Niewątpliwym osiągnięciem medycyny, a także szeroko pojętego rozwoju społeczno-techniczno-ekonomicznego jest wydłużenie czasu życia ludzi w ciągu kilku ostatnich dekad. Jednak demograficzne starzenie się ludności Europy i wielu innych regionów świata pozostaje w ścisłym związku z częstszym występowaniem chorób neurologicznych, w tym chorób otępiennych i zaburzeń motorycznych. Według danych WHO [24], otępienie (demencja) jest jedną z głównych przyczyn niepełnosprawności wśród osób po 65. roku życia. Wprawdzie w krajach rozwiniętych, zachorowalność na choroby neurodegeneracyjne zmniejsza się, to jednak z powodu rosnącego udziału ludzi starszych w większości społeczeństw, bezwzględna liczba chorych rośnie.
Choroby otępienne i zespoły zaburzeń motorycznych to nie tylko poważny problem medyczny i społeczny, wiążą się także z wysokimi kosztami opieki medycznej. Dane epidemiologiczne wykazują, że najczęstszą przyczyną otępienia jest choroba Alzheimera (AD), na którą w skali świata cierpi około 24 milionów ludzi, głównie w wieku między 65. a 85. rokiem życia. Prognozy wskazują, że w ciągu kolejnych 20 lat liczba osób z AD może ulec podwojeniu. Drugą najczęściej występującą chorobą neurodegeneracyjną jest choroba Parkinsona (PD). Zachorowalność na PD, podobnie jak na AD, jest związana z wiekiem, a częściej zapadają na nią mężczyźni niż kobiety. Różnice wieku, w którym rozpoznaje się AD i PD są powodowane współistniejącymi czynnikami ryzyka oraz mutacjami genowymi, odpowiedzialnymi za występowanie rodzinnej postaci tych chorób [90]. Trzecią, co do liczby przypadków chorobą, jest otępienie czołowo-skroniowe (FTD) o tzw. wczesnym początku. Średnia wieku pacjentów z rozpoznaniem FTD wynosi około 56 lat, przy czym odnotowano także przypadki, kiedy objawy choroby wystąpiły u osób poniżej 50 roku życia. Czas przeżycia chorych na FTD jest porównywalny z długością życia chorych na AD. Jedną z rzadszych chorób neurodegeneracyjnych jest zanik wieloukładowy (MSA) powodowany zwyrodnieniem neuronów ośrodkowych, a także nerwów autonomicznych. Choroba rozwija się najczęściej w szóstej dekadzie życia. W przebiegu tego schorzenia najczęściej dominują objawy parkinsonizmu, ale mogą także wystąpić zespoły móżdżkowe i autonomiczne, dlatego rozpoznanie MSA jest trudne, natomiast postęp choroby jest szybszy niż w PD.
Etiologia zespołów otępiennych i zaburzeń czynności ruchowych ma charakter wieloczynnikowy. Obejmuje czynniki genetyczne, immunologiczne oraz metaboliczne, i jest silnie skorelowana z wiekiem, współistniejącymi chorobami, rodzajem diety, sposobem życia oraz szkodliwymi czynnikami środowiskowymi. Choroby neurodegeneracyjne o najgroźniejszym przebiegu są spowodowane niszczeniem neuronów przez białka, które nabyły właściwości patologicznych i są przyczyną degeneracji neuronów i atrofii struktur mózgu. Do najczęściej występujących proteinopatii zalicza się synukleinopatie, tauopatie oraz proteinopatie TDP-43 (transactive response DNA-binding protein 43 kDa). Histopatologiczne cechy proteinopatii obejmują nieprawidłowe fałdowanie, a następnie charakterystyczny dla każdego białka sposób agregacji oraz zróżnicowane rozmieszczenie neuroanatomiczne patologicznych złogów w mózgu. Zmiany właściwości α-synukleiny (ASN) określane jako synukleinopatia, powodują tworzenie się w neuronach, a także w komórkach glejowych, ciał Lewy’ego. Nieprawidłowe potranslacyjne modyfikacje białka tau prowadzą do wadliwego funkcjonowania transportu aksonalnego oraz do akumulacji tau w postaci splątków neurofibrylarnych (NFTs) oraz ciałek Picka, które zaliczane są do tauopatii. Natomiast rybonukleoproteina TDP-43 po nabyciu patologicznych właściwości w wyniku różnych modyfikacji, gromadzi się w cytoplazmie neuronów w postaci włókienek i jest przyczyną degeneracji, szczególnie neuronów ruchowych [29]. Każda z proteinopatii powoduje rozwój innych chorób neurologicznych (tabela 1). Jednak trzeba podkreślić, że zarówno u pacjentów ze zdiagnozowaną chorobą neurodegeneracyjną, jak i u ludzi starszych bez objawów demencji, badania mózgu
Proteinopatie i choroby spowodowane dominującą agregacją patologicznego białka
Synukleinopatia | Choroba Parkinsona (PD) |
Otępienie z ciałami Lewy’ego (DLB) | |
Zanik wieloukładowy (MSA) | |
Tauopatia | Choroba Alzheimera (AD) |
Choroba Picka (PiD) | |
Otępienie czołowo-skroniowe i parkinsonizm sprzężony z chromosomem 17 (FTDP-17) | |
Przewlekła encefalopatia pourazowa (CTE) | |
Postępujące porażenie nadjądrowe (PSP) | |
Zwyrodnienie korowo-podstawne (CBD) | |
Otępienie z ziarnami argentofilnymi (AGD) | |
Proteinopatia TDP-43 | Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) |
Otępienie czołowo-skroniowe z inkluzjami TDP-43 (FTLD-TDP) |
Mimo znacznego postępu w zrozumieniu mechanizmów prowadzących do zwyrodnienia neuronów i coraz bardziej szczegółowej diagnostyki neuroobrazowej, a także oznaczania swoistych markerów biochemicznych w krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym, brak jest celowanych terapii. Pacjentów leczy się objawowo, a rozpoznanie oraz różnicowanie choroby nie należy do łatwych i trwa stosunkowo długo. Dlatego potencjalne strategie opóźniające postępowanie demencji lub hamowanie progresji choroby są przedmiotem intensywnych badań na całym świecie.
Po raz pierwszy ASN została wykryta przez Maroteaux i wsp. [70] w neuronach szczura, jako białko identyczne z białkiem synaptosomów drętwy elektrycznej (
ASN jest zbudowana ze 140 aminokwasów i razem z β-synukleiną (134 aminokwasów) oraz γ-synukleiną (127 aminokwasów) tworzy rodzinę małych, swoistych dla kręgowców białek [96]. W każdej z synuklein wyróżnia się trzy regiony funkcyjne (ryc. 1A):
konserwatywny, amfipatyczny N-koniec, który wchodzi w interakcję z fosfolipidami błonowymi; centralny, obejmujący hydrofobową domenę NAC (non amyloid-β component of Alzheimer’s disease plaques), która odpowiada za zdolność synukleiny do samoistnej agregacji oraz zmienny, o ujemnym ładunku region C-końcowy.
W obrębie N-końca oraz w części regionu NAC występują 11-aminokwasowe powtórzenia ze stałym motywem KTKEGV, które tworzą drugorzędową strukturę w postaci amfipatycznej α-helisy charakterystycznej dla domeny wiążącej lipidy w apolipoproteinach klasy A2 [53]. W α- oraz w β-synukleinie tych powtórzeń jest sześć, a w γ-synukleinie o jedno więcej. Taki rytm powtórzeń umożliwia zachowanie struktury monomerycznej cząsteczki, redukuje jej tendencję do fałdowania i tworzenia agregatów białka.
W warunkach fizjologicznych i bez działania czynników fizycznych czy chemicznych, natywna forma ASN ma postać nieuporządkowanego, rozpuszczalnego monomeru, który przyjmuje formę kompaktową, żeby chronić domenę NAC przed interakcją z białkami cytozolowymi, co mogłoby spowodować samoagregację białka. Odkąd w warunkach niedenaturujących wyizolowano ASN o większej masie cząsteczkowej (58 kDa), część badaczy sugeruje, że natywna cząsteczka ASN może mieć też formę tetramerową, i w warunkach fizjologicznych wraz z formą monomerową koegzystuje w równowadze do czasu pojawienia się czynnika agregującego. Natomiast badania struktury ASN z użyciem elektronowego rezonansu spinowego wykazały, że podczas interakcji między hydrofobowymi resztami amfipatycznymi N-końca a lipidami błonowymi powstaje multimerowa konformacja α-helikalna [73], a ułożenie części helikalnej cząsteczki ASN zależy od krzywizny błony lipidowej. Na silnie wygiętych błonach liposomów helikalny N-koniec ASN jest sfałdowany, a na bardziej płaskich błonach, jest prosty [8]. Prawdopodobnie dzięki zmiennym interakcjom z różnymi fosfolipidami błon, amfipatyczna helisa ASN dostosowuje się do krzywizn błon pęcherzyków synaptycznych. Z powodu zróżnicowanych wyników pomiaru wielkości różnych struktur konformacyjnych cząsteczki ASN obecny paradygmat zakłada, że ASN występuje w komórkach w postaci mieszaniny różnych nieustrukturyzowanych monomerów oraz helikalnych oligomerów, częściowo sfałdowanych w wyniku interakcji z fosfolipidami błon [8]. Nie wiadomo jednak, która konformacja ASN jest bardziej podatna na patologiczną agregację i tworzenie amyloidowych fibryli.
Fizjologiczna funkcja ASN nie jest dokładnie poznana. ASN bierze udział w uwalnianiu neurotransmiterów z pęcherzyków synaptycznych oraz ułatwia ich dynamiczny obrót w zakończeniach aksonów, niezbędny do zapewnienia homeostazy synaptycznej. Kilka zespołów badawczych wykazało, że ASN uczestniczy w prawidłowym działaniu kompleksu białek SNARE w zakończeniach presynaptycznych [11] oraz może działać jako regulator dokowania pęcherzyków synaptycznych do błony presynaptycznej wiążąc się z synaptobrewiną 2 [17] lub z Raszależną GTPazą Rab3a [14]. Wykazano także, że ASN chroni neurony dopaminergiczne przed apoptozą hamując zależną od acetylotransferazy histonów p300 transaktywację czynnika transkrypcyjnego NF-κB i ekspresję proapoptotycznej izoformy kinazy PKCδ [55]. Są także wyniki wskazujące na udział ASN w procesach różnicowania i wzrostu komórek, ponieważ aktywuje inhibitor kinazy Ras i zmienia aktywność kaskady sygnalizacyjnej Ras/MAPK/ERK [42].
Strukturę cząsteczki ASN może destabilizować wiele czynników. Do najważniejszych zalicza się: modyfikacje potranslacyjne (fosforylacja, glikacja, glikozylacja i acylacja), stres oksydacyjny, zaburzenia funkcjonowania mitochondriów, oddziaływanie z innymi białkami neuronalnymi i przekaźnikami katecholaminowymi, zwiększenie cytoplazmatycznego stężenia jonów Ca2+ i aktywacja kalmoduliny, a także dysfunkcja systemu ubikwitynacji i proteasomalnej degradacji białek [105]. Eksperymenty prowadzone w celu poznania mechanizmów agregacji ujawniły kilka stanów konformacyjnych ASN, począwszy od monomerów, przez pośrednie formy oligomeryczne, aż do amyloidogennych fibryli. Początkowe etapy agregacji ASN polegają na zmianach organizacji natywnej domeny NAC. Akceptowana jest hipoteza, że interakcja między środkową hydrofobową domeną NAC i C-końcem w cząsteczce ASN hamuje agregację białka, ponieważ domena NAC łatwo ulega przekształceniu w strukturę β-kartki [73]. Szczególnie odcinek między 71 a 82 aminokwasem w domenie NAC został zidentyfikowany jako region odpowiedzialny za tworzenie toksycznych włókien ASN. Zaburzenia interakcji w obrębie cząsteczki sprzyjają tworzeniu heterogennej populacji pośrednich konformacji białka, zwanych łącznie oligomerami. Z oligomerów ASN tworzą się protofibryle, a na skutek agregacji protofibryli, powstają dojrzałe fibryle amyloidowe. Wciąż niewyjaśnione pozostaje znaczenie poszczególnych przejściowych etapów agregacji ASN i roli różnych form agregacyjnych ASN w procesach neurodegeneracji. Zarówno oligomery, które łączą się z błonami pęcherzyków synaptycznych i zaburzają procesy neurotransmisji, jak i fibryle ASN są dla komórek toksyczne [36]. Analiza filogenetyczna paralogów synuklein ujawniła, że począwszy od linii ryb mięśniopłetwych ASN ma strukturę inherentnie nieuporządkowaną i skłonną do samoagregacji w wyniku zmiany składu aminokwasów w regionie 32–58 domeny N-końcowej, która oddziałuje z fosfolipidami błonowymi [94].
Na zmiany konformacji ASN wpływają także interakcje z innymi białkami w komórce. Obecność chaperonu 14-3-3 radykalnie hamuje proces agregacji amyloidowych form ASN oraz redukuje cytotoksyczność oligomerów i pośrednich stadiów agregacji, jeśli stężenie ASN nie przewyższa stężenia chaperonu w komórce [85]. W najnowszych badaniach kinetycznych agregacji białek syntetyzowanych na matrycy różnych konstruktów genowych, z użyciem techniki NMR i narzędzi bioinformatycznych, wykazano obecność dwóch krótkich motywów, 7- i 12-aminokwasowych w N-końcowym regionie sąsiadującym z domeną NAC. Co istotne: okazały się one ważne zarówno dla zwiększenia agregacji i toksyczności ASN, jak i dla zachowania jej fizjologicznych funkcji [28].
Patologiczne oligomery ASN niszczą głównie neurony dopaminergiczne, dlatego wiele badań dotyczy zaangażowania ASN w regulację homeostazy dopaminy w mózgu i patologii neuronów dopaminoergicznych w istocie czarnej śródmózgowia. Ustalono, że zwiększona zawartość ASN w neuronach hamuje aktywność hydroksylazy tyrozyny dzięki zwiększeniu aktywności fosfatazy 2A (PP2A) i prowadzi do zahamowania syntezy dopaminy [112]. Ponadto, nadekspresja ASN w neuronach istoty czarnej upośledza transport dopaminy przez transportery VMAT2 zwiększając jej stężenie w cytozolu oraz drastycznie hamuje wychwyt zwrotny dopaminy ze szczeliny synaptycznej przez transporter dopaminy DAT [69]. Do degeneracji neuronów dopaminoergicznych przyczynia się także sama dopamina, która jest podatna na degradację. W pęcherzykach transportowych powstają z dopaminy toksyczne dla mitochondriów chinony i semichinony oraz reaktywne formy tlenu, prowadząc do postępującej degeneracji neuronów szlaku istota czarna-prążkowie.
Ludzka ASN kodowana jest przez gen
Różnorodne składanie genu
Wiele badań poświęcono zmianom w strukturze
Inne mutacje odkryte u młodych chorych na PD to A53E oraz G51D [30, 76], a u starszych chorych H50Q [61]. Białko G51D-ASN ma obniżoną zdolność agregacji i wiązania się z błonami [30], natomiast H50Q-ASN ma prawidłowe właściwości wiązania z fosfolipidami błon, ale dużą łatwość tworzenia fibryli [61]. Mutacja A53E powoduje wolniejszą agregację białka oraz cytotoksyczność zbliżoną do natywnej postaci ASN. Jednak udowodniono, że nadekspresja A53E-ASN w neuronach powodowała tworzenie większej ilości oligomerów w obecności dopaminy i rotenonu, doprowadzając do nasilonego tworzenia reaktywnych form tlenu i obniżenia potencjału mitochondrialnego [76]. Te wyniki wskazują, że za dużą toksyczność zmutowanego białka A53E może odpowiadać nie tyle jego większa zdolność do agregacji, co indukowanie stresu oksydacyjnego w neuronach. W sporadycznej postaci PD zidentyfikowano dwie kolejne mutacje: A18T oraz A29S, w wyniku których alanina jest zastąpiona odpowiednio przez treoninę i serynę. Obie zmutowane formy ASN są bardziej podatne na agregację niż natywna cząsteczka ASN [64]. Zmiany w strukturze cząsteczki ASN w wyniku mutacji genu
W przypadku duplikacji genu
Białko tau zostało odkryte w latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku w aksonach neuronów kręgowców i razem z MAP2 (microtubule-associated protein-2) jest jednym z małych białek współpracujących z mikrotubulami (MT) [6]. Od kiedy helikalne filamenty tau wykryto w mózgach chorych na AD badania tego białka znacznie przyspieszyły. Tau jest dobrze rozpuszczalnym białkiem i nie ma zdefiniowanej struktury drugorzędowej. W zależności od izoformy, zbudowane jest z 352 do 441 aminokwasów [6]. W cząsteczce tau wyróżnia się trzy domeny:
N-końcową kwaśną domenę projekcyjną (projection domain), która zawiera zmienną liczbę tzw. insertów N; domenę bogatą w prolinę (PRR); oraz C-końcową domenę wiążącą tau z MT (assembly domain, MTBD), która zawiera powtórzenia amino-kwasowe (R).
Strukturę najdłuższej izoformy tau (2N4R) przedstawiono na ryc. 2A.
Duża zmienność cząsteczki tau wynika z jej licznych potranslacyjnych modyfikacji oraz wielu oddziaływań każdej domeny oddzielnie. Gauthier-Kemper i wsp. [39] wykryli, że N-koniec cząsteczki tau wiąże się z aneksyną A2 w sposób zależny od Ca2+, a wcześniej Brandt i wsp. [10] opisali współdziałanie tej domeny z błoną neuronów. Ponadto wykazano interakcje N-końcowych motywów tau z syntaksyną-1 i synaptogaminą-1, z białkami rodziny 14-3-3 oraz aneksyną A5 [98]. Dlatego przypuszcza się, że N-koniec tau pełni rolę łącznika między błoną aksonów a MT. Obszar bogaty w prolinę, znajdujący się między domenami projection i assembly, wiąże się z różnymi kinazami zawierającymi domenę SH3, a także jest głównym regionem potranslacyjnych modyfikacji białka. W regionie MTBD znajdują się konserwatywne powtórzenia R1-R4 oraz C-koniec o charakterze zasadowym. Stąd cząsteczka tau ma charakter dipola i kształtem przypomina spinacz chroniący ją przed agregacją. Mimo niewielkiej skłonności do agregacji w porównaniu do α-synukleiny, białko tau łatwo wchodzi w interakcje z wieloma białkami partnerskimi, które zmieniają jego konformację i sprzyjają jego agregacji.
W aksonach tau współdziała z białkami motorycznymi (kroczącymi), które transportują wzdłuż mikrotubul organelle, pęcherzyki z transmiterami, kompleksy białkowe i wiele innych molekuł. Przyjmuje się, że N-koniec tau jest odsunięty od mikrotubul [46] i chętnie oddziałuje z innymi białkami. W warunkach fizjologicznych tau jest potranslacyjnie modyfikowane, co determinuje jego sposób działania, lokalizację w komórce, konformację oraz interakcję z innymi białkami. Najczęstszą modyfikacją tau jest fosforylacja, co wynika z dużej liczby możliwych miejsc fosforylacji oraz dużej łatwości wiązania tau z kinazami i fosfatazami w regionie bogatym w prolinę. W najdłuższej izoformie tau (2N4R) znajduje się około 85 potencjalnych miejsc fosforylacji seryny, treoniny i tyrozyny [6]. W mózgu płodu wykazano większy stopień fosforylacji tau niż w mózgu dorosłego człowieka, co może świadczyć o innej dynamice transportu aksonalnego podczas procesów różnicowania i organizacji neuronów we wczesnych stadiach rozwojowych ośrodkowego układu nerwowego (OUN) [108].
Fizjologiczne działanie tau zależy od ściśle regulowanej, dynamicznej fosforylacji i defosforylacji, które decydują odpowiednio o przyłączaniu i odłączaniu tau od MT, co przekłada się na dynamikę procesów transportowych oraz stabilność MT. Tau współpracuje z kinezynami transportującymi w kierunku plus MT (odśrodkowo, do zakończenia aksonu) i dyneinami transportującymi w kierunku przeciwnym (dośrodkowo, do ciała neuronu). Tau współzawodniczy z motorami molekularnymi o miejsce wiązania z MT, redukując częstość ich wiązania z MT, ruchliwość motorów oraz długość odcinków MT, po których przemieszczają się kinezyna i dyneina. Silniejsze działanie hamujące tau wykazano w stosunku do kinezyny niż do dyneiny, co może odpowiadać za akumulowanie organelli, np. mitochondriów w ciele neuronu w przypadku nadekspresji tau [27]. Mimo że wszystkie badania
Stopień fosforylacji tau zależy od aktywności wielu kinaz i fosfataz. W tabeli 2 przedstawiono listę kinaz fosforylujących tau sklasyfikowanych w trzy grupy: kinazy zależne od proliny (PDPKs), kinazy niezależne od proliny (non-PDPKs) oraz kinazy tyrozynowe (TKs) [71]. Najważniejszymi fosfatazami defosforylującymi tau są: fosfataza białek 1 (PP1), PP2A, PP2B (kalcyneuryna) oraz PP5 [66]. W mózgu ludzkim największą aktywność wykazano dla PP2A (prawie 70% aktywności fosfatazowej), której aktywność u pacjentów z AD jest dużo niższa [40]. W związku z tym obniżenie aktywności fosfataz jest uznawane jako jedna z przyczyn patologicznej hiperfosforylacji tau.
Kinazy fosforylujące tau
Kinazy zależne od proliny (PDPKs) | syntaza glikogenu 3 (GSK-3) |
kinaza zależna od cykliny 5 (CDK5) | |
kinaza JNK | |
Kinazy niezależne od proliny (non-PDPKs) | kinaza aktywowana monofosforanem adenozyny (AMPK) |
kinaza kazeinowa 1 (CK1) | |
kinazy regulujące powinowactwo mikrotubul (MARKs) | |
kinaza zależna od cAMP (PKA) | |
kinaza zależna od kalmoduliny 2 (CaMKII) | |
kinaza regulowana fosforylacją tyrozyny o podwójnej specyficzności 1A (DYRK-1A) | |
Kinazy tyrozynowe (TKs) | z rodziny SRC: SYK, LCK i FYN dla Tyr18 |
z rodziny ABL: ARG, ABL1 dla Tyr394 |
Białko tau, oprócz aksonów, wykryto także w dendrytach oraz w jądrach neuronów, fibroblastów czy komórek neuroblastomy [101]. Funkcja tau w dendrytach nie jest dokładnie zdefiniowana, choć w okresie rozwoju OUN, białko to jest wykrywane w strefie somatodendrytycznej [81].
Tau znajdującemu się w jądrze komórkowym przypisuje się rolę integrowania genomowego DNA oraz cytoplazmatycznego i jądrowego RNA [100]. W warunkach fizjologicznych tau jest również uwalniane poza neurony [111].
Udokumentowano dwa mechanizmy degradacji białka tau i jego fosforylowanej postaci. Pierwszy polega na ubikwitynacji przez ligazę CHIP (C-terminus of heat shock cognate 70-kDa interacting protein), a następnie 20S proteasomalnej degradacji [75], drugi na proteolizie w lizosomach [60]. Proteasomalna degradacja może być hamowana przez acetylację reszt lizyny wymaganej do ubikwitynacji tau przez kompleks CHIP-Hsc70 [75].
Ludzkie białko tau kodowane jest przez gen
Mutacje genu
Patologiczna agregacja tau występuje w wielu chorobach neurodegeneracyjnych, ale jest także stwierdzana w mózgu starszych osób bez objawów neurologicznych (primary age-related tauopathy, PART). W zależności od stadium molekularnej patologii, cząsteczki tau początkowo tworzą spiralnie skręcone struktury, ze spiral powstają podwójne helikalne filamenty (PHFs) agregujące w nierozpuszczalne splątki neurofibrylarne (NFTs), w których N-i C-koniec białka tworzą splątaną okrywę wokół centrum o strukturze β-kartki [106]. Krótkie motywy w rejonie R2 i R3 domeny MTBD są kluczowe w agregacji, gdyż wykazują skłonność do tworzenia β-kartki. W mózgach chorych na AD znaleziono wiele zmodyfikowanych postaci tau: ubikwitynowane, glikowane, glikozylowane, poliaminowane i hiperfosforylowane [71]. Potranslacyjne modyfikacje tau mają różny udział w tauopatii. Na przykład O-glikozylacja chroni tau przed fosforylacją i zmniejsza agregację białka [115], natomiast N-glikozylacja i poliaminacja, zwłaszcza w połączeniu z innymi modyfikacjami tau, zwiększają tworzenie agregatów i powstawanie NFTs [35]. Spośród wielu modyfikacji hiperfosforylacja uważana jest za najważniejszy czynnik zwiększający agregację i toksyczność tau dla neuronów [71]. W PHFs wyizolowanych z mózgów chorych na AD przeważa fosforylacja miejsc Tyr180, Tyr262, Tyr394, która działa szczególnie destabilizująco na cząsteczkę, choć fosforylacja w innych miejscach także prowadzi do tauopatii [26].
Do kinaz biorących udział w patologicznej hiperfosforylacji tau należą przede wszystkim: GSK3, CDK5, PKA, kinazy aktywowane stresem (SAPK) i aktywowane mitogenem (MAPKs) oraz MARKs [71]. Wykazano, że fosforylacja w obrębie motywów KXGS na C-końcu cząsteczki przez kinazy MARK, PKA lub CaMKII zmniejsza oddziaływanie tau z MT i powoduje jego odłączenie od tubuliny [31]. Tau po odłączeniu od MT łatwiej reaguje z białkami partnerskimi i łatwiej tworzy agregaty. Badania genetycznie modyfikowanych komórek wykazały, że hiperfosforylacja tau może spowodować nie tylko łatwiejszą agregację, ale także zaburzać wiązanie z F-aktyną, gromadzenie się tau w dendrytach oraz ograniczenie jego proteasomalnej degradacji [117]. W synapsach tau tworzy platformę (scaffold) dla kinaz, przez co moduluje ich aktywność. Wykazano, że nagromadzenie się patologicznego tau w dendrytach ułatwia kontakt kinazy Fyn z błoną presynaptyczną i uaktywnia działanie szlaku sygnalizacyjnego NMDA/PSD-95, nasilając ekscytotoksyczność synaptyczną zależną od NMDA oraz toksyczne działanie amyloidu β (Aβ) [51]. Hiperfosforylacja tau może sprzyjać także interakcjom z innymi białkami, np. z ASN [88] czy PACSIN1 (protein kinase C and casein kinase substrate in neurons protein 1), które redukują zdolność łączenia się tau z MT [67]. Także uraz mózgu i związane z nim obniżenie aktywności fosfatazy alkalicznej oraz nasilenie prozapalnej odpowiedzi immunologicznej mogą powodować dysocjację tau od MT i być przyczyną tauopatii [5, 15]. Coraz częściej zwraca się także uwagę na rolę zespołu metabolicznego w procesie agregacji tau ze względu na związek między fosforylacją tau a szlakiem sygnalizacyjnym receptora insuliny. Zwiększona aktywność GSK3 w insulinooporności może prowadzić do hiperfosforylacji tau [113]. Rolę w indukowaniu tauopatii przypisuje się też aktywacji kinazy mTOR, która jest zaangażowana w wiele ważnych procesów biologicznych, takich jak: wzrost komórek, sygnalizacja komórkowa czy dynamika cytoszkieletu. Badania
Oprócz hiperfosforylacji tau podlega proteolizie. Jeden z fragmentów tau, powstający po odcięciu regionu powtórzeń tandemowych w domenie C-końcowej, określany jako tau rdzenia splątków neurofibrylarnych, jest nierozpuszczalny i toksyczny dla neuronów [74]. Inne patologiczne formy tau, które wyizolowano z PHFs pacjentów z AD oraz z innymi dysfunkcjami neurologicznymi powstają w wyniku odcięcia C-końca w miejscu Asp421 przez kaspazę 3 lub w miejscu Asp13 przez kaspazę 6 [25].
Szeroko dyskutowana jest także zdolność do rozprzestrzeniania się patologicznego tau w mózgu. Jak wykazały doświadczenia, inokulacja mózgu zdrowych myszy patologicznymi formami tau pochodzącymi z mózgów chorych na AD lub z mózgów transgenicznych myszy indukuje rozprzestrzenianie się tau w sposób przypominający rozprzestrzenianie się białek prionowych [18]. Proponowane są także dwa mechanizmy transsynaptycznego przekazywania patologicznego tau. Pierwszy to dyfuzja do przestrzeni synaptycznej wskutek zwiększenia przepuszczalności błony presynaptycznej „zainfekowanego” neuronu lub za pośrednictwem egzosomów [93]. Drugi mechanizm to wydzielanie tau do płynu mózgowo-rdzeniowego, w którym 441-aminokwasowe tau jest wykrywane u chorych na AD, jak również u myszy [56].
W pośmiertnie wyznakowanych mózgach chorych na AD wykazano, że w neurytach zajętych przez NFT, oprócz hiperfosforylowanych filamentów tau, występują złogi Aβ. Podczas gdy agregaty tau powstają wewnątrzkomórkowo, Aβ odkłada się przede wszystkim zewnątrzkomórkowo i tworzy patogenne blaszki amyloidowe. Peptydy amyloidowe powstają przez fragmentację białka prekursorowego amyloidu (APP). W wyniku działania β-sekretazy pojawia się βCTF (β-C-terminal fragment), który następnie ulega fragmentacji do Aβs przez γ-sekretazę [119]. Do amyloidogenezy mogą prowadzić zarówno mutacje genów APP oraz preseniliny-1 i -2 (PSEN1 i PSEN2) [34], jak i inne procesy patologiczne w mózgu, m.in. uruchomienie odpowiedzi immunologicznej mikrogleju i astrocytów przez patogeny i urazy [72], niedokrwienie lub stres oksydacyjny [91]. Najsilniejsze właściwości tworzenia patologicznych splątków oraz najbardziej toksyczne działanie na neurony mają hydrofobowe peptydy Aβ42 i Aβ40. Ich agregaty uruchamiają różne procesy prowadzące do dysfunkcji i śmierci neuronów, w tym zaburzenie gospodarki wapniowej, aktywację apoptozy, załamanie bioenergetyki mitochondriów oraz zmiany szlaków sygnałowych i maszynerii biochemicznej [59]. Agregaty oligomerów Aβ42 i Aβ40 mogą również powodować hiperfosforylację tau przez aktywację kinaz MAPK, GSK-3β oraz Fyn [120]. Badania
Każdy z opisanych procesów może być przyczyną modyfikacji w strukturze tau, które zaburzają dynamiczne zmiany konformacyjne podczas łączenia się tau z MT, zakłócając dystrybucję transportowanych organelli, pęcherzyków i białek, a to może hamować procesy plastyczności neuronów. Główną komponentą splątków neurofibrylarnych powodujących zaburzenia neurologiczne jest hiperfosforylowane tau w regionie bogatym w prolinę. Ta patologiczna forma tau znajduje się również w neuronach z prawidłowo funkcjonującymi MT oraz u starszych ludzi, u których nie powoduje deficytu neurologicznego przez dekady [1]. Szczegóły mechanizmów, które prowadzą do tworzenia nierozpuszczalnych agregatów tau oraz degeneracji neuronów pod ich wpływem nie są wyjaśnione, choć tauopatie są wykrywane w licznych schorzeniach neurologicznych. Dlatego poszukiwania strategii terapeutycznych mających na celu zmniejszenie toksyczności tau lub przywrócenie fizjologicznego działania MT rozwijane są wielokierunkowo. Są to:
redukcja tau przez zastosowanie nonsensownych oligonukleotydów, miRNA, siRNA i inhibitorów transkrypcji; hamowanie hiperfosforylacji przez ograniczenie aktywności kinaz lub zwiększenie aktywności fosfataz, z tym że ingerencja w działanie fosfataz jest dużo trudniejsza, ponieważ nie mają one takiej jak kinazy, swoistości substratowej; poszukiwanie cząsteczek stabilizujących MT; zwiększenie aktywności systemu degradacji białek, żeby podwyższyć efektywność usuwania patologicznego tau; poszukiwanie tau-specyficznych przeciwciał do blokowania patologicznych form tau w neuronach.
TDP-43 jest wielofunkcyjnym białkiem obecnym we wszystkich rodzajach komórek, które zostało po raz pierwszy zidentyfikowane jako czynnik hamujący transkrypcję genu HIV [80]. Następne lata przyniosły doniesienia o udziale TDP-43 w regulacji transkrypcji wielu genów, a także w alternatywnym splicingu mRNA Cdk6, ApoA-II i CFTR [7]. W 2006 r. TDP-43 zidentyfikowano jako główny składnik nierozpuszczalnych, ubikwitynowanych inkluzji w mózgu pacjentów chorych na FTLD [78].
TDP-43 jest zbudowane z 414 aminokwasów i w natywnej postaci występuje w równowadze dwóch konfiguracji monomeru i dimeru. Cząsteczkę TDP-43 tworzą trzy funkcjonalne domeny. Pierwsza to domena N-końcowa (NTD), w której umiejscowiony jest przewidywany region lokalizacji mitochondriów 1 (M1) [33]. W warunkach
Białko TDP-43 należy do czynników splicingowych z rodziny heterogennych rybonukleoprotein (hnRNP) i bierze udział zarówno w konstytutywnym, jak i w alternatywnym składaniu pre-mRNA. W warunkach fizjologicznych TDP-43 jest rozmieszczone punktowo głównie w jądrze komórkowym [78]. Jednak ze względu na możliwość jego translokacji w komórce jest kolokalizowany z retikulum endoplazmatycznym [7] i mitochondriami, przy czym był wykryty zarówno w matriks, jak i przestrzeni międzybłonowej mitochondriów [92]. TDP-43 razem z wieloma innymi czynnikami splicingowymi tworzy w jądrze spliceosomy. W wyniku konkurencyjnego wiązania czynników splicingowych typu SRE działających w
Gen
Neuropatologia wywołana przez TDP-43 dotyczy przede wszystkim zaburzenia dystrybucji tego białka w komórce. Nadmierne gromadzenie się TDP-43 w cytoplazmie powoduje tworzenie dysfunkcyjnych kompleksów splicingowych w jądrze oraz powstawanie wadliwych transkryptów. Taki mechanizm wskazano jako przyczynę dystrofii neuronów ruchowych różnych fenotypów ALS, a także części przypadków FTLD [45]. U pacjentów z tymi chorobami znajdowane są ubikwitynowane, fosforylowane agregaty TDP-43 oraz C-końcowe fragmenty tego białka (25 i 35 kDa). Białko TDP-43 podlega znacznej liczbie potranslacyjnych modyfikacji, w większości tworzących patologiczne formy tego białka. Skutki części tych modyfikacji zostały potwierdzone jedynie na modelowych cząsteczkach TDP-43. Jako pierwszą odkryto patologiczną ubikwitynację TDP-43 [78]. Komputerowa analiza struktury cząsteczki wykazała, że ubikwitynacja Lys263 redukuje wiązanie TDP-43 z RNA. Dysfunkcja i nabycie przez cząsteczkę TDP-43 agregacyjnych właściwości może nastąpić również w wyniku oksydacji reszt cysteinowych, zwłaszcza Cys173, Cys175, Cys198 i Cys244 [33]. Wadliwe działanie TDP-43 w składaniu RNA, nieprawidłowe współdziałanie z cytoszkieletem i wiele innych nieprawidłowych interakcji TDP-43 z białkami stwierdzono po acetylacji reszt lizyny [19], a ubikwitynacja Lys181 krytycznie destabilizuje cząsteczkę [43]. Patologiczne właściwości wykazuje także sumoilowana forma TDP-43. Najprawdopodobniej w wyniku tej modyfikacji nie działa sygnał NLS, TDP-43 nie przechodzi do jądra i gromadzi się w cytoplazmie.
Inną patologiczną modyfikacją rybonukleoproteiny TDP-43 jest nieprawidłowa fosforylacja. U chorych na ALS i FTLD w C-końcowej domenie białka są znajdowane fosforylowane reszty S403-404 oraz S409-410 [77]. Jednak badania właściwości ufosforylowanego TDP-43 nie rozstrzygnęły, jakie patologiczne zmiany następują w strukturze cząsteczki w wyniku tych fosforylacji. C-końcowa domena TDP-43 wraz z tandemem RRM1/RRM2 może wiązać jony cynku, destabilizując cząsteczkę, sprzyjając jej agregacji i tworzeniu amyloidowych form [38]. W przypadku kompleksu TDP-43 z cynkiem i dla fosforylowanych form TDP-43 nie potwierdzono jeszcze ich znaczenia w neuropatologii, choć wyniki uzyskane
W cytoplazmie, TDP-43 wchodzi w skład kompleksów białkowo-nukleinowych tzw. granul stresu. Ich rolą jest zahamowanie translacji podczas niekorzystnych warunków w komórce, podczas stresu oksydacyjnego, retikularnego i mitochondrialnego. Nieprawidłowa budowa TDP-43 oraz innych białek wiążących RNA (FUS, Atx2, TIA1) zwiększa nie tylko właściwości agregacyjne tych białek, ale także tworzenie białkowo-nukleinowych granul stresu, bez udziału stresu komórkowego. Wtedy translacja RNA jest blokowana [89]. Inną przyczyną degeneracji neuronów może być zmniejszenie ilości białka przeżycia neuronów ruchowych (SMN), które tworzy w jądrach struktury nazywane coilled bodies. Jedna z hipotez zakłada, że przy obniżonej zawartości TDP-43 w jądrze zmniejsza się ilość coilled bodies i zostaje zaburzone działanie SMN w neuronach [103]. Przyczyną dysfunkcji neuronów ruchowych o długich aksonach, może być także zaburzenie przez patologiczne formy TDP-43 transportu mRNA białek, takich jak: VEGFA/GRN, NLF, aktyna czy CAMKII, z ciała neuronu do zakończenia aksonu.
Fosforylowane formy TDP-43 połączone z mitochondriami są wykrywane w neuronach i fibroblastach pacjentów z ALS i FTD, co może sugerować zmiany czynności mitochondriów i być przyczyną neuropatologii. U chorych m.in. na ALS i AD z proteinopatią TDP-43 mitochondria mają nieprawidłową budowę, są pofragmentowane, a w komórkowych modelach proteinopatii TDP-43 potencjał mitochondrialny oraz aktywność kompleksu I łańcucha oddechowego są obniżone [68]. Jednak dotychczas nie wyjaśniono dokładnie mechanizmów działania patologicznych form TDP-43 na czynność mitochondriów i ich udziału w procesach neurodegeneracji chociaż wiadomo, że patologiczne formy ASN, tau oraz oligomery Aβ upośledzają czynność mitochondriów. Być może w procesach neurodegeneracji istnieje konwergencja działania różnych patologicznych białek na bioenergetykę i inne funkcje mitochondriów.
Tak jak w innych proteinopatiach, wiele czynników może trwale destabilizować cząsteczkę TDP-43 i powodować tworzenie nierozpuszczalnych agregatów oraz łączenie tych form z organellami, przyczyniając się do zaburzeń funkcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów. Bezpośrednie przyczyny destabilizujące białko i wyzwalające jego agregację nie zostały jednoznacznie określone, ale wiadomo, że niekontrolowana agregacja TDP-43 i jego nieprawidłowe rozmieszczenie w komórce nerwowej są przyczyną obumierania neuronów, zwłaszcza ruchowych. Trwają intensywne badania funkcjonalnych zmian zmutowanych białek TDP-43 i poszukiwanie mechanizmów odpowiedzialnych za neuropatologię TDP-43 u pacjentów z chorobami neuronów ruchowych i zespołami otępiennymi, u których nie stwierdza się mutacji genu
Najczęściej diagnozowaną chorobą otępienną jest AD, natomiast 5–15% przypadków zespołów otępiennych to heterogenna fenotypowo FTD, w której dochodzi do jednostronnej lub dwustronnej degeneracji płatów czołowych i skroniowych. Najczęstszą przyczyną zespołów otępiennych są tauopatie, w których zanikają zdolności poznawcze, zapamiętywania oraz dochodzi do zmian osobowości. Z punktu widzenia neuropatologii można wyróżnić tauopatie pierwotne, gdy w komórkach nerwowych odkładane są jedynie helikalne filamenty lub splątki tau (PSP, CBD, PiD oraz FTDP-17) oraz tauopatie mieszane, w których razem z agregatami tau występują depozyty amyloidu Aβ (AD) lub ziarna argentofilne. Proteinopatia TDP-43 występuje w różnych fenotypach ALS, a także w zespołach otępiennych FTLD połączonych z dystrofią neuronów ruchowych (FTLD-TDP), w których zmodyfikowane białko agreguje w cytoplazmie neuronów, powodując ich dystrofię. W synukleinopatii dochodzi do agregacji w neuronach różnych form konformacyjnych ASN, nazywanych razem oligomerami i do tworzenia ciał Lewy’ego. Agregaty ASN powodują dystrofię głównie neuronów układu pozapiramidowego (PD, MSA), ale są także znajdowane w splotach nerwowych jelit i w neuronach przedzwojowych układu współczulnego. Powstanie ciał Lewy`ego w neuronach korowych wywołuje zespół otępienny (DLB), w którym objawy demencji wyprzedzają pojawienie się objawów choroby Parkinsona w przeciągu roku lub demencja pojawia się równocześnie z objawami parkinsonizmu. Warto jednak podkreślić, że agregaty patologicznych białek są znajdowane pośmiertnie w wielu strukturach układu nerwowego u ludzi po 65 roku życia bez patologicznych objawów neurologicznych.
Sporadyczne (idiopatyczne) choroby układu nerwowego stanowią 90–95% przypadków chorób neurodegeneracyjnych i są spowodowane destabilizacją cząsteczek ASN, tau lub TDP-43, w których może brać udział wiele różnorodnych czynników. Należą do nich infekcje, niedotlenienie i urazy mózgu, które uruchamiają nieswoistą obronę immunologiczną aktywując mikroglej i astrocyty. W zależności od rodzaju czynnika następuje zmiana ekspresji różnych genów, nasila się sekrecja cytokin prozapalnych (IL-1β, TNF-α, C3), chemokin (CCL3, CCL5) oraz innych białek (TIMP), aktywując obwodowe komórki immunologiczne. Zmienione sygnały chemiczne pochodzące z komórek glejowych „obsługujących” neurony, prowadzą do zmian ekspresji mRNA białek, nieprawidłowego docelowego umiejscowienia biomolekuł i dystrybucji organelli w komórkach. W neuronach dochodzi do zaburzenia procesów energetycznych i czynności mitochondriów, powodując najpierw wystąpienie stresu oksydacyjnego, a w końcowej fazie uruchomienie procesu apoptozy. Do etiologicznych czynników sporadycznych zespołów otępiennych i różnych wariantów chorób pozapiramidowych, zalicza się także szkodliwe zanieczyszczenia środowiskowe. Są to metale ciężkie, trwałe zanieczyszczenia organiczne (dioksyny, polichlorowane bifenyle i wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne), które dostają się do organizmu wraz z pyłem atmosferycznym oraz chemiczne zanieczyszczenia środkami ochrony roślin (herbicydy, insektycydy) żywności i wody pitnej. Oprócz zdefiniowanych czynników etiologicznych, za częste pojawianie się sporadycznych proteinopatii u osób starszych odpowiadają postępujące z wiekiem obniżenie efektywności działania enzymatycznej maszynerii genetycznej i biochemicznej, współistniejące choroby przewlekłe, a także długotrwałe przyjmowanie leków.
Kilkanaście procent przypadków zespołów otępiennych i zaburzeń czynności układu pozapiramidowego wynika z przyczyn genetycznych, które prowadzą do ekspresji białek różniących się właściwościami od białek natywnych. Bezpośrednią przyczyną omówionych proteinopatii są mutacje genów
Wobec różnorodności fenotypów zespołów otępiennych i zaburzeń motorycznych, jednoczesne poznawanie skutków zmian genetycznych i molekularnych przyczyn proteinopatii, połączone z diagnostyką kliniczną i patomorfologiczną, może doprowadzić do trafniejszego i szybszego diagnozowania chorób neurodegeneracyjnych, ale przede wszystkim do opracowania celowanych terapii zwalniających lub wręcz hamujących postęp tych chorób, które dewastują życie osób w starszym wieku i są przyczyną ich wcześniejszej śmierci.
Autorzy dziękują Pani dr Barbarze Dziedzic za pomoc w przygotowaniu manuskryptu oraz Panu Lesławowi Miśkiewiczowi za wykonanie rycin.