Potential clinical use of miRNA molecules in the diagnosis of prostate cancer

Występowanie raka prostaty (prostate cancer - PCa) ocenianego na świecie na ponad 3,6 mln to globalny problem medyczny [13]. Oszacowanie liczby PCa w USA w 2018 r. wykazało prawie 164 690 nowych przypadków i w przybliżeniu 29 430 zgonów z powodu PCa. Rak prostaty dotyka prawie 30% populacji mężczyzn w wieku powyżej 50 lat, ale tylko u 10% z nich zostanie rozpoznany rak istotny klinicznie (clinical significant prostate cancer - csPCa), wymagający leczenia [35]. Obecnie PCa jest rozpoznawany na podstawie badania DRE (digital rectal egzamination) palcem przed odbyt i stężenia PSA (prostate specific antigen), jako standardowego biomarkera w surowicy. Jednak DRE charakteryzuje się niską czułością, podczas gdy PSA jest narządowo-, a nie nowotworowoswoisty i ma małą dodatnią wartość predykcyjną (30–35%). Oznaczanie PSA ma więc niewielką swoistość, ponieważ jest swoisty dla gruczołu krokowego, a nie dla raka gruczołu krokowego [49]. Prawidłowe rozpoznanie PCa opiera się na histopatologicznej weryfikacji przez wykonanie wielomiejscowej, rdzeniowej biopsji stercza. Od dłuższego czasu, wielomiejscowa, systematyczna biopsja stercza (10–12 – pobieranych próbek – rdzeni tkankowych) jest uznawana za referencyjną, najlepszą metodę diagnostyczną, mimo niskiej wykrywalności raka, na poziomie 20–30%. Poza tym, jest procedurą inwazyjną z możliwością wystąpienia istotnych powikłań, takich jak krwawienie, zatrzymanie moczu, zakażenie, a nawet posocznica. Natomiast niewielka swoistość PSA jest przyczyną wykonywania niepotrzebnych biopsji, a także rozpoznań nowotworów o powolnym przebiegu, które nie wymagają radykalnego leczenia.

Testy z użyciem biomarkerów, stosowanych w diagnostyce raka prostaty, powinny być minimalnie inwazyjne. Na przykład, „płynna biopsja” (liquid biopsy), jako nowe narzędzie diagnostyczne, jest cennym źródłem biomarkerów (np. pozakomórkowe mikroRNA) i jest coraz częściej stosowana w praktyce klinicznej, jako alternatywa standardowych zabiegów inwazyjnych pozyskiwania tkanek/komórek nowotworu (biopsja). Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania nowych, nieinwazyjnych markerów umożliwiających:

wczesne wykrycie agresywnych nowotworów (csPCa), zwłaszcza gdy PSA jest poniżej 4 ng/ml;

Większość obiecujących biomarkerów PCa w moczu jest wykrywanych testami, np. ExoDx™ (Intelliscore, MA, USA), który wykorzystuje egzosomalny RNA, a mający zastosowanie w celu zmniejszania częstości wykonywania niepotrzebnych biopsji stercza. Test MiPS, wykrywa TMPRSS2: transkrypty fuzyjne genu ERG, które wydają się wskazywać na agresywność PCa po biopsji [50].

Test SelectMDx jest oparty na izolacji biomarkera mRNA w próbce moczu. Obecność mRNA HOXC6 i DLX1 umożliwia oszacowanie, zarówno obecności PCa w biopsji, jak i wystąpienie raka podwyższonego ryzyka (high risk PCa) [51]. Marker molekularny PCA3 (prostate cancer antigen 3) wykrywany w moczu (testem Progensa), w połączeniu z danymi klinicznymi pacjenta jest obecnie zawarty w wytycznych EAU (European Association of Urology), jako czynnik wskazujący na ewentualną konieczność wykonania powtórnej biopsji stercza [54].

Istnieją również testy mierzące określony panel kallikrein w surowicy lub osoczu, które są obecnie komercyjnie dostępne, np. PHI (prostate health index), który łączy trzy odmiany PSA: wolny-, całkowity-PSA i [-2]pro-PSA, czy 4KScore, który łączy cztery odmiany PSA: wolny, nienaruszony, całkowity i ludzką peptydazę 2[hK2]). Testy te są stosowane w celu zmniejszenia liczby zbędnych biopsji gruczołu krokowego u mężczyzn diagnozowanych za pomocą PSA [30].

Są również biomarkery wykrywane w tkankach za pomocą testów, takich jak: OncotypeDx(Genomic Health, Redwood, CA, USA), Prolaris^® (Myriad Genetics Inc., UT, USA), czy ProMark^® (METAMARK, MA, USA), które są przydatne do monitorowania agresywności guza. Natomiast test Decipher^® (GenomeDx, Vancouver, Kanada) ma zastosowanie w monitorowaniu przebiegu leczenia po operacji raka prostaty [2].

Głównym celem współczesnej medycyny jest więc opracowanie skutecznych i nieinwazyjnych nowych biomarkerów, zapewniających zarówno dokładną i wczesną diagnozę, jak i odróżniający postacie agresywne raka w celu zaplanowania zindywidualizowanej terapii [14].

W tym celu stosowane cząstki mikroRNA (miRNA, mRNA) mogą być najlepszymi biomarkerami, zwłaszcza ze względu na ich stabilność w płynach ustrojowych, wyjątkową odporność na działanie RNaz oraz trwałość w środowisku o skrajnych wartościach pH i temperatury. Cząsteczki miRNA to małe, niekodujące fragmenty RNA, które działają w wyciszaniu niektórych RNA, w mechanizmie potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów. miRNA odgrywają główną rolę w patogenezie PCa przez regulację genów zaangażowanych w głównych etapach nowotworzenia [28]. Molekuły miRNA związane z nowotworem biorą udział w międzykomórkowej komunikacji i rozprzestrzeniają się w płynach zewnątrzkomórkowych za pomocą egzosomów aby wpływać na inne, nieraz odległe komórki [3]. Niedawne badania wykazały, że większość ludzkich genów kodujących miRNA znajduje się w obszarach genomu, zwanych kruchymi miejscami (fragile sites), które są związane z onkogenezą.

Ekspresja miRNA koreluje z różnymi nowotworami i uważa się, że geny te działają zarówno jako supresory nowotworów, jak i onkogeny. Wskazuje to, że cząstki miRNA mogą odgrywać kluczową rolę w rozwoju i progresji raka.

Z tych względów badacze skoncentrowali się na analizie profili ekspresji molekuł miRNA i zaproponowali ich zastosowanie jako potencjalne biomarkery wielu chorób, w tym również raka stercza [14]. Umożliwi to w przyszłości spersonalizowaną terapię, ukierunkowaną molekularnie u pacjentów z PCa. W artykule przedstawiono najważniejsze cząstki miRNA i ich rolę w opiece nad pacjentami z PCa.

miRNA są małymi cząstkami (o długości 18–22 nukleotydów), endogennymi, jednoniciowymi, niekodującymi RNA. Funkcjonują jako regulatory ekspresji ponad 60% ludzkich genów kodujących białka. Liczba nowo odkrytych i zidentyfikowanych ludzkich miRNA stale wzrasta, obecnie wynosi ponad 2,5 tys. sekwencji. Dlatego miRNA są uznawane za jedną z najliczniejszych klas regulatorów genowych. Regulują geny na poziomie potranslacyjnym, przez swoiste rozpoznawanie i oddziaływanie na matrycowe RNA (mRNA). Negatywnie regulują ludzkie geny na jeden z dwóch sposobów, w zależności od stopnia komplementarności miRNA i mRNA (genu docelowego):

ich ujemny mechanizm regulacji, czyli proces wyciszania genów opiera się na niedoskonałym, niepełnym komplementarnym wiązaniu, z docelowymi cząstkami mRNA, do końca 3′ nici mRNA w regionie nieulegającym translacji (3′UTR). W ten sposób miRNA hamują ekspresję genu;

Ryc. 1

Ryc. 2

W 2007 r. Porkka i wsp. przyporządkowali określony profil ekspresji miRNA dla PCa [38]. Odtąd rozpoczęły się prace badawcze nad identyfikacją profili miRNA, dotyczących ich diagnostycznych, prognostycznych i predykcyjnych możliwości u pacjentów z rakiem prostaty [36].

Badania izolacji i charakterystyki miRNA opierają się na próbkach tkankowych lub płynach ustrojowych, ponieważ miRNA są wyjątkowo stabilne w surowicy, osoczu i moczu, co czyni je szczególnie przydatnymi w przypadku testów nieinwazyjnych. W płynach ustrojowych miRNA są chronione przed degradacją enzymatyczną przez połączenie ich w kompleksy z białkiem Argonaute 2, czy lipoproteiną o dużej gęstości (HDL), a także przez ich włączenie do lipidowych pęcherzyków pozakomórkowych (EV) [37].

Cząstki miRNA odgrywają główną rolę w patogenezie PCa [10, 11] przez regulację ekspresji genów zaangażowanych w szlak sygnałowy receptora androgenowego AR, cykl komórkowy, apoptozę, proces EMT (epithelial mesenchymal transition), w kontrolowanie macierzystości w komórkach raka (CSCs) oraz w powstawanie przerzutów (metastases) (ryc. 3). Są istotnymi obiektami do badań diagnostycznych i monitorowania progresji guza, w różnych jego stadiach zaawansowania.

Ryc. 3

W dostępnym piśmiennictwie [1, 10] autorzy wykazują, że określone cząstki miRNA są powiązane ze specyficznymi etapami patogenezy PCa, co przedstawiono w tab. 1 i 2.

W 2008 r. Mitchell i wsp. po raz pierwszy wykazali, że określone cząstki miRNA są obecne we krwi pacjentów z PCa. Istniejące w surowicy cząsteczki miR-141 umożliwiają odróżnienie pacjentów z PCa od zdrowych osób z dokładnością AUC = 0,907 z czułością 60% i przy 100% swoistości, w grupie 25 osób z PCa i 25 zdrowych osobników [36]. Od tego czasu w następnych badaniach wykazano możliwość odróżniania cząstek miRNA krążących we krwi pacjentów z PCa od pacjentów z innymi patologiami prostaty, a nawet do przewidywania agresywności PCa. Wśród wielu rodzajów miRNA, cząstki miR-21, miR-141 i miR-375 są najczęściej powtarzającymi się krążącymi miRNA stosowanymi w badaniach PCa [14].

Na podstawie wyników badań [39], autorzy stwierdzili, że połączenie miR-141, miR-21 i miR-375 odróżnia pacjentów z PCa (średnia PSA 21,3 ng/ml) od zdrowych mężczyzn przy wartości AUC=0,864, i czułości 93% przy swoistości 63%. Jednak grupy były małe (20 pacjentów z PCa vs. osiem osób zdrowych stanowiących grupę kontrolną), co wymagałoby dalszej weryfikacji, liczniejszej grupy pacjentów.

Rak gruczołu krokowego jest androgenozależny, dlatego szlak sygnałowy receptora androgenowego (AR - signaling) jest bezpośrednio zaangażowany w proces nowotworzenia i progresji choroby. miRNA biorą udział w sygnalizacji AR, która jest istotna zwłaszcza w progresji nowotworu do stadium raka prostaty opornego na kastrację CRPC (castrate resistant prostate cancer). W raku gruczołu krokowego często występuje nadekspresja miR-21, który jest nadmiernie wytwarzany. miR-21 sprzyja proliferacji i inwazji nowotworowej przez zahamowania ekspresji genów PTEN i PDCD4 [57]. Podobnie miR-32 jest związany ze szlakiem receptora androgenowego, który działa jako onkogen poprzez represję genu BTG2. BTG2 kontroluje cykl komórkowy i proces apoptozy.

Cząstki miRNA odgrywają również istotną rolę w patogenezie PCa przez wpływ na przejście epitelialno-mezenchymalne EMT. Podczas procesu EMT, komórki nabłonkowe tracą właściwości komórek nabłonkowych (np. adhezji komórkowej i polaryzacji), a nabywają cechy komórek mezenchymalnych, które ułatwiają proces inwazji i powstawanie przerzutów. Rozregulowanie mechanizmu EMT jest jednym z najważniejszych procesów leżących u podstaw przerzutowego PCa. E-kadheryny to białka powierzchniowe komórki, przeznaczone do ustalenia i utrzymywania komórek - interakcji komórek i są uważane za wyznaczniki stanu nabłonka. W badaniach PCa wykazano, że nieprawidłowy przebieg procesu EMT jest związany z utraconą lub zmniejszoną ekspresją E-kadheryn. Niektóre miRNA biorą udział w regulacji EMT, działając jako gen supresorowy (family miR-200) lub oncogen (oncomiR - np. miR-34b) (tabela 2).

CSCs są małym podzbiorem populacji macierzystych komórek nowotworowych – wykazujących zdolność regeneracji, różnicowania, a nawet oporności na leczenie. Są zaangażowane w progresję nowotworu i powstawanie przerzutów. Przykładem miRNA regulującego CSCs w nowotworach prostaty jest miR-35 [26].

Nieprawidłowa regulacja cyklu komórkowego jest cechą kancerogenezy często skorelowaną z dysfunkcją miRNA, które kontrolują określone geny biorące udział w cyklu komórkowym. Główną rolę w regulacji cyklu komórkowego, odgrywa gen CCND1, co podkreślono w licznych badaniach dotyczących miRNA, które bezpośrednio lub pośrednio regulują jego ekspresję. Najczęściej występują w postaci klaster-miR. Najbardziej reprezentatywne klaster-miR to: miR-15/16; miR-221/222; miR -let- 7a, miR-24 i miR-31. Klaster miR-15a/16 jest często wyciszany w zaawansowanym PCa. Pełnią funkcję tłumiącą w PCa związaną z wpływem na gen CCND1, który bierze udział w przejściu faz cyklu komórkowego G1/S. Ponadto miR-15a/16 hamuje ekspresję genów WNT3A i BCL2, które uczestniczą w proliferacji komórek i oporności na apoptozę [5]. Klaster miR-221/222 działa jako onkogen i promuje postęp cyklu komórkowego i proliferację komórek PC3 agresywnych, przez represję kinazy zależnej inhibitora p27Kip1. Jednak dane dotyczące ekspresji miR-221/222 są zmienne. Funkcja ich może być również hamowana, jak wykazano, w niektórych analizach klinicznych PCa [16].

Inną, ważną sygnaturą miRNA, biorącą udział w cyklu komórkowym, jest family let-7. let-7a należy do rodziny supresorów nowotworowych i ulega represji w tkankach i liniach komórkowych PCa. Dong i wsp. udowodnili, że let-7a reguluje negatywnie E2F2 i CCND2, a to zatrzymuje cykl komórkowy w fazie G1/S w komórkach PC3 i LNCaP [12].

Tinay i wsp. stwierdzili istotną nadekspresję miR-9-3p, miR-330-3p-3p i miR-345-5p u pacjentów z PCa (n=25) w porównaniu do zdrowych mężczyzn (n=20). Dalszej analizie poddano miR-345-5p ze względu na bezpośrednie ukierunkowanie działania na CDKN1A - inhibitor kinazy p21 [48]. Wang i wsp. badali rozregulowanie miR-487a-3p w PCa. Testy in vitro i in vivo umożliwiły zrozumienie, że miR-487a-3p hamuje wzrost guza przez działanie bezpośrednio na CCND1 [52].

Opisano również profile miRNA związane z proliferacją komórek PCa, powodujące złośliwy rozwój i progresję choroby. Ogólnie rolę miRNA w proliferacji komórek PCa badano w tkankach prostaty i/lub w linii komórek raka prostaty. Istnieje kilka sygnatur miRNA ulegających wyciszaniu i działających jak geny supressorowe, np.: miR-139 [47], miR-202 [59] i miR-211 [20]. Zhang i wsp. wykazali, że miR-202 był istotnie mniej wytwarzany. Natomiast nadmierna ekspresja miR-202 przeniesionego na linie komórek PCa znacząco hamuje proliferację komórek przez wyciszanie docelowego genu PIK3CA [59].

W moczu wzorce miRNA swoiste dla PCa można wykryć w egzosomach za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS) i RT-qPCR (reverse transcription polymerase chain reaction). Na przykład stężenia miR-196a-5p i miR-501-3p były znacznie obniżone we wstępnym badaniu 28 pacjentów z PCa (GS > 7) w porównaniu z 19 zdrowymi mężczyznami [41].

W większym badaniu, obejmującym 215 pacjentów z PCa, 23 pacjentów z BPH i 62 bezobjawowych osób kontrolnych, Stuopelyte i wsp. wykryli 100 z 754 skanowanych miRNA deregulowanych w PCa. miR-148a i miR-375 były najliczniejszymi miRNA w moczu i wykazywały dużą czułość i swoistość (odpowiednio 85,31 i 65,22%), z AUC=0,79 w różnicowaniu między pacjentami z PCa (n=72) i BPH (n=23). W połączeniu z PSA w surowicy, AUC wyniosło 0,85, z czułością 84,29% przy swoistości 76,19%. W szarej strefie PSA - 4 - 10 ng/ml, AUC wzrosło do 0,90 z wrażliwością 83,87% i przy swoistości 81,82% [46].

Brak jest jednak uznanych swoistych sekwencji miRNA zapewniających dużą korzystną wartość predykcyjną (PPV) do wykrywania raka stercza wysokiego ryzyka. Największa negatywna wartość predykcyjna (NPV) wynosząca 0,939 pozwala przewidzieć nieobecność raka wysokiego ryzyka w porównaniu do BPH, co raportowano dla panelu 14-miRNA: miR-24, 26b, 30c, 93, 100, 103, 106a, 107, 130b, 223, 146a, 451, 874 i let-7a [34]. Niemniej jednak zaobserwowano niewielką odtwarzalność podanych wyników. Tylko kilka badań obejmowało odkrycie biomarkerów, walidację i zastosowanie wyników w dużych niezależnych prospektywnych badaniach, starannie rozważając wszystkie etapy od pobrania próbki do przechowywania i analizy. Metody sekwencjonowania nowej generacji, które porównują poziomy miRNA w tkankach nowotworu z prawidłowymi tkankami, będą przydatne do identyfikacji nowych miRNA, które są zaangażowane w powstawanie i rozwój raka stercza. Duża liczba sygnatur miRNA jest rozregulowana w PCa, ale tylko niektóre panele mogą zróżnicować raki wysokiego od niskiego ryzyka. Problem należy rozpoznać za pomocą szczegółowych badań.

Zrozumienie i poznanie roli miRNA w rozwoju raka gruczołu krokowego może doprowadzić do powstawania nowych sposobów leczenia opartych na technologii cząstek miRNA, jako leczenia ukierunkowanego molekularnie (targeted therapy). Główna terapia zastosowania molekuł miRNA obejmuje:

miRNA naśladujące (miRmimic) - techniki z użyciem syntetycznych oligonukleotydów miRNA, które działają jako supresory onkogenów,

Wstępne badania kliniczne wykazały potencjalne zastosowanie cząstek miRNA w chemioterapii (opartej na taxanach) i radioterapii PCa. Właściwości niektórych cząstek miRNA wykorzystywanych w radioterapii raka, to: -

miR-124 i miR-144 mogą zmniejszać hipoksję - wywołując proces autofagii, a dzięki temu zwiększyć czułość komórek PCa na promieniowanie przez zmniejszenie PIM1 [19],

Niektóre, syntetyczne miRNA mogą zwiększać wrażliwość na paklitaksel w liniach komórkowych PCa przez celowanie w YES1, gen zaangażowany w proliferację komórek i oporność na apoptozę. Na przykład, miRNA - miR-199a [57], miR-217, miR-181b [58], miR-451 [59], zwiększają wrażliwość na paklitaksel, kabazytaksel w liniach PCa.

miR-34 może kontrolować kilka procesów biologicznych, takich jak cykl komórkowy, apoptozę, przerzuty i macierzystość raka. To jest powód, dla którego mimiczne oligonukleotydy miR-34 zostały opracowane i z powodzeniem zastosowane w ksenoprzeszczepach myszy jako terapeutyczne cząstki miRNA. Układowe dostarczanie mimicznych oligonukleotydów miR-34 było skuteczne w blokowaniu komórek raka do wzrostu w mysich modelach heteroprzeszczepu [26].

Podjęto wiele prób badawczych, na modelach zwierzęcych PCa, w których modulacja pojedynczych miRNA wpływała na proliferację i rozwój nowotworu. Wykazano, że zmniejszona ekspresja klastrów miR-15/16 i zwiększenie ekspresji miR-21 są krytycznymi zdarzeniami w powstawaniu przerzutów PCa [6]. let-7a i miR-200b hamują rozwój nowotworu prostaty in vivo [12, 18]. Inną rolę miR-221/222 w proliferacji komórek i kontroli wzrostu wykazano in vitro [55]. Dlatego let-7a, miR-15/16, miR-21, miR-141, miR-143, miR-145, miR-199a-3p, miR-200b, miR-221/222 można zaproponować jako potencjalne narzędzia teranostyczne w PCa.

Opracowanie nowej strategii stosowania biomarkerów w diagnostyce i rokowaniu PCa jest pilnie potrzebne ze względu na ograniczenia stosowanych metod diagnostycznych. Wczesne rozpoznanie raka i prognozowanie są ważnymi elementami w podjęciu decyzji terapeutycznej.

miRNA są liczną klasą negatywnych regulatorów genów, które, jak wykazano, kontrolują szeroki zakres funkcji biologicznych. Najnowsze dane sugerują, że cząsteczki miRNA mogą w najbliższej przyszłości stać się obiecującymi nieinwazyjnymi biomarkerami w diagnostyce PCa.

W artykule podsumowano najistotniejsze cząstki miRNA, które biorą udział w głównych etapach onkogenezy i progresji PCa. Ich potencjał do ujawniania istotnych klinicznie zmian już na bardzo wczesnym etapie rozwoju raka, w porównaniu do zdrowych komórek, jest zachęcający do tworzenia nowych biomarkerów diagnostycznych i rokowniczych. Profilowanie ekspresji miRNA okazało się bardziej dokładnym sposobem klasyfikowania podtypów raka niż za pomocą profili ekspresji białka. Odpowiednie charakterystyki profili cząstek miRNA, w obrębie różnych podtypów nowotworu, ułatwiają tworzenie spersonalizowanej diagnostyki.

Ponadto, cząstki miRNA stanowią potencjalną opcję terapeutyczną w całej onkologii, stając się powoli postacią personalizowanej terapii. Podejścia terapeutyczne opierają się na zastosowaniu miRmimic, w celu naśladowania aktywności endogennego miRNA, wytwarzanego w zbyt małej ilości lub antagomiR, w celu stłumienia funkcji nadmiernie wytwarzanego oncomiRNA.

Rosnąca liczba bardziej zaawansowanych badań, a także standaryzacja metod analizy, zapewne umożliwi pozyskanie nowych narzędzi diagnostycznych do rozpoznawania i prognozowania raka stercza. miRNA, odgrywające rolę w mechanizmach karcynogenezy, mogą być nową grupą biomarkerów, pomocnych w ocenie stanu choroby oraz skuteczności leczenia na różnych etapach jej zaawansowania.