Coronaviruses – How Protein Interactions Changed Our Perception Of The World

Zgodnie z danymi Międzynarodowego Komitetu Taksonomii Wirusów koronawirusy należą do podrodziny Orthocoronavirinae w rodzinie Coronaviridae w rzędzie Nidovirales. Porównanie sekwencji genomu przeprowadzone w podrodzinie Orthocoronavirinae pozwoliło na wyodrębnienie w niej czterech rodzajów: Alpha-, Beta-, Gamma- i Deltacoronavirus. Wszystkie trzy koronawirusy atakujące dolne drogi oddechowe i wywołujące ciężki przebieg choroby (SARS-CoV, MERS-CoV i SARS-CoV-2) oraz wirusy HCoV-OC43 i HCoV-HKU1 należą do rodzaju Betacoronavirus, podczas gdy wirusy HCoV-229E i HCoV-NL63 zaliczone zostały do rodzaju Alphacoronavirus [46].

Koronawirusy są wirusami osłonkowymi, których genom stanowi niesegmentowany jednoniciowy RNA o dodatniej polarności liczący od 26 do 32 tysięcy nukleotydów [11, 35]. W 5’-końcowej części genomu wyróżnić można dwie zachodzące na siebie otwarte ramy odczytu (ORF – open reading frame) ORF1a i ORF1b kodujące 15 lub 16 białek niestrukturalnych, natomiast w części 3’-końcowej znajdują się geny kodujące białka strukturalne: białko nukleokapsydu (N – nucleocapside), białko osłonkowe (E – envelope), białko błonowe (M – membrane) oraz glikoproteinę kolca (S – spike), oraz geny kodujące białka regulatorowe (ryc. 1) [24, 77]. Genomowy RNA oraz fosforylowane białko N tworzą helikalny nukleokapsyd otoczony dwuwarstwą fosfolipidową. W osłonce zakotwiczone są dwa rodzaje glikoprotein tworzących tzw. kolce: homotrimer glikoproteiny S występujący u wszystkich koronawirusów oraz hemaglutynina-esteraza obecna tylko u niektórych beta-CoV. Podczas procesu replikacji glikoproteina S rozcinana jest przez proteazę komórkową na dwa peptydy, S1 odpowiedzialny za wiązanie receptora komórkowego i S2 formujący trzon cząsteczki [1]. Pozostałe dwa białka strukturalne, czyli białko błonowe (M) i osłonkowe (E) odpowiedzialne są za składanie potomnych cząstek wirusa i wirulencję i są związane z dwuwarstwą fosfolipidową [2, 24, 61, 68, 70].

Ryc. 1.

Szczególną uwagę zwrócić należy na białko S, pełni ono bowiem kluczową rolę w cyklu replikacyjnym koronawirusów, wiąże się z receptorem na powierzchni komórki docelowej warunkując tropizm wirusa oraz uczestniczy w procesie fuzji pomiędzy osłonką wirusa i błoną komórkową lub endosomu. W N-końcowej części białka S znajduje się sekwencja sygnałowa kierująca białko do retikulum endoplazmatycznego. Dalsza część białka S dzielona jest na N-końcową podjednostkę S1 zawierającą domenę wiążącą receptor (RBD – receptor binding domain) oraz podjednostkę S2, w obrębie której wyróżnić można peptyd odpowiedzialny za fuzję (FP – fusion peptide), wewnętrzny peptyd odpowiedzialny za fuzję (IFP – internal fusion peptide), motywy powtórzeń siedmioaminokwasowych 1/2 (HP1/2 – heptad repeat 1/2) oraz domenę śródbłonową (TM – transmembrane domain) [36]. W obrębie białka S znajdują się dwa miejsca cięcia proteolitycznego, cięcie w obrębie pierwszego miejsca zlokalizowanego pomiędzy podjednostkami S1 i S2 (miejsce S1/S2) określane jest „priming”, natomiast drugie, znajdujące się w N-końcowej części domeny FP (miejsce S2’), rozcinane jest w procesie określonym jako „triggering”. „Priming” pozwala cząsteczce S na przyjęcie konformacji umożliwiającej domenie RBD na związanie się z receptorem, natomiast „triggering” pomaga obniżyć barierę energetyczną fuzji z błoną komórkową lub endosomu. W proteolizie białka S uczestniczyć może kilka enzymów komórkowych. Białko S może podlegać działaniu zależnej od pH proteazy cysteinowej katepsyny L, transmembranowej proteazy serynowej 2 (TMPRSS2 – transmembrane serine protease 2) oraz innej proteazy serynowej – furyny. Enzymy te w komórce występują w różnej lokalizacji determinując miejsce fuzji osłonki wirusa z błoną komórki. TMPRSS2 jest zlokalizowana na powierzchni komórki i pozwala na fuzję osłonki z błoną komórkową, podczas gdy katepsyna L występuje w endosomach i rozcina białko S dopiero po tym, jak cząstka wirusowa znajdzie się w pęcherzyku, co pozwala na fuzję pomiędzy osłonką a błoną endosomu [5, 38]. Przebieg kaskady cięć proteolitycznych białka S koronawirusów warunkuje ich tropizm. Dla przykładu wydajne rozcinanie S1/S2 MERS-CoV odbywa się wkrótce po uformowaniu potomnych cząstek wirusa jeszcze w komórkach, w których zachodzi replikacja, co pozwala na równie wydajne cięcie S2’ natychmiast po związaniu wirusa z komórką docelową i umożliwia fuzję osłonki z błoną komórkową. Jednak niektóre warianty MERS-CoV oraz inne koronawirusy, procesy proteolityczne białka S rozpoczynają dopiero na powierzchni komórki, co opóźnia przeprowadzenie drugiego cięcia do etapu endosomalnego, a tym samym pozwala na fuzję osłonki z błoną endosomu. Znajomość procesów proteolitycznych umożliwiających zakażenie komórki docelowej pozwala przewidywać tropizm wirusa, patogenezę zakażeń oraz opracować strategię postępowania terapeutycznego [72].

Białko S SARS-CoV-2 ze względu na to, że zawiera epitopy immunodominujące i jest celem przeciwko któremu skierowane są przeciwciała neutralizujące zostało wybrane do skonstruowania szczepionki. W opracowaniu szczepionek mających stymulować odpowiedź immunologiczną przeciwko białku S wykorzystywane są różne strategie, między innymi syntetyczne lub rekombinowane polipeptydy (szczepionki podjednostkowe), wektory wirusowe, mRNA, DNA, wirusy atenuowane [50, 54]. Ostatnio Samad i wsp. zastosowali metody immunoinformatyczne do wybrania epitopów białka S SARS-CoV-2 silnie wiążących się z receptorem TLR4 (toll-like receptor 4) i wywołujących silną odpowiedź immunologiczną na infekcję tym wirusem [76].

Cykl replikacyjny koronawirusów inicjowany jest przez związanie białka S wirusa z receptorem na powierzchni komórki docelowej. Interakcja białka S z receptorem staje się możliwa po jego rozcięciu na podjednostki S1 i S2 pozostające w połączniu niekowalencyjnym. Następnie białko S podlega prowadzonemu przez proteazy komórkowe cięciu w położonym bezpośrednio przed domeną odpowiedzialną za fuzję miejscu S2’. Cięcie to powoduje zmiany konformacji białka umożliwiające przeprowadzenie fuzji osłonki wirusa z błoną komórki lub endosomu gospodarza, co w konsekwencji umożliwia uwolnienie genomu wirusa do cytoplazmy. Kolejnym etapem replikacji koronawirusa jest translacja otwartych ram odczytu ORF1a i ORF1b doprowadzająca do powstania poliprotein pp1a i pp1ab, które ulegają rozcięciu na 16 lub, rzadziej, 15 białek niestrukturalnych (tab. I, ryc. 1) [69, 71, 80, 102] tworzących kompleks replikacyjno-transkrypcyjny (RTC – replication-transcription complex) [24, 87]. Powstały kompleks odpowiedzialny jest za replikację RNA oraz transkrypcję subgenomowych RNA służących jako matryca do syntezy białek strukturalnych S, E i M wbudowywanych do retikulum endoplazmatycznego oraz białka N tworzącego wraz z RNA nukleokapsyd. Uformowany nukleokapsyd trafia do przedziału ERGIC (endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment), gdzie oddziałuje z białkiem M i uzyskuje osłonkę. Interakcje te rozpoczynają proces dojrzewania, transport w pęcherzykach i ostatecznie uwolnienie potomnych wirionów poprzez egzocytozę [19, 24, 64].

Peptydaza dwupeptydylowa IV (DPP4 – dipeptidyl peptidase IV), inaczej CD26, została rozpoznana jako receptor dla MERS-CoV w 2013 roku przez Raj i wsp., którzy wyizolowali z lizatów zakażonych komórek Huh-7 DPP4 związany z RBD białka S MERS-CoV [75]. DPP4 jest białkiem transbłonowym typu II występującym w formie dimerów. Część zewnątrzkomórkowa każdego monomeru złożona jest z dwu domen, położonej bliższej błony domeny katalitycznej α/β oraz dalszej ośmioczłonowej domeny wiążącej β o konformacji przypominającej śmigło. Dzięki aktywności hydrolazy domeny α/β DPP4 odcina dipeptydy X-L-prolina lub X-L-alanina z N-końca różnych polipeptydów takich jak hormony, cytokiny, chemokiny, neuropetydy i peptydy wazoaktywne. Człon 4 i 5 struktury β-śmigła DPP4 jest rozpoznawany przez domenę rozpoznającą receptor białka S MERS-CoV [4, 67]. W cząsteczce DPP4 zidentyfikowano 11 reszt aminokwasowych kluczowych dla wiązania z RBD i wykazano, że są one wysoce konserwatywne wśród gatunków wrażliwych na zakażenie MERS-CoV, takich jak wielbłądy, króliki i naczelne, natomiast fretki, szczury, czy myszy niewrażliwe na zakażenie MERS-CoV wykazują znaczne zróżnicowanie w obrębie reszt kluczowych dla wiązania z białkiem S. Tak więc struktura pierwszorzędowa DPP4 wyznacza grupę gatunków zwierząt będących gospodarzami dla MERS-CoV [90, 95].

Transmisja i patogeneza zakażeń MERS-CoV uwarunkowana jest zarówno przez strukturę DPP4 jak i jego tkankową lokalizację oraz poziom ekspresji. Umiejscowienie występowania DPP4 decyduje o znacznie wydajniejszej transmisji MERS-CoV u wielbłądów, aniżeli u ludzi i wyjaśnia, dlaczego głównym źródłem zakażenia MERS-CoV są wielbłądy, podczas gdy transmisja między ludźmi jest znacznie rzadsza. Różnica w poziomie rozprzestrzeniania się wirusa u wielbłądów i u ludzi wynika bowiem z możliwości jego namnażania się w górnych drogach oddechowych u wielbłądów i braku takiej możliwości u ludzi. W wymazach z nosa pobranych od wielbłądów, w odróżnieniu od próbek pochodzących od ludzi, wykryto stosunkowo wysoki poziom wirusa. Różnica ta wynika z faktu, że u ludzi receptor DPP4 występuje jedynie nabłonku dolnych dróg oddechowych, głównie w pneumocytach typu II, nieobecny jest natomiast w śluzówce nosa, podczas gdy u wielbłądów DPP4 jest obecny w śluzówce nosa i pozwala wirusowi replikować w tej lokalizacji [94].

Kolejną zagadką rozwiązaną dzięki pracom nad udziałem DPP4 w patogenezie zakażeń MERS-CoV było wewnątrzgatunkowe zróżnicowanie przebiegu zakażenia tym wirusem. Przebieg kliniczny zakażenia MERS-CoV jest bardzo zróżnicowany, od postaci bezobjawowej aż do ciężkiego zapalenia płuc z zespołem ostrej niewydolności oddechowej, prowadzącym do śmierci [109]. Wskazuje to na istnienie czynników osobniczych decydujących o przebiegu klinicznym zakażenia MERS-CoV. Takimi czynnikami są palenie tytoniu oraz przewlekła obturacyjna choroba płuc (COPD – chronic obstructive pulmonary disease). Wykazano, że palacze oraz pacjenci z COPD są bardziej wrażliwi na zakażenie MERS-CoV, co Seys i wsp. tłumaczą wyższym poziomem ekspresji DPP4 zarówno na etapie mRNA, jak i białka w porównaniu z osobami niepalącymi i nieobarczonymi COPD [78]. 98% powierzchni płuc pokrywają pneumocyty typu I, pozostałą część natomiast pneumocyty typu II. W płucach zdrowych ludzi DPP4 występuje prawie wyłącznie na pneumocytach typu II, podczas gdy u palaczy i pacjentów z COPD dochodzi do ekspresji DPP4 w pneumocytach typu I i białko to występuje w obu tych typach komórek. Obecność receptora na pneumocytach typu I może być przyczyną zakażania i niszczenia tych komórek przez MERS-CoV i prowadzić ostatecznie do rozległego uszkodzenia pęcherzyków płucnych [95].

Poznanie oddziaływań pomiędzy DPP4 i białkiem S MERS-CoV na poziomie molekularnym wykazało, że w bezpośredni kontakt z białkiem S wchodzi 15 aminokwasów [90]. Kleine-Weber i wsp. zadali pytanie, czy naturalnie występujące w DPP4 polimorfizmy dotyczące aminokwasów oddziałujących z białkiem S mogą wpływać na wejście wirusa do komórki. Przeprowadzona analiza wykazała, iż cztery polimorfizmy (K267E, K267N, A291P i Δ346–348) obniżają zdolność wiązania MERS-CoV, a co za tym idzie wydajność zakażania komórek i replikacji wirusa. Tak więc fenotyp DPP4 może oddziaływać na przebieg zakażenia MERS-CoV. Wariant DPP4 z delecją Δ346–348 jest mniej wydajnie, w porównaniu do typu dzikiego białka, transportowany na powierzchnię komórki, natomiast warianty K267E i A291P DPP4 słabiej wiążą się z białkiem S. Podsumowując, naturalnie występujące w DPP4 polimorfizmy mogą utrudniać wnikanie MERS-CoV do komórki i w konsekwencji wpływać na rozwój choroby u zakażonych pacjentów [52].

Konwertaza angiotensyny typ 2 (ACE2 – angiotensin-converting enzyme 2) jest złożoną z 805 aminokwasów, glikoproteiną transmembranową typu I z zewnątrzkomórkową domeną katalityczną. ACE2 należy do rodziny M2 metaloproteaz, a zlokalizowane po zewnętrznej stronie błony komórkowej domeny katalityczne uczestniczą w przemianach peptydów krążących zewnątrzkomórkowo. ACE2 zlokalizowany jest głównie w sercu, nerkach, jądrach, wątrobie, jelitach i endotelium naczyń krwionośnych, a w mniejszym stopniu w wielu innych organach, głównie w płucach i okrężnicy, nie występuje w komórkach ośrodkowego układu nerwowego [55]. ACE2 jest elementem układu renina--angiotensyna (RAS – renin–angiotensin system), w którym ACE przekształca będącą dekapeptydem angiotensynę I (AngI) w liczącą osiem reszt aminokwasowych angiotensynę II (AngII), natomiast ACE2 ma zdolność odcinania pojedynczych reszt aminokwasowych przekształcając AngI w Ang1-9, a AngII konwertując do Ang1-7. ACE2 w układzie RAS pełni funkcję negatywnego regulatora RAS, działając przeciwnie do ACE w wielu narządach takich jak serce, nerki czy płuca. W układzie oddechowym ACE, AngII i receptor typu 1 AngII (AT1R – AngII receptor type 1) są czynnikami, których działanie prowadzi do uszkodzenia płuc, podczas gdy ACE2 wpływa na płuca ochronnie [44]. Jedną z przyczyn ciężkiego przebiegu zakażenia SARS-CoV i stosunkowo wysokiej śmiertelności może być obniżona ekspresja ACE2 w płucach zakażonych pacjentów wykazana w badaniach Kuba i wsp., którzy dowiedli, że zarówno SARS-CoV, jak i rekombinowane białko S tego wirusa obniża ekspresję ACE2. Tak więc ACE2 w patogenezie zakażeń koronawirusami uczestniczy w dwojaki sposób, po pierwsze umożliwia zakażenie wrażliwych komórek, po drugie pod wpływem zakażenia jego ekspresja ulega osłabieniu, co nieuchronnie prowadzi do uszkodzenia płuc (ryc. 2) [56]. Zjawisko obniżenia poziomu ekspresji ACE2 w komórkach płuc wywołane przez SARS-CoV i HCoV-NL63 oddziałujące z tym receptorem może wyjaśniać różnice w przebiegu zakażenia wywołanego tymi wirusami. Rekombinowane białko S SARS-CoV wiąże się z ACE2 i powoduje jego uwolnienie z powierzchni komórki znacznie wydajniej aniżeli białko S wirusa HCoV-NL63 [31]. Badania strukturalne i biofizyczne wykazały natomiast, że SARS-CoV-2 wiąże się z ACE2 ze znacznie większym powinowactwem niż SARS-CoV. Te różnice w awidności wiązania do ACE2 mogą, przynajmniej częściowo, wyjaśniać łatwość, z jaką SARS-CoV-2 przenosi się między ludźmi [98]. Potwierdzenie tej hipotezy stanowią wyniki badań prowadzonych przez Chu i wsp., którzy odkryli, że SARS-CoV-2 replikuje się w tkankach płuc znacznie wydajniej niż SARS-CoV [15].

Ryc. 2.

Zaburzenie równowagi w układzie RAS poprzez związanie białka S SARS-CoV-2 z ACE2 odgrywa kluczową rolę w patogenezie COVID-19. AngII, która na skutek obniżenia ekspresji ACE2 pozostaje nieprzekształcona do Ang1-7, zwiększa przepuszczalność naczyń krwionośnych płuc, co prowadzi do obrzęków płuc, a także stymuluje makrofagi i inne komórki układu odpornościowego do produkcji cytokin prozapalnych, których wzmożona produkcja, tzw. „burza cytokinowa” prowadzi do uszkodzenia płuc oraz niewydolności wielonarządowej kończącej się śmiercią [3, 45, 100].

Badania dotyczące wielu innych wirusów wykazały, że istnienie wariantów allelicznych receptora gospodarza warunkuje wydajność wiązania wirusa, przez co modyfikuje stopień oporności komórki na zakażenie danym wirusem. Dlatego przeprowadzono liczne badania mające określić, czy warianty genetyczne ACE2 mogą determinować przebieg zakażenia SARS-CoV i SARS-CoV-2. Zidentyfikowano niewiele polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) w regionach kodujących ACE2 człowieka, ponadto w większości z nich częstość występowania polimorficznego allela wynosi poniżej 5%. Porównanie częstości występowania polimorficznych alleli regionów kodujących i niekodujących ACE2 pomiędzy grupą osób zakażonych SARS-CoV i grupą kontrolną nie potwierdziły istnienia ich związku z wrażliwością na rozwój zakażenia wśród populacji chińskiej i wietnamskiej [14, 48]. Z drugiej strony, utworzone modele polimorficznych wariantów ACE2 obejmujących miejsca zaangażowane w oddziaływania z RBD białka S koronawirusa pozwoliły obserwować wpływ zmian strukturalnych ACE2 na oddziaływania międzycząsteczkowe z białkiem S SARS--CoV-2. W badaniach tych odnotowano, że allele ACE2 rs73635825 (S19P) i rs143936283 (E329G) wykazują zróżnicowaną zdolność do oddziaływań z wirusowym białkiem S, co wskazuje na wpływ wariantów polimorficznych ACE2 na potencjalną oporność przeciw SARS-CoV-2 [43]. Jednakże rzeczywiste znaczenie tych polimorfizmów trudno ustalić ze względu na ich rzadkie występowanie oszacowane na 3.3 × 10^–3 dla rs73635825 w populacji afrykańskiej oraz 6.51 × 10^–5 dla rs143936283 w populacji europejskiej [49].

Zhao i wsp. stosując technikę sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki wykazali, że głównymi komórkami syntetyzującymi ACE2 są pneumocyty typu II i, co szczególnie interesujące, w komórkach tych wykryto również ekspresję wielu innych białek zapewniających replikację i transmisję wirusa. Innymi komórkami, w których stwierdzono syntezę, choć na niższym poziomie, ACE2 są pneumocyty typu I, fibroblasty, komórki nabłonka oddechowego, komórki śródbłonka oraz makrofagi. Podwójna rola jaką pełni ACE2, który z jednej strony działa ochronne w osi ACE2 – Ang1–7 – receptor Mas, a z drugiej strony stanowi kluczowy czynnik dla wejścia wirusa do komórek, sprawia, że zarówno wzrost, jak i obniżenie poziomu jego ekspresji w układzie oddechowym może wpływać na rozwój zakażenia i nasilenie przebiegu choroby. Co ciekawe, mimo tego że loci genu kodującego ACE2 znajduje się na chromosomie X, u mężczyzn stwierdzono wyższy poziom i szerszą dystrybucję ekspresji ACE2 w porównaniu do kobiet, czym badacze wyjaśniali większy odsetek zakażeń SARS-CoV-2 u mężczyzn [107]. Badania przeprowadzone na większą skalę nie wykazały jednak istotnych różnic w poziomie ekspresji ACE2 w płucach pomiędzy grupami różniącymi się wiekiem (> 60 vs < 60 r.ż.), płcią i pochodzeniem etnicznym (rasa kaukaska i azjatycka) [7]. Do innych wniosków prowadzą wyniki badań Xie i wsp., którzy ustalili, że poziom ekspresji ACE2 w płucach szczurów zmniejsza się wraz z ich wiekiem i spadek ten jest znaczniejszy u samców, co w połączeniu z działaniem SARS-CoV-2 zmniejszającym ekspresję tego receptora może tłumaczyć wynikający z niedostatku czynnika ochronnego cięższy przebieg zakażenia u osób starszych [99]. Bardziej wrażliwi na rozwój zakażenia SARS-CoV-2 mogą być również palacze, jako że w ich płucach ekspresja ACE2 jest bardziej nasilona, aniżeli u osób niepalących [6, 7]. Rzeczywiście, w płucach ludzi i gryzoni zaobserwowano wzrost poziomu ekspresji ACE2 w stopniu skorelowanym z liczbą wypalanych papierosów. Ekspresję ACE2 wykazano ponadto w różnych typach komórek wyściełających drogi oddechowe, między innymi w komórkach kubkowych, oskrzelikowych komórkach egzokrynnych i pneumocytach typu II. Długotrwała ekspozycja na dym papierosowy wyzwala reakcję ochronną polegającą na ekspansji wydzielających śluz komórek kubkowych i wzroście ekspresji ACE2 [79]. Fu i wsp., którzy wykryli wysoki poziom ACE2 w jądrach, układzie sercowo-naczyniowym oraz układzie pokarmowym, dostrzegli jeszcze jeden aspekt swoistej dla narządów dystrybucji ekspresji tego białka. Sugerują oni, że SARS-CoV-2 może nie tylko atakować płuca, ale także inne narządy, szczególnie jądra, co może prowadzić do ich uszkodzenia i zaburzenia rozwoju płciowego chłopców i bezpłodności dorosłych [27].

Rozpoznanie zakażenia przez układ odporności wrodzonej prowadzi do wydzielania kluczowych czynników, jakimi są interferony typu I/III. SARS-CoV-2 angażuje receptory rozpoznające wzorce (PRR – pattern recognition receptors) należące do dwóch rodzin: receptory RIG-I-podobne (RLR – RIG-I-like receptors) oraz receptory Toll-podobne (TLR – toll-like receptors) rozpoznające dwuniciowy i jednoniciowy RNA wirusów i inicjujące szlaki sygnałowe prowadzące do wydzielenia cytokin prozapalnych (m.in. IFN typu I, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-18). W wyniku uwolnienia cytokin dochodzi do przekazania sygnału do komórek śródbłonka, które umożliwiają przepływ chemokin do krwi i rekrutację komórek efektorowych odporności wrodzonej do miejsca zakażenia. Zaangażowane komórki NK, monocyty i neutrofile oddziałują ze śródbłonkiem, opuszczają krwioobieg i migrują do miejsca zakażenia, gdzie uaktywniane są mechanizmy prowadzące do zabicia zakażonych komórek oraz wytworzenia antygenowo--swoistej odpowiedzi odporności nabytej. Wydzielane w odpowiednim czasie i właściwym miejscu interferony uznawane są za najefektywniej działający czynnik ograniczający zakażenie CoVs [9]. Śródbłonowe białka indukowane przez IFN (IFITM – interferon-inducible transmembrane proteins) mogą zaburzać proces fuzji, w którym uczestniczy białko S [41]. W późniejszej fazie zakażenia IFN typu I może stać się czynnikiem patogennym, np. poprzez zwiększanie ekspresji ACE2 na powierzchni komórek nabłonka oddechowego [108] lub organizację odpowiedzi zapalnej odpowiedzialnej za zmiany patologiczne o podłożu immunologicznym [47]. SARS-CoV-2, podobnie jak inne koronawirusy, wykształcił różne mechanizmy hamowania indukcji i przekazywania sygnału szlaku IFN. Potwierdzeniem tego zjawiska jest występowanie znacznego zaburzenia szlaku IFN u pacjentów z ciężkim przebiegiem COVID-19 przy jednoczesnej aktywności procesów prozapalnych prowadzących do zmian patologicznych (wydzielanie cytokin prozapalnych). SARS-CoV-2 szczególnie wydajnie indukuje wydzielanie IL-6 i IL-8, np. poprzez hamowanie przy udziale nsp10 endogennego represora NF-κB (NKRF – NF-κB-repressing factor) [62].

Gwałtowny wzrost syntezy cytokin jest zjawiskiem udokumentowanym w ciężkim przebiegu COVID-19 [40; 63]. U pacjentów z najcięższym przebiegiem COVID-19 synteza cytokin takich jak IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, G-CSF (granulocyte colony stimulating factor; czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów), GM-CSF (granulocyte/macrophage colony stimulating factor; czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów), IP-10 (IFN-γ-inducible protein 10; białko indukowane przez interferon gamma), MCP1 (monocyte chemotactic protein-1; białko chemotaktyczne dla monocytów), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha; białko zapalne makrofagów), IFN-γ, TNF-α osiąga ekstremalnie wysoki poziom, co jest określone jako „burza cytokinowa”. U chorych z łagodniejszą formą zakażenia wzrost poziomu wydzielania cytokin przebiega na zdecydowanie niższym poziomie [40].

Do dysfunkcji i redukcji liczby limfocytów doprowadzać może kilka mechanizmów. Wykazano, że SARS--CoV-2 może zakażać limfocyty i makrofagi dzięki ekspresji receptora ACE2 mającej miejsce szczególnie na limfocytach T. Zdolność do zakażania zarówno limfocytów T jak i makrofagów jest kluczowym mechanizmem patogenezy SARS-CoV [73]. Wykazano, że SARS-CoV-2 zakaża limfocyty pomocnicze Th CD4⁺, ale nie cytotoksyczne Tc CD8⁺ i jest wykrywany w limfocytach Th we krwi oraz w popłuczynach pęcherzykowo-oskrzelowych. W procesie wejścia wirusa do Th CD4⁺ istotną rolę odgrywa oddziaływanie białka S z cząsteczką CD4 oraz wymagany jest udział ACE2 i TMPRSS2. W zakażonych przez SARS-CoV-2 limfocytach wzrasta poziom syntezy IL-10 w stopniu skorelowanym z nasileniem choroby. Zjawisko to może wyjaśniać słabą odpowiedź ze strony układu odporności wrodzonej, gdyż IL-10 jest czynnikiem hamującym ekspresję cytokin prozapalnych [17]. Również Diao i wsp. wnioskują, iż w obniżeniu liczby i osłabieniu aktywności limfocytów Th uczestniczy TNF-α, IL-10 i IL-6 [21]. Ponadto szczególnie ważne wydaje się być oddziaływanie IL-6 poprzez obniżenie ekspresji HLA klasy II na monocytach CD14⁺ oraz limfocytach B [30, 96]. Spadek liczby cząsteczek HLA u pacjentów z COVID-19 może powodować zaburzenie zdolności do prawidłowej odpowiedzi limfocytów Th ze względu na ograniczenie możliwości prezentacji antygenu poprzez TCR. W takich warunkach limfocyty Th ulegają apoptozie. Masowe niszczenie limfocytów związane z wysokim poziomem ekspresji IL-6 oraz indukcję apoptozy zależnej od Fas odnotowano w czasie autopsji pacjentów z COVID-19 [25]. W badaniach sekcyjnych narządów chorych zmarłych z powodu ciężkiego przebiegu COVID-19 ujawniono bezpośrednie niszczenie narządów limfatycznych, atrofię śledziony i nekrozę węzłów chłonnych, wywoływane przez SARS--CoV-2 prowadzące do limfopenii [8, 59]. Innym jeszcze mechanizmem wyjaśniającym zjawisko limfopenii u chorych z ciężką postacią COVID-19 jest wzrost poziomu kwasu mlekowego we krwi, co może hamować proliferację aktywowanych limfocytów T [83]. Kolejną przyczyną wyczerpania limfocytów T jest ich długotrwała nadmierna aktywacja. W limfocytach Th CD4⁺ i Tc CD8⁺ izolowanych z krwi pacjentów z ciężkim przebiegiem COVID-19 wykryto wzrost poziomu PD-1 (programmed cell death protein 1), TIM-3 (mucin domain-containing protein 3) i ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif), markerów świadczących o ich wyczerpaniu, przy równocześnie obniżonym poziomie ekspresji stymulatora CD28 [18].

U pacjentów z COVID-19 stwierdza się podwyższony poziom neutrofili [74]. Neutrofile indukowane są przez pojawienie się drobnoustrojów i mogą prowadzić do ich zniszczenia poprzez tworzenie aktywnych form tlenu, degranulację, wydzielanie czynników przeciwdrobnoustrojowych, ale również poprzez formowanie zewnątrzkomórkowych sieci neutrofilowych (NETs – neutrophil extracellular traps). Zaburzenie poziomu czynników wydzielanych przez neutrofile może prowadzić do uszkodzenia tkanek, co znalazło potwierdzenie w badaniach, w których w surowicy chorych z ciężkim przebiegiem zakażenia SARS-CoV-2 wykazano podwyższony poziom DNA pozakomórkowego, mieloperoksydazy-DNA (MPO-DNA – myeloperoxidase-DNA), i cytrulinowanych histonów H3 (Cit-H3 – citrullinated histone H3) będących markerami związanymi z NET [110].

Zjawisko zależnego od przeciwciał wzmocnienia zakażenia wirusowego (ADE – antibody-dependent enhancement) jest związane z udziałem wcześniej istniejących przeciwciał nieneutralizujących ułatwiających wejście wirusa do komórki i jego replikację. Udział ADE w patogenezie zakażeń wykazano dla SARS-CoV, który poprzez oddziaływanie receptorów FcR z fragmentami Fc przeciwciał związanych z wirusem może zakażać i zmieniać funkcjonowanie makrofagów prowadząc do hiperstymulacji układu odpornościowego i uszkodzenia płuc [65] oraz MERS-CoV, którego białko S po połączeniu z przeciwciałami ulega przekształceniu ułatwiającemu zakażanie komórek posiadających na powierzchni receptor dla Fc [22, 89].

Powstaje pytanie, czy obecność przeciwciał nieneutralizujących może pogarszać przebieg zakażenia SARS-CoV-2. Wiadomo, że w zakażeniu SARS-CoV powstają przeciwciała przeciwko różnym epitopom białka S działające albo ochronnie, albo wzmacniające zakażenie tym wirusem u makaków. Przeciwciała skierowane przeciwko epitopowi S579-603 silnie pogłębiały uszkodzenie płuc u makaków [91]. U myszy szczepionych czterema różnymi szczepionkami przeciwko SARS-CoV po zakażeniu odnotowano niższy poziom wirusa w porównaniu do kontroli, ale w odróżnieniu od kontroli w płucach zwierząt poddanych przed zakażeniem szczepieniu wykazano obecność zmian histopatologicznych z naciekaniem eozynofilów [85].

Dotychczas przeprowadzone badania, obejmujące niewielką grupę pacjentów, nie wykazały nasilenia objawów zakażenia SARS-CoV-2 po zastosowaniu osocza ozdrowieńców [23]. Efektu ADE nie odnotowano także po zastosowaniu inaktywowanych szczepów SARS-CoV-2 użytych do szczepienia myszy, szczurów i zwierząt z rzędu naczelnych [29]. Możliwość udziału przeciwciał w patogenezie COVID-19 pozostaje jednak tematem zasługującym na zwrócenie szczególnej uwagi ze względu na trzy zjawiska obserwowane w przebiegu pandemii SARS-CoV-2. Po pierwsze, występujący najczęściej bezobjawowy przebieg zakażenia u dzieci, co może być związane z brakiem wcześniejszego kontaktu z koronawirusami i brakiem przeciwciał mogących krzyżowo reagować z SARS-CoV-2. Po drugie, wczesne pojawianie się przeciwciał IgG u części pacjentów, u których serokonwersja IgG występowała przed IgM lub jednocześnie z IgM. Po trzecie dodatnia korelacja między wysokim poziomem przeciwciał, a niezależnym od wieku, płci i występowania innych schorzeń złym rokowaniem przebiegu choroby. Wyjaśnieniem tych obserwacji może być obecność przeciwciał powstałych po wcześniejszym kontakcie z koronawirusami powodującymi przeziębienia i wywołującymi zależne od przeciwciał wzmocnienie przebiegu zakażenia SARS-CoV-2 [66, 106].