Celuloza bakteryjna (BC), zwana również bionanocelulozą, to naturalny polimer, który ze względu na swoje wyjątkowe właściwości skupia w ostatnich latach szczególną uwagę naukowców z różnych obszarów wiedzy i techniki, a także coraz częściej zwykłych konsumentów. Szczególne właściwości tego naturalnego nanomateriału wynikają z unikalnej molekularnej budowy, którą stanowi chemicznie ultra czysty β-1,4-glukan. Struktura chemiczna jest czynnikiem determinującym główne cechy tego bionanopolimeru, takie jak wysoka higroskopijność, elastyczność oraz wytrzymałość mechaniczna, które decydują jednocześnie o szerokim komercyjnym zastosowaniu BC [43].
Celuloza bakteryjna jest produkowana przez wiele różnych drobnoustrojów, wśród których dominują bakterie z rodzaju
Różne postacie fizyczne BC (wytworzone zarówno w wyniku hodowli powierzchniowej, jak i wgłębnej) ze względu na swoje cenne właściwości znajdują zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu. Opracowano również metody syntezy modyfikowanej BC (np. solami chitozanu), która poprzez nadane cechy bakteriostatyczności ma zdolność hamowania wzrostu niektórych gatunków bakterii. Zrealizowane dotychczas badania nad BC dotyczą zarówno poznania molekularnych mechanizmów jej biosyntezy, jak również optymalizacji tego procesu w skali laboratoryjnej i przemysłowej. Prowadzone są również badania nad wykorzystaniem do masowej produkcji nowych, niestosowanych dotychczas gatunków drobnoustrojów oraz nad opracowaniem najbardziej efektywnych i opłacalnych ekonomicznie technologii produkcji BC. Podejmuje się również intensywne wysiłki nad poszukiwaniem nowych podłoży do produkcji BC, m.in. poprzez wykorzystanie surowców odpadowych.
Celem niniejszej pracy jest przedstawienie aktualnych doniesień na temat właściwości, metod produkcji oraz praktycznego zastosowania BC w różnych gałęziach przemysłu spożywczego.
Pod względem struktury chemicznej BC jest liniowym polimerem glukanowym, w którym poszczególne cząsteczki (opisane wzorem (C6H10O5)n) połączone są wiązaniem β-1,4 (β-1 → 4) [77]. Tworzenie BC rozpoczyna się wewnątrz komórki bakteryjnej, gdzie ma miejsce proces łączenia wielu cząsteczek glukozy w łańcuchy zawierające od 1 500 do ponad 20 000 reszt połączonych wiązaniem β-1,4 (β-1→ 4). Powstałe pojedyncze łańcuchy glukozowe są następnie usuwane na zewnątrz komórki poprzez pory obecne w otoczce i ścianie komórkowej. Na zewnątrz komórki, łańcuchy glukozy formowane są w mikrofibryle, czyli zespoły łańcuchów celulozowych, które następnie agregują w większe struktury tworząc tzw. wstążki celulozowe [24]. Z kolei „wstążki” BC budują uporządkowaną strukturę sieciową z pustymi przestrzeniami pomiędzy poszczególnymi wstążkami. Prawidłowo uformowane „wstążki” BC tworzą strukturę w postaci rozległej i wysoce porowatej matrycy [22]. Matryca ta jest dodatkowo stabilizowana poprzez wiązania wodorowe formujące się pomiędzy pojedynczymi łańcuchami glukozowymi [35]. Powstała w ten sposób włóknista sieć BC przyjmuje w końcowym efekcie postać wielowarstwowej cienkiej hydrożelowej powłoki o znacznej powierzchni właściwej i dużej porowatości [22].
Wykazano, że poszczególne włókienka budujące BC są około 100 razy cieńsze niż włókienka celulozy roślinnej, produkowanej przez rośliny wyższe [24]. Ponadto, w przeciwieństwie do nieprzetworzonej celulozy roślinnej, BC pod względem chemicznym jest ultraczystym materiałem, który nie posiada powiązań z ligniną czy hemicelulozami [98]. Kolejną cechą BC jest jej wysoki stopień krystaliczności (wynoszący ponad 60%) oraz odmienny, zawierający się w szerszym zakresie, stopień polimeryzacji łańcuchowej. Dla BC wynosi on od 16 000 do 20 000 cząsteczek, podczas gdy przeciętny stopień polimeryzacji celulozy roślinnej waha się od 13 000 do 14 000 cząsteczek glukozy w jednostce polimeru [7].
Potwierdzono również, że stopień polimeryzacji BC jest w dużym stopniu zależny od odczynu środowiska hodowlanego, w jakim następuje namnażanie drobnoustrojów i jej synteza. Wykazano, że bakterie podczas hodowli przy pH 4 produkują BC o stopniu polimeryzacji w zakresie od 14 000 do 16 000, natomiast przy pH 5 następuje produkcja BC zawierającej od 11 000 do 16 800 jednostek glukozy na cząsteczkę polimeru [77, 80]. Powyższa obserwacja ma istotne znaczenie dla procesu wytwarzania BC o określonych właściwościach wytrzymałościowych. Potwierdzono, że wytrzymałość mechaniczna powłoki BC wzrasta wraz z obniżeniem odczynu (wytworzona w środowisku o pH 4 jest istotnie wyższa aniżeli BC wytworzona w środowisku o pH 5) [91]. Większa wytrzymałość mechaniczna wytworzonej przez bakterie BC związana jest z obniżoną aktywnością w zakresie pH 4–4,5 bakteryjnych enzymów hydrolitycznych (takich jak celulazy), które zmniejszają stopień polimeryzacji BC poprzez jej rozkład na celobiozę (dimer glukozy) i celotriozę (3-glukozową celulodekstrynę), a następnie na pojedyncze cząsteczki glukozy [91].
Do syntezy celulozy przez drobnoustroje dochodzi przy udziale złożonego kompleksu enzymatycznego w postaci syntazy celulozy i polega na łączeniu ze sobą cząsteczek glukozy w jeden długi łańcuch [59, 77]. Zintegrowana z błoną komórek bakteryjnych syntaza celulozy to kompleks enzymatyczny dwóch wewnątrzkomórkowych białek – BcsA i BcsB, oraz białka BcsC, które stanowi zewnętrzny składnik błonowy. Białko BcsA wraz z peryplazmatyczną, zakotwiczoną w błonie podjednostką BcsB tworzą kompleks, który jest odpowiedzialny za bezpośredni proces syntezy BC. Natomiast BcsC, jako białko błony zewnętrznej, odpowiada bezpośrednio za proces translokacji nowo wytworzonej cząsteczki BC. Dowiedziono, że białko BcsA wytwarza w pobliżu miejsca syntezy aktywny kanał transportu w błonie komórkowej, umożliwiając w ten sposób translokację nowopowstałej BC przez białko BcsC na zewnątrz komórki [65, 67, 79].
Sugeruje się, że C-końcowa część BcsC tworzy kanał, przez który następuje translokacja BC przez błonę zewnętrzną. Natomiast pozostała pozostała cześć kompleksu enzymatycznego oddziałuje prawdopodobnie z cytoplazmatycznymi czynnikami aktywującymi syntezę celulozy, takimi jak cykliczny diguanozyno-5’-monofosforan (c-di-GMP) czy jony Mg2+ [21, 59, 65]. Powstała BC jest transportowana na zewnątrz komórki bakteryjnej poprzez pory powstające w zewnętrznej otoczce i ścianie komórkowej [66, 80].
Unikalny wśród bakterii proces syntezy i formowania BC spełnia u tych drobnoustrojów dwie zasadnicze funkcje – chroni przed wpływem niektórych czynników środowiskowych, takich jak oddziaływanie niekorzystnych temperatur czy promieniowania UV, a także chroni komórki bakteryjne przed nadmierną utratą wody. Ponadto BC spełnia rolę swoistego pływaka (maty), który utrzymuje wytwarzające ją drobnoustroje na granicy faz powietrze–woda i tym samym ułatwia komórkom drobnoustrojów pobieranie tlenu z powietrza atmosferycznego [13]
Najdokładniej opisanymi drobnoustrojami wytwarzającymi celulozę to szeroko rozpowszechnione w przyrodzie bakterie z rodzaju
Do syntezy BC zdolne są również bakterie z rodzaju
Przykładem podobnej interakcji z udziałem BC jest symbiotyczne oddziaływanie niepatogenicznych gatunków bakterii brodawkowych z rodzaju
Kolejną grupą drobnoustrojów produkujących BC są bakterie z rodzaju
Do drobnoustrojów, u których również potwierdzono zdolność produkcji BC, należą niektóre szczepy bakterii z rodzaju
Cechą charakterystyczną bakterii z rodzaju
Wśród drobnoustrojów mających zdolność syntezy BC są również bakterie z rodzaju
Spośród bakterii mogących syntetyzować BC wskazuje się również rodzaj
Inwazja bakterii
Innym gatunkiem bakterii z rodziny
Przytoczone przykłady wskazują, że biosynteza BC jest procesem umożliwiającym bakteriom zarówno zasiedlanie konkretnego środowiska, jak i efektywną adaptację podczas oddziaływań symbiotycznych lub pasożytniczych. Dlatego proces biosyntezy BC odgrywa istotną rolę zarówno w przypadku symbiontów wiążących azot (np.
Proces syntezy BC wydaje się również kluczowy w rozwoju zjadliwości (wirulencji) ważnych patogenów ludzkich, jak niektóre szczepy
Początkowo do uzyskania BC jako produktu biosyntezy przeprowadzanej przez
Powszechnie stosowanymi alternatywnymi surowcami do produkcji BC są głównie surowce zawierające cukry proste (np. glukozę, fruktozę, ksylozę) lub dwucukry (np. sacharozę, trehalozę, laktozę) [62]. Ze względu na dużą podaż i niskie koszty pozyskania, często do produkcji BC stosuje się produkty uboczne z przemysłu cukrowniczego, takie jak melasa (melas). Melasa charakteryzuje się dużą zawartością cukrów i dla drobnoustrojów wytwarzających BC jest również źródłem składników mineralnych, głównie potasu, wapnia, magnezu, fosforu, żelaza oraz selenu [6]. W zależności od surowca, z którego melasa jest wytwarzana, do hodowli szczepów bakterii produkujących BC wykorzystuje się melasę buraczaną, trzcinową oraz karobową, pozyskiwaną z mączki chleba świętojańskiego [5, 70].
Potwierdzono, że BC wytwarzana przez szczep
Istnieją liczne doniesienia na temat prób zastąpienia kosztownej tradycyjnej pożywki H-S innymi podłożami, będącymi produktami ubocznymi z przemysłu fermentacyjnego. Skutecznym w tym zakresie rozwiązaniem może być wykorzystanie wywaru gorzelnianego i ścieków po produkcji alkoholi [99].
Jednym z rozwiązań obniżających koszty produkcji względem podłoża H-S jest wykorzystanie do wytwarzania BC odpadów powstających z procesu produkcji wina ryżowego, jakim jest m.in. tzw. cienki wywar gorzelniany (distillery thin stillage). Wykazano, że osad będący pozostałością po procesie fermentacji ziarna ryżowego i dojrzewania wina ryżowego, może być dla drobnoustrojów produkujących BC, jak
Do produkcji BC, jako zamiennik standardowej pożywki H-S, wykorzystuje się również pszeniczny cienki wywar gorzelniany (thin wheat distillery), będący pozostałością procesu produkcyjnego alkoholu etylowego. Powstająca na bazie tego płynu pożywka umożliwia bakteriom
Innym naturalnym surowcem wykorzystywanym do produkcji BC jest filtrat z odpadów powstających przy produkcji koreańskiego wina ryżowego Makgeolli (Makgeolli sludge filtrate) [34]. Wykazano, że filtrat ten może być przydatną pożywką dla bakterii produkujących BC ze względu na wysoką zawartość węglowodanów i kwasów organicznych (np. kwas jabłkowy, mlekowy, bursztynowy oraz octowy). Stosując wspomniany filtrat jako podstawowe podłoże hodowlane lub też jako dodatkowe źródło węgla do zmodyfikowanego (niezawierającego glukozy) podłoża H-S można uzyskać 4–5-krotnie wydajniejszą produkcję BC przez
Jednym z rozwiązań w produkcji BC mających na celu zastąpienie podłoża H-S, które stanowi jednocześnie element służący zagospodarowaniu uciążliwych odpadów, jest wykorzystanie namoka kukurydzianego (corn steep liquor), czyli produktu ubocznego z procesu mielenia kukurydzy na mokro. Namok kukurydziany powstaje w procesie produkcji skrobi z ziaren kukurydzy i zawiera wiele cennych składników, jak kwasy organiczne (głównie kwas mlekowy), cukry redukujące, aminokwasy (głównie siarkowe, jak cysteina, homocysteina i metionina) oraz składniki mineralne (głównie fosfor i potas), które są wykorzystywane przez drobnoustroje zarówno do wzrostu, jak i produkcji metabolitów wtórnych [76].
Wykazano, że namok kukurydziany stosowany w procesie syntezy BC jako źródło azotu dostarczanego do standardowej pożywki, przyczynia się jednocześnie do zmniejszenia (średnio o 25%) zużycia glukozy z podłoża hodowlanego. Zaobserwowano, że BC wytworzona w oparciu o podłoże zawierające namok kukurydziany charakteryzuje się ulepszonymi cechami fizykochemicznymi (np. grubość polimeru oraz tekstura powierzchni) niż BC wytworzona w oparciu o podłoże tradycyjne. Potwierdzono również, że BC powstała z zastosowaniem alternatywnej pożywki (w skład której wchodziła glukoza (1,5% v/v), wodorofosforan sodu (0,27% v/v), kwas cytrynowy (1,5% v/v) oraz namok kukurydziany (2,5% v/v)) wykazuje większą odporność na działanie podwyższonej temperatury aniżeli BC wytworzona w oparciu o pożywkę H-S. Potwierdzono, że BC powstała na podłożu alternatywnym nie ulegała termicznemu rozkładowi nawet w temperaturze 250°C, podczas gdy BC wytworzona na bazie tradycyjnego podłoża H-S zachowywała stabilność strukturalną tylko w temperaturze poniżej 195°C. BC produkowana w oparciu o podłoże zawierające namok kukurydziany wykazuje wyższe zagęszczenie nanowłókien celulozowych w porównaniu do polimeru wytworzonego w oparciu o podłoże H-S [15].
Opisane właściwości BC uzyskanej na podłożu wzbogaconym o dodatek namoka kukurydzianego tłumaczy się korzystnym oddziaływaniem składników chemicznych podłoża na wzrost
Naturalnym surowcem, który może stanowić alternatywne źródło węgla dla produkcji BC mogą być również niedogotowane łuski ziaren kawy (coffee cherry husk) [71]. Potwierdzono, że wywar z oczyszczonych i zmielonych łusek ziaren (owoców) kawy odmiany robusta może stanowić wartościowe podłoże dla szczepu bakterii
Wykazano, że BC wytwarzana w oparciu o podłoże stanowiące wywar ze zmielonych łusek ziaren kawy charakteryzuje się korzystnymi właściwościami mechanicznymi, jak wytrzymałość na rozciąganie (wynosząca 28,5 MPa w porównaniu do 16,5 MPa dla podłoża H-S) oraz zwiększone wydłużenie nominalne (wynoszące 0,22 mm/s w porównaniu do 0,16 mm/s dla podłoża H-S). Znacznie wyższy zakres opisanych powyżej cech odnotowywano, gdy wystandaryzowane podłoże hodowlane (zawierające podłoże tradycyjne H-S i wywar z łusek ziaren kawy w proporcji 1:1) było wzbogacone ekstraktem z namoka kukurydzianego w ilości 8% (V/V). Wytworzona BC z zastosowaniem opisanego podłoża kombinowanego charakteryzowała się zwiększoną wytrzymałością mechaniczną na rozciąganie (37,8 MPa) oraz wydłużeniem nominalnym (0,45 mm/s). Natomiast najkorzystniejsze właściwości mechaniczne pod względem wytrzymałości na rozciąganie (42,4 MPa) i wydłużenia nominalnego (0,58 mm/s) wykazuje BC, która powstała przy zastosowaniu podłoża zawierającego wywar ze zmielonych łusek ziaren kawy, ekstrakt z namoka kukurydzianego oraz, dodatkowo, niewielką ilość etanolu (1,5%) i kwasu octowego (1,0%). Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że BC otrzyamana z użyciem pożywki kombinowanej o powyższym składzie charakteryzuje się zwiększonym przekrojem poprzecznym włókien celulozowych, jak również zwiększoną liczbą wiązań wodorowych pomiędzy poszczególnymi łańcuchami [71].
Wysokiej jakości BC może być wytwarzana również z wykorzystaniem ścieków pofermentacyjnych z syntezy biorozpuszczalników, które otrzymywane są w procesie określanym jako fermentacja ABE (acetonowo-butanolowo-etanolowa). Wykazano, że bakterie
Rozwiązaniem mającym wysoki potencjał praktyczny w zakresie opracowywania podłoża do produkcji BC, jest wykorzystanie pohodowlanego pofermentacyjnego wywaru będącego pozostałością po procesie utylizacji substancji ropopochodnych przez drożdże. Zaobserwowano, że odpad powstały po hodowli drożdży
Innym rozwiązaniem jest wykorzystanie do mikrobiologicznej syntezy BC hydrolizatu uzyskanego na drodze kwaśnej hydrolizy biomasy drożdży oleistych z rodzaju
Podejmowane są również próby wykorzystania do produkcji BC odpadowych drożdży piwowarskich. Wykazano, że alkaliczne hydrolizaty odpadowych drożdży piwowarskich mogą stanowić źródło cennych składników odżywczych dla
Kolejnym przykładem zastosowania odpadów organicznych jako źródła węgla oraz energii do produkcji BC jest wykorzystanie hydrolizatów biomasy roślinnej (
Interesujące rezultaty uzyskano w badaniach nad wykorzystaniem do hodowli
Badania wskazują, że wartościowymi substratami wykorzystywanymi w procesie mikrobiologicznej syntezy BC są również niektóre alkohole powstające jako odpad przy produkcji biodiesla (waste spirits from biodiesel production), jak glicerol, diacyloglicerol oraz metanol. Wykazano, że glicerol umożliwia
Prowadzone są również badania nad wykorzystaniem do produkcji BC podłoża stanowiącego ekstrakt wodny powstały po procesie rozwłóknienia surowca drzewnego, przeprowadzanego metodą ekstrakcji gorącą wodą lub parą wodną. Wykazano, że ekstrakty wodne takich surowców, jak osika, eukaliptus, brzoza, sosna czy świerk (będące jednocześnie materiałem odpadowym z przemysłu celulozowo-papierniczego) charakteryzują się wysoką zawartością monosacharydów i disacharydów, głównie fruktozy, glukozy, ksylozy oraz sacharozy. Dzięki temu wspomniane wodne ekstrakty z drzewnych (lignocelulozowych) materiałów odpadowych mogą stanowić pożywkę do produkcji BC przez
Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku innego surowca poprodukcyjnego z przemysłu spożywczego, jakim jest płynna serwatka. Serwatka zawiera 6–7% stałych składników odżywczych mleka, co powoduje, że surowiec ten umożliwia szybki wzrost większości drobnoustrojów. Wyniki badań wskazują, że zastosowanie serwatki jako pożywki umożliwia produkcję BC przez
Przykładowe surowce i drobnoustroje wykorzystywane do syntezy bionanocelulozy
Surowiec (źródło węgla) | Rodzaj bakterii | Piśmiennictwo |
---|---|---|
Melasa (melas): melasa buraczana, melasa trzcinowa, melasa karobowa | [70] | |
Cienki wywar gorzelniany | [99] | |
Namok kukurydziany | [76] | |
Wywar z łusek ziaren kawy | [71] | |
Odpad po produkcji wina ryżowego | [34] | |
Pszeniczny cienki wywar gorzelniany | [73] | |
Odpady z procesu fermentacji ABE | [31] | |
Pofermentacyjny wywar z hodowli drożdży | [30] | |
Hydrolizaty biomasy roślinnej: hydrolizaty liści rozplenicy słoniowej łupiny nasienne owocu Durian | [102] | |
Alkohole odpadowe z produkcji biodiesla: glicerol diacyloglicerol metanol | [54] | |
Wodne ekstrakty drzewne | [47] | |
Serwatka | [73] |
Wydajność i opłacalność produkcji oraz właściwości BC uzależnione są nie tylko od rodzaju bakterii i typu zastosowanego podłoża, ale również od metody hodowli drobnoustrojów. Warunki hodowli drobnoustrojów mają również wpływ na postać morfologiczną oraz właściwości fizyczne powstającej BC, jak np. wytrzymałość na rozciąganie czy zdolność do absorpcji wody.
Jedną z powszechnie stosowanych metod hodowli przy produkcji BC są hodowle powierzchniowe, w trakcie których wytwarzanie polimeru odbywa się na dużych powierzchniach podłóż stałych bądź płynnych. Ten rodzaj hodowli drobnoustrojów, stosowany jest przede wszystkim w celu uzyskania BC w formie płaskiej membrany o jednorodnej strukturze i zdefiniowanej grubości. W skali laboratoryjnej ten rodzaj produkcji przeprowadzany jest w naczyniach zapewniających dużą powierzchnię swobodną płynu hodowlanego. Powszechnie stosowanymi naczyniami zapewniającymi powyższe warunki są płytki Petriego, kolby typu Roux oraz kolby Fernbacha o dużej średnicy podstawy. W tego typu hodowlach drobnoustroje wykorzystują całą powierzchnię podłoża, na której formowany jest finalny produkt w postaci błony nanocelulozowej. W hodowli powierzchniowej ułatwione jest pozyskiwanie substancji wzrostowych, które pobierane są przez drobnoustroje z całej powierzchni ciekłego lub stałego podłoża. Prowadzenie hodowli na podłożach stałych pozwala również na szybkie i dokładne usuwanie z jego powierzchni wytworzonej BC [27].
Na skalę przemysłową produkcję metodami statycznymi przeprowadza się w wielolitrowych tacach, kuwetach i wannach ociekowych wypełnionych podłożem, na powierzchni którego formuje się BC [35]. Innym wariantem hodowli na podłożu w warunkach statycznych są hodowle okresowe z wykorzystaniem wielolitrowych fermentorów (bez wirnika). W tego typu hodowli, określanej terminem hodowli wsadowej, następuje okresowe uzupełnianie świeżej pożywki oraz okresowe pobieranie wytworzonej BC z powierzchni podłoża hodowlanego [29, 84].
W przypadku produkcji BC na skale przemysłową coraz częściej wykorzystuje się bioreaktory typu HoLiR (Horizontal Lift Reactor). Poziome bioreaktory typu HoLiR stanowią ułożone poziomo prostopadłościenne podłużne zbiorniki wypełnione pożywką hodowlaną, na powierzchni której odbywa się synteza BC w postaci błony powierzchniowej o kształcie prostokątnego arkusza. W tego typu bioreaktorach formowanie tworzącej się BC odbywa się w sposób ciągły poprzez podnoszenie (na jednym z końców zbiornika) i bardzo powolne wyciąganie kilkumilimetrowych arkuszy (błon) BC znad powierzchni podłoża [28].
Innym przykładem hodowli statycznej są hodowle kultur bakteryjnych prowadzone w tzw. reaktorach aerozolowych. W tego typu reaktorach składniki odżywcze dla drobnoustrojów są natryskiwane w kierunku prostopadłym do płaskiej powierzchni przesuwającej się taśmy, na której następuje formowanie się błony nanocelulozowej. Formujące się błony nanocelulozowe w reaktorach aerozolowych osiągają grubość kilku centymetrów i z tego powodu polimer w ten sposób otrzymany znajduje zastosowanie w tworzeniu materiałów konstrukcyjnych (np. biomedycznych), wymagających wysokich parametrów technicznych [11, 12, 101].
Zaobserwowano, że gdy proces hodowli drobnoustrojów (np.
Odmiennym sposobem produkcji jest wytwarzanie BC w warunkach hodowli wstrząsanych. Prowadzenie hodowli metodą wstrząsaną ma na celu wprowadzenie do podłoża dodatkowych ilości powietrza. Napowietrzenie jest jednym z głównych zabiegów technologicznych mających na celu poprawę wydajności produkcji BC. Dodatkowe zwiększenie efektu napowietrzenia osiąga się poprzez umieszczenie w podłożu hodowlanym szklanych kuleczek. W warunkach hodowli wstrząsanych, w których wykorzystywane są pożywki ciekłe, drobnoustroje wytwarzają BC w postaci owalno-kulistych kłębków nanocelulozowych o włóknistych nieregularnych brzegach [41, 92]. Produkcję BC metodą wstrząsaną prowadzi się zazwyczaj w szklanych kolbach stożkowych (np. Erlenmeyera), które umieszczone są w inkubatorach wstrząsarkowych. Tego typu hodowlę prowadzi się zazwyczaj przy 10–30% wypełnieniu kolb pożywką hodowlaną, najczęściej przy szybkości obrotowej od 150– 250 obrotów/min. oraz w zakresie temperatur 28–32°C w czasie 72–150 godzin. Poprzez zmianę każdego z tych parametrów można wpływać na przebieg produkcji BC, jak również dostosowywać warunki biosyntezy do konkretnego rodzaju drobnoustroju, jak również do właściwości i planowanych do uzyskania cech fizykochemicznych wytwarzanego materiału [45, 80, 106].
Kolejnym powszechnie stosowanym rodzajem hodowli drobnoustrojów produkujących BC są hodowle wgłębne prowadzone w bioreaktorach mikrobiologicznych z wykorzystaniem płynnych podłoży hodowlanych. Hodowle w bioreaktorach przeprowadzane są w celu osiągnięcia większej wydajności procesu biosyntezy. Z tego względu, że ilość tlenu w pożywkach płynnych jest stosunkowo niewielka (co jest szczególnie niekorzystne dla bezwzględnych tlenowców, do których należy np.
Innym sposobem napowietrzania hodowli płynnych jest wtłaczanie powietrza pod ciśnieniem z użyciem kompresora podłączonego do bioreaktora, który wypełniony jest podłożem hodowlanym. Ten rodzaj napowietrzania stosuje się w hodowlach prowadzonych na skalę wielkolaboratoryjną, półprzemysłową oraz przemysłową. Zaobserwowano, że podczas hodowli drobnoustrojów z wykorzystaniem reaktora z uruchomionym mieszadłem, następuje formowanie BC w nieregularne grudki lub pasma włóknistej masy celulozowej. Otrzymaną w efekcie hodowli bioreaktorowej BC oddziela się od cieczy pohodowlanej i wytwarzających ją drobnoustrojów przez dekantację lub sączenie (filtrację), które zazwyczaj przeprowadza się poprzez przelewanie podłoża hodowlanego z wykształconą BC przez odpowiednie sączki lub bibuły filtracyjne [106]. W procesie oczyszczania wytworzonej BC wykorzystuje się wiele chemicznych i fizycznych właściwości, którymi uzyskany materiał różni się od znajdujących się zanieczyszczeń w podłożu hodowlanym. Jedną z tych cech jest odporność BC na działanie alkaliów. Dlatego jedną z najczęściej spotykanych metod oczyszczania wytworzonej BC jest działanie rozcieńczonymi roztworami alkalicznymi (np. 1% roztworem wodorotlenku sodu) w podwyższonej temperaturze (80–85°C). W powyższych warunkach następuje hydroliza zanieczyszczeń organicznych (np. komórek drobnoustrojów) [25, 71]. Innym sposobem oczyszczania BC, który bardzo często stanowi uzupełnianie hydrolizy alkalicznej w podwyższonej temperaturze, jest usuwanie osadów i zanieczyszczeń roztworami kwasowymi (np. z wykorzystaniem 6% kwasu octowego). W końcowym etapie procesu oczyszczania uzyskaną BC intensywnie przepłukuje się wodą destylowaną, aby nadać jej odczyn obojętny [95].
Celuloza bakteryjna jest naturalnym materiałem, który ze względu na unikatowe właściwości oraz możliwość otrzymywania przy wykorzystaniu nieskomplikowanych technik syntezy mikrobiologicznej, znajduje coraz szersze zastosowanie w wielu sektorach przemysłu spożywczego. Początek zastosowania BC w przemyśle spożywczym jest związany z pojawieniem się na początku lat 90. (początkowo na rynku japońskim i filipińskim) produktów żywnościowych z dodatkiem nata de coco, czyli tzw. „galaretki kokosowej” lub „żelu kokosowego”. W pierwszym okresie istnienia na rynku, żywność z dodatkiem nata de coco była oferowana konsumentom w postaci napojów i deserów, które pełniły rolę produktów dietetycznych, stanowiących źródło błonnika pokarmowego. Dodatkowym elementem żywności z rodzaju nata de coco, który zadecydował o jej atrakcyjności wizualnej, jest charakterystyczna dla produktów wysokobłonnikowych żelowa konsystencja tworząca się po kontakcie błonnika nierozpuszczalnego z wodą [19].
Najczęstszym substratem hodowlanym do mikrobiologicznej produkcji BC, wykorzystywanej w produktach nata de coco, jest woda kokosowa pozyskiwana z niedojrzałych orzechów kokosowych [2]. Woda kokosowa to mało stężony płyn, który pozyskuje się z młodych, jeszcze zielonych, nie w pełni dojrzałych owoców palmy kokosowej (
Proces syntezy BC z wykorzystaniem wody kokosowej (nazywany również systemem hodowli nata de coco) ma charakter tlenowy i przejawia się w formowaniu na powierzchni podłoża w trakcie 3-dniowej hodowli białawego, galaretowatego kożucha. Po oddzieleniu od płynu hodowlanego, uzyskaną błonę nanocelulozową poddaje się dokładnemu płukaniu przy użyciu wody destylowanej lub 0,9% roztworu NaCl [85]. Następnie wypłukana z resztek składników płynu hodowlanego BC poddawana jest (w celu unieszkodliwieniu drobnoustrojów) krótkotrwałej obróbce cieplnej, najczęściej wysokotemperaturowej pasteryzacji. W celu nadania odpowiedniej postaci konsumpcyjnej, skład produktów nata de coco jest uzupełniany odpowiednim rodzajem cukru, najczęściej sacharozą lub fruktozą. Przygotowane w powyższy sposób deserowe produkty spożywcze, jak np. puddingi, są dodatkowo wzbogacane kawałkami owoców (np. mango, liczi, pomarańczy, truskawki, melona i in.) lub ekstraktami owocowymi [10, 39].
Celulozę bakteryjną w postaci dodatku do żywności (kostek nata de coco) coraz częściej wykorzystuje się jako czynnik stabilizujący i poprawiający właściwości półpłynnych produktów żywnościowych. Wykazano, że BC wiąże we wnętrzu swojej struktury wodę i tym samym tworzy galaretowaty, lepki i żelowy materiał, który jest łatwy do dzielenia, np. w trakcie formowania kęsów. Dlatego BC o odpowiednio przygotowanej galaretowato włóknistej konsystencji może być surowcem wykorzystywanym do przygotowywania niskokalorycznych, atrakcyjnych sensorycznie produktów spożywczych, jak sałatki oraz desery [22].
Jednym z wielu zastosowań BC w tym obszarze jest stabilizacja układów heterogenicznych żywności, jakimi są emulsje typu olej w wodzie. Wykazano, że BC może być wykorzystywana jako stabilizator wytwarzając tzw. emulsję Pickeringa. Udowodniono, że BC dodana do żywności, obniża napięcie międzyfazowe między niemieszającymi się fazami układu dwufazowego (ciecz niepolarna – ciecz polarna). Jest to możliwe dzięki tzw. oleożelom (organożelom), czyli strukturom powstałym w wyniku ustabilizowania oleju w sieci wytworzonej przez medium żelujące, które charakteryzuje się lepką i sprężystą konsystencją [107]. Wykazano, że do powstania emulsji olejowo-wodnych w środowisku hydrofilowym konieczna jest obecność substancji żelujących, jak np. etyloceluloza czy też hydroksypropylometyloceluloza [18]. Najprawdopodobniej podobną funkcję spełnia również BC, która poprzez proces włączania cząsteczek oleju do wodnej zawiesiny celulozowego polisacharydu prowadzi do powstania emulsji typu olej w wodzie. Na tej podstawie istnieją możliwości wykorzystania BC jako preparatu stabilizującego emulsje wodno-olejowe w strukturze żywności [56]. Dzięki tej właściwości BC dodawana do produktów może pełnić rolę naturalnych i bezpiecznych dla konsumentów emulgatorów. W przypadku takich produktów jak surimi (czyli żywności powstałej na bazie rozdrobnionego i zmielonego mięsa ryb), obecność BC staje się elementem stabilizującym mieszaninę oleju, octu i nawodnionego proszku jajecznego [52].
Ciekawym rozwiązaniem, wykorzystywanym przez producentów wyrobów spożywczych, jest stosowanie w produkcji żywności deserowej i dietetycznej preparatów zawierających sproszkowaną BC. Tego rodzaju preparaty wykorzystywane są jako środek wypełniający, zagęszczający, teksturujący oraz redukujący ilość kalorii w żywności [60].
Celuloza bakteryjna może być również wykorzystywana w przemyśle spożywczym w charakterze substancji przedłużającej trwałość żywności. Substancją wykorzystywaną w tym celu jest pochodna celulozy w postaci karboksymetylocelulozy lub soli sodowej karboksymetylocelulozy. Karboksymetyloceluloza otrzymywana z nata de coco, określana jako karboksymetylo-nata, najczęściej jest przygotowywana w procesie eteryfikacji kwasem monochlorooctowym oraz późniejszej merceryzacji ługiem sodowym. Jedną z praktyk mającą na celu przedłużenie trwałości owoców po ich zbiorze jest pokrywanie ich powierzchni warstwą karboksymetylocelulozy. Badania wykazały, że powlekanie owoców papryki warstwą karboksymetylocelulozy, pozwala skutecznie ograniczyć utratę jędrności oraz wody z wnętrza tych owoców, nawet w sytuacji, gdy są one przechowywane w temperaturze 25°C przez 30 dni. Wyniki badań wskazują również, że powłoki z karboksymetylocelulozy pomagają zmniejszać szybkość dojrzewania owoców, np. papryki. Tym samym stosowanie tego polimeru może być skuteczną metodą opóźniania dojrzewania owoców. To działanie ma szczególne znaczenie w zachowaniu jakości surowców roślinnych podczas działań transportowych [81]. Podobny eksperyment z wykorzystaniem metylocelulozy potwierdził, że niejonowe etery BC zwiększają trwałość i świeżość kurzych jaj. Wykazano, że kurze jaja tuż po zbiorze, które były pokryte warstwą metylocelulozy i przechowywane w temperaturze poniżej 18°C, dłużej zachowywały świeżość aniżeli jaja kontrolne (niepokryte warstwą metylocelulozy). Zastosowana warstwa metylocelulozy pozwoliła zachować kurzym jajom świeżość powyżej 28 dni po zniesieniu [89].
Pochodne chemiczne BC mogą poprawiać właściwości reologiczne produktów żywnościowych. Pozyskana z BC hydroksypropylometyloceluloza (zwana również hypromelozą) może być stosowana do sporządzania mieszanek piekarniczych. Dzięki tej substancji (oznaczanej symbolem E 464), wypiekane pieczywo nie kruszy się i zachowuje wymaganą wilgotność. Dodatek hydroksypropylometylocelulozy do mąki bezglutenowej pozwala uzyskać w procesie wypieku pieczywo, które charakteryzuje się odpowiednią spoistością i elastycznością, których to brak jest dużą uciążliwością w procesie produkcji wypieków pozbawionych glutenu. Ze względu na opisane właściwości hydroksypropylometyloceluloza jest często stosowana również przy produkcji sosów, zup instant, deserów mlecznych oraz jogurtów. Wykorzystuje się ją również przy produkcji suplementów diety jako zamiennik żelatyny podczas wytwarzania zarówno twardych jak i miękkich kapsułek dla takich substancji, jak witaminy czy sole mineralne [105].
Ponadto zaobserwowano, że produkty spożywcze wzbogacone o inną pochodną BC – karboksymetylocelulozę, charakteryzują się korzystniejszymi właściwościami reologicznymi i teksturalnymi względem tradycyjnych produktów spożywczych. Karboksymetyloceluloza otrzymywana jest w wyniku katalizowanej alkalicznie reakcji oczyszczonej BC z kwasem monochlorooctowym. Obecnie w przemyśle spożywczym najpowszechniej stosowana jest sól sodowa karboksymetylocelulozy, którą otrzymuje się poprzez działanie chlorooctanu sodu na BC. Dzięki dodatkowi karboksymetylocelulozy niektóre produkty, jak np. wyroby cukiernicze i ciastkarskie, charakteryzują się sprężystą teksturą przypominającą teksturę niektórych owoców, jak np. winogron [14].
Obecnie podejmowane są również próby wytwarzania z BC opakowań dla produktów żywnościowych. Opakowania powstałe na bazie surowców biologicznych, jakim jest BC, stają się ogromną nadzieją dla przemysłu opakowaniowego ze względu na niskie koszty wytworzenia oraz ich niewielkie oddziaływanie na środowisko przyrodnicze. Z tego względu, że opakowania z BC są w pełni biodegradowalne, rozwiązania te stwarzają szansę na ich upowszechnienie i masowe wykorzystanie w przemyśle i gospodarstwie domowym [3, 85, 86]. Wykazano, że z kolei proces oksydacji (w którym następuje utlenienie grup hydroksylowych celulozy do grup aldehydowych, ketonowych lub karboksylowych) powoduje, że BC uzyskuje właściwości przeciwdrobnoustrojowe. Z tego powodu oksydowana BC może być potencjalnym składnikiem opakowań, które mają na celu przedłużenie trwałości mikrobiologicznej opakowywanego produktu spożywczego [90] (Tab. II).
Zastosowanie bionanocelulozy i jej pochodnych w przemyśle spożywczym
Lp. | Bionanoceluloza i jej pochodne | Zastosowanie w przemyśle spożywczym | Piśmiennictwo |
---|---|---|---|
1 | nata de coco | dietetyczny dodatek do deserów (jako źródło błonnika pokarmowego) stabilizator półpłynnych produktów żywnościowych | [2, 22] |
2 | etyloceluloza hydroksypropylometyloceluloza (hypromeloza) | ◆ stabilizacja emulsji typu olej w wodzie | [18] |
3 | hydroksypropylometyloceluloza (hypromeloza) | stabilizacja emulsji Pickeringa nadawanie spoistości i elastyczności cukierniczym produktom bezglutenowym składnik otoczki kapsułek dla suplementów diety substancja nadająca sprężystą teksturę produktom żywnościowym | [56, 105] |
4 | karboksymetyloceluloza | ◆ substancja przedłużająca jędrność owoców | [81] |
5 | metyloceluloza | ◆ substancja przedłużająca świeżość kurzych jaj | [89] |
6 | oksydowana celuloza | ◆ biodegradowalny materiał opakowaniowy o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych | [86] |
Możliwości zastosowania na szeroką skalę BC w przemyśle spożywczym są silnie uzależnione od skuteczności metod wytwarzania czystego i sterylnego materiału o odpowiednich właściwościach reologicznych. Właściwości te są z kolei silnie uzależnione od metody zastosowanej do produkcji BC. Hodowle wstrząsane prowadzone w inkubatorach wytrząsarkowych umożliwiają syntezę silnie rozgałęzionej, trójwymiarowej BC, o siatkowej strukturze, podczas gdy hodowle statyczne umożliwiają wytwarzanie płaskiej błony celulozowej o znacząco mniejszej ilości wewnętrznych rozgałęzień [48, 51]. Z kolei zastosowanie do produkcji BC bioreaktora (fermentora) i tym samym odpowiednich warunków tlenowych umożliwia osiągnięcie dużej szybkości i wydajności produkcji. Zastosowanie do produkcji bioreaktora umożliwia ponadto wytworzenie przez
Celuloza bakteryjna (bionanoceluloza) to unikalny materiał o szczególnych właściwościach, które sprawiają, że surowiec ten znajduje coraz więcej praktycznych zastosowań w różnych gałęziach przemysłu, w tym w przemyśle spożywczym. Niektóre rodzaje drobnoustrojów, jak np. bakterie kwasu octowego, mogą stanowić (w odniesieniu do roślin wyższych) alternatywne źródło celulozy, która wytwarzana jest w procesie tlenowej biosyntezy prowadzonej w warunkach statycznych, wstrząsanych, jak i bioreaktorowych. Zastosowanie tradycyjnych podłoży mikrobiologicznych (np. Hestrin-Schramm’a), ze względu na ich wysokie koszty i niską wydajność dla produkcji, stanowi silne ograniczenie ich komercyjnego wykorzystania na skalę przemysłową. Dlatego współcześnie prowadzone badania skupiają się na wykorzystaniu organicznych i nieorganicznych odpadów przemysłowych, które mogą być nowym, opłacalnych źródłem węgla dla drobnoustrojów produkujących BC. Dzięki temu mikrobiologiczna produkcja BC może stać się elementem niwelowania negatywnego wpływu przedsiębiorstw produkcyjnych na środowisko naturalne. Być może z tego powodu w przyszłości produkcja BC będzie ściśle powiązana z systemami produkcji innych materiałów, którym towarzyszy proces powstawania uciążliwych odpadów i zanieczyszczeń.