Molecular basis of proteinopathies: Etiopathology of dementia and motor disorders

Niewątpliwym osiągnięciem medycyny, a także szeroko pojętego rozwoju społeczno-techniczno-ekonomicznego jest wydłużenie czasu życia ludzi w ciągu kilku ostatnich dekad. Jednak demograficzne starzenie się ludności Europy i wielu innych regionów świata pozostaje w ścisłym związku z częstszym występowaniem chorób neurologicznych, w tym chorób otępiennych i zaburzeń motorycznych. Według danych WHO [24], otępienie (demencja) jest jedną z głównych przyczyn niepełnosprawności wśród osób po 65. roku życia. Wprawdzie w krajach rozwiniętych, zachorowalność na choroby neurodegeneracyjne zmniejsza się, to jednak z powodu rosnącego udziału ludzi starszych w większości społeczeństw, bezwzględna liczba chorych rośnie.

Choroby otępienne i zespoły zaburzeń motorycznych to nie tylko poważny problem medyczny i społeczny, wiążą się także z wysokimi kosztami opieki medycznej. Dane epidemiologiczne wykazują, że najczęstszą przyczyną otępienia jest choroba Alzheimera (AD), na którą w skali świata cierpi około 24 milionów ludzi, głównie w wieku między 65. a 85. rokiem życia. Prognozy wskazują, że w ciągu kolejnych 20 lat liczba osób z AD może ulec podwojeniu. Drugą najczęściej występującą chorobą neurodegeneracyjną jest choroba Parkinsona (PD). Zachorowalność na PD, podobnie jak na AD, jest związana z wiekiem, a częściej zapadają na nią mężczyźni niż kobiety. Różnice wieku, w którym rozpoznaje się AD i PD są powodowane współistniejącymi czynnikami ryzyka oraz mutacjami genowymi, odpowiedzialnymi za występowanie rodzinnej postaci tych chorób [90]. Trzecią, co do liczby przypadków chorobą, jest otępienie czołowo-skroniowe (FTD) o tzw. wczesnym początku. Średnia wieku pacjentów z rozpoznaniem FTD wynosi około 56 lat, przy czym odnotowano także przypadki, kiedy objawy choroby wystąpiły u osób poniżej 50 roku życia. Czas przeżycia chorych na FTD jest porównywalny z długością życia chorych na AD. Jedną z rzadszych chorób neurodegeneracyjnych jest zanik wieloukładowy (MSA) powodowany zwyrodnieniem neuronów ośrodkowych, a także nerwów autonomicznych. Choroba rozwija się najczęściej w szóstej dekadzie życia. W przebiegu tego schorzenia najczęściej dominują objawy parkinsonizmu, ale mogą także wystąpić zespoły móżdżkowe i autonomiczne, dlatego rozpoznanie MSA jest trudne, natomiast postęp choroby jest szybszy niż w PD.

Etiologia zespołów otępiennych i zaburzeń czynności ruchowych ma charakter wieloczynnikowy. Obejmuje czynniki genetyczne, immunologiczne oraz metaboliczne, i jest silnie skorelowana z wiekiem, współistniejącymi chorobami, rodzajem diety, sposobem życia oraz szkodliwymi czynnikami środowiskowymi. Choroby neurodegeneracyjne o najgroźniejszym przebiegu są spowodowane niszczeniem neuronów przez białka, które nabyły właściwości patologicznych i są przyczyną degeneracji neuronów i atrofii struktur mózgu. Do najczęściej występujących proteinopatii zalicza się synukleinopatie, tauopatie oraz proteinopatie TDP-43 (transactive response DNA-binding protein 43 kDa). Histopatologiczne cechy proteinopatii obejmują nieprawidłowe fałdowanie, a następnie charakterystyczny dla każdego białka sposób agregacji oraz zróżnicowane rozmieszczenie neuroanatomiczne patologicznych złogów w mózgu. Zmiany właściwości α-synukleiny (ASN) określane jako synukleinopatia, powodują tworzenie się w neuronach, a także w komórkach glejowych, ciał Lewy’ego. Nieprawidłowe potranslacyjne modyfikacje białka tau prowadzą do wadliwego funkcjonowania transportu aksonalnego oraz do akumulacji tau w postaci splątków neurofibrylarnych (NFTs) oraz ciałek Picka, które zaliczane są do tauopatii. Natomiast rybonukleoproteina TDP-43 po nabyciu patologicznych właściwości w wyniku różnych modyfikacji, gromadzi się w cytoplazmie neuronów w postaci włókienek i jest przyczyną degeneracji, szczególnie neuronów ruchowych [29]. Każda z proteinopatii powoduje rozwój innych chorób neurologicznych (tabela 1). Jednak trzeba podkreślić, że zarówno u pacjentów ze zdiagnozowaną chorobą neurodegeneracyjną, jak i u ludzi starszych bez objawów demencji, badania mózgu post mortem z zastosowaniem przeciwciał przeciwko patologicznym białkom oraz izolowanie nierozpuszczalnych agregatów ze struktur mózgu wskazują na współwystępowanie różnych postaci złogów białkowych [101]. Ponadto obraz kliniczny wraz z badaniami neuroobrazowymi pacjentów, które jest podstawowym kryterium diagnostyki różnicującej w chorobach neurodegeneracyjnych, nie pozwalają jednoznacznie wskazać pierwotnej przyczyny zaburzeń funkcjonalnych układu nerwowego za życia pacjentów.

Mimo znacznego postępu w zrozumieniu mechanizmów prowadzących do zwyrodnienia neuronów i coraz bardziej szczegółowej diagnostyki neuroobrazowej, a także oznaczania swoistych markerów biochemicznych w krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym, brak jest celowanych terapii. Pacjentów leczy się objawowo, a rozpoznanie oraz różnicowanie choroby nie należy do łatwych i trwa stosunkowo długo. Dlatego potencjalne strategie opóźniające postępowanie demencji lub hamowanie progresji choroby są przedmiotem intensywnych badań na całym świecie.

Po raz pierwszy ASN została wykryta przez Maroteaux i wsp. [70] w neuronach szczura, jako białko identyczne z białkiem synaptosomów drętwy elektrycznej (Torpedo californica). Ludzką α-synukleinę zidentyfikowano podczas analizy składu złogów amyloidowych pacjentów chorych na AD i nazwano prekursorem składnika nieamyloidowego (non-amyloid component precursor, NACP) blaszki amyloidowej [52]. Późniejsza immunodetekcja ujawniła, że ASN jest związana z pęcherzykami synaptycznymi, dlatego stała się jednym z markerów błon presynaptycznych. Jednak frakcjonowanie struktur neuronów metodami biochemicznymi, wykazało obecność ASN także w rozpuszczalnej frakcji synaptosomów, co wskazuje na jej lokalizację w cytoplazmie.

ASN jest zbudowana ze 140 aminokwasów i razem z β-synukleiną (134 aminokwasów) oraz γ-synukleiną (127 aminokwasów) tworzy rodzinę małych, swoistych dla kręgowców białek [96]. W każdej z synuklein wyróżnia się trzy regiony funkcyjne (ryc. 1A):

konserwatywny, amfipatyczny N-koniec, który wchodzi w interakcję z fosfolipidami błonowymi;

Ryc. 1

W obrębie N-końca oraz w części regionu NAC występują 11-aminokwasowe powtórzenia ze stałym motywem KTKEGV, które tworzą drugorzędową strukturę w postaci amfipatycznej α-helisy charakterystycznej dla domeny wiążącej lipidy w apolipoproteinach klasy A2 [53]. W α- oraz w β-synukleinie tych powtórzeń jest sześć, a w γ-synukleinie o jedno więcej. Taki rytm powtórzeń umożliwia zachowanie struktury monomerycznej cząsteczki, redukuje jej tendencję do fałdowania i tworzenia agregatów białka.

W warunkach fizjologicznych i bez działania czynników fizycznych czy chemicznych, natywna forma ASN ma postać nieuporządkowanego, rozpuszczalnego monomeru, który przyjmuje formę kompaktową, żeby chronić domenę NAC przed interakcją z białkami cytozolowymi, co mogłoby spowodować samoagregację białka. Odkąd w warunkach niedenaturujących wyizolowano ASN o większej masie cząsteczkowej (58 kDa), część badaczy sugeruje, że natywna cząsteczka ASN może mieć też formę tetramerową, i w warunkach fizjologicznych wraz z formą monomerową koegzystuje w równowadze do czasu pojawienia się czynnika agregującego. Natomiast badania struktury ASN z użyciem elektronowego rezonansu spinowego wykazały, że podczas interakcji między hydrofobowymi resztami amfipatycznymi N-końca a lipidami błonowymi powstaje multimerowa konformacja α-helikalna [73], a ułożenie części helikalnej cząsteczki ASN zależy od krzywizny błony lipidowej. Na silnie wygiętych błonach liposomów helikalny N-koniec ASN jest sfałdowany, a na bardziej płaskich błonach, jest prosty [8]. Prawdopodobnie dzięki zmiennym interakcjom z różnymi fosfolipidami błon, amfipatyczna helisa ASN dostosowuje się do krzywizn błon pęcherzyków synaptycznych. Z powodu zróżnicowanych wyników pomiaru wielkości różnych struktur konformacyjnych cząsteczki ASN obecny paradygmat zakłada, że ASN występuje w komórkach w postaci mieszaniny różnych nieustrukturyzowanych monomerów oraz helikalnych oligomerów, częściowo sfałdowanych w wyniku interakcji z fosfolipidami błon [8]. Nie wiadomo jednak, która konformacja ASN jest bardziej podatna na patologiczną agregację i tworzenie amyloidowych fibryli.

Fizjologiczna funkcja ASN nie jest dokładnie poznana. ASN bierze udział w uwalnianiu neurotransmiterów z pęcherzyków synaptycznych oraz ułatwia ich dynamiczny obrót w zakończeniach aksonów, niezbędny do zapewnienia homeostazy synaptycznej. Kilka zespołów badawczych wykazało, że ASN uczestniczy w prawidłowym działaniu kompleksu białek SNARE w zakończeniach presynaptycznych [11] oraz może działać jako regulator dokowania pęcherzyków synaptycznych do błony presynaptycznej wiążąc się z synaptobrewiną 2 [17] lub z Raszależną GTPazą Rab3a [14]. Wykazano także, że ASN chroni neurony dopaminergiczne przed apoptozą hamując zależną od acetylotransferazy histonów p300 transaktywację czynnika transkrypcyjnego NF-κB i ekspresję proapoptotycznej izoformy kinazy PKCδ [55]. Są także wyniki wskazujące na udział ASN w procesach różnicowania i wzrostu komórek, ponieważ aktywuje inhibitor kinazy Ras i zmienia aktywność kaskady sygnalizacyjnej Ras/MAPK/ERK [42].

Strukturę cząsteczki ASN może destabilizować wiele czynników. Do najważniejszych zalicza się: modyfikacje potranslacyjne (fosforylacja, glikacja, glikozylacja i acylacja), stres oksydacyjny, zaburzenia funkcjonowania mitochondriów, oddziaływanie z innymi białkami neuronalnymi i przekaźnikami katecholaminowymi, zwiększenie cytoplazmatycznego stężenia jonów Ca²⁺ i aktywacja kalmoduliny, a także dysfunkcja systemu ubikwitynacji i proteasomalnej degradacji białek [105]. Eksperymenty prowadzone w celu poznania mechanizmów agregacji ujawniły kilka stanów konformacyjnych ASN, począwszy od monomerów, przez pośrednie formy oligomeryczne, aż do amyloidogennych fibryli. Początkowe etapy agregacji ASN polegają na zmianach organizacji natywnej domeny NAC. Akceptowana jest hipoteza, że interakcja między środkową hydrofobową domeną NAC i C-końcem w cząsteczce ASN hamuje agregację białka, ponieważ domena NAC łatwo ulega przekształceniu w strukturę β-kartki [73]. Szczególnie odcinek między 71 a 82 aminokwasem w domenie NAC został zidentyfikowany jako region odpowiedzialny za tworzenie toksycznych włókien ASN. Zaburzenia interakcji w obrębie cząsteczki sprzyjają tworzeniu heterogennej populacji pośrednich konformacji białka, zwanych łącznie oligomerami. Z oligomerów ASN tworzą się protofibryle, a na skutek agregacji protofibryli, powstają dojrzałe fibryle amyloidowe. Wciąż niewyjaśnione pozostaje znaczenie poszczególnych przejściowych etapów agregacji ASN i roli różnych form agregacyjnych ASN w procesach neurodegeneracji. Zarówno oligomery, które łączą się z błonami pęcherzyków synaptycznych i zaburzają procesy neurotransmisji, jak i fibryle ASN są dla komórek toksyczne [36]. Analiza filogenetyczna paralogów synuklein ujawniła, że począwszy od linii ryb mięśniopłetwych ASN ma strukturę inherentnie nieuporządkowaną i skłonną do samoagregacji w wyniku zmiany składu aminokwasów w regionie 32–58 domeny N-końcowej, która oddziałuje z fosfolipidami błonowymi [94].

Na zmiany konformacji ASN wpływają także interakcje z innymi białkami w komórce. Obecność chaperonu 14-3-3 radykalnie hamuje proces agregacji amyloidowych form ASN oraz redukuje cytotoksyczność oligomerów i pośrednich stadiów agregacji, jeśli stężenie ASN nie przewyższa stężenia chaperonu w komórce [85]. W najnowszych badaniach kinetycznych agregacji białek syntetyzowanych na matrycy różnych konstruktów genowych, z użyciem techniki NMR i narzędzi bioinformatycznych, wykazano obecność dwóch krótkich motywów, 7- i 12-aminokwasowych w N-końcowym regionie sąsiadującym z domeną NAC. Co istotne: okazały się one ważne zarówno dla zwiększenia agregacji i toksyczności ASN, jak i dla zachowania jej fizjologicznych funkcji [28].

Patologiczne oligomery ASN niszczą głównie neurony dopaminergiczne, dlatego wiele badań dotyczy zaangażowania ASN w regulację homeostazy dopaminy w mózgu i patologii neuronów dopaminoergicznych w istocie czarnej śródmózgowia. Ustalono, że zwiększona zawartość ASN w neuronach hamuje aktywność hydroksylazy tyrozyny dzięki zwiększeniu aktywności fosfatazy 2A (PP2A) i prowadzi do zahamowania syntezy dopaminy [112]. Ponadto, nadekspresja ASN w neuronach istoty czarnej upośledza transport dopaminy przez transportery VMAT2 zwiększając jej stężenie w cytozolu oraz drastycznie hamuje wychwyt zwrotny dopaminy ze szczeliny synaptycznej przez transporter dopaminy DAT [69]. Do degeneracji neuronów dopaminoergicznych przyczynia się także sama dopamina, która jest podatna na degradację. W pęcherzykach transportowych powstają z dopaminy toksyczne dla mitochondriów chinony i semichinony oraz reaktywne formy tlenu, prowadząc do postępującej degeneracji neuronów szlaku istota czarna-prążkowie.

Ludzka ASN kodowana jest przez gen SNCA znajdujący się na długim ramieniu chromosomu 4 (4q21.3–q22). Geny dwóch pozostałych synuklein są umiejscowione w innych chromosomach, SNCB kodujący β-synukleinę leży w chromosomie 5 (5q35.2), a gen SNCG kodujący γ-synukleinę w chromosomie 10 (10q23.2–q23.3) [96]. Porównanie genów synuklein wykazało dużą homologię między α- a β-synukleiną (78%), mniejszą dla γ-synukleiny (około 60%). W SNCA znajduje się 5 eksonów kodujących białko oraz zmienna sekwencja eksonu 1, niepodlegająca translacji. Ponadto występują transkrypty z delecją eksonu 5 lub 3 bądź obu tych eksonów. W ramach alternatywnego splicingu następuje także selekcja miejsc poliadenylacji w regionie 3′UTR, która jest źródłem kolejnych wariantów mRNA ASN z krótkimi lub długimi regionami 3′UTR [37]. W regulacji transkrypcji genu SNCA potwierdzono udział motywów, takich jak GATA, wyspa CpG oraz złożone powtórzenie mikrosatelitarne REP1, które występują w promotorze SNCA. Zgodnie z bazą danych „The human protein atlas” największa ekspresja mRNA SNCA występuje w korze mózgu [102].

Różnorodne składanie genu SNCA powoduje tworzenie kilkunastu transkryptów, z których po translacji powstają różniące się właściwościami izoformy α-synukleiny, w tym AS140, AS112, AS126, AS98 [37]. AS140 jest natywną postacią białka ASN. Izoformy AS112 oraz AS126 mają skrócone domeny NAC i różnią się właściwościami. AS126 może być neuroprotekcyjna, natomiast AS112 przeciwnie, wykazuje skłonność do agregacji. Podobnie zwiększoną skłonność do agregacji ma najkrótsza izoforma AS98. Ustalono, że brak seryny w pozycji 129 w regionie C-końcowym, odgrywa główną rolę w nabyciu przez ASN właściwości agregacyjnych i toksycznych.

Wiele badań poświęcono zmianom w strukturze SNCA, które w około 10% są przyczyną rodzinnej postaci choroby Parkinsona dziedziczonej w sposób autosomalny dominujący. W chorobie tej zniszczeniu ulegają głównie neurony dopaminergiczne istoty czarnej śródmózgowia, prowadząc do bradykinezji, wzmożonego napięcia mięśniowego i drżenia spoczynkowego, co uniemożliwia chorym wykonywanie ruchów zamierzonych i utrzymanie postawy ciała. Analiza właściwości białek zmutowanego SNCA dostarczyła nowych danych o przebiegu oligomeryzacji, fibrylacji oraz o kinetyce tych procesów [36]. Punktowe mutacje w locus PARK chromosomu 4 dotyczą głównie N-końca cząsteczki ASN i mogą zaburzać interakcję białka z fosfolipidami błonowymi, a także nasilać właściwości agregacyjne ASN [36, 94]. Pierwszą, najlepiej scharakteryzowaną mutacją ASN jest mutacja A53T, w wyniku której alanina jest zastąpiona przez treoninę. Białko A53T-ASN ma zwiększoną zdolność tworzenia fibryli i oligomerów [20], zwiększa przepuszczalność błon lipidowych, choć ma podobne do ASN właściwości wiązania z fosfolipidami [12]. Mutacja ta wpływa także na interakcje między regionami w cząsteczce ASN zwiększając zdolność domeny NAC do tworzenia struktury β-kartki [21]. W przypadku mutacji A30P, w wyniku której alanina jest zamieniona na prolinę, wiązanie ASN do błon lipidowych oraz proces fibrylacji białka są znacząco zredukowane, a przebieg choroby jest łagodniejszy w porównaniu z chorymi posiadającymi mutację A53T [12]. Natomiast oba te białka mogą indukować stres oksydacyjny, który jest istotnym czynnikiem synukleinopatii i patogenezy PD. Trzecia opisana mutacja E46K powoduje zamianę kwasu glutaminowego na lizynę i jest także związana z wczesną postacią PD oraz DLB [116]. Białko E46K-ASN ma najsilniejsze właściwości agregacyjne i neurotoksyczne [82], a także hamuje obrót pęcherzyków synaptycznych oraz zakłóca transport między retikulum endoplazmatycznym a aparatem Golgiego [110].

Inne mutacje odkryte u młodych chorych na PD to A53E oraz G51D [30, 76], a u starszych chorych H50Q [61]. Białko G51D-ASN ma obniżoną zdolność agregacji i wiązania się z błonami [30], natomiast H50Q-ASN ma prawidłowe właściwości wiązania z fosfolipidami błon, ale dużą łatwość tworzenia fibryli [61]. Mutacja A53E powoduje wolniejszą agregację białka oraz cytotoksyczność zbliżoną do natywnej postaci ASN. Jednak udowodniono, że nadekspresja A53E-ASN w neuronach powodowała tworzenie większej ilości oligomerów w obecności dopaminy i rotenonu, doprowadzając do nasilonego tworzenia reaktywnych form tlenu i obniżenia potencjału mitochondrialnego [76]. Te wyniki wskazują, że za dużą toksyczność zmutowanego białka A53E może odpowiadać nie tyle jego większa zdolność do agregacji, co indukowanie stresu oksydacyjnego w neuronach. W sporadycznej postaci PD zidentyfikowano dwie kolejne mutacje: A18T oraz A29S, w wyniku których alanina jest zastąpiona odpowiednio przez treoninę i serynę. Obie zmutowane formy ASN są bardziej podatne na agregację niż natywna cząsteczka ASN [64]. Zmiany w strukturze cząsteczki ASN w wyniku mutacji genu SNCA, będących przyczyną rodzinnej postaci PD przedstawiono na ryc. 1B.

W przypadku duplikacji genu SNCA początek choroby przypada na wiek zbliżony do wieku chorych z idiopatyczną postacią PD, choć postęp choroby jest szybszy [13]. Natomiast triplikacja SNCA znacząco upośledza funkcje poznawcze chorych i odpowiada za wczesny wiek pojawienia się choroby [95]. Istnieje duża zależność między czynnikami środowiskowymi a genetycznymi. Dlatego poznanie czynników wpływających na mutacje genu SNCA oraz ich wpływu na dynamikę tworzenia toksycznych amyloidowych fibryli ASN, stwarza możliwości opracowania genetycznych interwencji w leczeniu PD. Szczególnie interwencja w strukturę N-końca cząsteczki ASN, jako regionu hamującego powstawanie patologicznego fałdowania domeny NAC, stała się obecnie ważnym celem terapeutycznym w walce z chorobami wywołanymi fibrylacją i agregacją ASN.

Białko tau zostało odkryte w latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku w aksonach neuronów kręgowców i razem z MAP2 (microtubule-associated protein-2) jest jednym z małych białek współpracujących z mikrotubulami (MT) [6]. Od kiedy helikalne filamenty tau wykryto w mózgach chorych na AD badania tego białka znacznie przyspieszyły. Tau jest dobrze rozpuszczalnym białkiem i nie ma zdefiniowanej struktury drugorzędowej. W zależności od izoformy, zbudowane jest z 352 do 441 aminokwasów [6]. W cząsteczce tau wyróżnia się trzy domeny:

N-końcową kwaśną domenę projekcyjną (projection domain), która zawiera zmienną liczbę tzw. insertów N;

Strukturę najdłuższej izoformy tau (2N4R) przedstawiono na ryc. 2A.

Ryc. 2

Duża zmienność cząsteczki tau wynika z jej licznych potranslacyjnych modyfikacji oraz wielu oddziaływań każdej domeny oddzielnie. Gauthier-Kemper i wsp. [39] wykryli, że N-koniec cząsteczki tau wiąże się z aneksyną A2 w sposób zależny od Ca²⁺, a wcześniej Brandt i wsp. [10] opisali współdziałanie tej domeny z błoną neuronów. Ponadto wykazano interakcje N-końcowych motywów tau z syntaksyną-1 i synaptogaminą-1, z białkami rodziny 14-3-3 oraz aneksyną A5 [98]. Dlatego przypuszcza się, że N-koniec tau pełni rolę łącznika między błoną aksonów a MT. Obszar bogaty w prolinę, znajdujący się między domenami projection i assembly, wiąże się z różnymi kinazami zawierającymi domenę SH3, a także jest głównym regionem potranslacyjnych modyfikacji białka. W regionie MTBD znajdują się konserwatywne powtórzenia R1-R4 oraz C-koniec o charakterze zasadowym. Stąd cząsteczka tau ma charakter dipola i kształtem przypomina spinacz chroniący ją przed agregacją. Mimo niewielkiej skłonności do agregacji w porównaniu do α-synukleiny, białko tau łatwo wchodzi w interakcje z wieloma białkami partnerskimi, które zmieniają jego konformację i sprzyjają jego agregacji.

W aksonach tau współdziała z białkami motorycznymi (kroczącymi), które transportują wzdłuż mikrotubul organelle, pęcherzyki z transmiterami, kompleksy białkowe i wiele innych molekuł. Przyjmuje się, że N-koniec tau jest odsunięty od mikrotubul [46] i chętnie oddziałuje z innymi białkami. W warunkach fizjologicznych tau jest potranslacyjnie modyfikowane, co determinuje jego sposób działania, lokalizację w komórce, konformację oraz interakcję z innymi białkami. Najczęstszą modyfikacją tau jest fosforylacja, co wynika z dużej liczby możliwych miejsc fosforylacji oraz dużej łatwości wiązania tau z kinazami i fosfatazami w regionie bogatym w prolinę. W najdłuższej izoformie tau (2N4R) znajduje się około 85 potencjalnych miejsc fosforylacji seryny, treoniny i tyrozyny [6]. W mózgu płodu wykazano większy stopień fosforylacji tau niż w mózgu dorosłego człowieka, co może świadczyć o innej dynamice transportu aksonalnego podczas procesów różnicowania i organizacji neuronów we wczesnych stadiach rozwojowych ośrodkowego układu nerwowego (OUN) [108].

Fizjologiczne działanie tau zależy od ściśle regulowanej, dynamicznej fosforylacji i defosforylacji, które decydują odpowiednio o przyłączaniu i odłączaniu tau od MT, co przekłada się na dynamikę procesów transportowych oraz stabilność MT. Tau współpracuje z kinezynami transportującymi w kierunku plus MT (odśrodkowo, do zakończenia aksonu) i dyneinami transportującymi w kierunku przeciwnym (dośrodkowo, do ciała neuronu). Tau współzawodniczy z motorami molekularnymi o miejsce wiązania z MT, redukując częstość ich wiązania z MT, ruchliwość motorów oraz długość odcinków MT, po których przemieszczają się kinezyna i dyneina. Silniejsze działanie hamujące tau wykazano w stosunku do kinezyny niż do dyneiny, co może odpowiadać za akumulowanie organelli, np. mitochondriów w ciele neuronu w przypadku nadekspresji tau [27]. Mimo że wszystkie badania in vitro genetycznie modyfikowanych neuronów wskazują na istotną rolę tau w transporcie aksonalnym, to pierwszorzędowe neurony pobrane od myszy z delecją genu kodującego tau nie wykazują znaczących zaburzeń transportu aksonalnego [114], chociaż mają krótsze neuryty i różnicują się wolniej [22]. U transgenicznych myszy z knock-out lub wyciszeniem genu kodującego tau wykazano inne dysfunkcje, m.in. zaburzenie neurogenezy i plastyczności neuronów hipokampa [2], a także akumulację żelaza w neuronach wskutek blokowania jego eksportu przez ferroportynę związaną z białkiem prekursorowym amyloidu (APP) [65].

Stopień fosforylacji tau zależy od aktywności wielu kinaz i fosfataz. W tabeli 2 przedstawiono listę kinaz fosforylujących tau sklasyfikowanych w trzy grupy: kinazy zależne od proliny (PDPKs), kinazy niezależne od proliny (non-PDPKs) oraz kinazy tyrozynowe (TKs) [71]. Najważniejszymi fosfatazami defosforylującymi tau są: fosfataza białek 1 (PP1), PP2A, PP2B (kalcyneuryna) oraz PP5 [66]. W mózgu ludzkim największą aktywność wykazano dla PP2A (prawie 70% aktywności fosfatazowej), której aktywność u pacjentów z AD jest dużo niższa [40]. W związku z tym obniżenie aktywności fosfataz jest uznawane jako jedna z przyczyn patologicznej hiperfosforylacji tau.

Białko tau, oprócz aksonów, wykryto także w dendrytach oraz w jądrach neuronów, fibroblastów czy komórek neuroblastomy [101]. Funkcja tau w dendrytach nie jest dokładnie zdefiniowana, choć w okresie rozwoju OUN, białko to jest wykrywane w strefie somatodendrytycznej [81].

Tau znajdującemu się w jądrze komórkowym przypisuje się rolę integrowania genomowego DNA oraz cytoplazmatycznego i jądrowego RNA [100]. W warunkach fizjologicznych tau jest również uwalniane poza neurony [111].

Udokumentowano dwa mechanizmy degradacji białka tau i jego fosforylowanej postaci. Pierwszy polega na ubikwitynacji przez ligazę CHIP (C-terminus of heat shock cognate 70-kDa interacting protein), a następnie 20S proteasomalnej degradacji [75], drugi na proteolizie w lizosomach [60]. Proteasomalna degradacja może być hamowana przez acetylację reszt lizyny wymaganej do ubikwitynacji tau przez kompleks CHIP-Hsc70 [75].

Ludzkie białko tau kodowane jest przez gen MAPT znajdujący się na długim ramieniu chromosomu 17 (17q21) mający 16 eksonów [79]. W wyniku alternatywnego splicingu powstaje 6 izoform tau, różniących się liczbą wstawek aminokwasowych N (insertów N) w regionie N-końcowym. Izoformy tau różnią się także liczbą 31- aminokwasowych powtórzeń (R) w domenie wiążącej białko z MT na C-końcu, których może być trzy (3R) lub cztery (4R) [79]. Ekson 1 (E1), E4, E5, E7, E9, E11 i E13 ulegają ekspresji we wszystkich izoformach. Alternatywny splicing dotyczy eksonów E2 i E3, które kodują inserty N w domenie projekcyjnej, oraz eksonu 10, który koduje dodatkowe powtórzenie R. Strukturę genu MAPT oraz sześć izoform białka tau powstających w wyniku alternatywnego splicingu genu przedstawiono na ryc. 2B. Wszystkie 6 izoform tau ulega ekspresji u ludzi w odróżnieniu od myszy, u których występuje głównie izoforma 4R [41]. Ekspresja tau jest regulowana w trakcie rozwoju OUN, ponieważ w mózgu płodu człowieka występują tylko formy 3R, a w mózgu dorosłych osób 3R i 4R są w równej proporcji [62], ze stosunkowo dużym udziałem form 0N i 1N. Ekspresja genu MAPT odbywa się głównie w neuronach i jest kontrolowana przez czynniki transkrypcyjne AP2, Sp1 oraz GCF [44]. Mapowanie i sekwencjonowanie ludzkiego genu MAPT wykazało, że w regionie 5′ zlokalizowany jest ekson nieulegający translacji. Zaproponowano, że aktywacja alternatywnego promotora MAPT prowadzi do wytwarzania patologicznych, skróconych form tau oraz do zmiany lokalizacji i funkcji białka. Krótsze transkrypty pochodzące z tego promotora stwierdzono w mózgu pacjentów z AD oraz z PSP [48]. W komórkach glejowych ekspresja tau jest niższa niż w neuronach zarówno na poziomie mRNA [118], jak i białka.

Mutacje genu MAPT w chromosomie 17 są przyczyną otępienia czołowo-skroniowego i parkinsonizmu sprzężonego z tym chromosomem (FTDP-17) [109], w których agregaty tau są wykrywane zarówno w neuronach, jak i w komórkach glejowych. Późniejsze badania wykazały, że przyczyną FTDP-17 mogą być także mutacje sąsiadującego z MAPT genu progranuliny (PGRN), którym towarzyszą też inne proteinopatie [47]. Polimorfizm genu MAPT zwiększa ryzyko zachorowania na PSP i zwyrodnienie korowo-rdzeniowe, należących do tauopatii typu 4R. Do 2019 r. wykryto ponad 40 patogennych mutacji genu MAPT, głównie u chorych na AD i FTD [99]. Większość mutacji MAPT jest umiejscowiona w eksonach 9–12 kodujących powtórzenia w domenie MTBD oraz w intronach sąsiadujących z tymi eksonami. Poznane mutacje zmiany sensu w MAPT ingerują w strukturę białka albo w splicing eksonu 10. Jeśli ekson 10 jest włączony do transkrypcji powstaje izoforma 4R (tauopatie 4R). Ingerencja w strukturę białka jest przyczyną zaburzeń jego powinowactwa do mikrotubul, prowadząc do modyfikacji transportu aksonalnego, zwiększenia hiperfosforylacji i agregacji tau, które są toksyczne dla neuronów [23]. Tauopatie 4R powodują tworzenie patologicznych filamentów ulokowanych w licznych strukturach mózgu i są przyczyną różnych wariantów zespołów otępiennych o odmiennym obrazie klinicznym. W tauopatiach 4R nie wykazano zmian liczby miejsc fosforylacji w cząsteczce, co może świadczyć o tym, że hiperfosforylacja tau nie jest główną przyczyną FTDP-17 [104]. Mutacje MAPT są bezpośrednią przyczyną tauopatii występującej w takich fenotypach neuropatologicznych, jak: AD, PSP, FTDP-17, CBD oraz w neurodegeneracji ze złogami argentofilnymi i z ciałami Picka, w których obraz kliniczny pacjentów we wczesnych fazach choroby jest podobny lub czasem identyczny. W komórkach z nadekspresją tau dochodzi do wielu zaburzeń transportu aksonalnego. Powodują one redukcję liczby dostępnych motorów molekularnych i gromadzenie w ciele komórki nerwowej transportowanych organelli, m.in. mitochondriów, a także odłączanie pęcherzyków transportowych od kinezyny przez aktywację fosfatazy 1 (PP1) i kinazy GSK3 β [58].

Patologiczna agregacja tau występuje w wielu chorobach neurodegeneracyjnych, ale jest także stwierdzana w mózgu starszych osób bez objawów neurologicznych (primary age-related tauopathy, PART). W zależności od stadium molekularnej patologii, cząsteczki tau początkowo tworzą spiralnie skręcone struktury, ze spiral powstają podwójne helikalne filamenty (PHFs) agregujące w nierozpuszczalne splątki neurofibrylarne (NFTs), w których N-i C-koniec białka tworzą splątaną okrywę wokół centrum o strukturze β-kartki [106]. Krótkie motywy w rejonie R2 i R3 domeny MTBD są kluczowe w agregacji, gdyż wykazują skłonność do tworzenia β-kartki. W mózgach chorych na AD znaleziono wiele zmodyfikowanych postaci tau: ubikwitynowane, glikowane, glikozylowane, poliaminowane i hiperfosforylowane [71]. Potranslacyjne modyfikacje tau mają różny udział w tauopatii. Na przykład O-glikozylacja chroni tau przed fosforylacją i zmniejsza agregację białka [115], natomiast N-glikozylacja i poliaminacja, zwłaszcza w połączeniu z innymi modyfikacjami tau, zwiększają tworzenie agregatów i powstawanie NFTs [35]. Spośród wielu modyfikacji hiperfosforylacja uważana jest za najważniejszy czynnik zwiększający agregację i toksyczność tau dla neuronów [71]. W PHFs wyizolowanych z mózgów chorych na AD przeważa fosforylacja miejsc Tyr180, Tyr262, Tyr394, która działa szczególnie destabilizująco na cząsteczkę, choć fosforylacja w innych miejscach także prowadzi do tauopatii [26].

Do kinaz biorących udział w patologicznej hiperfosforylacji tau należą przede wszystkim: GSK3, CDK5, PKA, kinazy aktywowane stresem (SAPK) i aktywowane mitogenem (MAPKs) oraz MARKs [71]. Wykazano, że fosforylacja w obrębie motywów KXGS na C-końcu cząsteczki przez kinazy MARK, PKA lub CaMKII zmniejsza oddziaływanie tau z MT i powoduje jego odłączenie od tubuliny [31]. Tau po odłączeniu od MT łatwiej reaguje z białkami partnerskimi i łatwiej tworzy agregaty. Badania genetycznie modyfikowanych komórek wykazały, że hiperfosforylacja tau może spowodować nie tylko łatwiejszą agregację, ale także zaburzać wiązanie z F-aktyną, gromadzenie się tau w dendrytach oraz ograniczenie jego proteasomalnej degradacji [117]. W synapsach tau tworzy platformę (scaffold) dla kinaz, przez co moduluje ich aktywność. Wykazano, że nagromadzenie się patologicznego tau w dendrytach ułatwia kontakt kinazy Fyn z błoną presynaptyczną i uaktywnia działanie szlaku sygnalizacyjnego NMDA/PSD-95, nasilając ekscytotoksyczność synaptyczną zależną od NMDA oraz toksyczne działanie amyloidu β (Aβ) [51]. Hiperfosforylacja tau może sprzyjać także interakcjom z innymi białkami, np. z ASN [88] czy PACSIN1 (protein kinase C and casein kinase substrate in neurons protein 1), które redukują zdolność łączenia się tau z MT [67]. Także uraz mózgu i związane z nim obniżenie aktywności fosfatazy alkalicznej oraz nasilenie prozapalnej odpowiedzi immunologicznej mogą powodować dysocjację tau od MT i być przyczyną tauopatii [5, 15]. Coraz częściej zwraca się także uwagę na rolę zespołu metabolicznego w procesie agregacji tau ze względu na związek między fosforylacją tau a szlakiem sygnalizacyjnym receptora insuliny. Zwiększona aktywność GSK3 w insulinooporności może prowadzić do hiperfosforylacji tau [113]. Rolę w indukowaniu tauopatii przypisuje się też aktywacji kinazy mTOR, która jest zaangażowana w wiele ważnych procesów biologicznych, takich jak: wzrost komórek, sygnalizacja komórkowa czy dynamika cytoszkieletu. Badania in vivo wykazały, że aktywacja kinazy mTOR może być związana z nadekspresją tau i z jej nieprawidłową fosforylacją [4].

Oprócz hiperfosforylacji tau podlega proteolizie. Jeden z fragmentów tau, powstający po odcięciu regionu powtórzeń tandemowych w domenie C-końcowej, określany jako tau rdzenia splątków neurofibrylarnych, jest nierozpuszczalny i toksyczny dla neuronów [74]. Inne patologiczne formy tau, które wyizolowano z PHFs pacjentów z AD oraz z innymi dysfunkcjami neurologicznymi powstają w wyniku odcięcia C-końca w miejscu Asp421 przez kaspazę 3 lub w miejscu Asp13 przez kaspazę 6 [25].

Szeroko dyskutowana jest także zdolność do rozprzestrzeniania się patologicznego tau w mózgu. Jak wykazały doświadczenia, inokulacja mózgu zdrowych myszy patologicznymi formami tau pochodzącymi z mózgów chorych na AD lub z mózgów transgenicznych myszy indukuje rozprzestrzenianie się tau w sposób przypominający rozprzestrzenianie się białek prionowych [18]. Proponowane są także dwa mechanizmy transsynaptycznego przekazywania patologicznego tau. Pierwszy to dyfuzja do przestrzeni synaptycznej wskutek zwiększenia przepuszczalności błony presynaptycznej „zainfekowanego” neuronu lub za pośrednictwem egzosomów [93]. Drugi mechanizm to wydzielanie tau do płynu mózgowo-rdzeniowego, w którym 441-aminokwasowe tau jest wykrywane u chorych na AD, jak również u myszy [56].

W pośmiertnie wyznakowanych mózgach chorych na AD wykazano, że w neurytach zajętych przez NFT, oprócz hiperfosforylowanych filamentów tau, występują złogi Aβ. Podczas gdy agregaty tau powstają wewnątrzkomórkowo, Aβ odkłada się przede wszystkim zewnątrzkomórkowo i tworzy patogenne blaszki amyloidowe. Peptydy amyloidowe powstają przez fragmentację białka prekursorowego amyloidu (APP). W wyniku działania β-sekretazy pojawia się βCTF (β-C-terminal fragment), który następnie ulega fragmentacji do Aβs przez γ-sekretazę [119]. Do amyloidogenezy mogą prowadzić zarówno mutacje genów APP oraz preseniliny-1 i -2 (PSEN1 i PSEN2) [34], jak i inne procesy patologiczne w mózgu, m.in. uruchomienie odpowiedzi immunologicznej mikrogleju i astrocytów przez patogeny i urazy [72], niedokrwienie lub stres oksydacyjny [91]. Najsilniejsze właściwości tworzenia patologicznych splątków oraz najbardziej toksyczne działanie na neurony mają hydrofobowe peptydy Aβ42 i Aβ40. Ich agregaty uruchamiają różne procesy prowadzące do dysfunkcji i śmierci neuronów, w tym zaburzenie gospodarki wapniowej, aktywację apoptozy, załamanie bioenergetyki mitochondriów oraz zmiany szlaków sygnałowych i maszynerii biochemicznej [59]. Agregaty oligomerów Aβ42 i Aβ40 mogą również powodować hiperfosforylację tau przez aktywację kinaz MAPK, GSK-3β oraz Fyn [120]. Badania in vitro oraz na transgenicznych modelach zwierzęcych jednoznacznie potwierdziły, że neurotoksyczność Aβ jest ściśle zależna od obecności hiperfosforylowanego tau [3]. Ittner i wsp. [50] wysunęli nawet hipotezę „osi tau”, w której stwierdzają, że krytycznym punktem toksycznego działania Aβ na neurony jest gromadzenie się patologicznego tau w dendrytach.

Każdy z opisanych procesów może być przyczyną modyfikacji w strukturze tau, które zaburzają dynamiczne zmiany konformacyjne podczas łączenia się tau z MT, zakłócając dystrybucję transportowanych organelli, pęcherzyków i białek, a to może hamować procesy plastyczności neuronów. Główną komponentą splątków neurofibrylarnych powodujących zaburzenia neurologiczne jest hiperfosforylowane tau w regionie bogatym w prolinę. Ta patologiczna forma tau znajduje się również w neuronach z prawidłowo funkcjonującymi MT oraz u starszych ludzi, u których nie powoduje deficytu neurologicznego przez dekady [1]. Szczegóły mechanizmów, które prowadzą do tworzenia nierozpuszczalnych agregatów tau oraz degeneracji neuronów pod ich wpływem nie są wyjaśnione, choć tauopatie są wykrywane w licznych schorzeniach neurologicznych. Dlatego poszukiwania strategii terapeutycznych mających na celu zmniejszenie toksyczności tau lub przywrócenie fizjologicznego działania MT rozwijane są wielokierunkowo. Są to: (1)

redukcja tau przez zastosowanie nonsensownych oligonukleotydów, miRNA, siRNA i inhibitorów transkrypcji;

TDP-43 jest wielofunkcyjnym białkiem obecnym we wszystkich rodzajach komórek, które zostało po raz pierwszy zidentyfikowane jako czynnik hamujący transkrypcję genu HIV [80]. Następne lata przyniosły doniesienia o udziale TDP-43 w regulacji transkrypcji wielu genów, a także w alternatywnym splicingu mRNA Cdk6, ApoA-II i CFTR [7]. W 2006 r. TDP-43 zidentyfikowano jako główny składnik nierozpuszczalnych, ubikwitynowanych inkluzji w mózgu pacjentów chorych na FTLD [78].

TDP-43 jest zbudowane z 414 aminokwasów i w natywnej postaci występuje w równowadze dwóch konfiguracji monomeru i dimeru. Cząsteczkę TDP-43 tworzą trzy funkcjonalne domeny. Pierwsza to domena N-końcowa (NTD), w której umiejscowiony jest przewidywany region lokalizacji mitochondriów 1 (M1) [33]. W warunkach in vitro i in vivo wykazano, że NTD jest niezbędna do tworzenia dimerów i zorganizowanych oligomerów TDP-43. Badania wiązania NTD z sekwencjami DNA i RNA wskazują, że domena ta decyduje o specyficzności i stabilności wiązania z kwasami nukleinowymi [54]. Środkową część cząsteczki TDP-43 zajmuje tandem konserwatywnych motywów wiążących RNA (RRM1 i RRM2) oraz region lokalizacji mitochondriów 2 (M2). Między NTD a regionem RRM1 znajduje się motyw sygnalizacji jądrowej (NLS) rozpoznawany przez importynę-α [84]. Oba motywy RRM rozpoznają dwuzasadowe sekwencje (TG)/(UG) w kwasach nukleinowych [33]. Region RRM1 jest wystarczający do prawidłowego wiązania z dwuzasadowymi powtórzeniami, jak i z innymi sekwencjami w kwasach nukleinowych. Natomiast RRM2 ma nietypową strukturę, która bierze udział w przekształcaniu form rozpuszczalnych białka we włókna amyloidowe. Ingerencja w strukturę cząsteczki w tym regionie powoduje akumulację TDP-43 w cytoplazmie i tworzenie nierozpuszczalnych agregatów oraz prowadzi do utraty jego zdolności wiązania z RNA [32]. W regionie RRM2 znaleziono motyw eksportu z jądra (NES). Jednak najnowsze badania przez ingerencję genetyczną w tym regionie nie potwierdziły udziału motywu NES w eksporcie TDP-43 z jądra, natomiast wykazały bierną dyfuzję TDP-43 z jądra [84]. Stąd przypuszczenie, że dimery TDP-43 wiążą się z kwasami nukleinowymi w jądrze, a monomery mogą dyfundować do cytoplazmy. Trzecia domena C-końcowa zawiera region lokalizacji mitochondriów 5 (M5), sekwencję niepolarnych aminokwasów glutamina/asparagina (Q/N) o właściwościach prionopodobnych oraz C-koniec bogaty w glicynę [87]. Ta domena TDP-43 łatwo przybiera patologiczną konformację o strukturze β-kartki [54], ponadto jest miejscem interakcji z wieloma partnerskimi czynnikami splicingowymi [7]. Z tego powodu karboksylowy koniec TDP-43 może się przyczyniać do tworzenia agregatów białka, choć sugeruje się również, że do amyloidogenezy TDP-43 potrzebne jest współdziałanie domeny C–końcowej z regionem RRM2 [107]. Ponadto większość mutacji genu kodującego TDP-43 powodujących degenerację neuronów ruchowych, jest umiejscowiona właśnie w domenie C-końcowej [83]. Funkcjonalną organizację cząsteczki TDP-43 przedstawia ryc. 3.

Ryc. 3

Białko TDP-43 należy do czynników splicingowych z rodziny heterogennych rybonukleoprotein (hnRNP) i bierze udział zarówno w konstytutywnym, jak i w alternatywnym składaniu pre-mRNA. W warunkach fizjologicznych TDP-43 jest rozmieszczone punktowo głównie w jądrze komórkowym [78]. Jednak ze względu na możliwość jego translokacji w komórce jest kolokalizowany z retikulum endoplazmatycznym [7] i mitochondriami, przy czym był wykryty zarówno w matriks, jak i przestrzeni międzybłonowej mitochondriów [92]. TDP-43 razem z wieloma innymi czynnikami splicingowymi tworzy w jądrze spliceosomy. W wyniku konkurencyjnego wiązania czynników splicingowych typu SRE działających w cis oraz czynników działających w trans, np. hnRNP i białek SR, z sekwencjami splicingu obecnymi w intronach i w eksonach genów, powstaje konstytutywny albo alternatywny transkrypt genu. TDP-43 wiąże się głównie z sekwencjami wyciszającymi i hamuje składanie pre-mRNA. TDP-43 uczestniczy nie tylko w podstawowych procesach splicingu RNA, ale także w translacji, w transporcie i stabilizacji mRNA oraz w procesie tworzenia long non-coding RNA (lncRNA) i miRNA. Po związaniu się TDP-43 z cząsteczkami RNA powstają granule rybonukleoproteinowe, w których mRNA jest transportowane wzdłuż mikrotubul z ciała neuronów do zakończeń aksonów. Związanie się TDP-43 z mRNA modyfikuje także czas półtrwania kwasu rybonukleinowego. Zastosowanie techniki CLIP-seq wykazało, że TDP-43 wiąże się z około 30% całego transkryptomu w komórce [86].

Gen TARDBP kodujący TDP-43 wykazuje konserwatywną strukturę, począwszy od muszek owocowych (Drosophila sp.) na człowieku skończywszy. Umiejscowiony jest w chromosomie 1 (1p36.22), zawiera 7 eksonów oraz gatunkowo zmienną liczbę intronów. Białko TDP-43 powstaje w wyniku translacji eksonów 2–6. Zidentyfikowano około 50 mutacji TARDBP, które występują zarówno w rodzinnej (4–5% przypadków), jak i w sporadycznej postaci ALS (około 1%) [49]. Mutacje TARDBP są w rzadkich przypadkach znajdowane także w demencji czołowo-skroniowej określanej jako podtyp FTLD z chorobą neuronu ruchowego (FTLD-TDP) [87]. Znalezione mutacje są umiejscowione w eksonie 6 kodującym C-końcową domenę białka [83], z wyjątkiem mutacji D169G w eksonie 4, która dotyczy regionu RRM1 oraz mutacji A90V znalezionej w NTD [16]. Badania genetyczne potwierdziły ścisły związek między proteinopatią TDP-43 a degeneracją neuronów ruchowych. Najczęstszą mutacją w rodzinnej i sporadycznej ALS jest zamiana alaniny na treoninę (A382T) lub glicyny na cysteinę (G348C) [83]. Mutacje zmiany sensu w eksonie 6 wywołują zmiany aminokwasów w pozycjach od 267 do 393 w C-końcowej domenie TDP-43, która również jest miejscem licznych potranslacyjnych modyfikacji. W dziewięciu mutacjach, w których reszty glicyny zostały zastąpione przez serynę lub treoninę, zwiększa się znacząco hiperfosforylacja TPD-43 [83]. Trzy inne mutacje zmiany sensu: S379C, S379P i S393L, prowadzą do likwidacji miejsc fosforylacji TPD-43 [57], a to może być przyczyną zaburzeń translokacji TDP-43 w początkowym stadium ALS lub w progresji tej choroby. W najnowszym doniesieniu opisano mutację S379A u pacjenta z ALS o późnym początku i gwałtownym przebiegu [97]. Inne mutacje TARDBP powodują tworzenie nowych miejsc ubikwitynacji (Q331K i N345K) lub przyspieszają spontaniczną agregację TDP-43 przez tworzenie wiązań dwusiarczkowych (G348C i S379C) [63]. Mutacja D169G w RRM1 zwiększa podatność TPD-43 na proteolizę przez kaspazę 3 i tworzenie patogennych fragmentów białka [16]. Natomiast TDP-43 z mutacjami A315T, G348C, A382T wykazuje dużą toksyczność dla neuronów [83].

Neuropatologia wywołana przez TDP-43 dotyczy przede wszystkim zaburzenia dystrybucji tego białka w komórce. Nadmierne gromadzenie się TDP-43 w cytoplazmie powoduje tworzenie dysfunkcyjnych kompleksów splicingowych w jądrze oraz powstawanie wadliwych transkryptów. Taki mechanizm wskazano jako przyczynę dystrofii neuronów ruchowych różnych fenotypów ALS, a także części przypadków FTLD [45]. U pacjentów z tymi chorobami znajdowane są ubikwitynowane, fosforylowane agregaty TDP-43 oraz C-końcowe fragmenty tego białka (25 i 35 kDa). Białko TDP-43 podlega znacznej liczbie potranslacyjnych modyfikacji, w większości tworzących patologiczne formy tego białka. Skutki części tych modyfikacji zostały potwierdzone jedynie na modelowych cząsteczkach TDP-43. Jako pierwszą odkryto patologiczną ubikwitynację TDP-43 [78]. Komputerowa analiza struktury cząsteczki wykazała, że ubikwitynacja Lys263 redukuje wiązanie TDP-43 z RNA. Dysfunkcja i nabycie przez cząsteczkę TDP-43 agregacyjnych właściwości może nastąpić również w wyniku oksydacji reszt cysteinowych, zwłaszcza Cys173, Cys175, Cys198 i Cys244 [33]. Wadliwe działanie TDP-43 w składaniu RNA, nieprawidłowe współdziałanie z cytoszkieletem i wiele innych nieprawidłowych interakcji TDP-43 z białkami stwierdzono po acetylacji reszt lizyny [19], a ubikwitynacja Lys181 krytycznie destabilizuje cząsteczkę [43]. Patologiczne właściwości wykazuje także sumoilowana forma TDP-43. Najprawdopodobniej w wyniku tej modyfikacji nie działa sygnał NLS, TDP-43 nie przechodzi do jądra i gromadzi się w cytoplazmie.

Inną patologiczną modyfikacją rybonukleoproteiny TDP-43 jest nieprawidłowa fosforylacja. U chorych na ALS i FTLD w C-końcowej domenie białka są znajdowane fosforylowane reszty S403-404 oraz S409-410 [77]. Jednak badania właściwości ufosforylowanego TDP-43 nie rozstrzygnęły, jakie patologiczne zmiany następują w strukturze cząsteczki w wyniku tych fosforylacji. C-końcowa domena TDP-43 wraz z tandemem RRM1/RRM2 może wiązać jony cynku, destabilizując cząsteczkę, sprzyjając jej agregacji i tworzeniu amyloidowych form [38]. W przypadku kompleksu TDP-43 z cynkiem i dla fosforylowanych form TDP-43 nie potwierdzono jeszcze ich znaczenia w neuropatologii, choć wyniki uzyskane in vitro potwierdzają proteinopatię TDP-43. Inne patologiczne formy TDP-43, o masie 25 kDa (TDP-25) i 35 kDa (TDP-35) powstają w wyniku proteolizy białka z udziałem kaspaz [9]. W obu tych fragmentach brakuje domeny NTD. W TDP-25 usunięty jest region NLS i większa część RRM1. W TDP-35 przerwany jest także motyw NLS, a to uniemożliwia translokację TDP-43 do jądra i białko zostaje uwięzione w cytoplazmie.

W cytoplazmie, TDP-43 wchodzi w skład kompleksów białkowo-nukleinowych tzw. granul stresu. Ich rolą jest zahamowanie translacji podczas niekorzystnych warunków w komórce, podczas stresu oksydacyjnego, retikularnego i mitochondrialnego. Nieprawidłowa budowa TDP-43 oraz innych białek wiążących RNA (FUS, Atx2, TIA1) zwiększa nie tylko właściwości agregacyjne tych białek, ale także tworzenie białkowo-nukleinowych granul stresu, bez udziału stresu komórkowego. Wtedy translacja RNA jest blokowana [89]. Inną przyczyną degeneracji neuronów może być zmniejszenie ilości białka przeżycia neuronów ruchowych (SMN), które tworzy w jądrach struktury nazywane coilled bodies. Jedna z hipotez zakłada, że przy obniżonej zawartości TDP-43 w jądrze zmniejsza się ilość coilled bodies i zostaje zaburzone działanie SMN w neuronach [103]. Przyczyną dysfunkcji neuronów ruchowych o długich aksonach, może być także zaburzenie przez patologiczne formy TDP-43 transportu mRNA białek, takich jak: VEGFA/GRN, NLF, aktyna czy CAMKII, z ciała neuronu do zakończenia aksonu.

Fosforylowane formy TDP-43 połączone z mitochondriami są wykrywane w neuronach i fibroblastach pacjentów z ALS i FTD, co może sugerować zmiany czynności mitochondriów i być przyczyną neuropatologii. U chorych m.in. na ALS i AD z proteinopatią TDP-43 mitochondria mają nieprawidłową budowę, są pofragmentowane, a w komórkowych modelach proteinopatii TDP-43 potencjał mitochondrialny oraz aktywność kompleksu I łańcucha oddechowego są obniżone [68]. Jednak dotychczas nie wyjaśniono dokładnie mechanizmów działania patologicznych form TDP-43 na czynność mitochondriów i ich udziału w procesach neurodegeneracji chociaż wiadomo, że patologiczne formy ASN, tau oraz oligomery Aβ upośledzają czynność mitochondriów. Być może w procesach neurodegeneracji istnieje konwergencja działania różnych patologicznych białek na bioenergetykę i inne funkcje mitochondriów.

Tak jak w innych proteinopatiach, wiele czynników może trwale destabilizować cząsteczkę TDP-43 i powodować tworzenie nierozpuszczalnych agregatów oraz łączenie tych form z organellami, przyczyniając się do zaburzeń funkcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów. Bezpośrednie przyczyny destabilizujące białko i wyzwalające jego agregację nie zostały jednoznacznie określone, ale wiadomo, że niekontrolowana agregacja TDP-43 i jego nieprawidłowe rozmieszczenie w komórce nerwowej są przyczyną obumierania neuronów, zwłaszcza ruchowych. Trwają intensywne badania funkcjonalnych zmian zmutowanych białek TDP-43 i poszukiwanie mechanizmów odpowiedzialnych za neuropatologię TDP-43 u pacjentów z chorobami neuronów ruchowych i zespołami otępiennymi, u których nie stwierdza się mutacji genu TARDBP.

Najczęściej diagnozowaną chorobą otępienną jest AD, natomiast 5–15% przypadków zespołów otępiennych to heterogenna fenotypowo FTD, w której dochodzi do jednostronnej lub dwustronnej degeneracji płatów czołowych i skroniowych. Najczęstszą przyczyną zespołów otępiennych są tauopatie, w których zanikają zdolności poznawcze, zapamiętywania oraz dochodzi do zmian osobowości. Z punktu widzenia neuropatologii można wyróżnić tauopatie pierwotne, gdy w komórkach nerwowych odkładane są jedynie helikalne filamenty lub splątki tau (PSP, CBD, PiD oraz FTDP-17) oraz tauopatie mieszane, w których razem z agregatami tau występują depozyty amyloidu Aβ (AD) lub ziarna argentofilne. Proteinopatia TDP-43 występuje w różnych fenotypach ALS, a także w zespołach otępiennych FTLD połączonych z dystrofią neuronów ruchowych (FTLD-TDP), w których zmodyfikowane białko agreguje w cytoplazmie neuronów, powodując ich dystrofię. W synukleinopatii dochodzi do agregacji w neuronach różnych form konformacyjnych ASN, nazywanych razem oligomerami i do tworzenia ciał Lewy’ego. Agregaty ASN powodują dystrofię głównie neuronów układu pozapiramidowego (PD, MSA), ale są także znajdowane w splotach nerwowych jelit i w neuronach przedzwojowych układu współczulnego. Powstanie ciał Lewy`ego w neuronach korowych wywołuje zespół otępienny (DLB), w którym objawy demencji wyprzedzają pojawienie się objawów choroby Parkinsona w przeciągu roku lub demencja pojawia się równocześnie z objawami parkinsonizmu. Warto jednak podkreślić, że agregaty patologicznych białek są znajdowane pośmiertnie w wielu strukturach układu nerwowego u ludzi po 65 roku życia bez patologicznych objawów neurologicznych.

Sporadyczne (idiopatyczne) choroby układu nerwowego stanowią 90–95% przypadków chorób neurodegeneracyjnych i są spowodowane destabilizacją cząsteczek ASN, tau lub TDP-43, w których może brać udział wiele różnorodnych czynników. Należą do nich infekcje, niedotlenienie i urazy mózgu, które uruchamiają nieswoistą obronę immunologiczną aktywując mikroglej i astrocyty. W zależności od rodzaju czynnika następuje zmiana ekspresji różnych genów, nasila się sekrecja cytokin prozapalnych (IL-1β, TNF-α, C3), chemokin (CCL3, CCL5) oraz innych białek (TIMP), aktywując obwodowe komórki immunologiczne. Zmienione sygnały chemiczne pochodzące z komórek glejowych „obsługujących” neurony, prowadzą do zmian ekspresji mRNA białek, nieprawidłowego docelowego umiejscowienia biomolekuł i dystrybucji organelli w komórkach. W neuronach dochodzi do zaburzenia procesów energetycznych i czynności mitochondriów, powodując najpierw wystąpienie stresu oksydacyjnego, a w końcowej fazie uruchomienie procesu apoptozy. Do etiologicznych czynników sporadycznych zespołów otępiennych i różnych wariantów chorób pozapiramidowych, zalicza się także szkodliwe zanieczyszczenia środowiskowe. Są to metale ciężkie, trwałe zanieczyszczenia organiczne (dioksyny, polichlorowane bifenyle i wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne), które dostają się do organizmu wraz z pyłem atmosferycznym oraz chemiczne zanieczyszczenia środkami ochrony roślin (herbicydy, insektycydy) żywności i wody pitnej. Oprócz zdefiniowanych czynników etiologicznych, za częste pojawianie się sporadycznych proteinopatii u osób starszych odpowiadają postępujące z wiekiem obniżenie efektywności działania enzymatycznej maszynerii genetycznej i biochemicznej, współistniejące choroby przewlekłe, a także długotrwałe przyjmowanie leków.

Kilkanaście procent przypadków zespołów otępiennych i zaburzeń czynności układu pozapiramidowego wynika z przyczyn genetycznych, które prowadzą do ekspresji białek różniących się właściwościami od białek natywnych. Bezpośrednią przyczyną omówionych proteinopatii są mutacje genów SNCA, MAPT, TARDBP kodujących odpowiednio ASN, tau oraz TDP-43, a także sąsiadujących z nimi genów np. PGRN. Do powstania proteinopatii może prowadzić również nadekspresja tych genów, alternatywny splicing mRNA oraz potranslacyjne modyfikacje białek, przede wszystkim hiperfosforylacja i ubikwitynacja. Powstają białka o zmienionej strukturze oraz nasilonej skłonności do agregacji. Jeśli patologiczne białka nie zostaną sprawnie usunięte przez system proteasomów, dochodzi do tworzenia nierozpuszczalnych fibryli, które odkładają się w postaci inkluzji, ciałek, złogów, blaszek, zawierających także inne toksyczne białka, takie jak peptydy amyloidowe β. Najbardziej zróżnicowanym pod względem genetycznym, patomorfologicznym i klinicznym zespołem otępiennym jest dziedziczona w sposób autosomalny dominujący rodzinna postać FTDP. U 15-20% chorych na FTD mutacje genów MAPT, GRN w chromosomie 17 (FTDP-17) współistnieją z parkinsonizmem, a u 18–30% chorych współwystępuje ekspansja 6-nukleotydowych powtórzeń w genie C9orf72 w chromosomie 9, powodująca dystrofię neuronów ruchowych lub ALS. Przyczyną dziedziczonych zespołów otępiennych, rozpoznawanych we wczesnym wieku, są także mutacje genów TARDBP i FUS, które występują w 3–6% przypadków FTD. Dlatego w przebiegu otępienia czołowo-skroniowego wyróżnia się wiele wariantów klinicznych tej choroby. Towarzyszą mu parkinsonizm, degeneracja motoneuronów, zmiana osobowości i zachowania (wariant behawioralny, bvFTD), zaburzenia motoryczne mowy (apraksja i dyzartria) oraz składni zdań, określane jako językowy wariant FTD (nfvPPA).

Wobec różnorodności fenotypów zespołów otępiennych i zaburzeń motorycznych, jednoczesne poznawanie skutków zmian genetycznych i molekularnych przyczyn proteinopatii, połączone z diagnostyką kliniczną i patomorfologiczną, może doprowadzić do trafniejszego i szybszego diagnozowania chorób neurodegeneracyjnych, ale przede wszystkim do opracowania celowanych terapii zwalniających lub wręcz hamujących postęp tych chorób, które dewastują życie osób w starszym wieku i są przyczyną ich wcześniejszej śmierci.

Autorzy dziękują Pani dr Barbarze Dziedzic za pomoc w przygotowaniu manuskryptu oraz Panu Lesławowi Miśkiewiczowi za wykonanie rycin.