Potential Possibilities of HPV DNA Detection in Liquid Biopsy for Diagnosis of Patients with Head and Neck Cancer

Płynna biopsja to zabieg diagnostyczny polegający na pobraniu krwi od chorego w celu diagnostyki nowotworu. Próbkę krwi poddaje się analizie pod kątem obecności krążących komórek nowotworowych lub kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA – deoxyribonucleic acid) pochodzącego z nowotworu [1,2,3]. Pozakomórkowy krążący we krwi DNA nazywany jest cfDNA (circulating free DNA) i wykazuje te same zmiany genetyczne, które istnieją w guzach nowotworowych [4,5,6]. Krew może być zatem bogatym źródłem informacji o zmianach genetycznych czy epigenetycznych w nowotworze. Płynna biopsja jest badaniem mało inwazyjnym w porównaniu do innych metod diagnostycznych. Będąc alternatywą do biopsji z guza, przedstawia szczególną wartość nie tylko w przypadkach niedostępności materiału tkankowego, ale również ze względu na możliwość wielokrotnego jej powtarzania np. na różnych etapach leczenia czy po jego zakończeniu [7,8,9]. Płynna biopsja stwarza unikalną możliwość śledzenia obecności ocenianej cechy genetycznej w aspekcie skuteczności terapii czy też wczesnego wykrycia wznowy nowotworu. U części chorych na raka regionu głowy i szyi (RRGiSz) za kancerogenne działanie odpowiadają wirusy HPV (Human Papillomavirus), nazywane wirusami wysokiego ryzyka. HPV aż w 70% jest czynnikiem etiologicznym raka gardła środkowego [10,11,12]. Ocenę obecności DNA wirusa HPV w płynnej biopsji (circulating tumor HPV, ctHPV) można zatem wykorzystać do potwierdzenia etiologii nowotworu HPV-zależnego oraz do określenia stopnia remisji choroby podczas leczenia.

Wirus brodawczaka ludzkiego (HPV) to wirus o ikosaedralnej symetrii, którego materiałem genetycznym jest dwuniciowa cząsteczka DNA. W swoim genomie liczącym ok. 8000 pz zawiera dwa regiony kodujące, składające się z sześciu genów wczesnych (E – early) i dwóch późnych (L – late), które rozdzielone są regionem regulatorowym (UPR – upstream regulatory region) [13, 14]. HPV wykazuje tropizm do różnicujących się komórek nabłonkowych, które są niezbędne do przejścia pełnego cyklu rozwojowego [15, 16]. Wirus ma ponad 100 wariantów genetycznych, które zostały podzielone na typy wysokiego ryzyka, np. HPV16 (nawet do 93,6% pozytywnych guzów), 18 (do 18%), 35 (do 7,6%), 33 (do 4%), 45 (ok. 4%) 39 (ok. 0,6%), 52 (3,2%), 51 (11,4%), 31 (7,1%) i niskiego ryzyka, np. HPV 6 i 11 [13, 17,18,19,20]. Typy o niskim potencjale onkogennym (niskiego ryzyka) mogą powodować wzrost nieprawidłowych komórek, ale tylko typy o wysokim potencjale onkogennym (wysokiego ryzyka) prowadzą do rozwoju nowotworu, ponieważ posiadają gen kodujący białko E7, które umożliwia immortalizację ludzkich komórek nabłonkowych, co oznacza, że komórki ulegają niekontrolowanym, ciągłym podziałom [21,22,23]. Dłuższe narażenie na tego wirusa, występujące podczas chronicznej infekcji oraz współtowarzysząca niesprawność układu odpornościowego mogą doprowadzić już po ok. 10 latach do rozwoju nowotworu [24,25,26]. Kluczową rolę w kancerogenezie odgrywają białka kodowane przez geny wczesne E, natomiast produkty genów późnych L pełnią funkcję strukturalną wirusa [27,28,29,30]. Kodowane przez genom wirusa onkoproteiny E6 i E7 powodują degradację i inaktywację białek supresorowych pRb i p53, które w prawidłowych warunkach są odpowiedzialne za kontrolę cyklu komórkowego, poprzez indukcję naprawy DNA lub indukcję apoptozy [31,32,33]. Przy braku aktywności białka Rb często dochodzi do amplifikacji centrosomów, co powoduje zaburzenie rozchodzenia się chromosomów do komórek potomnych czyli aneuploidię, co z kolei generuje niestabilność genetyczną komórki [34]. Degradacja białka p53 za pośrednictwem ubikwityny, powoduje blokadę apoptozy, przez co komórki ulegają niekontrolowanym podziałom, co przyczynia się do kumulacji mutacji, promocji transformacji nowotworowej oraz powstawania raka [35,36,37,38].

Wirus brodawczaka ludzkiego może znajdować się w komórce w formie episomalnej (pozachromosomowej, niezintegrowanej) lub zintegrowanej z chromosomem gospodarza [39]. Obserwacja obecności formy episomalnej w zmianach przednowotworowych oraz dominacji formy zintegrowanej w zmianach o wysokim stopniu zaawansowania doprowadziła do ogólnego stwierdzenia wpływu integracji na progresję nowotworową [40, 41]. Nie ma ściśle określonego miejsca, w którym zachodzi integracja, choć zauważono, że występuje ona w pobliżu miejsc bardziej dostępnych i wrażliwych na pęknięcia [42,43,44,45]. Badania nad RRGiSz wykazały obecność bardzo wielu miejsc integracji, przy czym najczęściej HPV wbudowuje się do chromosomów 1, 3, 8, 9, 17 i 21, a zjawisku temu mogą dodatkowo towarzyszyć rearanżacje chromosomowe, takie jak translokacja, delecja lub duplikacja [45, 47, 48]. Integracja zachodzi zarówno w regionach międzygenowych, jak również w regionach kodujących geny. Dotychczas zidentyfikowano kilkanaście genów zaburzonych integracją HPV, a które mogą oddziaływać na szlaki związane z onkogenezą. W grupie tych genów są DIAPH2, TP63 i NAP14, BCL2, BRE, EPHA7, FANCC, HDAC2, INO80C, LEPREL1, SYNPO2, TRAF3, TUBD1, ERC2, GARS, SLC7A1, SYN3, ZMAT4, CUX1, CSMD1, EBF3, FOXK2, CDH11, DNAJB6, FOXP2, EPHA3, PTEN [45, 47, 48]. Przy czym, region kodujący gen TP63 wskazano jako najczęstsze miejsce integracji wirusa [45, 47,48,49].

W przypadku nowotworów RGiSz zaobserwowano dominowanie formy episomalnej w zaawansowanych guzach. Badania na materiale biopsyjnym wykazały obecność formy episomalnej w 61% RGiSz [45]. W innych badaniach wykazano obecność formy episomalnej we wszystkich bioptatach (wycinkach) raka migdałka [50]. Z kolei badania na różnych liniach komórkowych (wyprowadzonych z raka podstawy języka, jamy ustnej) pokazują, że w większości z nich obecne są postacie zintegrowane lub mieszanka zintegrowanej i episomalnej formy wirusa [47]. Natomiast najnowsze badania sekwencjonowania całego genomu wykazało integrację DNA HPV w 70% guzów (rak podstawy języka lub rak migdałka) [48]. Wynika z tego, że w nowotworach regionu głowy i szyi forma episomalna występuje również w zaawansowanych guzach. Skutek kliniczny obecności formy episomalnej nie jest dobrze poznany, choć Nulton i wsp. w swoich badaniach wykazali, że pacjenci chorzy na RRGiSz i guzami ze zintegrowaną formy wirusa mieli gorszy współczynnik przeżycia niż pacjenci z formą episomalną [51].

Pozakomórkowy DNA – cfDNA (circulating cell-free DNA), [52, 53] odnosi się do całkowitej ilości DNA we krwi [54]. Okres półtrwania cfDNA we krwi może wynosić od kilkunastu minut do kilku godzin i zależy od konformacji lub długości cząsteczek cfDNA [55,56,57]. Dłużej w krwiobiegu utrzymuje się dwuniciowa niż jednoniciowa forma, a dodatkowo stwierdzono, że mniejsze cząsteczki cfDNA są usuwane szybciej z organizmu niż te większe [56, 57]. Główna frakcja całkowitego cfDNA pochodzi z komórek prawidłowych, a jedynie tylko jego część (od ok. 3% do 63%) pochodzi z komórek nowotworowych guza [58,59,60].

Funkcjonujące w onkologii pojęcie krążącego nowotworowego DNA, w skrócie ctDNA (circulating tumor DNA) odnosi się właśnie do frakcji nowotworowej. Obecne w ctDNA zmiany genetyczne lub epigenetyczne są identyczne z tymi znajdywanymi w komórce nowotworowej guza [7, 61,62,63]. Mechanizm uwalniania kwasów nukleinowych do krwi nie jest dokładnie znany. Jeden z postulatów utrzymuje, że ctDNA pochodzą z rozpadu, krążących we krwi komórek nowotworowych. Innym mechanizmem jest samorzutne wydzielanie DNA do krwi w wyniku oddziaływania proliferujących komórek nowotworowych z limfocytami. Do możliwych procesów, w wyniku których dochodzi do uwalniania DNA guza do krwi zalicza się również zjawiska martwicy i apoptozy [64, 65].

W przypadku nowotworów o etiologii wirusowej, część całkowitej puli cfDNA będzie miała sekwencje wirusowe. Wykrywanie cząsteczek genomu wirusa w całkowitej puli cfDNA pacjentów z rakiem zależnym od HPV stał się podstawą koncepcji, że DNA HPV pochodzi z komórki nowotworowej, a wobec faktu wykrywania go w krwiobiegu nazywany jest krążącym DNA HPV (w skrócie ctHPV) [66, 67, 68]. ctHPV odnosi się do frakcji pochodzącej z komórek guza zawierających HPV i w tym znaczeniu jest odpowiednikiem funkcjonującego ogólnego termin ctDNA w onkologii. Czułość tego biomarkera we krwi chorych na RGŚ do wykrywania nowotworu wynosi ok 80%, natomiast specyficzność mieści się w zakresie od 95% do 98% [69, 70]. Natomiast zastosowanie go do wykrywania wznowy po zakończonym leczeniu odznacza się czułością 73% i swoistością 100% [70]. Ze względu na niewielką inwazyjność pobrania płynnej biopsji czyli pobrania krwi w celu pozyskania cfDNA, jest on pożądanym materiałem dla diagnostyki molekularnej ctHPV i umożliwia monitorowanie jego poziomu we krwi. Rutynowa diagnostyka ctHPV u pacjentów z RGŚ zależnym od HPV zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia nowotworu, a włączenie diagnostyki ctHPV opartej na osoczu do obecnych protokołów i standardów może zwiększyć zdolność klinicysty do oceny stanu pacjena [71, 72].

Powszechnie stosowaną metodą badania ctHPV jest badanie PCR. Do badania wystarcza zwykle pobranie 5–10 ml krwi z żyły. Separacja osocza wymaga powszechnie dostępnego sprzętu jak wirówki, ekstrakcję DNA z osocza można przeprowadzić komercyjnie dostępnymi zestawami do izolacji manualnej lub automatycznej, a badanie PCR przeprowadza się przy użyciu termocyklera z detektorem i pomiarem w czasie rzeczywistym [73, 74]. Początkowe doniesienia wskazywały na niską czułość klasycznej metody PCR [75], która w następnych badaniach została zastąpiona qPCR (quantitative polymerase chain reaction), z wykorzystaniem sond fluorescencyjnych do sekwencji E6 lub E7, wykazując znacznie wyższą czułość wykrywania ctHPV w osoczu, sięgającą ok. 65% [76, 77]. Technika qPCR to jedna z najpopularniejszych metod do ilościowego określania DNA, która w laboratorium diagnostycznym jest przeprowadzana przez diagnostę laboratoryjnego. Metoda qPCR jest czułym, nieskomplikowanym badaniem do oznaczania małej ilości kwasów nukleinowych we krwi, a wynik analizy można uzyskać już po kilku godzinach. W jednym z pierwszych doniesień o wykorzystaniu tej techniki w oznaczaniu DNA w płynach ustrojowych, grupa badaczy Cao i wsp. pokazali, że zwiększenie czułości qPCR można osiągnąć poprzez zwiększenie objętości osocza użytego do izolacji cfDNA [76]. W badaniach Cao i wsp. należy jednak zwrócić uwagę na dużą rozpiętość w liczbie kopii u poszczególnych pacjentów w zakresie od ok. 100 kopii/ml do ok. 6000 kopii/ml. Na podstawie tego, można wnioskować, że liczba kopii DNA HPV jest osobniczo charakterystyczna, a wyjściowa ilość kopii w guzie koreluje z ilością we krwi, co pokazuje badanie Mazurek i wsp. [77]. W pracy wykazano także, że mała liczba kopii w guzie istotnie wpływa na wykrywalność wirusa we krwi [77]. Spośród wszystkich pacjentów z wykrytym DNA wirusa HPV16 w guzie za pomocą techniki qPCR, u 27% mediana kopii wynosiła 63 kopii/genom i w tej grupie ctHPV nie był wykrywany we krwi, natomiast u 72% pacjentów z większą ilością DNA wirusa HPV w guzie (mediana 463 kopii/genom) ctHPV był wykrywany we krwi [77]. Należy tu wspomnieć, że spośród wszystkich RRGiSz najmniejsze ilości DNA HPV w guzie zaobserwowano w rakach krtani, nosogardła, zatok czy jamy ustnej, a w rakach gardła dolnego wirusa nie stwierdza się, co przekłada się na fakt niewykrywalności ctHPV we krwi tej grupy chorych [badania własne].

W badaniach Ahn i wsp., których celem było zwiększenie czułości i specyficzności, do oznaczania miana wirusa wykorzystano nie tylko osocze ale również ślinę jako źródło cfDNA [78]. Badacze zastosowali kombinację próbek osocza i śliny do zwiększenia czułości statusu HPV16 przed leczeniem jako narzędzia do badania przesiewowego w kierunku raka gardła środkowego (RGŚ) zależnego od HPV [78]. Czułość łączonego badania śliny i osocza pobranych przed leczeniem wynosiła 76%, podczas gdy czułość samej śliny wynosiła 52,8%, a samego osocza 67,3%. Dołączenie zatem badania z wykorzystaniem śliny do badania osocza zwiększyło czułość wykrywania pacjentów z pozytywnym wynikiem HPV16 o 9%, przy czym specyficzność wynosiła 100% w łączonym jak i oddzielnych badaniach śliny lub osocza [78]. Grupa badaczy Ahn i wsp. przeprowadziła również badania korelacji wyniku testu HPV ze stanem klinicznym po leczeniu, ale czułość metody opartej na ślinie okazała się znacznie niższa (18%) w porównaniu do trzykrotnie wyższej czułości opartej na badaniu osocza (55%) [78].

Inną metodą wykorzystaną do wykrywania HPV u chorych na RGŚ może być ddPCR (digital droplet PCR), który umożliwia wykrywanie i ocenę ilościową niskich poziomów ctHPV [79]. W badaniach Chera i wsp, wykazano, że czułość techniki ddPCR do wykrywania ctHPV w osoczu jest wysoka i wynosi 89%, choć swoistość w tej technice jest już nieco niższa i wynosi 97% (w porównaniu do ww. badań z wykorzystaniem qPCR) [80]. W innym badaniu wykazano silną korelację ilości kopii ctHPV w osoczu za pomocą ddPCR a całkowitym obciążeniem guza (TTB – total tumor burden) [81]. TTB to suma największej średnicy wszystkich wykrywalnych zmian w obrazowaniu obliczana przed leczeniem. Badania pokazały, że mediana miana ctHPV była najniższa u pacjentów z chorobą lokoregionalną (5 kopii/ml), wyższa u chorych z przerzutami do płuc (163 kopii/ml), a najwyższy poziom był u pacjentów z rozsianą chorobą (452 kopii/ml) [81].

W większości badań źródłem pozakomórkowego nowotworowego DNA jest osocze, a nie surowica. Biorąc pod uwagę fakt rozpadu białych krwinek podczas procesu krzepnięcia wydaje się logiczne, że surowica może zawierać więcej DNA pochodzącego z komórek prawidłowych pojawiającego się podczas krzepnięcia. W naszych badaniach oszacowaliśmy, że w surowicy jest znacznie więcej całkowitego cfDNA i powstający produkt endogennej kontroli (np. genu globiny, który jest wewnętrzną kontrolą obecności DNA) może zaburzać wykrywanie ctHPV [dane niepublikowane]. Dlatego należy z ostrożnością podejść do badań opierających się na surowicy jako źródła cfDNA. Przykładem takich niepewnych wyników mogą być badania Dahlstroma i wsp., w których wykorzystana jest też surowica, a autorzy poddają wątpliwości wykorzystania ctHPV jako biomarkera wznowy ponieważ nie zostaje on wykryty u niektórych pacjentów [82].

Ostatecznie do badania wykorzystywane są różne ilości materiału wyjściowego i najczęściej jest to osocze. Do izolacji DNA wykorzystuje się różne metody, manualne z wykorzystaniem zestawów lub automatyczne. Wykrywanie ctHPV oparte jest na technologii PCR i dominują dwie metody detekcji qPCR oraz ddPCR. W tabeli I przedstawiono przegląd metodologii badania ctHPV we krwi u chorych na raka gardła środkowego.

Leczenie zawansowanych nowotworów regionu głowy i szyi radioterapią samodzielną (RT) bądź w skojarzeniu z chemioterapią (CHRT) jest leczeniem z wyboru [83, 84]. Jest to leczenie pozwalające oszczędzić organy do zachowania podstawowych funkcji życiowych jak np. gardło [83]. Ponieważ około 70% RGŚ ma etiologię wirusową, to w tej grupie chorych HPV może być markerem wykorzystanym do monitorowania postępów CHRT. W jednym z pierwszych doniesień literaturowych, dotyczących przydatności biomarkera ctHPV w monitorowaniu, wykazano stopniowy spadek kopii ctHPV we krwi podczas CHRT, aż do całkowitego zaniku [76]. U kilku chorych, u których wykryto przerzuty do płuc lub węzłów chłonnych, ctHPV był wykrywany również we krwi. U jednego chorego ctHPV wykryto 4 miesiące przed wykryciem przerzutów do płuc, a obecność guza w płucu (przerzut) zostało potwierdzone za pomocą tomografii komputerowej klatki piersiowej [76].

W badaniu Chera i wsp., za pomocą techniki ddPCR pokazano profil spadku (klirens) liczby kopii ctHPV podczas CHRT pacjentów chorych na RGŚ [80]. W pracy pokazano, że szybkość klirensu ctHPV16 (circulating tumor HPV type 16) koreluje z efektem CHRT. Pacjenci, u których po 4 tygodniu leczenia nie stwierdzono ctHPV16 we krwi mieli doskonały czas przeżycia wolny od wznowy węzłowej i miejscowej (100% po 18 miesiącach). Wśród pacjentów z niekorzystnym profilem klirensu ctHPV16, który ciągle utrzymywał się we krwi po 4 tygodniu, zaobserwowano wysokie prawdopodobieństwo wystąpienia choroby resztkowej lub nawrót regionalnej choroby węzłowej (35% po 18 miesiącach) [80]. W badaniach Hanna i wsp., w których wykorzystywano ślinę oraz krew pacjentów jako źródła cfDNA zaobserwowano korelację ctHPV ze wznową lokoregionalną (miejscową), natomiast u pacjentów z przerzutami odległymi taka korelacja nie występowała [85]. Z kolei, Ahn i wsp. stwierdzili, że badanie samej śliny jest stosunkowo niespecyficznym markerem prognostycznym i dopiero w połączeniu z osoczem pozwala na wyciągnięcie prawidłowych wniosków [78].

Największym atutem płynnej biopsji jest możliwość monitorowania choroby nowotworowej podczas leczenia oraz zaraz po jego zakończeniu umożliwiając wczesne wykrycie choroby resztkowej lub nawrotu choroby. Tradycyjnie zaleca się chirurgiczne leczenie ratunkowe po badaniu klinicznym i obrazowaniu wykonanym 10–12 tygodni po leczeniu, ale taka wczesna interpretacja może być trudna ze względu na zmiany związane z leczeniem, które ograniczają radiologiczne obrazowanie choroby resztkowej [86]. W naszych najnowszych badaniach śledzenie poziomu ctHPV16 po CHRT pomogło w rozpoznaniu choroby resztkowej, która nie była widoczna w obrazowaniu radiograficznym. Wynik badania ctHPV16 okazał się bardzo pomocny w podjęciu decyzji dotyczącej przeprowadzenia operacji ratującej [87]. U innego chorego wykazaliśmy, że wykryty ctHPV16 kilka tygodni po leczeniu był sygnałem do przeprowadzenia dokładnego badania pozytonowej tomografii emisyjnej, umożliwiając wykrycie przerzutu [87].

Podczas chemioterapii badanie obecności HPV we krwi może być wykonane przed przystąpieniem do wykonania każdego wlewu (podanie dożylne leku). Badanie molekularne poziomu ctHPV w osoczu nie stwarza żadnego dodatkowego ryzyka dla pacjenta, a przeprowadzenie tego badania podczas leczenia stwarza możliwość szybkiej identyfikacji oceny stopnia wyleczenia miejscowego i węzłowgo u chorych na RGŚ zależnego od HPV. Wykorzystując potencjalne narzędzie jakim jest płynna biopsja, badanie ctHPV może mieć wpływ na ocenę radiologiczną a następnie na dobór metody leczenia.

Badanie DNA HPV we krwi, skrótowo ctHPV, jako specyficznego biomarkera tylko dla chorego z rakiem zależnym od HPV, jest nowatorską metodą diagnostyczną, która:

jest przykładem zastosowania płynnej biopsji do diagnostyki RGŚ,