Skóra jest największym, wysoce zorganizowanym organem ciała; pełni funkcje ochronne, sensoryczne i immunologiczne oraz uczestniczy w komunikacji endokrynnej i neuronalnej [1, 2]. Jest zbudowana z naskórka, tworzącego bezpośrednią barierę oddzielającą organizm od środowiska leżącej poniżej skóry właściwej. Obie warstwy: naskórek i skóra właściwa są oddzielone od siebie błoną podstawną (ryc. 1).
A - Schemat budowy skóry; B - obraz histologiczny niezranionej, barwionej hematoksyliną i eozyną skóry myszy szczepu C57BL/6; mw- mieszki włosowe
Naskórek charakteryzuje się budową wielowarstwową; warstwa przylegająca do błony podstawnej to warstwa podstawna (bazalna), po niej następują warstwy: kolczysta, ziarnista i najbardziej zewnętrzna warstwa rogowa. Obecne w warstwie podstawnej (rozrodczej) komórki macierzyste i progenitorowe zapewniają nieustanną zdolność naskórka do odnowy, a nowo powstające keratynocyty opuszczają warstwę podstawną i rozpoczynają migrację w kierunku zewnętrznej powierzchni skóry, ulegając licznym przemianom biochemicznym i morfologicznym. W czasie migracji keratynocyty, regulowane aktywnością czynników transkrypcyjnych, tracą zdolność do proliferacji i przechodzą następujące po sobie stadia różnicowania, tworząc kolejne warstwy naskórka (ryc. 1). Komórki każdej z warstw charakteryzują się ekspresją swoistych markerów, np. keratyny 14 w warstwie podstawnej, keratyny 10 i inwolukryny w warstwie kolczystej (ryc. 1) [3]. Oprócz keratynocytów, głównego budulca naskórka, obecne są w nim również: melanocyty i komórki Langerhansa [4].
W skórze właściwej wyróżnia się zasadniczo trzy warstwy: przyległą do naskórka warstwę brodawkowatą (papillary dermis), warstwę siateczkowatą (reticular dermis) oraz warstwę śródskórnych komórek tłuszczowych (dermal white adipose tissue; dWAT) (ryc. 1). Warstwy: brodawkowata oraz siateczkowata są zbudowane z dwóch typów fibroblastów skóry charakteryzujących się odmienną ekspresję genów [17]. Ta „odmienność” przekłada się na różnice w zdolności do wytwarzania składników macierzy zewnątrzkomórkowej, podziałów komórkowych czy też kurczliwości [6, 7]. Śródskórne komórki tłuszczowe budują najgłębiej położoną warstwę skóry, która od niedawna jest przedmiotem intensywnych badań [8, 9, 10, 11]. Wykazano, że komórki dWAT biorą udział w procesach utrzymania homeostazy skóry, termoregulacji, cyklu wzrostu włosów i gojenia urazów.
W urazach przebiegających z uszkodzeniem skóry najważniejsze jest przywrócenie jej ciągłości jako bariery ochronnej. Proces gojenia uszkodzeń skóry (ran) składa się z nakładających się na siebie etapów: odpowiedzi zapalnej (I), migracji i proliferacji komórkowej (II) oraz przebudowy (III) [4, 12].
Etap I: Do miejsca urazu napływają liczne komórki układu immunologicznego m.in.: neutrofile, makrofagi, limfocyty. Rezultatem ich aktywności jest usunięcie bakterii i szczątków komórkowych w miejscu zranienia oraz uwalnianie licznych mediatorów prozapalnych i wytwarzanie cytokin – czynników, które wpływają na migrację, proliferację i aktywację wielu typów komórek.
Etap II: Odbudowa uszkodzonego naskórka rozpoczyna się już w pierwszej dobie po zranieniu. Keratynocyty warstwy podstawnej naskórka obecne na brzegu rany wydłużają się i zaczynają migrować, stopniowo pokrywając uszkodzony obszar skóry [13, 14]. Migracja komórek wymaga wydzielania licznych enzymów m.in. metaloproteinaz macierzy (MMPs).
Etap III: Stopniowo zaczyna dominować etap przebudowy blizny. Fibroblasty skóry migrujące w miejsce rany i wytwarzające składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (w tym kolagen) przekształcają się w bardzo aktywne miofibroblasty, zdolne do obkurczania rany [15]. Początkowo rusztowanie rany stanowi kolagen typu III, następnie jest on częściowo zastępowany przez kolagen typu I. Organizacja włókien kolagenu w bliźnie pozostaje jednak inna niż w pierwotnej tkance. Metaloproteinazy macierzy, aktywne w procesie odbudowy naskórka, są również zaangażowane na tym etapie gojenia, odpowiadając m.in. za organizację włókien kolagenowych. Ostatecznie, gdy miofibroblasty stają się zbędne, są eliminowane w procesie apoptozy. Końcowym efektem naprawczego procesu gojenia urazów skóry jest blizna, której rozmiar i struktura zależy od wielu czynników, m.in. obszaru i miejsca urazu, czynników powodujących uraz, głębokości rany, ale również od osobniczego stanu fizjologicznego, a także etapu rozwoju ontogenicznego (płód, wiek dorosły, wiek starczy) [16, 17, 18]. Innym, niezwykle istotnym czynnikiem w przebiegu procesu gojenia jest hipoksja, czyli zmniejszona dostępność tlenu. Pojawia się w miejscu urazu wskutek wzmożonej aktywności komórek (m.in. stanu zapalnego) i uszkodzenia naczyń krwionośnych, zjawisk prowadzących do ograniczenia podaży tlenu z krwi [19].
Podkreślić należy, że punktem wyjścia kaskady zdarzeń prowadzącej do „zamknięcia” rany jest skoordynowana aktywność regulatorów ekspresji genów – czynników transkrypcyjnych – wśród których są m.in.: FOXN1, FOXO1 i 3, HOXA3, HOXD3, SMAD2, AP-1, OVOL 1 i OVOL 2 [12, 20, 21, 22]. Współdziałają ze sobą, aby kontrolować proliferację, różnicowanie, migrację i apoptozę komórek – procesy, które składają się na przywrócenie homeostazy w przypadku urazu oraz utrzymanie jej w warunkach fizjologicznych [12, 23, 24, 25, 26].
Odmiennym w porównaniu do bliznowego (naprawczego) gojenia, jest proces regeneracji. Częsta u bezkręgowców i niższych kręgowców zdolność regeneracji, u ssaków jest ewenementem. W 1979 r. Rowlatt i wsp. wykazali, że ludzkie płody są zdolne do regeneracji urazów skóry [27], jednak zdolność tą tracą w trzecim trymestrze rozwoju płodowego [28]. Podobnie płody myszy i szczurów są zdolne do regeneracji urazów skóry przez pierwsze dwa trymestry, czyli odpowiednio do 16. i 18. dnia rozwoju płodowego [29]. Mimo licznych badań, które wskazują na potencjalne czynniki sprawcze tej unikatowej zdolności płodów, mechanizm regeneracji nie został w pełni poznany. Jak dotąd wykazano, że to nie środowisko, w którym rozwija się płód, lecz cechy własne (właściwości) regenerującej się skóry, determinują rezultat procesu gojenia [30]. Wspomniane właściwości to różnice na poziomie komórkowym i molekularnym, na które składają się m.in. obniżony poziom odpowiedzi immunologicznej, odmienna charakterystyka fibroblastów (np. różnice w zdolności do migracji czy wytwarzania kolagenu), zmniejszony poziom TGF-β1 i zwiększona ilość kwasu hialuronowego [31, 32].
U dorosłych przedstawicieli ssaków zjawisko regeneracyjnego (bezbliznowego) gojenia urazów skóry zostało opisane jedynie u dwóch reprezentantów tej gromady: myszy pozbawionych aktywności czynnika transkrypcyjnego FOXN1 (myszy Foxn1-/-) [33, 34, 35] oraz kolcomyszy (
Czynnik transkrypcyjny FOXN1 ulega ekspresji wyłącznie w nabłonkach: grasicy oraz skóry [38, 39]. Brak jego aktywności u myszy skutkuje brakiem grasicy (athymic mouse) oraz związanym z tym niedoborem odporności (brak limfocytów T), a także brakiem włosów wyrastających ponad powierzchnię skóry (fenotypowo myszy nagie; nude) [40]. Myszy nagie powstałe w wyniku spontanicznej mutacji w genie kodującym czynnik transkrypcyjny FOXN1 (mutacja ta prowadzi do przedwczesnej terminacji translacji i powstania nieaktywnego białka) są znane już od 1966 r. i powszechnie stosowane w badaniach biomedycznych m.in. nad nowotworami [41]. Brak grasicy oraz limfocytów T, czyli brak odpowiedzi immunologicznej, spowodował, że myszy Foxn1-/- stały się eksperymentalnym modelem dla przeszczepianych ludzkich komórek nowotworowych [42].
Natomiast zdolność myszy Foxn1-/- do regeneracyjnego gojenia urazów jest przedmiotem badań od niedawna. Dotychczas wykazano, że ani brak grasicy, ani też niedobór odporności nie są wystarczającymi warunkami sprzyjającymi regeneracji [35]. Wskazano również, że czynnik transkrypcyjny FOXN1 jest włączony w proces gojenia bliznowego (naprawczego), gdyż bierze udział w reepitelializacji (odbudowie naskórka) i EMT – procesach odpowiedzialnych za wytworzenie pourazowej blizny, a także w regulacji dWAT [10, 20, 43]. Zatem przyczyną unikatowej zdolności myszy Foxn1-/- do gojenia bezbliznowego może być brak aktywnego FOXN1 [35, 44].
Lokalizacja ekspresji FOXN1 w skórze jest ograniczona do naskórka i mieszków włosowych (ryc 2). W naskórku międzymieszkowym (interfollicular epidermis) FOXN1 występuje wyłącznie w populacji pierwszej warstwy komórek kolczystych przyległych bezpośrednio do warstwy podstawnej (warstwa przypodstawna; suprabasal) oraz pojedynczych komórek warstwy podstawnej (bazalnej; basal) (ryc. 1) [20, 43, 45].
Umiejscowienie w warstwie przypodstawnej, czyli w miejscu wczesnych etapów terminalnego różnicowania keratynocytów, koreluje z wykazaną rolą czynnika transkrypcyjnego FOXN1 jako czynnika stymulującego przejście keratynocytów ze stadium proliferacji do stadium postmitotycznego różnicowania [45, 46, 47, 48]. Keratynocyty, wędrując z najgłębiej położonych warstw naskórka: podstawnej i przypodstawnej, przestają wykazywać ekspresję FOXN1 [46, 47, 48]. Dowiedziono, że dodatek Ca2+ (induktor różnicowania komórek
Podobnie jak inni członkowie rodziny czynników transkrypcyjnych z motywem forkhead/helix winged, FOXN1 zawiera wysoce konserwatywną domenę wiążącą DNA, której sekwencja aminokwasowa wykazuje co najmniej 80% homologii wśród odległych przedstawicieli
Lee i wsp. (1999 r.) wykazali, że ekspresja FOXN1 w skórze rozpoczyna się u myszy od okolic nosa i pyszczka w 14. dniu rozwoju płodowego i rozszerza się do całej skóry w 16.– 17. dniu rozwoju płodowego [45]. Zatem utrata zdolności do regeneracji urazów skóry u płodów myszy zbiega się z czasem, w którym uaktywnia się ekspresja czynnika transkrypcyjnego FOXN1 [29, 45]. Co niezwykle istotne, brak aktywności FOXN1 jest wspólną właściwością płodów (przez dwa pierwsze trymestry) i zdolnych do regeneracji urazów skóry myszy nagich (Foxn1-/-). Nasuwają się więc pytania: o znaczenie braku aktywności FOXN1, podobieństwa w ekspresji genów komórek budujących skórę myszy zdolnych do regeneracji i ich powiązanie z FOXN1. W odpowiedzi na postawione pytania przeprowadzono porównanie profili transkryptomicznych metodą sekwencjonowania nowej generacji SOLiD [60]. W doświadczeniach wykorzystano dwa modele regeneracyjnego gojenia urazów skórnych, które łączy brak ekspresji FOXN1: płody myszy w 14. dniu rozwoju (E14 – etap rozwoju charakteryzujący się bezbliznowym gojeniem urazów skóry i brakiem ekspresji FOXN1) oraz dorosłe myszy nagie (Foxn1-/-). Modelem przeciwstawnym, czyli modelem gojenia urazów skóry w sposób bliznowy (reperacyjny), były mysie płody w 18. dniu rozwoju (E18 – etap rozwoju charakteryzujący się bliznowym gojeniem urazów skóry i ekspresją FOXN1) oraz dorosłe myszy (Foxn1+/+). Badania przeprowadzono na myszach o wspólnym podłożu genetycznym (szczep C57BL/6) [60]. Celem takiego postępowania było wykluczenie potencjalnych różnic w ekspresji genów, a w związku z tym różnic w przebiegu naprawczego/bliznowego procesu gojenia wynikających jedynie ze zróżnicowania między szczepami. Analiza wyników wykazała, że dwa unikatowe modele regeneracyjnego gojenia urazów skóry: myszy Foxn1-/- i płody myszy (E14) charakteryzują się podobnymi profilami transkryptomicznymi. Myszy Foxn1-/- i mysie płody E14 łączy zmieniony profil ekspresji genów skóry związanych z przebudową tkanek, budową cytoszkieletu, gojeniem urazów, odpowiedzią immunologiczną i różnicowaniem [60]. Te charakterystyczne zmiany w profilu ekspresji określonych grup (klastrów) genów tworzą „sygnaturę regeneracji”, która może być pośrednim lub bezpośrednim następstwem braku aktywnego FOXN1. Ważne jest to, że wyłonione w analizie porównania profili transkryptomicznych grupy genów o zbliżonych funkcjach, podobnie jak kierunek regulacji genów w tych grupach (stymulacja lub supresja), są wspólne i zgodne nie tylko dla myszy Foxn1-/- i E14, ale również innych modeli zwierząt zdolnych do regeneracji, np. niższych kręgowców [61] czy myszy MRL [62].
W analizie transkryptomów skóry wśród genów o obniżonym poziomie ekspresji jednocześnie u myszy nagich i E14 znalazły się geny:
Pomimo że FOXN1 ulega ekspresji wyłącznie w keratynocytach (komórkach budujących naskórek) w sposób pośredni wpływa także na własności fibroblastów skóry (FS) – komórek skóry właściwej [34, 64, 65]. Wyniki te potwierdziła analiza fenotypowa FS izolowanych z myszy Foxn1-/-, która wykazała wyższy niż w przypadku FS izolowanych ze skóry myszy kontrolnych procentowy udział populacji komórek o charakterze komórek macierzystych (progenitorowych), wykazujących ekspresję markerów OCT4, CD73 oraz CD117 [65]. Ponadto FS izolowane ze skóry myszy pozbawionych Foxn1-/- charakteryzowały się większą plastycznością (łatwością w różnicowaniu się do komórek tłuszczowych), jak również wzmożoną wrażliwością na stymulację TGF-β3 [64]. Kompleksowo wyniki te wykazały, że FOXN1 to niezwykle istotny czynnik transkrypcyjny, którego aktywność lub jej brak determinuje dojrzewanie skóry, jej homeostazę oraz przebieg procesu gojenia urazów skórnych: reperacyjny
Niewiele wiadomo o genach regulowanych przez FOXN1, a jeszcze skromniejsza jest wiedza dotycząca regulacji samego czynnika FOXN1. Przeprowadzone serie doświadczeń z wykorzystaniem hodowli keratynocytów oraz ich transdukcji adenowirusem wyposażonym w cDNA
Główne grupy białek regulowanych poziomem FOXN1 w keratynocytach skóry myszy C57BL/6 (B6) transdukowanych wektorem adenowirusowym obarczonym transgenem Foxn1 (nadekspresja FOXN1) oraz wektorem kontrolnym/pustym (ekspresja endogennego Foxn1). Zestawienie opracowane na podstawie analizy proteomicznej wykonanej metodą 2D-DIGE [53]
Białka regulowane poziomem FOXN1 | ||||
---|---|---|---|---|
Antyapoptotyczne | Proapoptotyczne | Związane z odpowiedzią na hipoksję | Charakterystyczne dla warunków normoksji | |
Komórki z nadekspresją FOXN1 | ||||
P4HB |
||||
PDPK1 |
||||
Jednym z istotniejszych wyników porównania proteomów keratynocytów transdukowanych Ad-Foxn1 lub Ad-GFP było wykazanie różnic w obecności oraz poziomie białek związanych z odpowiedzią komórek na hipoksję [53] (tabela 1). Wśród nich można wymienić TXN (silnie stymuluje ścieżki sygnałowe zależne od HIF1α) oraz HSP70, których obecność pozytywnie koreluje ze wzrostem poziomu ekspresji FOXN1. Keratynocyty o zwiększonej ekspresji FOXN1 charakteryzuje podwyższony poziom TXN i HSP70, natomiast w komórkach tych wykazano również zwiększone poziomy białek typowych dla warunków normoksji, takich jak: CTSD, ACO2, P4HB, ECHS1. Wskazuje to, podobnie jak w przypadku zjawiska apoptozy, na dwukierunkową rolę FOXN1 w regulacji białek kluczowych dla przetrwania komórek w zmiennych warunkach dostępności tlenu. Uzyskane wyniki wnoszą nową, istotną wiedzę o roli FOXN1 jako stymulatora szlaków komórkowych, wskazują na jego potencjalne geny docelowe, a także pośrednio sugerują możliwość regulacji ekspresji czynnika FOXN1 dostępnością tlenu. W systemie
Udział FOXN1 w procesie bliznowego gojenia urazów skóry wykazano na modelu myszy transgenicznych, u których jeden allel genu
Obraz histologiczny pourazowej skóry (dzień 6 po zranieniu). Immunofluorescencyjna detekcja E-kadheryny w pourazowej skórze myszy transgenicznych Foxn1: eGFP. br- brzeg rany, nk- naskórek, sw-skóra właściwa, strzałki wskazują mieszki włosowe, linia przerywana oddziela naskórek od skóry właściwej
Wykazany w badaniach
Istotnym i niedawno zaobserwowanym zjawiskiem jest potencjalny udział czynnika FOXN1 w kształtowaniu podatności na indukowaną dietą otyłość [10, 66]. Wykazano, że myszy Foxn1-/- w warunkach neutralnej temperatury otoczenia karmione dietą wysokotłuszczową nie przybierają na wadze tak jak myszy kontrolne (Foxn1+/+) [66]. Podobnie myszy o obniżonej ekspresji genu FOXN1 (Foxn1+/-) są mniej podatne na otyłość [10]. Analiza niezranionych oraz pourazowych tkanek skórnych myszy Foxn1+/- wykazała zmienione w porównaniu do tkanek myszy kontrolnych (Foxn1+/+) profile ekspresji regulatorów zaangażowanych w proces adipogenezy:
Czynnik transkrypcyjny FOXN1 reguluje rozwój i dojrzewanie skóry, odpowiada za ciągłą odnowę naskórka, a także zaangażowany jest w proces bliznowego gojenia urazów skóry. Brak aktywności FOXN1 w okresie życia płodowego powoduje zachowanie cech embrionalnych skóry w trakcie życia dorosłego (zjawisko neotenii).
Podobieństwo transkryptomów skóry myszy regenerujących urazy skórne (płodów myszy i dorosłych myszy nagich) oraz porównanie ich do profili transkryptomicznych skóry myszy gojących urazy skórne w procesie bliznowym/ naprawczym, wskazuje na FOXN1 jako główny element szlaku sygnałowego regulującego przejście między gojeniem regeneracyjnym (bezbliznowym) a reperacyjnym (bliznowym). Uwzględniając to, że lokalizacja i modulacja ekspresji czynnika FOXN1 w skórze myszy jest analogiczna z ekspresją w skórze człowieka oraz że fenotyp nieaktywnego czynnika FOXN1 występuje również u ludzi, rozpoznanie ścieżek sygnałowych – w tym genów docelowych czynnika FOXN1 – może pozwolić na ukierunkowanie procesu gojenia urazów skóry na bezbliznową regenerację.