C. auris: typowych form drożdżakowych (ang. yeast cells, YC), komórek drożdżakowych zdolnych do filamentacji (ang. filamentation-competent yeast cells, FCYC) oraz form filamentacyjnych/nitkowatych (ang. filamentous, F), co stanowi przykład, tzw. przełączania fenotypowego (ang. phenotype switching). Dziedziczony proces przełączania zachodzi na drodze YC-F; nie dziedziczony i uzależniony od uwarunkowań środowiskowych pozostaje proces przełączania z formy FCYC na F. Co więcej, przełączanie pomiędzy formą YC a fenotypem F zachodzi podczas zakażenia układowego, w wyniku pasażu przez organizm myszy, zaś zmiana z formy FCYC na F zachodzi pod wpływem zmian temperatury. Niska temperatura promuje fenotyp F, zaś wysoka – FCYC. Fenotyp F przechodzi w fenotyp FCYC w temperaturze odpowiadającej fizjologicznej ciepłocie organizmu gospodarza (37°C) i w warunkach in vivo, co odróżnia C. auris od C. albicans (której filamentacja jest indukowana pod wpływem wysokiej temperatury), przy czym komórki FCYC utrzymują zdolność do filamentacji. Kolonizacja powierzchni skóry, typowa dla C. auris, może sprzyjać powstawaniu form F, które jednocześnie wydzielają mniejsze ilości proteaz aspartylowych SAP, przez co mogą one uczestniczyć w ustaleniu komensalnej interakcji z organizmem gospodarza. Ponadto, zdolność do tworzenia pseudogrzybni przez C. auris zaobserwowano w wyniku ekspozycji na działanie 10% NaCl, co sugeruje możliwość zachodzenia procesu filamentacji pod wpływem bliżej nieznanych czynników środowiskowych. Analiza porównawcza profilu transkrypcyjnego form YC i F wykazała zwiększoną ekspresję genów związanych z filamentacją w fenotypie F, zróżnicowaną ekspresję genów warunkujących skład ściany komórkowej lub związanych z powierzchnią komórek oraz – co okazało się szczególnie istotne – odmienny poziom aktywności genów związanych z metabolizmem. Fenotyp F wykazywał zmniejszoną ekspresję genów uczestniczących w cyklu Krebsa i glikolizie, zwiększona zaś była ekspresja genów uczestniczących w metabolizmie kwasów tłuszczowych.

Borman i wsp. [10] zaobserwowali występowanie tzw. form agregujących i nie-agregujących C. auris w warunkach in vitro i badali patogenność tego drożdżaka z wykorzystaniem modelu Galleria mellonella. Formy agregujące (powstałe w wyniku tego, że komórki potomne nie oddzieliły się od siebie po procesie pączkowania) charakteryzowały się mniejszą wirulencją, zaś formy nie-agregujące dorównywały zjadliwością C. albicans. Podobne wyniki, związane z większą wirulencją form nie-agregujących przy wykorzystaniu analogicznego modelu in vivo, zostały uzyskane przez innych badaczy [46, 47, 90], przy czym Garcia-Bustos i wsp. [47] wykazali mniejszą niż C. albicans, ale większą niż C. parapsilosis, wirulencję szczepów C. auris. Autorzy ci stwierdzili także zdolność C. auris do filamentacji w zastosowanym modelu zakażenia in vivo, przy czym obie formy morfologiczne drożdżaka wykazywały różny stopień tworzenia pseudogrzybni, którą można traktować jako determinant patogenności zależny od szczepu. Histologicznie, zdolności inwazyjne C. auris i C. albicans były podobne, z efektywnym rozprzestrzenianiem się zarówno form drożdżakowych jak i filamentacyjnych, począwszy od wczesnych etapów zakażenia, z wyjątkiem silnego tropizmu C. auris do dróg oddechowych [47]. Garcia-Bustos i wsp. [46] stwierdzili, że zdolność filamentacji niekoniecznie jest głównym determinantem patogenności C. auris, biorąc pod uwagę fakt, że mniej wirulentne formy agregujące wykazują silniejszą zdolność do tworzenia pseudogrzybni. Mniejszą wirulencję form agregujących C. auris można łączyć z ich słabszą zdolnością do rozprzestrzeniania się w organizmie gospodarza [10]. Odmienne wyniki opublikowali Wurster i wsp. [100], stwierdzając brak korelacji pomiędzy zdolnością C. auris do agregacji a wirulencją w zastosowanym modelu zakażenia Drosophila melongaster, przy czym izolaty C. auris doprowadziły do wyższej śmiertelności wśród zakażonych owadów niż C. albicans.

Stwierdzono zdolność form nie-agregujących do tworzenia biofilmu [47, 90]. Brown i wsp. [12] poddali badaniu agregujące i nie-agregujące izolaty C. auris w kontekście ich zdolności do tworzenia biofilmu i stwierdzili wysoki poziom heterogenności wśród analizowanych fenotypów. Niezależnie od zdolności tworzenia biofilmu, zidentyfikowano unikalne transkrypcyjne profile obu fenotypów podczas tworzenia biofilmu z komórek plaktonicznych. W przypadku biofilmu tworzonego przez agregujący izolat stwierdzono zwiększenie ekspresji genów kodujących komponenty ściany i błony komórkowej, w tym białkek biorących udział w adhezji do powierzchni nieożywionych i komórek gospodarza oraz inwazji i przeżyciu patogenu (na przykładzie innych gatunków grzybów). Proces agregacji wpływa zatem na transkryptom grzybów podczas tworzenia biofilmu. Ponadto, oba fenotypy wywołały minimalną odpowiedź w przebiegu modelu zakażenia tkanki nabłonkowej w warunkach in vitro. W przypadku rany, obie formy doprowadziły do indukcji silniejszej odpowiedzi, przy czym fenotyp agregujący wykazał silniejsze właściwości prozapalne.

Stwierdzono że tworzenie agregatów przez C. auris jest indukowane działaniem leków przeciwgrzybiczych, w tym triazoli i echinokandyn. Ta forma fenotypowa charakteryzuje się też lepszą zdolnością przetrwania w porównaniu z pojedynczymi komórkami C. auris [91]. Sugeruje się, że trudno ulegające dyspersji agregaty komórek C. auris podlegają osłabionej penetracji przez środki dezynfekcyjne, promieniowanie UV, co może przyczyniać się do utrzymywania się grzyba w środowisku szpitalnym [27]. Short i wsp. [91] stwierdzili, że zdolność do agregacji komórkowej zwiększa zdolność przeżycia C. auris, co łączy się także ze zwiększoną ekspresją genów związanych z tworzeniem biofilmu. Ponadto,stwierdzono zdolność form agregujących do przeżycia przez co najmniej dwa tygodnie po poddaniu ich działaniu klinicznych stężeń NaOCl [91].

Fan i wsp. [38] wykazali fenotypowe zróżnicowanie wśród klinicznych izolatów C. auris reprezentujących cztery różne genetyczne klady. Dotyczyło ono zarówno morfologii komórek (obecne formy drożdżakowe, filamentacyjne, agregujące, wydłużone), jak i kolonii na podłożu hodowlanym, skłaniając autorów do wysnucia wniosku o powszechnym występowaniu morfologicznej plastyczności u reprezentantów tego gatunku. Co więcej, zmiany morfologiczne nie były uzależnione od indukcji przez organizm gospodarza (pasażowanie w organizmie myszy), występowała ona także w hodowli in vitro. Badania z wykorzystaniem modelu Galleria mellonella wykazały większą zjadliwość form filamentacyjnych i wydłużonych C. auris oraz rozbieżności dotyczące wartości MIC badanych leków przeciwgrzybiczych dla poszczególnych form fenotypowych tego gatunku. Podobne obserwacje, dotyczące tworzenia różnych morfologicznych fenotypów (komórki okrągłe, wydłużone, pseudogrzybnia) przez kliniczny szczep C. auris, w zależności od zastosowanych warunków hodowli, opisali Wang i wsp. [94]. Potwierdzili oni zdolność tworzenia pseudogrzybni drożdżaka w wyniku ekspozycji na wysokie stężenia NaCl, co może odzwierciedlać zaburzenia procesu podziału komórkowego w obecności czynników stresogennych. Autorzy wykazali znacznie mniejszą wirulencję C. auris w porównaniu z C. albicans, wykorzystując zarówno model uogólnionego zakażenia u immunokompetentnych myszy, jak i model Galleria mellonella [94]. Forgacs i wsp. [41] wykorzystali z kolei model kandydemii u neutropenicznych myszy, by ocenić wirulencję izolatów C. auris należących do czterech genetycznych kladów i w odniesieniu do C. albicans. Gatunek C. auris charakteryzował się mniejszą wirulencją niż C. albicans, niezależnie od kladu. Stwierdzono jednak różnice w wirulencji pomiędzy izolatami należącymi do tego samego kladu oraz zróżnicowaną wirulencję poszczególnych kladów – wskaźnik śmiertelności myszy oscylował bowiem między 44% (klad wschodnio-azjatycki) a 96% (klad południowoamerykański). Agregaty blastokinidiów i komórek pączkujących C. auris wykryto w sercu, nerkach i wątrobie zakażonych myszy, przy czym serce i nerki były najsilniej obciążonymi narządami, niezależnie od kladu, co korelowało ze śmiertelnością zwierząt.

Fakhim i wsp. [37] wykorzystali do badania potencjału patogennego C. auris model zakażenia uogólnionego immunokompetentnych myszy, porównując jednocześnie ten gatunek z C. haemulonii, C. glabrata i C. albicans. Wysoką wirulencją charakteryzował się gatunek C. albicans, a następnie C. auris, C. glabrata i C. haemulonii, przy czym potencjał patogenny badanych gatunków był porównywalny. Nerki, śledziona wątroba i płuca zakażonych zwierząt były najbardziej obciążone zakażeniem grzybiczym. Pseudogrzybnię stwierdzono w tkankach nerek myszy zakażonych C. albicans; w odniesieniu do pozostałych gatunków Candida wykazano obecność jedynie form drożdżakowych, co, według autorów, może tłumaczyć fakt częstej ich izolacji z hodowli krwi zakażonych pacjentów. Badania z wykorzystaniem myszy w immunosupresji wskazały na mniejszą wirulencję C. auris w porównaniu z C. albicans, ale większą niż C. haemulonii. Analiza histopatologiczna wykazała obecność agregatów komórek drożdżakowych C. auris w tkankach nerek myszy, podczas gdy inwazyjne formy nitkowate w obrębie tego narządu tworzyła C. albicans. Agregacja komórek może stanowić strategię pomocną w unikaniu działania układu immunologicznego gospodarza (np. ataku fagocytów) i przeżyciu w obrębie tkanek [6].

Unikanie przez C. auris działania układu immunologicznego gospodarza, w tym jego mechanizmów wrodzonej odporności, jawi się obecnie jako jedna z ważniejszych strategii tego drożdżaka, wpływających na jego potencjał patogenny. Wang i wsp. [95] porównali mechanizmy odporności naturalnej indukowane przez kliniczny szczep C. auris BJCA001 i C. albicans SC5314 w warunkach in vitro i in vivo, wskazując na słabsze właściwości immunostymulacyjne C. auris i łącząc różnice między dwoma gatunkami z cechami ich ściany komórkowej. Wykorzystując ludzkie neutrofile oraz model inwazyjnej kandydozy Danio rerio, Johnson i wsp. [56] stwierdzili brak zdolności neutrofili do zabijania C. auris. W przeciwieństwie do C. albicans, zakażeniu C. auris towarzyszy niewystarczająca rekrutacja tych komórek immunologicznie czynnych do ogniska zakażenia; nie powstają też, tzw. struktury NET (ang. neutrophil extracellular traps) – składające się z DNA, histonów i białek o aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Wykazano, że unikanie działania neutrofili przez C. auris jest związane z mannozylacją ściany komórkowej (modele ex vivo i Danio rerio), zaś genetyczne „wyłączenie” ścieżek mannozylacji zmniejsza zawartość mannanu w zewnętrznej warstwie ściany, powoduje odsłonięcie składników immunostymulujących, co skutkuje silniejszym zaangażowaniem neutrofili, fagocytozą i zabijaniem komórek grzyba. Mechanizm tej ucieczki immunologicznej wyróżnia C. auris na tle innych gatunków Candida [53]. Badania przeprowadzone przez Wang i wsp. [95] wskazują, że zewnętrzna warstwa mannanu maskuje wewnętrzną warstwę beta-glukanu, chroniąc ją przed ekspozycją i detekcją przez receptory komórek wro-dzonej odpowiedzi immunologicz-nej, takich jak makrofagi. Osłabiona aktywacja makrofagów prowadzi do kolonizacji i proliferacji C. auris poprzez unikanie eliminacji przez neutrofile. Zaburzenie ciągłości powłoki mannanowej umożliwia ekspozycję beta-glukanu, który ulega rozpoznaniu przez receptory makrofagów. Interakcja ta skutkuje aktywacją ścieżki sygnałowej MAPK, uwolnieniem prozapalnych cytokin i chemokin, a następnie aktywacją i napływem neutrofili, które eliminują komórki grzybicze. Na słabsze zdolności immunozapalne C. auris w porównaniu z C. albicans w przeprowadzonych badaniach in vivo wskazują: persystencja C. auris w organizmie gospodarza, unikanie rozpoznawania i eliminacji przez wrodzone mechanizmy odpornościowe, mniejsza liczba komórek immunologicznie czynnych (neutrofile, leukocyty, komórkiCD45+, makrofagi, monocyty, komórki NK) w zakażonych tkankach, niższe surowicze stężenia prozapalnych cytokin i chemokin.

Bruno i wsp. [13] uzyskali odmienne wyniki, wykazując, że C. auris jest silnym induktorem wrodzonych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej. Gatunek ten indukuje specyficzny transkryptom w ludzkich komórkach jednojądrzastych, silniejszą odpowiedź cytokinową w porównaniu z C. albicans, niemniej jednak cechuje go słabsza zdolność do wywoływania lizy makrofagów. Charakterystyczne dla C. auris mannoproteiny są w dużej mierze związane z indukcją mechanizmów naturalnej odporności przez rozpoznawanie receptorów lektynowych typu C. Bada-nia in vivo przy wykorzystaniu modelu uogólnio-nej kandydozy wykazały mniejszą wirulencję C. auris w porównaniu z C. albicans.

Wang i wsp. [95] tłumaczą rozbieżności w wynikach uzyskanych przez wspomniane dwie, niezależne grupy badawcze, m.in., rożnymi rodzajami użytych w eksperymentach komórek immunologicznie czynnych i szczepów C. auris, oraz innymi szczegółami metodologicznymi. Warto też zaznaczyć, że poszczególne szczepy C. auris mogą różnić się chemiczną strukturą mannanów obecnych w ścianie komórkowej, co może przekładać się na zróżnicowane interakcje z układem immunologicznym. Ponadto istnieją zapewne inne, jeszcze nieznane czynniki i mechanizmy immunologiczne uczestniczące w rozpoznawaniu C. auris jako patogenu.

Na silniejszą niż oczekiwano, przy umiarkowanym stopniu inwazji tkankowej, immunogenną aktywność C. auris, wskazują też wyniki badań opublikowane przez Garcia-Bustos i wsp. [46]. Gatunek ten wywoływał silniejszą odpowiedź zapalną niż C. albicans i C. parapsilosis, zwłaszcza wśród szczepów nie-agregujących, wykazywał szczególną zdolność do inwazji układu oddechowego larw G. mellonella oraz różnice dotyczące tropizmu tkankowego w zależności od szczepu.

Można zatem przyjąć, że heterogenność wirulencji stanowi wsparcie hipotezy sugerującej, że morfogenetyczna zmienność jest naturalną, wrodzoną cechą C. auris oraz wykładnikiem zdolności adaptacyjnych do różnych czynników stymulujących i warunków środowiskowych [47].

Jedno z najnowszych badań wskazuje na znaczące zwiększenie ekspresji białka PD-1 (ang. programmed cell death protein 1) na powierzchni limfocytów T oraz jego ligandu PD-L1 na makrofagach myszy zakażonych agregującym szczepem C. auris w porównaniu do niezakażonych myszy [99]. Białko PD-1 odgrywa znaczącą rolę w hamowaniu odpowiedzi immunologicznej poprzez modulację aktywności limofcytów T, aktywację apoptozy antygenowo-swoistych komórek T i hamowanie apoptozy regulatorowych komórek T. Przezbłonowe białko PD-L1 pełni ko-inhibitora odpowiedzi immunologicznej, a jego interakcja z PD-1 doprowadza do osłabienia proliferacji komórek PD-1-pozytywnych, hamowania wydzielania cytokin i indukcji apoptozy [50]. Indukcja PD-1/PD-L1 w przebiegu sepsy wywołanej przez C. auris może zatem promować supresyjny fenotyp immunologiczny (podobnie do wcześniejszych doniesień na temat kandydemii wywołanej przez C. albicans), a jej blokada mogłaby być brana pod uwagę jako potencjalna immunoterapeutyczna strategia walki z kandydozą wywołaną przez C. auris [99].

Zamith-Miranda i wsp. [102] zwrócili uwagę na zdolność C. auris do wydzielania zewnątrzkomórkowych pęcherzyków (ang. extracellular vesicles, EVs) i ich potencjalnego udziału w patogenezie zakażeń. Grzybicze EV zawierają wiele biologicznie aktywnych substancji, w tym czynników wirulencji oraz substancji regulatorowych, co wskazuje na ich udział w aktywacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej oraz wpływ na przebieg zakażenia grzybiczego. Molekularna analiza porównawcza EV wytwarzanych przez C. auris i C. albicans oraz badanie ich wpływu na modulowanie efektorowych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej wykazało, że EV uwalniane przez C. auris (w odróżnieniu od C. albicans) zwiększały adhezję drożdżaka do komórek nabłonkowych. Ponadto EV C. auris promowały przeżycie komórek grzybiczych, podczas gdy EV uwalniane przez C. albicans przygotowywały makrofagi do wewnątrzkomórkowego zabijania komórek drożdżakowych. EV wydzielane przez oba gatunki doprowadzały do aktywacji komórek dendrytycznych, wywodzących się ze szpiku kostnego. Można zatem zakładać, że EV C. auris wykazują właściwości immunoregulatorowe, czy czym niektóre z nich są odmienne od tych, które wykazuje C. albicans.

2.2.2.

Wytwarzanie enzymów litycznych

C. auris jest gatunkiem zdolnym do wytwarzania enzymów warunkujących procesy adaptacji i inwazji, takich jak fosfolipazy, lipazy, wydzielnicze proteazy aspartylowe SAP; wykazuje też aktywność hemolityczną [17, 64].

2.2.3.

Adaptacja do stresogennych warunków środowiskowych

Zdolność do wzrostu w wysokich temperaturach przekraczających 40°C i tolerancja wysokich (10%) stężeń NaCl odróżnia C. auris od pozostałych przedstawicieli tego rodzaju. Sugeruje się, że morfologiczna tranzycja grzyba poprzez tworzenie struktur przypominających pseudostrzępki w odpowiedzi na wysokie stężenia soli, może stanowić przykład adaptacji do stresogennych warunków. Wspomniane cechy mogą też sprzyjać przeżyciu i utrzymywaniu się tego drożdżaka na powierzchniach ożywionych (np. ludzka skóra) i nieożywionych [34].

Sugerowana jest rola różnych ścieżek sygnałowych w rozwoju oporności C. auris na warunki stresogenne. Jedną z nich jest ścieżka SAPK (ang. stress activated proteinase kinase signalling pathway), która odgrywa rolę w odpowiedzi na stres środowiskowy w postaci stresu osmotycznego, czy nadtlenku wodoru. Proponowany jest jej udział w tworzeniu agregatów komórek C. auris, jako potencjalnej strategii przetrwania. Inne ścieżki są zależne od białkowej fosfatazy kalcyneuryny, która wchodzi w interakcję z białkiem chaperonowym Hsp90. Białko Hsp90 ulega konsytutywnej nadekspresji, wykazuje różnorodne funkcje i jest zasadnicze dla wzrostu tego drożdżaka. Prawdopodobnie odgrywa ono znaczącą rolę w wirulencji, termicznej tolerancji, tolerancji na stres osmotyczny i w wieloantybiotykooporności. Jest ono, m.in., negatywnym regulatorem filamentacji C. auris, jego inaktywacja prowadzi do powstania wydłużonych form przypominających pseudogrzybnię, morfologicznie podobnych do tych, które są indukowane pod wpływem wysokiego zasolenia czy pasażu przez organizm ssaka. Jego zahamowanie prowadzi do zwiększonej wrażliwości na flukonazol, co wykazano na przykładzie izolatów C. auris nie mających powszechnych w obrębie tego gatunku mutacji w genie ERG11, które związane są z opornością na azole [58].

2.2.4.

Tworzenie biofilmu

Biofilm jest rodzajem ustrukturyzowanej „społeczności” drobnoustrojów, osadzonej w zewnątrzkomórkowej macierzy i utworzonej na powierzchni ożywionej lub nieożywionej. Struktura ta może tworzyć się na powierzchni ludzkich tkanek, błon śluzowych lub na powierzchni biomateriałów (np. cewników) i stanowić ognisko zakażenia, z którego drobnoustroje mogą dostawać się do innych miejsc [34]. Wykazano, że C. auris może tworzyć biofilm w warunkach in vitro, aczkolwiek jego biomasa wydaje się być słabsza niż biofilm tworzony przez C. albicans [90]. Co więcej, zdolność tworzenia biofilmu jest zależna od szczepu oraz typu morfologicznego/fenotypowego. Podobnie jak biofilm tworzony przez inne gatunki Candida, struktura ta stanowi ochronę przed działaniem antybiotyków i fagocytozą [72]. Sherry i wsp. [90] stwierdzili zróżnicowaną zdolność C. auris w zakresie adherencji do powierzchni polimerowych, tworzenia biofilmu i oporności na leki, które są aktywne względem komórek planktonicznych. Kaspofungina okazała się w dużym stopniu nieaktywna względem biofilmu C. auris. Oporność biofilmu tworzonego przez drożdżaki na leki przeciwgrzybicze może być wynikiem, m.in., osłabionej penetracji leku przez jego strukturę oraz być związana ze zwiększoną ekspresją genów związanych z biofilmem przy zwiększonej aktywności pomp wyrzutu czy enzymów modyfikujących strukturę glukanu [45].

Zdolność C. auris do tworzenia biofilmu stanowi jedno z kluczowych wyzwań w praktyce klinicznej w związku z powszechnym stosowaniem biomateriałów. Kolonizacja powierzchni u pacjentów poddawanych procedurom związanym z instrumentalizacją, zwiększa ryzyko rozwoju inwazyjnej kandydozy i szpitalnego ogniska epidemicznego, a także zmniejsza szansę eradykacji kolonizacji pacjenta. W konsekwencji, |inwazyjna kandydoza wywołana przez C. auris w wielu przypadkach jest związana ze stosowaniem biomateriałów i innych medycznych urządzeń, przyjmując klinicznie postaci, m.in., zakażeń układu moczowego u pacjentów cewnikowanych, zakażeń układu sercowo-naczyniowego, czy zakażeń w u pacjentów neurochirurgicznych [45].

Kean i wsp. [59] przeprowadzili transkryptomiczną analizę biofilmów C. auris, stwierdzając zwiększoną, co najmniej dwukrotnie, ekspresję 791 genów podczas tworzenia biofilmu (vs. 464 geny w komórkach planktonicznych). Wykazano zwiększoną, na wszystkich etapach powstawania biofilmu, ekspresję genów ściany komórkowej, biorących udział w adhezji (ang. adhe-sin-related glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored cell wall genes) oraz w biofilmach stadium pośredniego i dojrzałego, genów kodujących pompy wyrzutu należące do rodzin ABC i MFS. Zablokowanie aktywności tych pomp zwiększało wrażliwość mikroorganizmu na flukonazol 4-16-krotnie.

Biofilm tworzony przez C. auris charakteryzuje się zwiększoną (w porównaniu z komórkami planktonicznymi) tolerancję na działanie środków dezynfekcyjnych, w tym na klinicznie znaczące stężenia chlorheksydyny (0,5%, 2%) i nadtlenku wodoru (3%). W jednym z badań eradykację osiągnięto wyłącznie przy zastosowaniu powidonu jodu [57]. Sherry i wsp. [90] wykazali efektywność chlorheksydyny względem planktonicznych komórek C. auris oraz biofilmu, sugerując możliwe zastosowanie jej standardowych stężeń w dezynfekcji skóry i ran.

2.3.

Oporność Candida auris na leki przeciwgrzybicze

Jedną z najważniejszych cech C. auris determinujących znaczenie tego gatunku jako „superpatogenu”, stanowiącego jedno z największych zagrożeń dla zdrowia publicznego w XXI wieku, jest jego częsta wieloantybiotykooporność, w tym również oporność na wszystkie grupy chemiczne leków przeciwgrzybiczych, dostępne obecnie w praktyce klinicznej. Zjawisko to znacząco ogranicza możliwość skutecznego leczenia zakażeń [45].

Gatunek C. auris zdołał wykształcić szeroki zakres mechanizmów oporności na leki, które obejmują: zmianę miejsca docelowego (mutacje) lub jego nadekspresję, zmianę przepuszczalności osłon komórkowych lub aktywny wyrzut leku z komórki, aktywację ścieżek komórkowych warunkujących odpowiedź na warunki stresogenne i tworzenie biofilmu.

Szczepy C. auris są filogenetycznie spokrewnione z gatunkami C. krusei, C. lusitaniae, C. haemulonii, które charakteryzują się naturalną lub nabytą opornością na flukonazol i/lub amfoterycynę B [68]. Jak przedstawiono wyżej, odsetek szczepów C. auris opornych na flukonazol, amfoterycynę B i echinokandyny przekracza odpowiednio 90%, 30% i 5% [17, 36]. Według Chow i wsp. [19] klad I wykazywał największy odsetek szczepów MDR (45%, oporność na dwie grupy leków przeciwgrzybiczych), jako jedyny obejmował też szczepy o rozszerzonej wieloantybiotykooporności (oporność na trzy grupy leków, 3%). Klad II wykazywał największy odsetek szczepów wrażliwych (86%).

Niemalże wszystkie szczepy C. auris wykazują oporność in vitro na flukonazol, przy czym niektóre szczepy wykazują podwyższone wartości MIC w stosunku do innych leków należących do grupy azoli, przewyższając wartości MIC raportowane dla C. albicans czy C. glabrata [33]. Oporność C. auris na azole, które hamują biosyntezę ergosterolu – głównego składnika grzybiczej błony komórkowej – uwarunkowana jest mutacjami w obrębie genu ERG11, kodującego 14-alfa-demetylazę lanosterolu, enzymu, który bierze udział w demetylacji lanosterolu, będącego prekursorem ergosterolu. Są to substytucje aminokwasowe typu: Y132F, K143R, F144, F126T i VF125AL (znana także jako F126L), których obecność stwierdzana jest wśród szczepów C. auris należących do różnych genetycznych kładów [33, 68, 82]. Raportowano także szczepy C. auris wrażliwe na flukonazol (MIC = 1–8 mg/l), u których obecne były mutacje typu Y132F lub K143R, co sugeruje istnienie dodatkowych mechanizmów warunkujących oporność [21, 68, 81]. Należą do nich m.in., zwiększona ekspresja genu ERG11 wynikająca ze zwiększonej ilości czynników transkrypcyjnych ERG11 lub zwiększonej liczby kopii tego genu [7, 19, 72]. W obu tych przypadkach wysokie stężenie cząsteczki stanowiącej punkt uchwytu dla leku „rozcieńcza” końcowy efekt aktywności środka terapeutycznego [25]. Oporność na azole wynika też ze zwiększonej aktywności białek transportowych i pomp wyrzutu. Należą one do rodzin typu ABC i MFS, i odpowiadają im, odpowiednio, pompy typu CDR1 i MDR1. Są one jednocześnie ortologami białek transportujących leki zidentyfikowanych u C. albicans [7, 81, 82]. Stwierdzono, że pompy CDR1 and MDR1 ulegają silniejszej ekspresji w komórkach klinicznych szczepów C. auris opornych na leki triazolowe, a nadekspresja CDR1 znacząco przyczynia się do klinicznej oporności na tę grupę leków [81]. Zwiększona aktywność pomp wyrzutu typu ABC u C. auris w porównaniu z C. glabrata może stanowić mechanistyczną podstawę wytłumaczenia naturalnej oporności C. auris na leki azolowe [6].

Fan i wsp. [39] opisali kliniczny szczep C. auris (BJCA002) należący do kladu III (południowo-afry-kański) charakteryzujący się opornością na flukonazol i amfoterycynę B w oparciu o proponowane wartości graniczne i porównali jego właściwości genetyczne i biologiczne z wcześniej opisanym [94] szczepem BJCA001, charakteryzującym się wrażliwością na badane leki przeciwgrzybicze i należącym do kladu I (południowo-azjatycki). Stwierdzono mniejszą wirulencję opornego szczepu BJCA002 niż wrażliwego BJCA001 przy zastosowaniu dwóch typów modeli doświadczalnych: Galleria mellonella oraz zakażenia układowego u myszy BALB/c. Szczep BJCA002, w odróżnieniu od BJCA001, miał mutacje w genach związanych z antybiotykoopornością, w tym mutację typu hot-spot w genie ERG11 (VF125AL, tj. V125A i F126L) oraz mutacje w genach CDR1, MDR1, a także TAC1 i MMR1 (prawdopodobnie pełniących rolę transkrypcyjnych regulatorów genów CDR1 i MDR1) [39].

Wykazano, że C. auris może nabywać oporność na flukonazol poprzez adaptacyjny mechanizm związany z aneuploidalnością (atypową liczbą chromosomów). Bing i wsp. [8] stwierdzili, że w wyniku poddania szczepu C. auris BJCA001 presji selekcyjnej związanej z pasażowaniem na podłożu w obecności wzrastających stężeń leku, doszło do rozwoju oporności, przy czym część opornych szczepów posiadała dodatkową kopię chromosomu V. Ponadto wykazano, że obecne w obrębie tego chromosomu geny, ERG9 i OPT1/2, potencjalnie warunkujące oporność na flukonazol lub związane z biosyntezą ergosterolu, podlegały zwiększonej transkrypcji. Uzyskanie dodatkowego chromosomu może zatem mieć związek z rozwojem oporności C. auris na flukonazol. Przy braku presji selekcyjnej w postaci flukonazolu komórki grzybicze szybko odzyskiwały wrażliwość, tracąc jednocześnie dodatkową kopię chromosomu [8].

Leki polienowe, do których należy amfoterycyna B, działają poprzez wiązanie się z ergosterolem błon komórkowych grzybów, doprowadzając do powstania porów i uwolnienia do środowiska składników wewnątrzkomórkowych, takich jak cukry, jony potasu czy wapnia, co prowadzi do śmierci komórki [25]. Przypuszczalnie, oporność na tę grupę leków mogą determinować zmiany w ścieżce biosyntezy i w składzie steroli błonowych, mutacje w obrębie czynnika transkrypcyjnego FLO8 wpływającego na wirulencję i tworzenie biofilmu przez C. albicans oraz w genie kodującym białko transbłonowe [25, 36]. Stwierdzono także nadekspresję białek transportujących leki (wyrzut) w obecności amfoterycyny B [25, 27]. Rybak i wsp. [80] odkryli nową mutację w genie ERG6 C. auris kodującym metyltransferazę steroli, opisując przypadek kliniczny zakażenia, w przebiegu którego oporność na amfoterycynę B została nabyta przez ten szczep in vivo podczas leczenia. W szczepach C. auris mających wspomnianą mutację, wykryto zaburzenia biosyntezy ergosterolu.

Echinokandyny są lekami, których mechanizm działania polega na nie-kompetycyjnym hamowaniu syntezy glukanu, co doprowadza do zablokowania jego syntezy. Skutkiem tego jest osłabienie grzybiczej ściany komórkowej i zwiększenie jej wrażliwości na działanie stresu osmotycznego. Oporność na tę grupę leków związana jest przede wszystkim z mutacjami w genie FKS1, kodującym katalityczną podjednostkę syntazy 1,3-beta-glukanu (mutacje/substytucje: S639F, F635Y, F635L, S639P, S639Y, R1354S). Sugerowana jest pomocnicza rola zwiększonej transkrypcyjnej regulacji syntezy chityny oraz genów ściany komórkowej uczestniczących w odpowiedzi grzyba na obecność w środowisku czynników stresogennych w promowaniu oporności C. auris na echinokandyny [61, 89].

Flucytozyna jest analogiem nukleozydowym, który hamuje syntezę grzybiczych kwasów nukleinowych. Stosowana jest do leczenia inwazyjnych zakażeń wywołanych przez C. auris, zwłaszcza związanych z biomateriałami. Prolek ulega aktywacji przez uracyl-fosfory-bozylotransferazę, kodowaną przez gen FUR1. Jednym z udokumentowanych mechanizmów oporności C. auris jest substytucja typu F211I w genie FUR1 [45].

Oprócz uznanych mechanizmów warunkujących antybiotykooporność C. auris, istnieją dodatkowe czynniki wpływające na zmniejszoną efektywność prowadzonego leczenia. Wśród nich należy wymienić opisaną wcześniej zdolność C. auris do tworzenia biofilmu czy fenotypową plastyczność tego gatunku [45].

Kolonizacja a zakażenie

C. auris kolonizuje różne anatomiczne powierzchnie człowieka, wykazuje jednak szczególne powinowactwo do powierzchni skóry. Najczęściej szczepy tego gatunku są izolowane z okolic pach i pachwin, ale również z jamy ustnej, gardła oraz wysięków. Bywa też izolowany z moczu, jamy nosowej i zewnętrznego przewodu słuchowego. Z łatwością kolonizuje rany.

Kolonizacja powierzchni skóry skutkuje wytworzeniem przez drożdżaki złożonego biofilmu, zbudowanego z wielu warstw o wysokim stopniu adherencji i zdolności do proliferacji w niszach o zwiększonej wilgotności. Tworzenie biofilmów na powierzchni biomateriałów stosowanych w praktyce medycznej zwiększa ryzyko wieloogniskowej kolonizacji oraz jej długotrwałego utrzymywania się, co dramatycznie zmniejsza szansę eradykacji grzyba.

Kolonizacja pacjentów w środowisku szpitalnym przez C. auris zachodzi bardzo szybko, w ciągu kilku godzin po ekspozycji. Trwać może przez tygodnie, miesiące, a nawet lata, pomimo stosowania środków dezynfekcyjnych jak i leczniczych, takich jak chlorheksydyna, nystatyna, echinkandyny. Przewlekła kolonizacja może z kolei prowadzić do rozwoju kolejnych epizodów inwazyjnej kandydozy w ciągu kilku miesięcy, niezależnie od zastosowanej optymalnej leczenia przeciwgrzybiczej [45].

Różnicowanie pomiędzy kolonizacją a zakażeniem, podobnie jak w przypadku zakażeń wywoływanych przez inne grzyby z rodzaju Candida, powinno być oparte na obserwacji wystąpienia u pacjenta objawów klinicznych, wskazujących na proces infekcyjny, toczący się w miejscu, z którego C. auris została wyizolowana [27]. Należy przy tym podkreślić, że izolacja i identyfikacja C. auris z miejsc fizjologicznie niejałowych jest ważna, gdyż kolonizacja pacjenta niesie wysokie ryzyko transmisji tego drobnoustroju. Zdolność do długotrwałej kolonizacji, stwierdzanej nawet trzy miesiące po pierwszej identyfikacji, pomimo podjętego leczenia przeciwgrzybicznego i ujemnych wyników późniejszych badań przesiewowych, w dużym stopniu stanowi o potencjale epidemicznym C. auris [57, 76]. Pacjent skolonizowany C. auris stanowi źródło kontaminacji środowiska szpitalnego [oszacowano, że około milion komórek grzybiczych na godzinę ulega uwolnieniu z powierzchni skóry do środowiska], co sprawia, że staje się on rezerwuarem tego drobnoustroju i źródłem jego szpitalnej transmisji [76].

Stwierdzono pozytywną korelację między stopniem kolonizacji pacjenta przez C. auris, a kontaminacją środowiska w jego najbliższym sąsiedztwie [28, 87]. Kontaminacja łóżek szpitalnych, poręczy, klamek, parapetów okiennych, krzeseł, urządzeń pomiarowych wielokrotnego użytku (np. pulsykometrów, termometrów) wykrywana jest w przebiegu wielu szpitalnych ognisk epidemicznych i może mieć charakter długotrwały [28]. Ponadto, C. auris może zanieczyszczać ręce, rękawiczki i odzież personelu medycznego, będącego w bezpośrednim kontakcie ze skolonizowanym pacjentem, nie przestrzegającego zasad higieny rąk oraz prewencji zakażeń, co z kolei przyczynia się do transmisji drożdżaka na kolejnych pacjentów [76].

Tabela I przestawia najczęściej stwierdzane miejsca kolonizacji, inwazyjnych zakażeń wywoływanych przez C. auris oraz czynniki ryzyka rozwoju zakażeń u pacjentów skolonizowanych [27, 45, 76].

Tabela I

Najczęstsze miejsca kolonizacji i postaci inwazyjnych zakażeń wywoływanych przez C. auris oraz czynniki ryzyka dla rozwoju zakażenia u pacjentów skolonizowanych [na podstawie 45, 27, 76]

	Candida auris
Kolonizacja*	Zewnętrzny przewód słuchowy
	Jama nosowa
	Jama ustna, gardło
	Pachy
	Pachwiny
	Mocz
	Odbytnica, odbyt
	Inne: dłonie, skóra koniuszków palców, przestrzenie międzypalcowe stóp
Zakażenie	Zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych
	Stan zapalny tkanek oka
	Zapalenie ucha zewnętrznego, zapalenie ucha i wyrostka sutkowatego
	Zapalenie segmentu ruchowego kręgosłupa
	Zakażenia odcewnikowe
	Zapalenie wsierdzia, mięśnia sercowego
	Zakażenia skóry i tkanek miękkich, zakażenia ran
	Kandydemia
	Zakażenia układu moczowego i kandyduria
	Zakażenia wewnątrzbrzuszne
	Zapalenie kości i szpiku
Czynniki ryzyka	Wcześniejsza ekspozycja na leki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze
	Zabiegi chirurgiczne
	Mechaniczna wentylacja
	Żywienie pozajelitowe
	Cewnikowanie
	Hemodializa
	Przewlekła niewydolność nerek
	Wieloogniskowa kolonizacja C. auris
	Cukrzyca

możliwa kolonizacja więcej niż jednego miejsca anatomicznego

Najczęstszą postacią zakażeń wywoływanych przez C. auris jest kandydemia. Obecność drożdżaka we krwi niesie ryzyko jego rozsiewu do narządów wewnętrznych (m.in. wątroby, mózgu, płuc, kości, nerek oraz układu moczowego), co może prowadzić do wystąpienia zakażenia uogólnionego, wstrząsu septycznego i niewydolności wielonarządowej. Kolonizacja i zakażenia miejscowe mogą prowadzić do wystąpienia lub nawrotu kandydemii nawet po kilku miesiącach od zakończonego wyleczeniem pierwszego epizodu infekcji. Śmiertelność z powodu zakażeń wywołanych przez C. auris jest wyższa niż dla innych przedstawicieli rodzaju Candida i wynosi 30–70%. Wczesne wykrycie i szybkie wdrożenie leczenia przeciwgrzybiczego zwiększają szansę pacjenta na przeżycie [45].

Laboratoryjna diagnostyka Candida auris

Izolacja i identyfikacja C. auris jest kluczowa w zakresie rozpoczęcia właściwej leczenia zakażonego pacjenta oraz w celu kontroli transmisji drożdżaka i opanowania ognisk epidemicznych w warunkach szpitalnych. Postępowanie diagnostyczne nastręcza jednak wiele problemów.

4.1.

Identyfikacja gatunku Candida auris

Identyfikacja C. auris oparta o metody klasyczne, w tym wyniki reakcji biochemicznych, jest problematyczna i prowadzi do identyfikacji szczepów jako Rhodotorula glutinis, Saccharomyces cerevisiae, C. sake, C. haemulonii, C. duobushmaemulonii, C. famata, C. lusitaniae, C. albicans, S. guillermondii czy C. parapsilosis [30, 45, 79]. Dodatkowym problemem jest istnienie 5 kladów C. auris, różniących się między sobą np. profilami asymilacji Nacetyloglukozaminy [69].

Najczęstsze przykłady błędnej identyfikacji C. auris za pomocą komercyjnych systemów do identyfikacji drobnoustrojów opartych na badaniu profilu aktywności biochemicznej oraz wskazówki dotyczące dalszych etapów diagnostyki mikrobiologicznej, koniecznych przy podejrzeniu izolacji C. auris, są dostępne na stronie CDC [https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/identification.html; https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/pdf/Testing-algorithm_by-Method_508.pdf].

Wiarygodna identyfikacja C. auris jest obecnie możliwa przy zastosowaniu [33]: √

MALDI-TOF (ang. matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/ desorpcja/jonizacja laserem wspomagana matrycą z pomiarem czasu przelotu jonów) pod warunkiem zastosowania zaktualizowanej względem C. auris bazy danych dotyczącej profilów białkowych badanych drobnoustrojów (Bruker Biotyper® [Palaiseau, France; system bioMérieux Vitek®, Capronne, France; niezależna biblioteka MSI®, Paris, France],

√

metod biologii molekularnej (PCR, multipleks PCR, Real-Time PCR, PCR polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (ang. Restriction Fragment Lenght Polymorphisms, RLFP) sekwencjonowanie genetycznych loci: regionu D1/D2 28S rDNA; 18S Internal Transcribed Regions (ITS 1/2) rDNA; RPB1 i RPB2). Handlowo dostępne zestawy do przeprowadzenia reakcji PCR w kierunku C. auris to AurisID (OLM, Newcastle Upon Tye, UK), Fungiplex Candida Auris RUO Real-Time PCR (Bruker, Bremen, Germany).

W jednym z badań [85] wykazano, że oba testy pozwalają zidentyfikować C. auris nawet przy niskich stężeniach DNA.

Połączenie analizy loci D1/D2 i ITS pozwala także na zakwalifikowanie izolatu do kladu genetycznego bez konieczności wykonywania sekwencjonowania całego genomu.

Proponowane są molekularne protokoły uwzględniające wykrycie C. auris bezpośrednio z wymazów, co może ułatwiać przeprowadzanie badań przesiewowych pacjentów [65, 87]. Opracowano metodę opartą na uzyskaniu RNA rybosomalnego genu ITS2 i przeprowadzeniu reakcji real-time PCR z wykorzystaniem odwrotnej transkrypcji (RT-qPCR), w celu wykrycia żywych komórek C. auris w środowisku szpitalnym, co może być pomocne w kontroli transmisji tego drożdżaka [42].

Obecnie dostępne metody izolacji i identyfikacji C. auris zostały przedstawione w publikacji Lockharti wsp. [69].

Wykrywanie kolonizacji C. auris jest szczególnie istotne w aspekcie kontroli zakażeń, podjęcia decyzji o ewentualnej konieczności izolacji pacjenta. Badania przesiewowe oparte są na pobraniu wymazów ze skóry pach i pachwin, po czym wstępne namnażanie prowadzone jest w bulionie Sabouraud, zawierającym 10% NaCl i dulcytol. Po zaobserwowaniu wzrostu w bulionie, hodowla jest przesiewana na podłoże chromogenne CHROMagar w celu uzyskania wzrostu izolatu, który w kolejnym etapie zostanie poddany identyfikacji. Procedure izolacji C. auris przy zastosowaniu tej metodyki jest dostępna na stronie CDC pod adresem: https://www.cdc.gov/fungal/lab-professionals/pdf/c.-auris-colonization-screening-508.pdf.

Procedura pobierania wymazów w kierunku C. auris jest dostępna pod adresem: https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/c-auris-patient-swab.html

Wzrost kolonii C. auris obserwowany jest po 24 go-dzinach inkubacji w temperaturze 30–35°C, np. na podłożu Sabouraud z dekstrozą w postaci gładkich kolonii o kolorze białym lub kremowym. W odróżnieniu od innych gatunków Candida, C. auris wzrasta także w temperaturze 42°C. Na podłożach chromogennych obserwowana jest zmienność morfologii kolonii [https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/identification.html], w tym zabarwienia, od koloru różowego do beżowego [62].

Ostatnio opracowano i poddano analizie dwa nowe podłoża chromogenne CHROMagar Candida Plus (CHROMagar, France) i HiCrome C. auris MDR selective agar (HiMedia, Mumbai, India) w celu identyfikacji C. auris [5, 9, 31]. W badaniu De Jong i wsp. [31] podłoże CHROMagar Candida Plus jako jedyne podłoże chromogenne (spośród analizowanych: CHROMagar Candida Plus (CHROMagar), HiCrome C. auris MDR selective agar (HiMedia), CandiSelect (Bio-Rad), CHROMagar Candida (CHROMagar), Chromatic Candida (Liofilchem)) prawidłowo pozwala rozróźnić badane izolaty C. auris. Kolonie tego gatunku były zabarwione na kolor jasno niebieski, z tworzeniem charakterystycznego niebieskiego halo [https://www.chromagar.com/en/product/chromagar-candida-plus/]. Niemniej jednak, blisko spokrewnione gatunki C. pseudohaemulonii i C. vulturna tworzyły kolonie o podobnym wyglądzie, prowadząc do uzyskania wyników fałszywie-dodatnich [31]. Z tego powodu zaleca się, aby kolonie podejrzane o przynależność do gatunku C. auris na podstawie wzrostu na podłożu chromogennym, zostały poddane dalszej analizie, z wykorzystaniem sekwencjonowania lub MALDI-TOF [69]. Kumar i wsp. [63] zaproponowali wykorzystanie tolerancji temperaturowej i CHROMagaru uzupełnionego podłożem Pal w celu morfologicznego rozróżnienia pomiędzy C. auris a C. haemulonii i C. duobushaemulonii, aczkolwiek opcja ta wydaje się być przydatna jedynie w sytuacji, gdy zawężamy identyfikację tylko do tych blisko spokrewnionych ze sobą gatunków [69].

Opracowano także dwa podłoża selektywne dla C. auris, z których jedno (Selective Auris Medium, SAM) zawiera wysokie (12,5%) stężenie NaCl oraz siarczan żelaza, co w połączeniu z podwyższoną temperaturą inkubacji (42°C), preferencyjnie umożliwia wzrost C. auris [30]. Inne podłoże (SCA/Specific C. auris medium), jest wzbogaconym bulionem, w skład którego wchodzi 10% NaCl, mannitol i fiolet krystaliczny (inkubacja w temperaturze 40°C) [54]. Podłoża te oczekują jednak na proces walidacji z użyciem większej liczby gatunków Candida, łącznie z blisko spokrewnionym kompleksem C. haemulonii [69].

4.2.

Ocena antybiotykowrażliwości Candida auris na leki przeciwgrzybicze

Wobec wysokiego odsetka izolatów C. auris charakteryzujących się antybiotykoopornością, oznaczanie lekowrażliwości tego drożdżaka w warunkach in vitro jest niezwykle istotne.

Według rekomendacji Instytutu Klinicznych i Laboratoryjnych Standardów (ang. Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) oraz Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości (ang. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST) metody oceny lekowrażliwości tego drobnoustroju, obejmują metodę mikrorozcieńczeń w bulionie, metodę gradientowo-dyfuzyjną (E-testy, bioMérieux), Sensititre YeastOne (Thermo Fisher Scientific), system VITEK-2 (bioMérieux), a także MALDI-Biotyper antibiotic susceptibility test rapid assay (MBT ASTRA) i metody molekularne [40].

Niestety, dotychczas nie ustalono wartości granicznych (ang. breakpoint) dla żadnego z dostępnych leków przeciwgrzybiczych, wykazujących aktywność względem C. auris. Wiele laboratoriów korzysta z próbnych wartości „breakpoint”opracowanych i zaproponowanych przez CDC (https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/c-auris-antifungal.html) w oparciu o analizę wartości MIC, wyniki przeprowadzonych na zwierzętach modeli zakażeń C. auris i molekularną identyfikację mechanizmów lekooporności tego drobnoustroju. CDC udostępniło także przewodnik w interpretacji wartości MIC dla C. auris w oparciu o wiedzę uzyskaną na temat Candida spp. oraz opinie ekspertów [https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/c-auris-antifungal.html]. Mimo, iż wspomniane wartości „breakpoint” mogą być pomocne klinicystom w interpretacji wartości MIC klinicznych szczepów C. auris, nie powinna ona być włączana do końcowych raportów z wynikami przeprowadzonej diagnostyki laboratoryjnej [69].

Wyzwaniem diagnostycznym stwierdzanym w przy-padku wielu izolatów C. auris analizowanych przy zastosowaniu metody mikrorozcieńczeń w bulionie dla kaspofunginy jest także tzw. efekt Eagle [61, 69]. Polega on na tym, że izolat poddany ekspozycji na stężenia antybiotyku wyższe niż tzw. optymalne stężenie bakteriobójcze (ang. optimal bactericidal concentration, OBC) paradoksalnie wykazuje zwiększoną przeżywalność niż przy ekspozycji na OBC, co powodowane jest zmniejszonym tempem obumierania komórek grzyba [https://www.cell.com/trends/microbiology/fulltext/S0966-842X(18)30230-0].

Jeśli wrażliwość na inne echinonadyny nie jest badana równolegle z kaspofunginą, zjawisko to może prowadzić do błędnej identyfikacji oporności na tą grupę leków w szczepie wrażliwym [81]. Należy podkreślić, że efekt Eagle nie odzwierciedla potencjalnej odpowiedzi in vivo C. auris na echinokandyny, czego dowiedziono, przeprowadzając doświadczalny model inwazyjnej kandydozy u myszy [61].

4.3.

Rekomendowany algorytm postępowania diagnostycznego

Izolaty podejrzane o przynależność do gatunku C. auris powinny być identyfikowane z wykorzystaniem metody MALDI-TOF MS lub sekwencjonowania DNA. Jeśli nie ma możliwości zastosowania żadnej z tych metod, system Vitek2 (bioMérieux) jest obecnie uznany za najbardziej wiarygodny w kontekście identyfikacji biochemicznej tego gatunku. Niemniej jednak, należy pamiętać, że niektóre klady tego drożdżaka mogą zostać błędnie zidentyfikowane jako kompleks C. haemulonii i konieczna będzie ich dalsza charakterystyka. Jeśli żadna z wyżej wymienionych opcji diagnostycznych nie jest dostępna, można zastosować CHROMagar Candida Plus w celu identyfikacji izolatu na podstawie koloru wyrosłych kolonii. Swoistość tego podłoża nie wynosi jednak 100%, dlatego też izolaty wstępnie zidentyfikowane jako C. auris, powinny być poddane gatunkowo-swoistej reakcji PCR lub RT-PCR, by zweryfikować przynależność gatunkową. W ostateczności, przy niemożności zastosowania żadnej z opisanych opcji diagnostycznych, należy wysłać szczep to laboratorium referencyjnego w celu identyfikacji [69] zwłaszcza, jeśli w testach biochemicznych został on zidentyfikowany jako C. haemulonii, C. famata, C. sake, Rhodotorula spp., Saccharomyces spp. Tego rodzaju postępowanie jest szczególnie ważne w szpitalach o zwiększonym występowaniu zakażeń wywołanych przez gatunki nie-albicans oraz tych, które przyjmują pacjentów z innych ośrodków, zgłaszających ogniska występowania zakażeń C. auris.

Leczenie zakażeń wywoływanych przez Candida auris

Leczenie inwazyjnych zakażeń wywoływanych przez C. auris stanowi duże wyzwanie, biorąc pod uwagę zarówno często spotykaną wśród szczepów oporność na dostępne leki przeciwgrzybicze, jak i brak rekomendacji na temat optymalnego schematu leczenia. Na wybór odpowiedniego schematu terapeutycznego powinien mieć wpływ rodzaj szczepu C. auris (niektóre profile antybiotykooporności są zależne od genetycznego kladu), zakażenie związane z możliwością tworzenia biofilmu przez drobnoustrój oraz czynniki związane z pacjentem, m.in. wiek, wcześniejsze leczenie przeciwgrzybicze, postać kliniczna zakażenia, czy stan układu odpornościowego pacjenta [25, 33].

Ze względu na najczęściej stwierdzane wśród izolatów klinicznych profile wrażliwości na antybiotyki, mikafungina traktowana jest obecnie jako lek z wyboru w terapii większości klinicznych postaci zakażeń C. auris u pacjentów dorosłych. Lek ten jest drogi, w niektórych krajach nie jest on łatwo dostępny. Podczas leczenia konieczne jest monitorowanie stanu klinicznego pacjenta i antybiotykowrażliwości szczepu poprzez wykonywanie kolejnych badań mikrobiologicznych, jako że znane są przypadki nabycia oporności na mikafunginę w wyniku ekspozycji grzyba na lek. Przy braku klinicznej odpowiedzi na terapię echinokandynami lub w przypadku rozwoju trwającej ponad 5 dni kandydemii, należy rozważyć dodanie lub zmianę schematu leczenia poprzez podanie liposomalnej amfoterycyny B lub izawukonazolu [91].

W terapii zakażeń noworodków i dzieci <2 m.ż. lekiem pierwszego rzutu powinien być deoksycholan amfoterycyny B; podanie echinokandyn (kaspofungina, mikafungina) można rozważyć jedynie po upewnieniu się, że zakażeniem nie został objęty ośrodkowy układ nerwowy (OUN) dziecka. Ze względu na słabą penetrację echinkandyn do OUN, terapia powinna obejmować wówczas inne leki, w tym flucytozynę, pozakonazol lub izawukonazol, w zależności od profilu lekowrażliwości szczepu in vitro [83]. Bardziej szczegółowe informacje na temat rekomendowanego obecnie postępowania terapeutycznego dostępne są na stronie CDC pod adresem: https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/c-auris-treatment.html.

Warto dodać, że nie zaleca się podejmowania leczenia w przypadku izolacji C. auris z miejsc fizjologicznie niejałowych (np. układ oddechowy, mocz) i kolonizacji powierzchni skóry, przy braku objawów klinicznych, wskazujących na aktywne zakażenie. W tych sytuacjach, jednak, konieczne jest wdrożenie odpowiednich procedur mających na celu zapobieganie i kontrolę zakażeń i ograniczenie transmisji drobnoustroju w środowisku szpitalnym. Brak wystarczających dowodów na skuteczność procedur, mających na celu dekolonizację, np. za pomocą chlorheksydyny [https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/c-auris-treatment.html] [1].

W ostatnich latach coraz większą uwagę zwraca się na poszukiwanie nowych leków o aktywności przeciwgrzybiczej, ale także alternatywnych metod terapii zakażeń wywoływanych przez C. auris. Potencjalnie nowe metody terapii o wykazanej aktywności względem tego gatunku zostały przedstawione w Tabeli II.

Tabela II

Nowe leki przeciwgrzybicze oraz alternatywne strategie leczenia o wykazanej aktywności względem C. auris [na podstawie 25, 45]

Nowe leki przeciwgrzybicze
Lek	Mechanizm działania	Piśmiennictwo
Fosmanogepix (APX001)	Inhibitor enzymu Gwt1 (ang. Glycosylphosphatidylinositol-anchored Wall protein Transfer 1)	[48]
Arylamidyna T-2307	Powoduje zaburzenia potencjału błony mitochondrialnej w komórkach grzybiczych	[98]
Ibrexafungerp (SCY-078)	Inhibitor syntazy glukanu	[3]
Nitroksolina	Pochodna hydroksychinoliny, mechanizm działania prawdopodobnie oparty na chelatacji jonowej	[43]
VT-1598	Lek tetrazolowy, inhibitor enzymu CYP51 (ERG11p) i syntezy ergosterolu	[97]
PC945	Lek triazolowy, inhibitor demetylazy 14a-lanosterolu	[79]
Rezafungina	Nowa echinokandyna o długim okresie półtrwania	[67]
Alternatywne strategie leczenia
Karwakrol	Roślinne olejki eteryczne, zawierają składniki fenolowe o aktywności przeciwgrzybiczej Osłabianie wirulencji, adherencji i tworzenia biofilmu przez C. auris	[88]
Farnesol		[92]
Krotamina	Naturalny peptyd, toksyna uzyskana z jadu grzechotnika; powoduje destabilizację błony komórkowej	[29]
Nanocząsteczki tlenku azotu	Hamowanie proliferacji planktonicznych komórek C. auris, hamowanie tworzenia biofilmu	[26]

Coraz większym zainteresowaniem w zakresie potencjalnego zastosowania w terapii zakażeń C. auris cieszą się także istniejące już leki, włączając preparaty o aktywności przeciwwirusowej, przeciwpasożytniczej, przeciwnowotworowej, przeciwzapalnej, czy przeciwdepresyjnej. Potencjalna aktywność przeciwgrzybicza tych środków terapeutycznych została szczegółowo opisana w pracy przeglądowej Izadi i wsp. [55].

Zalecane działania prewencyjne

Jedną z kluczowych zasad postępowania w przypadku pacjentów skolonizowanych lub zakażonych C. auris jest ich izolacja (ewentualnie kohortacja) oraz zastosowanie kontaktowych środków ostrożności. Bardzo istotna w zakresie działań prewencyjnych jest możliwość wydzielenia osobnego personelu i sprzętu medycznego (np. sprzęt USG, zestawy do tracheostomii) dla tych pacjentów. Jeśli to tylko możliwe, należy stosować sprzęt i materiały jednorazowego użytku. Powinno obowiązywać mycie i dezynfekcja środowiskowa, w tym np. aparatów do RTG, EKG, sprzętu do fizjoterapii, przed i po użyciu, a także codzienna (oraz po wypisaniu pacjenta skolonizowanego/zakażonego) dezynfekcja sal szpitalnych. Szczególny nacisk należy położyć na dezynfekcję często używanych powierzchni (stoły, poręcze łózek, szafki) z zastosowaniem odpowiednich środków z uwzględnieniem zalecanego przez producenta czasu ekspozycji. Rekomendowane są środki na bazie chloru, kwasu nadoctowego, nadtlenku wodoru, alkoholu. Należy natomiast unikać czwartorzędowych związków amoniowych ze względu na brak wrażliwości C. auris [1, 28, 33].

Personel medyczny powinien podczas leczenia i ochrony nad pacjentami z C. auris zakładać jednorazowe fartuchy z długimi rękawami i jednorazowe rękawiczki (germ-free). Szczególne znaczenie ma odpowiednia dezynfekcja skóry rąk z wykorzystaniem środków na bazie alkoholu, według rekomendacji WHO [https://www.who.int/campaigns/world-hand-hygiene-day]. Ze względu na fakt, iż C. auris jest nowym patogenem, konieczna jest również edukacja personelu, uświadomienie zagrożeń z nim związanych, ze szczególnym uwzględnieniem jego wieloantybiotykooporności i dróg transmisji [1].

W przypadku kontaktu (> 24-godzinny pobyt w tej samej sali szpitalnej, stosowanie tego samego sprzętu medycznego) z „pacjentem zero”, konieczne są badania przesiewowe osób z kontaktu. Powinny one obejmować pobranie wymazów z pach, pachwin (po jednej wymazówce dla każdej z nisz) i jamy nosowej/gardła, oraz moczu (tylko pacjenci cewnikowani) i wymazu z odbytu. Badaniu przesiewowemu powinni być natomiast poddani wszyscy pacjenci w jednostce objętej potencjalną transmisją C. auris. Dodatkowo, w zależności od sytuacji klinicznej, można rozważyć dodatkowe pobranie wymazów z ran, zewnętrznego przewodu słuchowego, pochwy. Dwa pierwsze badania przesiewowe (dzień 0 i dzień 4.) powinny być wykonane w pierwszym tygodniu, po czym kolejne – raz w tygodniu. Pobrane materiały kliniczne powinny być wysiane na chromogenne podłoże selektywne w kierunku C. auris bądź na podłoże umożliwiające identyfikację gatunków non-albicans za pomocą MALDI-TOF. Izolację pacjentów można zakończyć po uzyskaniu ujemnych wyników badań przesiewowych w co najmniej dwóch seriach wymazów pobranych w odstępie tygodnia, przy niestosowaniu w tym czasie leków przeciwgrzybiczych. Rekomendowane jest testowanie w kierunku C. auris za pomocą reakcji PCR po pobraniu drugiego zestawu wymazów, w celu zwiększenia czułości badań. Badaniom mikrobiologicznym należy także poddać sprzęt medyczny mający kontakt z pacjentem, w celu ustalenia potencjalnych dróg transmisji [1].

Do jednostki, w której wykryto C. auris, nie należy przyjmować pacjentów, aż do czasu ustalenia zasięgu szpitalnej transmisji drożdżaka oraz potencjalnych dróg transmisji. Alternatywnie, żadni nowi pacjenci nie powinni być przyjmowani, do czasu wypisania wszystkich dotychczasowych pacjentów z C. auris [1]. Co więcej, nawet jeśli kolejne przypadki izolacji C. auris nie zostaną wykryte w jednostce, zalecane jest cotygodniowe badanie przesiewowe pacjentów (wymazy ze skóry pach i pachwin, oraz mocz u pacjentów cewnikowanych, ewentualnie wymaz z odbytu – materiały pobierane w celu hodowli) przez co najmniej 3 miesiące od wypisania ostatniego pacjenta z C. auris.

Tabela III przedstawia rekomendacje CDC i ECDC na temat zapobiegania i kontroli transmisji C. auris w warunkach szpitalnych [27].

Tabela III

Rekomendacje CDC i ECDC dotyczące zapobiegania i kontroli transmisji C. auris w warunkach szpitalnych [na podstawie 27]

ECDC

CDC

Prawidłowa identyfikacja gatunku (MALDI-TOF, sekwencjonowanie domeny D1/D2)

Raportowanie nowych przypadków, analiza retrospektywna przypadków

Opracowanie standardów kontroli zakażeń (włączając mycie i dezynfekcję środowiskową, reprocesowanie urządzeń medycznych, izolację pacjenta), szybkie i właściwe raportowanie nowych przypadków

Wczesna identyfikacja nosicieli poprzesz aktywny skrining? proszę wpisać polskie określenieproszę o konsekwencję (wymazy z nosa, gardła, pach, pachwin, odbytu, miejsc wkłucia cewników dożylnych, mocz, kał, płyn z drenażu rany, materiały z dróg oddechowych)

Ustalenie źródła ogniska epidemicznego (dochodzenie epidemiologiczne, badania przesiewowe pacjentów, wymazy środowiskowe); prewencja transmisji drobnoustroju

Ograniczanie rozprzestrzeniania się ogniska (kontaktowe środki ostrożności, izolacja/kohortowanie pacjentów, personel medyczny dedykowany do opieki nad skolonizowanymi/zakażonymi pacjentami)

Edukacja personelu medycznego

Właściwa szpitalna polityka antybiotykowa

Prawidłowa identyfikacja gatunku (MALDI-TOF, metody biologii molekularnej)

Raportowanie potwierdzonych izolatów C. auris

Strategie kontroli zakażeń:

➢

Jednoosobowe pokoje dla pacjentów, kontaktowe środki ostrożności

➢

Właściwa higiena rąk

➢

Mycie i dezynfekcja środowiskowa (codzienna i po wypisaniu pacjenta) odpowiednimi środkami

➢

Badania przesiewowe osób z kontaktu, identyfikacja przypadków kolonizacji (wymazy: pachy, pachwiny, nos, zewnętrzny przewód słuchowy, część ustna gardła, inne: mocz, rany, odbyt)

➢

Badania przesiewowe zalecane dla pacjentów z tej samej sali, co pacjent z C. auris

Edukacja personelu medycznego

Monitorowanie przestrzegania zasad kontroli zakażeń

Właściwa szpitalna polityka antybiotykowa

Podsumowanie

C. auris, ze względu na nieznane, jak dotąd, pochodzenie oraz szereg cech odróżniających ten gatunek od pozostałych przedstawicieli rodzaju Candida, a w szczególności – wysoki potencjał epidemiczny, zdolność do transmisji horyzontalnej, odporność na działanie zewnętrznych czynników środowiskowych, niektórych środków dezynfekcyjnych oraz wieloantybiotykooporność, a także trudności związane z identyfikacją laboratoryjną, traktowany jest jako enigmatyczny i bardzo groźny drobnoustrój. Z tego względu konieczne jest kontynuowanie badań mających na celu poznanie potencjału patogennego tego drobnoustroju i mechanizmów wirulencji, a także rozwój i wdrożenie do rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej metod, które pozwolą na szybką i wiarygodną identyfikację tego gatunku. Kluczowe jest opracowywanie nowych strategii terapeutycznych oraz skutecznych metod zapobiegania transmisji tego drożdżaka, co jest szczególnie ważne w warunkach szpitalnych.

eISSN:: 2545-3149
Lingue:: Inglese, Polacco

Frequenza di pubblicazione:: 4 volte all'anno
Argomenti della rivista:: Life Sciences, Microbiology and Virology

Feed RSS della rivista

Candida Auris: What do We Know about the Most Enigmatic Pathogen of the 21st Century?

Pubblicato online: 21 mar 2023

Pagine: 27 - 46

Ricevuto: 01 ott 2022

Accettato: 01 dic 2022

DOI: https://doi.org/10.2478/am-2023-0003

© 2023 Agnieszka Bogut, published by Sciendo

This work is licensed under the Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

Ryc. 1.

Candida Auris: What do We Know about the Most Enigmatic Pathogen of the 21^st Century?