Borelioza jest chorobą odkleszczową wywoływaną przez bakterie zaliczane do kompleksu
Borelioza to wieloukładowa choroba o przebiegu fazowym. Na wczesnym etapie choroby (do 8 tygodni od momentu zakażenia) najczęściej jedynym objawem jest rumień wędrujący (EM,
Bakterie należące do grupy
Genom krętków składa się z liniowego chromosomu o długości około 910 kpz oraz 21 plazmidów (9 kolistych i 12 liniowych) o wielkościach wynoszących w przybliżeniu od 5 do 54 kpz. Ponadto charakteryzuje się on dużą zawartością genów paralogicznych, pseudogenów oraz niekodujących fragmentów DNA. Warto zaznaczyć, iż do tej pory nie poznano funkcji wielu genów, ponieważ nie wykazują one znaczącej homologii z wcześniej poznanymi sekwencjami [7, 9, 17].
Liniowy chromosom ma dość dobrze zakonserwowaną sekwencję wśród dotychczas przebadanych genogatunków
Duża liczba plazmidów, niespotykana u innych bakterii sprawia, że
Ze względu na zróżnicowany przebieg rozpoznanie boreliozy na podstawie objawów klinicznych jest bardzo trudne. Jedynie w przypadku pojawienia się typowego rumienia wędrującego można postawić prawidłową diagnozę. Niestety, nie pojawia się on u wszystkich chorych a jedynie u 40–90% z nich [1, 31, 38, 51]. Często też jest przez nich niezauważany, dlatego nie zawsze istnieje możliwość zdiagnozowania choroby na tej podstawie. Z tychże względów diagnostyka boreliozy opiera się głównie na metodach laboratoryjnych [1, 27, 38].
Dla większości chorób bakteryjnych diagnostyka oparta o laboratoryjną hodowlę patogenów z materiału biologicznego pobranego od pacjentów jest uznawana za złoty standard, cechujący się 100% specyficznością. Niestety, podejście to nie jest wykorzystywane w rozpoznaniu choroby z Lyme ze względu na bardzo duże wymagania wzrostowe krętków oraz długi czas oczekiwania na wynik [11, 27].
Obecnie w większości przypadków boreliozę rozpoznaje się na podstawie dwustopniowego badania serologicznego, którego pierwszym etapem jest czuły test immunoenzymatyczny (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay
Dodatkowo czułość testów serologicznych jest silnie uzależniona od czasu trwania choroby. Ze względu na tzw. okienko serologiczne, czyli przedział czasu od momentu zakażenia do chwili pojawienia się w krążeniu swoistych immunoglobulin, które są wykrywane z wykorzystaniem laboratoryjnych metod diagnostycznych, wyniki badań serologicznych na wczesnym etapie choroby są często fałszywie ujemne. W miarę trwania infekcji odpowiedź immunologiczna stopniowo dojrzewa, w wyniku czego czułość testów serologicznych podczas późniejszych stadiów choroby znacząco wzrasta [1, 27, 31].
Rozwiązaniem problemów, które towarzyszą prawidłowemu, wczesnemu rozpoznaniu boreliozy może być zastosowanie nowoczesnych metod molekularnych polegających na wykrywaniu materiału genetycznego krętka tj. DNA w próbkach klinicznych za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR, polymerase chain reaction) [11, 25, 44].
Najprostszym podejściem mającym na celu amplifikację określonego fragmentu DNA jest klasyczna reakcja PCR z użyciem dwóch specyficznych starterów. Po jej zakończeniu należy określić wielkość otrzymanego produktu za pomocą elektroforezy agarozowej lub poliakrylamidowej. Istotną wadą tego podejścia jest możliwość pojawienia się niespecyficznych produktów PCR o zbliżonej wielkości do oczekiwanej. Z tego też względu niezbędna jest dodatkowa kontrola specyficzności. Zwykle do tego celu wykorzystuje się wyznakowane sondy, które są komplementarne do fragmentu amplifikowanej sekwencji DNA [11, 44].
Inną często wykorzystywaną metodą jest PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR, real-time PCR), który charakteryzuje się wyższą czułością i specyficznością niż standardowa reakcja PCR. Specyficzność reakcji jest kontrolowana poprzez hybrydyzację produktu reakcji z sondą dodaną do mieszaniny reakcyjnej lub poprzez analizę krzywej topnienia. W wyniku przyłączenia się sondy do powstałych amplikonów następuje wyemitowanie sygnału fluorescencyjnego, dzięki któremu możliwe jest monitorowanie przyrostu produktów w czasie rzeczywistym. Natomiast wyznaczenie temperatury topnienia produktu PCR jest możliwe dzięki znajdującemu się w mieszaninie reakcyjnej barwnikowi (np. SYBR Green), który zwiększa swoją fluorescencję po związaniu się z podwójną nicią DNA. Temperaturę topnienia produktu PCR wyznacza się po zakończeniu reakcji RT-PCR poprzez stopniowe ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej. W momencie osiągnięcia temperatury właściwej dla denaturacji fragmentu DNA (przejście do pojedynczej nici DNA) sygnał fluorescencji gwałtownie spada, co jest widoczne na wykresie (tzw. krzywej topnienia) jako wyraźny pik [11, 44].
Kolejna popularna odmiana metody PCR, która znalazła zastosowanie w diagnostyce boreliozy to tzw. wewnętrzny PCR. Jest to dwuetapowa reakcja PCR z wykorzystaniem dwóch par starterów (zewnętrznych oraz wewnętrznych), które charakteryzują się dużymi różnicami w temperaturze topnienia. W pierwszym etapie reakcji otrzymuje się dłuższy produkt PCR z udziałem starterów zewnętrznych. Następnie po obniżeniu temperatury przyłączania starterów w reakcji bierze udział druga para oligonukleotydów, komplementarna wobec sekwencji nukleotydowej znajdującej się w obrę bie pierwotnego produktu PCR. Udowodniono, iż zastosowanie wewnętrznego PCR może nawet 1000-krotnie zwiększyć czułość testu diagnostycznego w porównaniu ze standardową reakcją PCR [11, 26].
Charakterystyka najpopularniejszych celów molekularnych
Cel molekularny | Lokalizacja | Produkt translacji | Źródło |
---|---|---|---|
Plazmid lp54 | Lipoproteina niezbędna do przeżycia w organizmie kleszcza | [34, 41] | |
Plazmid cp26 | Lipoproteina niezbędna do transmisji z kleszcza do ciała ssaka | [14, 15] | |
Chromosom | Jedno z integralnych białek membranowych budujących poryny | [3, 41] | |
Chromosom | Białko budujące wici | [54] | |
Chromosom | Wysoce specyficzny region pomiędzy fragmentami kodującymi 23S rRNA i 5S rRNA | [11] | |
Chromosom | Białko katalizujące rekombinację pojedynczych nici DNA | [11, 44] | |
Chromosom | Cząsteczka 16S rRNA wchodząca w skład małej podjednostki rybosomu | [11, 34] | |
Chromosom | Cząsteczka 23S rRNA wchodząca w skład dużej podjednostki rybosomu | [11] | |
Chromosom | Polimeraza DNA III podjednostka α | [44] | |
Chromosom | Polimeraza RNA, podjednostka β | [14, 15] | |
Chromosom | Histonopodobne białko wiążące DNA | [40] | |
Chromosom | Białko L2 podjednostki 50S rybosomu | [14, 15] | |
Chromosom | Podjednostka B topoizomerazy DNA | [14, 15] | |
Chromosom | Ligaza leucyno-tRNA | [14, 15] |
Jedną z nowszych metod jest reakcja PCR połączona ze spektrometrią masową (MS, mass spectrometry) z elektrorozpylaniem (ESI, electrospray ionization) (PCR/ESI-MS). Podstawą PCR/ESI-MS jest zastosowanie starterów zdolnych do amplifikacji fragmentów genów metabolizmu podstawowego szerokiej grupy organizmów. Po zakończeniu reakcji produkty są analizowane za pomocą spektrometrii masowej z wystarczającą dokładnością, aby można było określić w nich zawartość poszczególnych zasad azotowych (A, G, C i T). Następnie uzyskane wyniki są porównywane z bazą danych znanych organizmów, co pozwala na szybką identyfikację organizmu, z którego pochodziło amplifikowane DNA. Amplifikacja fragmentów siedmiu genów
Kluczowym elementem diagnostyki molekularnej jest wybór odpowiedniego genu docelowego. Aby metoda ta była wysoce czuła i specyficzna cel molekularny musi być stabilny genetycznie oraz wysoce zakonserwowany wśród wszystkich genogatunków
Ogromna różnorodność genetyczna bakterii z grupy
Różni przedstawiciele grupy
Możliwość opracowania szybkiej i taniej metody pozwalającej na rozróżnienie poszczególnych genogatunków
Jednym z fragmentów genomu pozwalającym na identyfikację poszczególnych genogatunków
Bardzo wysoki potencjał różnicujący posiada gen
Popularną, lecz stosunkowo czasochłonną metodą umożliwiającą identyfikację poszczególnych genogatunków jest PCR połączony z analizą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP, restriction fragments length polymorphism). RFLP polega na trawieniu produktu PCR odpowiednim enzymem restrykcyjnym, co prowadzi do powstania fragmentów DNA o różnych długościach, charakterystycznych dla każdego genogatunku. Unikalny wzór prążków wizualizuje się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wykazano, iż analiza PCR-RFLP wykorzystująca fragmenty genów
Metodą mającą bardzo wysoki potencjał dyskryminacyjny jest MLST (multilocus sequence typing). Polega ona na amplifikacji fragmentów kilku genów metabolizmu podstawowego, a następnie sekwencjonowaniu otrzymanych produktów PCR. Porównanie sekwencji ośmiu genów
Rodzaj badanego materiału klinicznego uzależniony jest od objawów choroby oraz czasu ich trwania. W przypadku występowania EM lub ACA pobiera się bioptaty zajętej skóry, natomiast przy podejrzeniu NB jest to płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF, cerebrospinal fluid), gdy zaś występują objawy stawowe do badań pobiera się płyn stawowy. Krew jest wykorzystywana jedynie w przypadku podejrzenia wczesnej boreliozy, natomiast stosowanie moczu jako materiału klinicznego nie jest zalecane ze względu na małą powtarzalność wyników. Każdy z tych materiałów charakteryzuje się odmienną przydatnością w diagnostyce boreliozy (Tab. II), na co wpływ ma obecność inhibitorów w danym rodzaju próbki klinicznej oraz tropizm tkankowy krętków [27, 44, 52].
Czułość metod molekularnych w zależności od badanej tkanki
Materiał kliniczny | Cele molekularne | Zakres czułości [%] | Zakres specyficzności [%] |
---|---|---|---|
Wycinki skóry – EM | 30–89 | 98–100 | |
Wycinki skóry – ACA | 20–100 | 100 | |
Płyn stawowy | 23–100 | 100 | |
Płyn mózgowo-rdzeniowy | 5–100 | 99–100 | |
Krew, surowica, osocze | 0–100 | 95–100 | |
Mocz | 7–92 | 77–100 |
Według wielu fachowców najlepszym materiałem do badań molekularnych w kierunku boreliozy są wycinki skóry z obszaru zajętego przez EM, czułość takich testów osiąga nawet 90%, natomiast swoistość waha się w zakresie 98–100%. Badania mające na celu porównanie skuteczności metod diagnostycznych w przypadku pacjentów z EM wykazały, iż najwyższą czułością charakteryzował się RT-PCR (80%). Na kolejnym miejscu znalazła się dwuetapowa diagnostyka serologiczna (66%), następnie wewnętrzny PCR (64%) oraz metoda biologiczna oparta o hodowlę krętków z próbek klinicznych (51%). Test oparty na RT-PCR wykazał dużo wyższą czułość niż badanie serologiczne, co pokazuje, o ile większą użyteczność mogą mieć metody molekularne w początkowych fazach infekcji [35, 44]. Wysoką czułość uzyskuje się również w przypadku badania bioptatów skóry pobranych ze zmian obecnych w przebiegu ACA, dodatkowo podejście to również charakteryzuje się bardzo wysoką specyficznością [11, 52].
Bardzo wysoką czułość i specyficzność testów diagnostycznych opartych na reakcji PCR otrzymuje się w przypadku badania płynu stawowego – w niektórych pracach naukowych obie te wartości wynoszą nawet 100%. Jednak w przypadku podejrzenia LA materiałem wyjściowym może być również błona maziowa. Takie podejście może prowadzić do znacznego zwiększenia czułości testu (nawet z 25% do 90%) [21, 44]. Dodatkowo udowodniono, iż po antybiotykoterapii DNA krętka dłużej utrzymuje się w tkance maziowej niż w płynie stawowym [11, 27]. Należy jednak podkreślić, iż metodyka opisana w powyższych publikacjach nie jest jeszcze powszechnie stosowana, dlatego te optymistyczne doniesienia o tak wysokiej czułości tego typów testów powinny być jeszcze zweryfikowane przez inne zespoły badawcze. Dodatkowo należy pamiętać, iż LA (podobnie jak ACA) jest objawem późnej boreliozy, więc u pacjentów na tym etapie choroby prawie zawsze w krążeniu występuje wysokie miano przeciwciał klasy IgG [11, 52].
Diagnostyka molekularna neuroboreliozy opiera się na analizie płynu mózgowo-rdzeniowego. Podejście to jednak ze względu na małą liczbę krętków w CSF, wysokie powinowactwo bakterii do otoczki mielinowej oraz możliwość degradacji materiału genetycznego, ma stosunkowo niską czułość (22,5%). Największe prawdopodobieństwo wykrycia DNA krętków w CSF występuje we wczesnej neuroboreliozie [18, 33, 44].
Próbki krwi, pomimo łatwości ich pozyskania, nie stanowią dobrego materiału klinicznego w diagnostyce molekularnej boreliozy. Spowodowane jest to niską liczbą krętków w krążeniu na co ma wpływ silny tropizm tkankowy patogenów (stawy, serce, tkanka nerwowa). Testy PCR z krwi są przydatne jedynie we wczesnej fazie infekcji, podczas rozprzestrzeniania się
Mocz jest jednym z najłatwiej dostępnych materiałów klinicznych, dlatego wielu naukowców badało jego przydatność do diagnostyki molekularnej boreliozy. Wstępne doniesienia literaturowe były bardzo obiecujące. Bergmann i wsp. (2002) opracowali reakcję PCR wykrywającą DNA
Dla uzyskania wiarygodnego wyniku testu opartego o reakcję PCR ważne jest, by próbkę kliniczną pobrać od pacjenta przed rozpoczęciem leczenia. Wykazano bowiem, iż 4-tygodniowa antybiotykoterapia znacząco obniża wykrywalność DNA krętków. Natomiast przyjmowanie przez pacjenta antybiotyków przez kilka dni nie wpływa znacząco na czułość metod molekularnych [23].
Jednym z najczęstszych problemów w diagnostyce molekularnej jest obecność inhibitorów w próbkach biologicznych. Związki hamujące reakcję PCR są powszechnie obecne we krwi (np. hemoglobina), w płynie mózgowo-rdzeniowym i fragmentach skóry (np. melanina). Dodatkowo wiele odczynników laboratoryjnych używanych przy pobieraniu i przechowywaniu próbek również jest silnymi inhibitorami amplifikacji (np. heparyna czy formalina). Najprostszą metodą pozwalającą na ograniczenie niepożądanego wpływu tych związków jest zmniejszenie ich stężenia poprzez rozcieńczenie wyizolowanego DNA. Aby upewnić się, że żadne związki zawarte w próbce nie hamują reakcji PCR, przyczyniając się do otrzymania wyniku fałszywie ujemnego, konieczne jest wykonanie wewnętrznej kontroli dodatniej [12, 48].
Innym czynnikiem wpływającym na wydajność reakcji PCR przy wykrywaniu kwasów nukleinowych krętka w materiale biologicznym może być zbyt duża zawartość ludzkiego DNA w stosunku do materiału genetycznego patogenu. Problem ten można jednak łatwo rozwiązać wykorzystując jeden z wielu komercyjnie dostępnych zestawów do izolacji kwasów nukleinowych pozwalających na selektywne usunięcie ludzkiego DNA, takich jak np.: MolYsis Basic5 kit (Molzym, Bremen, Germany), NEBNext Microbiome DNA Enrich ment kit (New England Biolab’s, USA) [44].
Bardzo często uzyskuje się wyniki fałszywie pozytywne, które prowadzą do wdrożenia nieodpowiedniego leczenia pacjenta. Źródłem kontaminacji może być DNA innych patogenów spokrewnionych z
Diagnostyka molekularna ma znaczną przewagę nad standardowo stosowanymi metodami serologicznymi w początkowych fazach infekcji (zlokalizowanej i rozsianej), gdy organizm nie zdążył jeszcze wytworzyć swoistych przeciwciał. Dodatkowo, pomimo znacznych zalet reakcji PCR, również w przypadku diagnostyki molekularnej możliwe jest otrzymanie wyników fałszywie pozytyw nych bądź fałszywie negatywnych. Spowodowane jest to faktem, iż na skuteczność techniki PCR wpływa wiele czynników, które zostały omówione powyżej (m.in.: rodzaj reakcji PCR, cel molekularny, materiał kliniczny, czas pobrania próbki – przed lub po rozpoczęciu leczenia, metody izolacji i oczyszczania DNA, obecności inhibitorów i/lub zanieczyszczeń) [27, 44]. Prawdopodobnie te właśnie problemy z powtarzalnością wyników przyczyniają się do tego, iż metody diagnostyczne oparte o metodę PCR nie są rekomendowane przez największe agencje zajmujące się ochroną zdrowia [6, 20, 33, 37]. Jednakże, mimo braku standaryzacji, coraz więcej placówek ochrony zdrowia dostrzega zalety metod molekularnych w rozpoznaniu boreliozy, dopuszczając to podejście diag nostyczne w niektórych przypadkach (Tab. III).
Zalecenia te dotyczą m.in. występowania nietypowych postaci rumienia wędrującego, które nie pozwalają na jednoznaczną diagnozę. Możliwe są przypadki pojawienia się krwotocznego EM (szczególnie na kończynach dolnych) przybierającego ciemnofioletowy kolor, inne doniesienia mówią także o wyjątkowo,, bladych” postaciach EM, w których wyraźnie widoczne są jedynie ich obwódki. Dodatkowo w miejscu ugryzienia kleszcza, w odpowiedzi na alergeny zawarte w ślinie pajęczaka, może pojawić się odczyn zapalny przypominający swoją formą EM. W takich przypadkach diagnostyka molekularna może mieć rozstrzygające znaczenie w rozpoznaniu boreliozy [20, 25, 37].
Podobne rekomendacje dotyczą pacjentów z zanikowym zapaleniem skóry. ACA jest postacią późnej boreliozy, dlatego też w większości przypadków rozpoznanie choroby opiera się na testach serologicznych. Jednak, w niektórych okolicznościach (nietypowy wygląd zmian skórnych, niski wzrost miana przeciwciał) zaleca się wykonanie dodatkowych testów diagnostycznych obejmujących badanie histopatologiczne oraz metodę PCR [20, 37].
Rekomendacje towarzystw naukowych dotyczące wykorzystywania reakcji PCR w rozpoznaniu boreliozy
Objaw | Warunek | Źródło |
---|---|---|
EM | Nietypowa postać (ciemnofioletowy kolor, brak centralnego przejaśnienia, średnica mniejsza niż 5 cm) | [20, 37] |
NB | Wczesny etap choroby (< 6 tygodni) | [6, 33, 37] |
BL | Nietypowa postać, niejednoznaczne wyniki badań serologicznych | [20, 37] |
ACA | Nietypowa postać | [20, 37] |
LA | Nieustąpienie objawów mimo antybiotykoterapii | [6, 37] |
EM - rumień wędrujący; NB – neuroborelioza; BL - chłoniak limfocytowy; ACA -zanikowe zapalenie skóry; LA - boreliozowe zapalenie stawów
W przypadku neuroboreliozy zgodnie z wytycznymi Europejskiej Federacji Towarzystw Neurologicznych wykrywanie
Wykorzystanie metod molekularnych jest również dopuszczane w przypadkach, gdy pacjenci z podejrzeniem LA, mimo trwającej antybiotykoterapii, nadal odczuwają dolegliwości stawowe. Świadczyć to może o tym, iż rozwinęło się u nich antybiotykooporne zapalenie stawów (AZS). W tym przypadku, w celu postawienia prawidłowej diagnozy, powinno się przeprowadzić detekcję DNA
Mimo, iż złotym standardem w rozpoznaniu boreliozy jest diagnostyka serologiczna, nie pozostaje ona wolna od wielu ograniczeń. Jednym z głównych problemów jest tzw. okienko serologiczne (trwające ok. 2–3 tygodnie), w czasie którego serodiagnostyka jest niewskazana.
Należy pamiętać, że najlepsze wyniki w leczeniu boreliozy otrzymuje się, gdy odpowiednia antybio tykoterapia zostanie wdrożona najszybciej jak to możliwe. Opóźnienie w diagnozie, związane z okienkiem serologicznym, może prowadzić do szerokiego zakresu problemów zdrowotnych dla pacjenta, takich jak zaburzenia neurologiczne, zapalenie mięśnia sercowego i zapalenie stawów. Z tego względu konieczne jest opracowanie nowych metod diagnostycznych umożliwiających rozpoznanie boreliozy już w początkowych etapach infekcji. Innym problemem są pacjenci cierpiący z powodu dysfunkcji układu immunologicznego, u których produkcja swoistych przeciwciał może być zaburzona. Dodatkowo ze względu na wysokie wymagania wzrostowe
W tych przypadkach rozwiązaniem powyższych problemów wydają się być metody molekularne, charakteryzujące się prostotą wykonania oraz krótkim czasem oczekiwania na wynik. Umożliwiają one wykrycie DNA
O popularności idei wykorzystania reakcji PCR w diagnostyce boreliozy, świadczy duża liczba publikacji naukowych opisujących jej zastosowanie w detekcji DNA
Dotychczasowe doniesienia literaturowe udowadniają, iż diagnostyka molekularna charakteryzuje się wysoką specyficznością (z wyjątkiem prób moczu) oraz stosunkowo dużą czułością. Niestety, pomimo tych niezaprzeczalnych zalet, testy diagnostyczne oparte na reakcji PCR muszą sprostać wielu wyzwaniom. Największym problemem jest brak wystandaryzowanych protokołów jasno opisujących poszczególne etapy testów. Testy molekularne opisane w pracach naukowych różnią się od siebie prawie w każdym aspekcie. Wykorzystują różne typy reakcji PCR (klasyczny PCR, Real-Time PCR, wewnętrzny PCR, PCR/ESI-MS), odmienne cele molekularne (
Prawdopodobnie właśnie z wyżej wymienionych powodów diagnostyka molekularna boreliozy stanowi obecnie jedynie wsparcie dla testów serologicznych. Jednakże, coraz więcej agencji ochrony zdrowia zaczyna dostrzegać jej potencjał i wprowadza w swoich wytycznych możliwość zastosowania testów diagnostycznych polegających na bezpośredniej detekcji DNA
Na świecie nadal prowadzone są badania mające na celu opracowanie skutecznego testu do diagnostyki boreliozy opartego o reakcję PCR. Część z nich dotyczy lepszego poznania genomu
Obecnie, mimo wielu obiecujących doniesień naukowych metody molekularne nie są wystarczająco wystandaryzowane by mogły zastąpić rutynowo stosowaną serodiagnostykę. Jednakże, szybki rozwój biologii molekularnej i intensywne badania mające na celu dokładne poznanie genomu