PrzydatnoŚĆ Diagnostyczna Reakcji Pcr W Rozpoznawaniu Boreliozy

Borelioza jest chorobą odkleszczową wywoływaną przez bakterie zaliczane do kompleksu Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.). Obecnie do grupy tej należy około 20 genogatunków, z czego tylko dla 5 (Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia bavariensis, Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.), Borrelia spielmanii) definitywnie potwierdzono patogenność dla człowieka. Wszystkie z wyżej wymienionych genogatunków występują na terenie Europy. Natomiast w Ameryce Północnej jedynym wykrywanym czynnikiem wywołującym boreliozę jest B. burgdorferi s.s. Jednakże najnowsze doniesienia sugerują, iż również Borrelia bisettii i Borrelia mayonii mogą wywoływać chorobę z Lyme na terenie USA i Kanady [27, 52].

Borelioza to wieloukładowa choroba o przebiegu fazowym. Na wczesnym etapie choroby (do 8 tygodni od momentu zakażenia) najczęściej jedynym objawem jest rumień wędrujący (EM, erythema migrans). Jest to bardzo charakterystyczna zmiana skórna, mająca postać zaczerwienienia z centralnym przejaśnieniem. Według zaleceń Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych (PTEiLCHZ) wystąpienie typowego EM jest wskazaniem do natychmiastowego rozpoczęcia antybiotykoterapii bez wykonywania badań serologicznych [37]. Niestety, EM nie występuje u wszystkich pacjentów, dotyka jedynie ok. 40–90% zakażonych [1, 31, 38, 51]. Zazwyczaj na tym etapie bore liozy nie towarzyszą pacjentom żadne inne dolegli wości lub przybierają one postać objawów grypopodobnych, dlatego też chorzy często nie zdają sobie sprawy, iż potrzebują specjalistycznej pomocy. Prowadzi to do bardzo poważnych konsekwencji, ponieważ w przypadku braku odpowiedniej antybiotykoterapii, choroba może rozwinąć się do fazy rozsianej (od 6 do 26 tygodni od momentu zakażenia). Do najczęstszych objawów fazy rozsianej należą m.in. rumień wędrujący mnogi, objawy ze strony układu nerwowego pod postacią zespołu Bannwartha, zapalenia opon mózgowo--rdzeniowych, zapalenia korzeni nerwowych i nerwów czaszkowych, zmian zapalnych w obrębie serca oraz ostre nawracające zapalenie stawów. Innym charakterystycznym, lecz bardzo rzadkim objawem jest chłoniak limfocytowy (BL, borrelial lymphocytoma), który występuje u 0,3–3% chorych. BL ma postać niebolesnego, czerwonego obrzęku o średnicy kilku centymetrów zlokalizowanego głównie w lub na małżowinie usznej, mosznie i brodawkach sutkowych. Dolegliwości związane z późną fazą boreliozy, pojawiające się 6 miesięcy po zakażeniu, w znacznym stopniu uzależnione są od genogatunku krętka, który wywołał chorobę. Za boreliozowe zapalenie stawów (LA, Lyme arthritis) odpowiada głównie B. burgdorferi s.s., natomiast blisko ze sobą spokrewnione genogatunki B. garinii i B. bavariensis przeważnie prowadzą do postaci neurologicznej choroby (NB, neuroborelioza). B. afzelii jest w głównej mierze związana z zanikowym zapaleniem skóry (ACA, acrodermatitis chronica atrophicans). Natomiast B. spielmanii jest genogatunkiem sporadycznie wywołującym boreliozę u ludzi i jak dotąd izolowano go jedynie ze zmian skórnych [13, 25, 27, 50, 51].

Bakterie należące do grupy B. burgdorferi s.l. podczas swojego cyklu życiowego przebywają w bardzo zróż nicowanym środowisku. Prawdopodobnie to ta różnorodność warunków ich bytowania sprawiła, iż genom B. burgdorferi s.l. ma jedną z najbardziej skomplikowanych struktur wśród bakterii [5, 17].

Genom krętków składa się z liniowego chromosomu o długości około 910 kpz oraz 21 plazmidów (9 kolistych i 12 liniowych) o wielkościach wynoszących w przybliżeniu od 5 do 54 kpz. Ponadto charakteryzuje się on dużą zawartością genów paralogicznych, pseudogenów oraz niekodujących fragmentów DNA. Warto zaznaczyć, iż do tej pory nie poznano funkcji wielu genów, ponieważ nie wykazują one znaczącej homologii z wcześniej poznanymi sekwencjami [7, 9, 17].

Liniowy chromosom ma dość dobrze zakonserwowaną sekwencję wśród dotychczas przebadanych genogatunków B. burgdorferi s.l. Posiada on kowalencyjnie zamknięte końce przypominające strukturę spinki do włosów. Jego replikacja ma charakter dwukierunkowy symetryczny, jednakże jej szczegółowy mechanizm nie został dotychczas poznany. Chromosom zawiera 26 pseudogenów oraz 860 genów kodujących 797 białek, odpowiedzialnych głównie za metabolizm podstawowy bakterii. Dokładniejsza analiza sekwencji wykazała, że B. burgdorferi s.l. nie posiada genów kodujących enzymy niezbędne do syntezy aminokwasów, nukleotydów, kwasów tłuszczowych i kofaktorów enzymów. Prawdopodobnie zostały one utracone na skutek przystosowania się krętka do pasożytniczego trybu życia [5, 7, 9, 17, 36]. W związku z tym B. burgdorferi s.l. posiada wiele genów (co najmniej 52) kodujących różnego typu białka transporotowe oraz wiążące odpowiedzialne za dostarczanie komórce bakterii niezbędnych do przeżycia węglowodanów, peptydów i aminokwasów [45].

Duża liczba plazmidów, niespotykana u innych bakterii sprawia, że B. burgdorferi s.l. wykazuje znaczną zmien ność w obrębie gatunku oraz w ciągu cyklu życio wego. Liczne plazmidy kodują głównie informację genetyczną wpływającą na wirulencję i patogenność bakterii z rodzaju Borrelia. Lipoproteiny, występujące na zewnętrznej błonie bakteryjnej stanowią kluczową grupę białek odpowiedzialnych między innymi za transmisję krętka, jego rozprzestrzenianie oraz przeżycie w orga niz mie żywiciela. Ich różnorodność oraz ogromne znaczenie w cyklu życiowym B. burgdorferi s.l. podkreśla fakt, iż geny kodujące lipoproteiny stanowią nawet 15% informacji genetycznej zlokalizowanej na plazmidach [7, 8, 30, 46]. Nie wszystkie szczepy B. burgdoferi s.l. posiadają pełen zestaw plazmidów. Jedynie plazmidy cp26, cp32 i lp54 są niezbędne do przeżycia bakterii w środowisku. Dlatego też obecne są we wszystkich izo latach B. burgdorferi s.l. oraz wykazują stosunkowo wysoki stopień zakonserwowania sekwencji nukleotydowej. Reszta z plazmidów jest dość łatwo gubiona, co wiąże się z dużą trudnością w hodowli laboratoryjnej w pełni wirulentnych szczepów B. burgdorferi s.l. [5, 8, 27, 36].

Ze względu na zróżnicowany przebieg rozpoznanie boreliozy na podstawie objawów klinicznych jest bardzo trudne. Jedynie w przypadku pojawienia się typowego rumienia wędrującego można postawić prawidłową diagnozę. Niestety, nie pojawia się on u wszystkich chorych a jedynie u 40–90% z nich [1, 31, 38, 51]. Często też jest przez nich niezauważany, dlatego nie zawsze istnieje możliwość zdiagnozowania choroby na tej podstawie. Z tychże względów diagnostyka boreliozy opiera się głównie na metodach laboratoryjnych [1, 27, 38].

Dla większości chorób bakteryjnych diagnostyka oparta o laboratoryjną hodowlę patogenów z materiału biologicznego pobranego od pacjentów jest uznawana za złoty standard, cechujący się 100% specyficznością. Niestety, podejście to nie jest wykorzystywane w rozpoznaniu choroby z Lyme ze względu na bardzo duże wymagania wzrostowe krętków oraz długi czas oczekiwania na wynik [11, 27].

Obecnie w większości przypadków boreliozę rozpoznaje się na podstawie dwustopniowego badania serologicznego, którego pierwszym etapem jest czuły test immunoenzymatyczny (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay). Jeżeli wynik badania jest dodatni lub wątpliwy, jako test drugiego stopnia wykorzystuje się technikę Western blotting (WB). W obu metodach główne źródło antygenów stanowią całkowite lizaty komórkowe B. burgdoferi s.l. Niestety, ogromna różnorodność genogatunków w obrębie B. burgdorferi s.l. oraz niski stopień zakonserwowania sekwencji aminokwasowej ich białek sprawia, że wykorzystanie lizatów komórkowych jednego genogatunku nie jest wystarczające do prawidłowego rozpoznania boreliozy. Potencjalnym rozwiązaniem wyżej wymienionych problemów może być zastosowanie w serodiagnostyce niniejszej choroby antygenów rekombinantowych otrzymywanych z wykorzystaniem metod inżynierii genetycznej i biologii molekularnej. Jednakże, aby testy immunodiagnostyczne oparte na białkach rekombinantowych miały jak największą czułość i swoistość należy wykorzystać w nich starannie wyselekcjonowane antygeny lub ich fragmenty [19].

Dodatkowo czułość testów serologicznych jest silnie uzależniona od czasu trwania choroby. Ze względu na tzw. okienko serologiczne, czyli przedział czasu od momentu zakażenia do chwili pojawienia się w krążeniu swoistych immunoglobulin, które są wykrywane z wykorzystaniem laboratoryjnych metod diagnostycznych, wyniki badań serologicznych na wczesnym etapie choroby są często fałszywie ujemne. W miarę trwania infekcji odpowiedź immunologiczna stopniowo dojrzewa, w wyniku czego czułość testów serologicznych podczas późniejszych stadiów choroby znacząco wzrasta [1, 27, 31].

Rozwiązaniem problemów, które towarzyszą prawidłowemu, wczesnemu rozpoznaniu boreliozy może być zastosowanie nowoczesnych metod molekularnych polegających na wykrywaniu materiału genetycznego krętka tj. DNA w próbkach klinicznych za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR, polymerase chain reaction) [11, 25, 44].

Najprostszym podejściem mającym na celu amplifikację określonego fragmentu DNA jest klasyczna reakcja PCR z użyciem dwóch specyficznych starterów. Po jej zakończeniu należy określić wielkość otrzymanego produktu za pomocą elektroforezy agarozowej lub poliakrylamidowej. Istotną wadą tego podejścia jest możliwość pojawienia się niespecyficznych produktów PCR o zbliżonej wielkości do oczekiwanej. Z tego też względu niezbędna jest dodatkowa kontrola specyficzności. Zwykle do tego celu wykorzystuje się wyznakowane sondy, które są komplementarne do fragmentu amplifikowanej sekwencji DNA [11, 44].

Inną często wykorzystywaną metodą jest PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR, real-time PCR), który charakteryzuje się wyższą czułością i specyficznością niż standardowa reakcja PCR. Specyficzność reakcji jest kontrolowana poprzez hybrydyzację produktu reakcji z sondą dodaną do mieszaniny reakcyjnej lub poprzez analizę krzywej topnienia. W wyniku przyłączenia się sondy do powstałych amplikonów następuje wyemitowanie sygnału fluorescencyjnego, dzięki któremu możliwe jest monitorowanie przyrostu produktów w czasie rzeczywistym. Natomiast wyznaczenie temperatury topnienia produktu PCR jest możliwe dzięki znajdującemu się w mieszaninie reakcyjnej barwnikowi (np. SYBR Green), który zwiększa swoją fluorescencję po związaniu się z podwójną nicią DNA. Temperaturę topnienia produktu PCR wyznacza się po zakończeniu reakcji RT-PCR poprzez stopniowe ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej. W momencie osiągnięcia temperatury właściwej dla denaturacji fragmentu DNA (przejście do pojedynczej nici DNA) sygnał fluorescencji gwałtownie spada, co jest widoczne na wykresie (tzw. krzywej topnienia) jako wyraźny pik [11, 44].

Kolejna popularna odmiana metody PCR, która znalazła zastosowanie w diagnostyce boreliozy to tzw. wewnętrzny PCR. Jest to dwuetapowa reakcja PCR z wykorzystaniem dwóch par starterów (zewnętrznych oraz wewnętrznych), które charakteryzują się dużymi różnicami w temperaturze topnienia. W pierwszym etapie reakcji otrzymuje się dłuższy produkt PCR z udziałem starterów zewnętrznych. Następnie po obniżeniu temperatury przyłączania starterów w reakcji bierze udział druga para oligonukleotydów, komplementarna wobec sekwencji nukleotydowej znajdującej się w obrę bie pierwotnego produktu PCR. Udowodniono, iż zastosowanie wewnętrznego PCR może nawet 1000-krotnie zwiększyć czułość testu diagnostycznego w porównaniu ze standardową reakcją PCR [11, 26].

Jedną z nowszych metod jest reakcja PCR połączona ze spektrometrią masową (MS, mass spectrometry) z elektrorozpylaniem (ESI, electrospray ionization) (PCR/ESI-MS). Podstawą PCR/ESI-MS jest zastosowanie starterów zdolnych do amplifikacji fragmentów genów metabolizmu podstawowego szerokiej grupy organizmów. Po zakończeniu reakcji produkty są analizowane za pomocą spektrometrii masowej z wystarczającą dokładnością, aby można było określić w nich zawartość poszczególnych zasad azotowych (A, G, C i T). Następnie uzyskane wyniki są porównywane z bazą danych znanych organizmów, co pozwala na szybką identyfikację organizmu, z którego pochodziło amplifikowane DNA. Amplifikacja fragmentów siedmiu genów B. burgdorferi s.l. tj. ropC, rplB, leuS, flaB, ospC, hbb, gyrB pozwala nie tylko na detekcję materiału genetycznego krętka, ale również umożliwia identyfikację poszczególnych genogatunków patogenu [14, 15].

Kluczowym elementem diagnostyki molekularnej jest wybór odpowiedniego genu docelowego. Aby metoda ta była wysoce czuła i specyficzna cel molekularny musi być stabilny genetycznie oraz wysoce zakonserwowany wśród wszystkich genogatunków B. burgdorferi s.l. Dotychczas do celów klinicznych wykorzystywano zarówno geny zlokalizowane na chromo somie (hbb, fla, rrs, rrl, region międzygenowy rrl-rrf, recA, bmpA, p66) jak i kodowane na plazmidach (ospA, ospC, dbpA) (Tab. I). Znaczący wpływ na czułość metody ma również liczba kopii danego fragmentu DNA w genomie bakterii. Plazmidy często występują w komórkach bakterii w kilku kopiach, z tego powodu wydaje się, iż wybór celu molekularnego zlokalizowanego na jednym z nich może zwiększać czułość testu diagnostycznego [1, 11, 39, 44]. Wyniki potwierdzające tę tezę przedstawili Nocton i wsp. (1994) udowadniając, iż PCR ukierunkowany na kodowany plazmidowo gen ospA charakteryzował się wyższą czułością w detekcji DNA B. burgdorferi s.l. w płynie stawowym, niż ten wykrywający zlokalizowany na chromosomie gen rrs [34]. Jednakże, w 1997 roku Priem i wsp. badając próby moczu, płynu mózgowo-rdzeniowego i płynu maziowego pobrane od 57 pacjentów z boreliozą w kierunku obecności DNA B. burgdorferi s.l. otrzymali odmienne rezultaty. Badania te wykazały, iż reakcja PCR mająca na celu amplifikację sekwencji DNA zlokalizowanej na chromosomie (gen p66) cechowała się wyższą czułością w wykrywaniu DNA patogenu, niż oparta o kodowany plazmidowo gen ospA [41]. Przyczyną tej rozbież ności wyników wydaje się być wysoka heterogenność genu ospA wśród przedstawicieli B. burgdorferi s.l. [53]. Nocton i wsp. (1994) w swych badaniach wykorzystywali próbki kliniczne pobrane od pacjentów zamieszkujących USA, gdzie jedynym genogatunkiem wywołującym boreliozę jest B. burgdorferi s.s., prawdopodobnie więc sekwencja nukleotydowa genu ospA wśród poszczególnych izolatów była stosunkowo mało zróżnicowana. Natomiast Priem i wsp. (1997) badaniu poddali próby pochodzące od pacjentów zamieszkujących teren Niemiec, gdzie za wywołanie boreliozy może być odpowiedzialnych co najmniej 5 genogatunków. Wydaje się zatem, iż zróżnicowanie genetyczne przedstawicieli B. burgdorferi s.l. w próbkach wykorzystywanych w powyżej przedstawionych badaniach było znacznie większe, a co za tym idzie startery wykorzystane w reakcji PCR nie rozpoznawały wszystkich wariantów sekwencji genu ospA, tym samym obniżając jej czułość.

Ogromna różnorodność genetyczna bakterii z grupy B. burgdorferi s.l. oraz duża liczba plazmidów utrudnia wybór celu molekularnego zlokalizowanego na plazmi dzie, który umożliwiłby rozpoznanie boreliozy bez względu na to jakim genogatunkiem nastąpiło zakażenie. Z tego względu to właśnie geny umiejscowione na chromosomie, o stosunkowo wysoko zakonserwowanej sekwencji nukleotydowej, wydają się bardziej odpowiednie jako cele molekularne w diagnostyce boreliozy. Dzięki dostępnym w bazie NCBI (National Center for Biotechnology Information) sekwencjom nukleotydowym różnych genogatunków B. burgdorferi s.l. możliwe jest ich porównanie w celu zidentyfikowania zakonserwowanych fragmentów. W wyniku takiej analizy naukowcom udało się zlokalizować region DNA (umiejscowiony na chromosomie) kodujący fragment rdzenia białka rybosomalnego S21, który powtarza się u 31 genogatunków B. burgdorferi s.l. [24].

Różni przedstawiciele grupy B. burgdorferi s.l. powodują inny przebieg późnej boreliozy oraz mogą odmiennie reagować na używane w leczeniu choroby z Lyme antybiotyki. Z tych powodów identyfikacja poszczególnych genogatunków pozwala na lepsze poznanie epidemiologii oraz mechanizmów wirulencji B. burgdorferi s.l. [32, 49].

Możliwość opracowania szybkiej i taniej metody pozwalającej na rozróżnienie poszczególnych genogatunków B. burgdorferi s.l. daje diagnostyka molekularna. Niestety, wybór odpowiedniej sekwencji, umożliwiającej łatwą identyfikację genogatunkową metodami molekularnymi jest bardzo trudny. Jednakże udowodniono, iż kilka specyficznych fragmentów genomu B. burgdorferi s.l. posiada potencjał różnicujący umożliwiający identyfikację genogatunków na podstawie analizy produktów reakcji PCR. Procedury te obejmują sekwencjonowanie, porównywanie wielkości produktów amplifikacji, wyznaczenie temperatury topnienia, analizę restrykcyjną oraz hybrydyzację ze specyficznymi sondami.

Jednym z fragmentów genomu pozwalającym na identyfikację poszczególnych genogatunków B. burgdorferi s.l. jest region rrf-rrl umiejscowiony między genami kodującymi podjednostki 23S rRNA i 5S rRNA. Wykazano, iż przy użyciu wewnętrznego PCR skierowanego na ten niekodujący fragment DNA, można łatwo odróżnić od siebie (na podstawie wielkości produktów PCR) B. burgdorferi s.s., B. afzelii oraz B. garinii, które są najczęstszą przyczyną boreliozy w Europie [54]. Na szybką identyfikację wyżej wymienionych genogatunków pozwala również analiza krzywych topnienia produktów PCR powstałych na drodze amplifikacji wysoce zróżnicowanego genu ospA [42].

Bardzo wysoki potencjał różnicujący posiada gen hbb, kodujący jedno z białek histonopodobnych. W badaniach udowodniono, iż analiza krzywej topnienia amplifikowanego fragmentu genu hbb pozwala rozróżnić 5 genogatunków B. burgdorferi s.l., tj. B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. garinii, Borrelia valaisiana, Borrelia lusitaniae [16, 40].

Popularną, lecz stosunkowo czasochłonną metodą umożliwiającą identyfikację poszczególnych genogatunków jest PCR połączony z analizą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP, restriction fragments length polymorphism). RFLP polega na trawieniu produktu PCR odpowiednim enzymem restrykcyjnym, co prowadzi do powstania fragmentów DNA o różnych długościach, charakterystycznych dla każdego genogatunku. Unikalny wzór prążków wizualizuje się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wykazano, iż analiza PCR-RFLP wykorzystująca fragmenty genów fla (trawienie enzymem restrykcyjnym HpyF3I) i rrs (trawienie enzymem restrykcyjnym FspBI) pozwala na identyfikację sześciu genogatunków z kompleksu B. burgdorferi s.l., tj. B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. garinii, B. valaisiana, B. lusitaniae i Borrelia bissetti [54].

Metodą mającą bardzo wysoki potencjał dyskryminacyjny jest MLST (multilocus sequence typing). Polega ona na amplifikacji fragmentów kilku genów metabolizmu podstawowego, a następnie sekwencjonowaniu otrzymanych produktów PCR. Porównanie sekwencji ośmiu genów B. burgdorferi s.l. (clpA, clpX, nifS, pepX, pyrG, recG, rplB, uvrA) pozwala na rozróżnienie nawet bardzo blisko spokrewnionych ze sobą genogatunków, np. B. garinii i B. bavariensis. Ze względu na to, iż MLST jest metodą wyjątkowo czułą, ale zarazem kosztowną, jest ona wykorzystywana przede wszystkim w badaniach epidemiologicznych oraz w analizie filogenetycznej [29, 44].

Rodzaj badanego materiału klinicznego uzależniony jest od objawów choroby oraz czasu ich trwania. W przypadku występowania EM lub ACA pobiera się bioptaty zajętej skóry, natomiast przy podejrzeniu NB jest to płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF, cerebrospinal fluid), gdy zaś występują objawy stawowe do badań pobiera się płyn stawowy. Krew jest wykorzystywana jedynie w przypadku podejrzenia wczesnej boreliozy, natomiast stosowanie moczu jako materiału klinicznego nie jest zalecane ze względu na małą powtarzalność wyników. Każdy z tych materiałów charakteryzuje się odmienną przydatnością w diagnostyce boreliozy (Tab. II), na co wpływ ma obecność inhibitorów w danym rodzaju próbki klinicznej oraz tropizm tkankowy krętków [27, 44, 52].

Według wielu fachowców najlepszym materiałem do badań molekularnych w kierunku boreliozy są wycinki skóry z obszaru zajętego przez EM, czułość takich testów osiąga nawet 90%, natomiast swoistość waha się w zakresie 98–100%. Badania mające na celu porównanie skuteczności metod diagnostycznych w przypadku pacjentów z EM wykazały, iż najwyższą czułością charakteryzował się RT-PCR (80%). Na kolejnym miejscu znalazła się dwuetapowa diagnostyka serologiczna (66%), następnie wewnętrzny PCR (64%) oraz metoda biologiczna oparta o hodowlę krętków z próbek klinicznych (51%). Test oparty na RT-PCR wykazał dużo wyższą czułość niż badanie serologiczne, co pokazuje, o ile większą użyteczność mogą mieć metody molekularne w początkowych fazach infekcji [35, 44]. Wysoką czułość uzyskuje się również w przypadku badania bioptatów skóry pobranych ze zmian obecnych w przebiegu ACA, dodatkowo podejście to również charakteryzuje się bardzo wysoką specyficznością [11, 52].

Bardzo wysoką czułość i specyficzność testów diagnostycznych opartych na reakcji PCR otrzymuje się w przypadku badania płynu stawowego – w niektórych pracach naukowych obie te wartości wynoszą nawet 100%. Jednak w przypadku podejrzenia LA materiałem wyjściowym może być również błona maziowa. Takie podejście może prowadzić do znacznego zwiększenia czułości testu (nawet z 25% do 90%) [21, 44]. Dodatkowo udowodniono, iż po antybiotykoterapii DNA krętka dłużej utrzymuje się w tkance maziowej niż w płynie stawowym [11, 27]. Należy jednak podkreślić, iż metodyka opisana w powyższych publikacjach nie jest jeszcze powszechnie stosowana, dlatego te optymistyczne doniesienia o tak wysokiej czułości tego typów testów powinny być jeszcze zweryfikowane przez inne zespoły badawcze. Dodatkowo należy pamiętać, iż LA (podobnie jak ACA) jest objawem późnej boreliozy, więc u pacjentów na tym etapie choroby prawie zawsze w krążeniu występuje wysokie miano przeciwciał klasy IgG [11, 52].

Diagnostyka molekularna neuroboreliozy opiera się na analizie płynu mózgowo-rdzeniowego. Podejście to jednak ze względu na małą liczbę krętków w CSF, wysokie powinowactwo bakterii do otoczki mielinowej oraz możliwość degradacji materiału genetycznego, ma stosunkowo niską czułość (22,5%). Największe prawdopodobieństwo wykrycia DNA krętków w CSF występuje we wczesnej neuroboreliozie [18, 33, 44].

Próbki krwi, pomimo łatwości ich pozyskania, nie stanowią dobrego materiału klinicznego w diagnostyce molekularnej boreliozy. Spowodowane jest to niską liczbą krętków w krążeniu na co ma wpływ silny tropizm tkankowy patogenów (stawy, serce, tkanka nerwowa). Testy PCR z krwi są przydatne jedynie we wczesnej fazie infekcji, podczas rozprzestrzeniania się B. burgdorferi s.l. z miejsca wkłucia kleszcza przez układ krwionośny do innych narządów. Dodatkowo we krwi obecne są liczne inhibitory reakcji PCR (takie jak np. heparyna, hemoglobina, DNA gospodarza), co może prowadzić do uzyskania wyników fałszywie negatywnych [1, 28, 47].

Mocz jest jednym z najłatwiej dostępnych materiałów klinicznych, dlatego wielu naukowców badało jego przydatność do diagnostyki molekularnej boreliozy. Wstępne doniesienia literaturowe były bardzo obiecujące. Bergmann i wsp. (2002) opracowali reakcję PCR wykrywającą DNA B. burgdorferi s.l. w moczu z czułoś cią na poziomie 85% [2]. Niestety, po przeprowadzeniu badań na większej liczbie prób pacjentów z boreliozą okazało się, iż czułość, a w szczególności specyficzność testów molekularnych wykorzystujących ten materiał kliniczny, nie jest zadowalająca. Obecnie większość europejskich i amerykańskich standardów odradza stosowanie moczu w metodach opartych na PCR głównie z powodu często pojawiających się niespecyficznych produktów i małej powtarzalności wyników [1, 12, 23, 27, 43].

Diagnostyka molekularna ma znaczną przewagę nad standardowo stosowanymi metodami serologicznymi w początkowych fazach infekcji (zlokalizowanej i rozsianej), gdy organizm nie zdążył jeszcze wytworzyć swoistych przeciwciał. Dodatkowo, pomimo znacznych zalet reakcji PCR, również w przypadku diagnostyki molekularnej możliwe jest otrzymanie wyników fałszywie pozytyw nych bądź fałszywie negatywnych. Spowodowane jest to faktem, iż na skuteczność techniki PCR wpływa wiele czynników, które zostały omówione powyżej (m.in.: rodzaj reakcji PCR, cel molekularny, materiał kliniczny, czas pobrania próbki – przed lub po rozpoczęciu leczenia, metody izolacji i oczyszczania DNA, obecności inhibitorów i/lub zanieczyszczeń) [27, 44]. Prawdopodobnie te właśnie problemy z powtarzalnością wyników przyczyniają się do tego, iż metody diagnostyczne oparte o metodę PCR nie są rekomendowane przez największe agencje zajmujące się ochroną zdrowia [6, 20, 33, 37]. Jednakże, mimo braku standaryzacji, coraz więcej placówek ochrony zdrowia dostrzega zalety metod molekularnych w rozpoznaniu boreliozy, dopuszczając to podejście diag nostyczne w niektórych przypadkach (Tab. III).

Zalecenia te dotyczą m.in. występowania nietypowych postaci rumienia wędrującego, które nie pozwalają na jednoznaczną diagnozę. Możliwe są przypadki pojawienia się krwotocznego EM (szczególnie na kończynach dolnych) przybierającego ciemnofioletowy kolor, inne doniesienia mówią także o wyjątkowo,, bladych” postaciach EM, w których wyraźnie widoczne są jedynie ich obwódki. Dodatkowo w miejscu ugryzienia kleszcza, w odpowiedzi na alergeny zawarte w ślinie pajęczaka, może pojawić się odczyn zapalny przypominający swoją formą EM. W takich przypadkach diagnostyka molekularna może mieć rozstrzygające znaczenie w rozpoznaniu boreliozy [20, 25, 37].

Borrelial lymphocytoma jest rzadką postacią zakażenia B. burgdorferi s.l. W przypadku jego wystąpienia zalecane jest badanie serologiczne, jednak ze względu, iż BL pojawia się we wczesnej lub wczesnej rozsianej fazie boreliozy uzyskane wyniki mogą być niejednoznaczne. Zauważono również, iż BL może przybierać nietypową postać. W wyżej wymienionych przypadkach rekomenduje się wykonanie badań mających na celu bezpośrednią identyfikację krętków [10, 20, 37].

Podobne rekomendacje dotyczą pacjentów z zanikowym zapaleniem skóry. ACA jest postacią późnej boreliozy, dlatego też w większości przypadków rozpoznanie choroby opiera się na testach serologicznych. Jednak, w niektórych okolicznościach (nietypowy wygląd zmian skórnych, niski wzrost miana przeciwciał) zaleca się wykonanie dodatkowych testów diagnostycznych obejmujących badanie histopatologiczne oraz metodę PCR [20, 37].

W przypadku neuroboreliozy zgodnie z wytycznymi Europejskiej Federacji Towarzystw Neurologicznych wykrywanie B. burgdorferi s.l. w CSF ma uzasadnienie kliniczne jedynie w pierwszych 6 tygodniach NB, gdy swoiste przeciwciała nie są jeszcze obecne w surowicy pacjentów [33, 37].

Wykorzystanie metod molekularnych jest również dopuszczane w przypadkach, gdy pacjenci z podejrzeniem LA, mimo trwającej antybiotykoterapii, nadal odczuwają dolegliwości stawowe. Świadczyć to może o tym, iż rozwinęło się u nich antybiotykooporne zapalenie stawów (AZS). W tym przypadku, w celu postawienia prawidłowej diagnozy, powinno się przeprowadzić detekcję DNA B. burgdorferi s.l. w płynie stawowym. Brak DNA krętka w próbce świadczy o AZS, co wiąże się z koniecznością wdrożenia innej metody leczenia [37].

Mimo, iż złotym standardem w rozpoznaniu boreliozy jest diagnostyka serologiczna, nie pozostaje ona wolna od wielu ograniczeń. Jednym z głównych problemów jest tzw. okienko serologiczne (trwające ok. 2–3 tygodnie), w czasie którego serodiagnostyka jest niewskazana.

Należy pamiętać, że najlepsze wyniki w leczeniu boreliozy otrzymuje się, gdy odpowiednia antybio tykoterapia zostanie wdrożona najszybciej jak to możliwe. Opóźnienie w diagnozie, związane z okienkiem serologicznym, może prowadzić do szerokiego zakresu problemów zdrowotnych dla pacjenta, takich jak zaburzenia neurologiczne, zapalenie mięśnia sercowego i zapalenie stawów. Z tego względu konieczne jest opracowanie nowych metod diagnostycznych umożliwiających rozpoznanie boreliozy już w początkowych etapach infekcji. Innym problemem są pacjenci cierpiący z powodu dysfunkcji układu immunologicznego, u których produkcja swoistych przeciwciał może być zaburzona. Dodatkowo ze względu na wysokie wymagania wzrostowe B. burgdorferi s.l., długi czas oczekiwania na wynik oraz niską skuteczność, diagnostyka mikrobiologiczna nie może być alternatywą dla serodiagnostyki.

W tych przypadkach rozwiązaniem powyższych problemów wydają się być metody molekularne, charakteryzujące się prostotą wykonania oraz krótkim czasem oczekiwania na wynik. Umożliwiają one wykrycie DNA B. burgdorferi s.l. w organizmie człowieka jeszcze przed pojawieniem się we krwi swoistych przeciwciał. Pozwala to na bardzo wczesne wdrożenie leczenia, co uniemożliwia patogenom rozprzestrzenienie się w organizmie pacjenta.

O popularności idei wykorzystania reakcji PCR w diagnostyce boreliozy, świadczy duża liczba publikacji naukowych opisujących jej zastosowanie w detekcji DNA B. burgdorferi s.l. Szybki rozwój metod biologii molekularnej zaowocował opracowaniem nowych odmian reakcji PCR, które charakteryzują się wyższą czułością oraz pozwalają na dokładniejsze kontrolowanie specyficzności reakcji. Zalety te sprawiają, iż obecnie w większości doniesień naukowych wykorzystywane są nowocześniejsze metody amplifikacji DNA B. burgdorferi s.l., takie jak RT-PCR oraz wewnętrzny PCR. Dodatkowo, metody szybkiego i taniego sekwencjonowania DNA umożliwiły dokładne poznanie genomu wielu bakterii z rodzaju Borrelia. Dzięki temu można wytypować wysoko zakonserwowane fragmenty, pozwalające na detekcję wszystkich genogatunków B. burgdorferi s.l. lub takie, których różnice w sekwencji umożliwiają szybką ich identyfikację. Obecnie jako cele molekularne wykorzystywane są zarówno geny umiejscowione na chromosomie (wyższy stopień zakonserwowania), jak i te zlokalizowane na plazmidach (większa różnorodność).

Dotychczasowe doniesienia literaturowe udowadniają, iż diagnostyka molekularna charakteryzuje się wysoką specyficznością (z wyjątkiem prób moczu) oraz stosunkowo dużą czułością. Niestety, pomimo tych niezaprzeczalnych zalet, testy diagnostyczne oparte na reakcji PCR muszą sprostać wielu wyzwaniom. Największym problemem jest brak wystandaryzowanych protokołów jasno opisujących poszczególne etapy testów. Testy molekularne opisane w pracach naukowych różnią się od siebie prawie w każdym aspekcie. Wykorzystują różne typy reakcji PCR (klasyczny PCR, Real-Time PCR, wewnętrzny PCR, PCR/ESI-MS), odmienne cele molekularne (hbb, fla, rrs, rrl, region międzygenowy rrl-rrf, recA, bmpA, p66, ospA, ospC, dbpA) oraz zróżnicowane rodzaje próbek klinicznych (wycinek skóry, płyn stawowy, CSF, krew, mocz). Brak standaryzacji metod molekularnych dotyczy również procedur mających miejsce bezpośrednio przed właściwym testem diagnostycznym tj. objętość pobieranej próbki, sposób jej przechowywania oraz metody izolacji materiału genetycznego. Mimo tego, iż wykazano wpływ przebiegu wyżej wymienionych czynności na czułość reakcji PCR [2, 3, 11], w wielu przypadkach autorzy publikacji nie zamieszczali w pracach ich opisu. Z powodu wspomnianych różnic i niedopowiedzeń uzyskane przez różne zespoły badawcze wyniki są często rozbieżne i niejednoznaczne. Konieczne wydaje się zatem przeprowadzenie wiarygodnych i rzetelnych badań porównawczych mających na celu opracowanie najbardziej optymalnego testu diagnostycznego opartego o reakcję PCR.

Prawdopodobnie właśnie z wyżej wymienionych powodów diagnostyka molekularna boreliozy stanowi obecnie jedynie wsparcie dla testów serologicznych. Jednakże, coraz więcej agencji ochrony zdrowia zaczyna dostrzegać jej potencjał i wprowadza w swoich wytycznych możliwość zastosowania testów diagnostycznych polegających na bezpośredniej detekcji DNA B. burgdorferi s.l. Jak na razie, rekomendacje te obejmują rzadkie przypadki nietypowych objawów EM, ACA, BL oraz wczesnych faz infekcji, jednakże jeszcze kilka, kilkanaście lat temu metody PCR nie były w ogóle uwzględnione w klinicznej diagnostyce boreliozy. Kolejną przeszkodą w powszechnym stosowaniu metod molekularnych w rozpoznaniu choroby z Lyme jest fakt, iż dostępne na rynku testy diagnostyczne, głównie oparte o reakcję RT-PCR (np. (ViPrimePLUS Lyme disease qPCR Kit (Vivantis Technologies, Malezja), Lyme Disease genesig Advanced Kit (Primerdesign^TM, Wielka Brytania), Lyme Disease Real-time PCR Kit (NZYtech, Portugalia) w więk szości przypadków nie posiadają odpowiednich certyfikatów pozwalających na ich wykorzystanie w rutynowej diagnostyce pacjentów.

Na świecie nadal prowadzone są badania mające na celu opracowanie skutecznego testu do diagnostyki boreliozy opartego o reakcję PCR. Część z nich dotyczy lepszego poznania genomu B. burgdorferi s.l. i ich zadaniem jest wyodrębnienie sekwencji DNA mogących być nowymi celami molekularnymi. Inne natomiast skupione są na poszukiwaniu nowych schematów diagnostycznych. Szczególnie interesująca wydaje się koncepcja łącząca reakcję PCR ze spektrometrią masową (PCR/ESI-MS), która pozwala na szybką i dokładną identyfikację patogenów. Metoda ta wykazała bardzo dużą przydatność w precyzyjnej identyfikacji szerokiej gamy patogenów we krwi, tkankach pacjentów oraz organizmach wektorowych [4, 14, 15, 22, 55]. Dlatego wydaje się, iż może stanowić ważny filar w diagnostyce boreliozy, szczególnie ze względu na swoją czułość i wysoki potencjał różnicujący.

Obecnie, mimo wielu obiecujących doniesień naukowych metody molekularne nie są wystarczająco wystandaryzowane by mogły zastąpić rutynowo stosowaną serodiagnostykę. Jednakże, szybki rozwój biologii molekularnej i intensywne badania mające na celu dokładne poznanie genomu B. burgdorferi s.l. dają nadzieję, iż w przyszłości diagnostyka molekularna będzie powszechnie stosowana w rozpoznaniu boreliozy.