- Journal Details
- Format
- Journal
- eISSN
- 2545-3149
- First Published
- 01 Mar 1961
- Publication timeframe
- 4 times per year
- Languages
- English, Polish
Systematyczna kontrola wskaźników zanieczyszczenia kałowego, takich jak
Bakteriofagi infekujące
Przedstawiciele i charakterystyka colifagów
| Przykład | Typ | Rodzina | Kwas nukleinowy | Budowa |
|---|---|---|---|---|
| T2, T4 | Colifagi somatyczne | dsDNA | Ogonek składający się z wewnętrznej struktury rdzeniowej otoczonej kurczliwą osłonką | |
| λ, T1 | Colifagi somatyczne i bakteriofagi | dsDNA | Długi, niekurczliwy ogonek, bez otoczki | |
| P22 | Colifagi somatyczne | dsDNA | Krótki, niekurczliwy ogonek, bez otoczki | |
| phiX174 | Colifagi somatyczne | dsDNA | Bez otoczki, izometryczny | |
| PR772 | F-specyficzne bakteriofagi DNA | dsDNA | Brak ogonka, sześcienny kapsyd bez otoczki | |
| MS2, Qβ | F-specyficzne bakteriofagi RNA | ssRNA | Bez otoczki, izometryczny | |
| M13 | F-specyficzne bakteriofagi DNA | ssDNA | Bez otoczki, pałeczkowaty |
Colifagi są niepatogenne dla ludzi i wydalane z kałem przez zwierzęta stałocieplne [8, 15, 18, 27]. Colifagi somatyczne namnażają się w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt, ale nie tylko, ponieważ w naturalnych środowiskach wodnych do replikacji mogą wykorzystywać jako gospodarzy inne bakterie niż
Bakteriofagi są jedną z najliczniejszych grup organizmów występujących na Ziemi. Ich obecność była wykrywana w wodach głębinowych, powierzchniowych, ściekach oraz w glebie [8, 22, 26, 35, 62]. Colifagi somatyczne są wydalane z kałem przez większość ludzi i zwierząt [8, 15, 18, 29, 66]. F-specyficzne bakteriofagi RNA wydalane są natomiast przez ludzi i zwierzęta w różnym, zwykle niższym, odsetku [8, 66]. Colifagi F-RNA z grupy I i IV wykrywano dotychczas wyłącznie w odchodach zwierząt (głównie bydła), natomiast fagi z grupy III wykrywane były w odchodach ludzkich. Fagi z grupy II wykrywano zasadniczo tylko w odchodach ludzkich, poza przypadkiem stwierdzenia ich w 28% próbek kału świń [8, 66]. Colifagi somatyczne mogą występować w dużych ilościach w ściekach i zanieczyszczonych środowiskach wodnych [15]. Liczba cząstek colifagów somatycznych w ściekach może wynosić nawet 106–108 na litr [4, 18, 36]. Według niektórych autorów liczba colifagów somatycznych w ściekach i wodzie surowej może 2–5-krotnie przewyższać liczbę colifagów F-RNA i około 500-krotnie liczbę ludzkich wirusów patogennych [18, 27]. Zarówno colifagi somatyczne jak i F-specyficzne bakteriofagi RNA wykrywane są w wodach jezior i rzek w liczbie do 105 cząstek na litr [18].
Badania nad częstością występowania bakteriofagów, w tym colifagów w środowisku wodnym prowadzone są od wielu lat [8, 17, 18, 21, 22, 26, 29, 37, 68]. Niestety dane nie są spójne, między innymi ze względu na wiele czynników, które wpływają na występowanie, zdolność przetrwania i rozwój fagów w różnych środowiskach wodnych. Wśród tych czynników, należy wymienić liczebność komórek gospodarza, jak i samych wirusów, zdolność wirusów do adhezji do cząstek stałych, obecność zwłaszcza materii organicznej, która wpływa na aktywność metaboliczną bakterii, promieniowanie słoneczne, temperaturę, pH, stężenie i rodzaj jonów w wodzie oraz aktywność metaboliczną mikroorganizmów innych niż bakterie gospodarza [61].
Wpływ czynników środowiskowych na zdolność przetrwania fagów była badana w warunkach laboratoryjnych oraz środowiskowych [22]. Danych uzyskanych w warunkach środowiskowych jest jednak znacznie mniej. Wpływ temperatury, światła słonecznego, zasolenia, pH na colifagi w dużej mierze związany jest z ich morfologią. Wykazano, że takie cechy jak obecność ogonków, duże kapsydy i brak otoczki wpływają na ich większą odporność na czynniki zewnętrzne [22]. Przy czym z powodu wielu zmiennych, które wpływają na zdolność przetrwania i replikację fagów, trudno jest usystematyzować i przewidzieć występowanie oraz zachowanie fagów w środowisku wodnym.
Temperatura jest jednym z kluczowych czynników wpływających na zdolność przetrwania bakteriofagów [44]. Odgrywa ona istotną rolę między innymi na etapie adhezji, wnikania i replikacji fagów. W przypadku colifagów F-RNA, decydujące są warunki wytwarzania przez bakterie F-fimbrii wyłącznie w fazie wzrostu logarytmicznego, w temperaturze powyżej 30°C, co precyzyjnie determinuje, że do ich replikacji dochodzi wyłącznie w przewodzie pokarmowym zwierząt stałocieplnych. Jest to również zmienna, która koreluje z utrzymywaniem się colifagów w warunkach środowiskowych [22, 43, 69]. Badania wpływu tego czynnika na zdolność do przetrwania colifagów somatycznych w środowiskach wodnych wykazały, że fagi te, podobnie jak wirusy jelitowe, występowały częściej i przez dłuższy czas w środowiskach naturalnych, w niższych temperaturach (np. woda morska, rzeki, woda podziemna) [32]. W temperaturze niższej niż optymalna, przemieszczanie się fagów jest spowolnione, a proces adsorpcji faga do komórki gospodarza zaburzony. W konsekwencji mniej cząstek faga wnika do bakteryjnych komórek gospodarza, natomiast wyższa temperatura może wydłużać fazę uśpienia, w wyniku czego czas od etapu infekcji komórki do namnożenia faga będzie wydłużony [63].
Przeprowadzona przez Bertrand i wsp. (2012) meta-analiza danych w zakresie wpływu temperatury na inaktywację wirusów jelitowych oraz bakteriofagów m.in. w ściekach i wodzie (woda do picia, podziemna, woda morska) wykazała, że inaktywacja wirusów przebiega szybciej w temperaturach ≥ 50°C w porównaniu do niższych temperatur. Testowany w badaniach colifag somatyczny phiX174 wykazywał wysoką stabilność we wszystkich wymienionych wyżej warunkach, w zakresie temperatur 0–100°C, szczególnie w wyższych temperaturach (podobnie jak colifagi F-RNA). W wyższych temperaturach colifagi somatyczne i colifagi F-RNA wykazywały większą odporność w porównaniu do wirusów jelitowych [5]. Z kolei wyniki badań Lee i Sobsey (2011) dotyczące wpływu temperatury na inaktywację różnych colifagów somatycznych (T4, phiX174, λ T1, T7), w próbkach wody powierzchniowej oraz w wodzie o czystości laboratoryjnej wykazały, że colifagi T4, phiX174 i λ dłużej utrzymywały się w niskich (4°C) i wyższych temperaturach (25°C) w porównaniu z T1 i T7.
Wyraźne różnice w odporności na wysoką temperaturę pomiędzy naturalnie występującymi bakteriami a colifagmi somatycznymi, zaobserwowali w swoich badaniach Mocé-Llivina i wsp. (2003). W doświadczeniu, obróbce cieplnej poddawano ścieki surowe, inkubując je w temperaturze 60°C przez 30 min. oraz osad, inkubując w temperaturze 80° C przez 30 min. i 90 min. W obu eksperymentach colifagi somatyczne wykazywały większą odporność. Redukcja liczby drobnoustrojów po 30 min. i 90 min. inkubacji wynosiła ponad 3,6 log10 dla
Promieniowanie słoneczne jest kolejnym czynnikiem mającym wpływ na inaktywację wirusów, w tym colifagów somatycznych [22, 33]. Zaobserwowano korelację pomiędzy stopniem inaktywacji środowiskowych izolatów colifagów somatycznych pod wpływem promieniowania słonecznego, a wielkością genomu. Izolaty posiadające większe genomy wykazywały wyższy wskaźnik inaktywacji [33]. Z kolei wyniki badań Sinton i wsp. (1999) wykazały, że ekspozycja próbek wody morskiej i ścieków na promieniowanie słoneczne zwiększa tempo rozpadu cząstek colifagów somatycznych i innych bakteriofagów oraz bakterii z grupy coli typu kałowego, w porównaniu z próbkami bez dostępu światła [58]. Wyniki kolejnych badań prowadzonych przez Sinton i wsp. na próbkach wody świeżej pochodzącej z rzeki, wody morskiej oraz wody będącej odpowiednikiem wody z estuarium (50% wody z rzeki + 50% wody morskiej) wykazały wolniejsze tempo rozpadu kapsydów colifagów somatycznych oraz F-specyficznych bakteriofagów RNA w porównaniu z bakteriami
Dane piśmiennictwa wskazują, że wraz ze wzrostem zasolenia rośnie stopień inaktywacji colifagów [58, 59]. Woda morska to przede wszystkim roztwór NaCl. Jony sodu i chloru stanowią ponad 86% związków soli w wodzie. Średnie zasolenie wód morskich wynosi 35 g/litr. W innych rodzajach wód naturalnych stężenie jonów Na+ i Cl− jest znacznie mniejsze [42]. W wielu analizach środowiskowych potwierdzono powszechne występowanie colifagów somatycznych w wodach morskich [9, 21, 34]. W badaniach prowadzonych na terenie Europy (Irlandia, Anglia, Francja, Hiszpania, Gracja), colifagi somatyczne izolowane były w 71–100% próbek wody morskiej pochodzącej z kąpielisk [9]. Częstotliwość wykrywania colifagów somatycznych w rzekach jest porównywalnie wysoka, jednak badania ilościowe wykazują że jest ich od 100 do 1000-krotnie więcej w porównaniu z wodą morską [9, 21]. Z kolei w wodach głębinowych, colifagi somatyczne występują znacznie rzadziej. W badaniach prowadzonych w krajach takich jak Kanada, Argentyna, Kolumbia, Francja, Hiszpania, Korea czy USA fagi te były izolowane w 8,7–53,6% próbek pochodzących ze studni i ujęć głębinowych [1, 21, 23, 30, 35, 37]. Jak wykazali Sinton i wsp. [58, 59] tempo inaktywacji colifagów somatycznych rośnie wraz ze wzrostem zasolenia. Gdy hodowle prowadzono bez dostępu światła, tempo rozpadu cząstek colifagów somatycznych było 5,5-krotnie wyższe w wodzie słonej w porównaniu z wodą z rzeki, podczas gdy dla F-specyficznych colifagów RNA tempo rozpadu było 3,1-krotnie wyższe w tych samych warunkach. Gdy badania prowadzono w warunkach dostępu do światła słonecznego, tempo rozpadu colifagów somatycznych wzrastało 2,3-krotnie w wodzie słonej w porównaniu z wodą pochodzącą z rzeki. W tych samych warunkach, odnotowane tempo rozpadu kapsydów colifagów F-RNA było wyższe 1,4-krotnie. Powyższe wyniki wskazują. że colifagi somatyczne są bardziej wrażliwe na zasolenie w porównaniu z F-specyficznymi colifagami RNA.
Do istotnych czynników wpływających na stabilność fagów jest pH środowiska. W badaniach nad stabilnością faga T7 inkubowanego w buforach o pH od 3 do 11 zaobserwowano, że najbardziej stabilny jest, gdy wartość pH wynosi od 6 do 8. Fag T7 inkubowany przez 2 tygodnie w buforze fosforanowym o pH = 7, w temperaturze 0,5–2°C, utracił 20% swojej początkowej aktywności, czego wynikiem było obniżenie miana faga. Gdy wartość pH spadła poniżej 4, już po 96 godz. fag ten utracił niemal całkowicie zdolność do infekcji, a po inkubacji w buforach o pH < 3, przez 1 godzinę, w ogóle nie wykryto aktywnych cząstek wirusa. Inkubacja faga T7 w buforach o wyższym pH wykazała, że przy pH = 9.0 fag wykazywał 30% początkowej aktywności, tracąc ją niemal całkowicie po 24 godz. inkubacji w buforze o pH > 10 [22, 24]. W innych badaniach, fag T2 był stabilny w pH od 5 do 9, a najwyższą stabilność wykazywał przy pH w zakresie 5–6 [22, 56]. Z kolei Jepson i March (2004) badali aktywność faga λ w pH w zakresie 2–14. Po 24 godz. inkubacji w temperaturze pokojowej, badacze nie zauważyli znaczącego spadku miana faga przy pH w zakresie 3–11. Natomiast przy pH = 2.0 oraz powyżej wartości 11.8, fag λ tracił całkowicie swoją aktywność [20, 22]. Z kolei Kłak i wsp. (2010) badali wpływ pH na faga T4, prowadząc inkubację w buforach o pH w zakresie 1.1–9.2 w temperaturze 37°C, przez 1 godz. Stwierdzono, że optymalne pH wynosiło 6.0–7.4. Miano faga było o 50% niższe, gdy inkubację prowadzono w buforze o pH = 9.2, natomiast całkowitą aktywność fag utracił podczas inkubacji w pH = 4.0 [22, 25].
Colifagi somatyczne są przez wielu autorów uznawane jako organizmy użyteczne w celu oceny skuteczności procesów oczyszczania wody i ścieków [15, 19, 50]. Colifagi, lepiej niż kałowe bakterie wskaźnikowe naśladują utrzymywanie się patogennych wirusów w środowisku i podczas procesu oczyszczana wody oraz ścieków. Redukcja wirusów jelitowych człowieka oraz colifagów może przebiegać w podobny sposób na różnych etapach procesu oczyszczania ścieków [15, 19, 50, 64]. Według wielu doniesień, colifagi somatyczne przewyższają liczbą colifagi F-RNA w ściekach nieoczyszczonych oraz oczyszczonych [3, 14, 17, 18]. Ze względu na złożoność i wieloetapowość procesu oczyszczania ścieków, trudno jest wyciągnąć wnioski na podstawie publikowanych wyników badań, które nie dostarczają informacji co do specyfiki badanej matrycy oraz o warunkach procesu (np. pH, temperatura, dawka UV, stężenie lub forma stosowanego chloru itp.). Według danych z piśmiennictwa oczyszczanie ścieków z wykorzystaniem osadu czynnego pozwala na redukcję liczby colifagów somatycznych o 2–2,4 log10 [3, 50]. Natomiast stosując filtrację (m.in. z użyciem filtrów piaskowych, antracytowych czy antracytowo-piaskowych) odnotowano redukcję o ok. 0,5 log10. Dezynfekcja ścieków środkami na bazie chloru oraz stosowanie promieniowania UV skutkowała redukcją o ok. 0,5 log10 [50]. Porównując poziom redukcji liczby (log10) na różnych etapach oczyszczania ścieków, colifagi (w tym somatyczne), wykazywały wartości bliskie enterowirusom (ok. 3–4 log10), podczas gdy bakteryjne wskaźniki zanieczyszczenia kałowego redukowane były na poziomie 5–6 log10 [50]. Według raportu z badań przeprowadzonych przez Rose i wsp. (2004), poziom zanieczyszczenia colifagami i wirusami w próbkach pobranych ze ścieków wpływających do sześciu analizowanych oczyszczalni nie był znacząco różny. Z kolei poziom zanieczyszczenia colifagami w próbkach ścieków wypływających z oczyszczalni, różnił się w zależności od stosowanych w danej oczyszczalni technologii [50]. Chociaż nie zaobserwowano korelacji między stężeniem colifagów i enterowirusów w oczyszczonych próbkach, autorzy stwierdzili, że w oparciu o poziom colifagów można wykluczyć obecność enterowirusów. Poziomy poniżej 10 pfu/100 ml (zarówno colifagów F-RNA lub colifagów F-RNA w połączeniu z colifagami somatycznymi) wskazywały, że w próbkach tych nie były wykrywane enterowirusy [50].
Wirusy są obligatoryjnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi i mogą replikować się tylko w żywych komórkach gospodarza, powodując ich lizę. Właściwość ta leży u podstawy metod hodowlanych do oznaczania bakteriofagów, w tym colifagów somatycznych. Metody hodowlane są powszechnie stosowane ze względu na łatwość wykonania, niezawodność, niskie koszty i brak konieczności posiadania szczególnego wyposażenia laboratorium. Wadą ich jest to, że są pracochłonne, a wynik otrzymywany jest w czasie dłuższym niż jeden dzień roboczy. Dodatkowo badania próbek wody o dużych objętościach oraz próbek o niskiej liczbie fagów mogą wymagać przeprowadzenia dodatkowego etapu – zatężania. Alternatywnie możliwe jest zastosowanie coraz bardziej powszechnych szybkich testów, które są mniej pracochłonne, nie wymagają wstępnego zatężania próbek i umożliwiają uzyskanie wyników w krótszym czasie.
Metody hodowlane stosowane do badań bakteriofagów, w tym colifagów somatycznych pozwalają na oznaczenie ich liczby (metody ilościowe) lub wykrycie obecności (metody jakościowe) w badanej próbce wody.
Metody ilościowe oparte są tzw. teście łysinkowym, opisanym już w 1959 roku [2]. Polega on na przygotowaniu mieszaniny badanej próbki, hodowli bakterii wrażliwych na faga i półpłynnego agaru. Mieszaninę przenosi się następnie na płytkę Petriego w celu zestalenia. Po inkubacji w temperaturze optymalnej dla wzrostu komórek gospodarza, w przypadku obecności fagów w badanej próbce, ich obecność wyrażana jest w postaci przejaśnień – łysinek na powierzchni murawy szczepu gospodarza [2]. Wyniki badań przedstawiane są jako liczba jednostek tworzących łysinki pfp – plaque forming particles) [11] lub pfu (plaque forming units) [11, 14] w objętości próbki. Colifagi są różnorodną grupą wirusów, które tworzą łysinki o różnej morfologii i średnicy od 1 do 10 mm [14]. Dodatkowym utrudnieniem w odczycie może być specyfika próbki i obecność mikroflory towarzyszącej. Do ułatwienia wizualizacji łysinek może być stosowany TTC (chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoliowy) nadający komórkom gospodarza kontrastowe różowe zabarwienie [45]. Metoda łysinkowa występuje w dwóch wariantach: SAL (single agar layer) – metoda płytek jednowarstwowych [14] i DAL (double agar layer) – metoda płytek dwuwarstwowych [11]. Różnica pomiędzy nimi polega na dodatkowej warstwie podłoża stałego pod warstwą półpłynnego agaru w metodzie DAL. Warstwa ta ma za zadanie zapewnienie bardziej stabilnego podłoża dla warstwy półpłynnego agaru. Metody jakościowe składają się z dwóch etapów: etapu namnażania i etapu testu kropelkowego. Metody te mogą być stosowane również w formacie NPL (najbardziej prawdopodobnej liczby), co umożliwia uzyskanie wyniku ilościowego.
Metody hodowlane mające zastosowanie do oznaczania colifagów somatycznych w wodzie przeznaczonej do spożycia przez ludzi to rekomendowane obecnie przez dyrektywę UE [10] metody znormalizowane EN-ISO 10705-2:2000 [11] i EN-ISO 10705-3:2003 [12]. Na metodach hodowlanych opierają się także protokoły US EPA (
Metody rekomendowane do oznaczania colifagów somatycznych w próbkach wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi
| Metoda | Parametr/zastosowanie | Matryca | Rodzaj metody | Objętość próbki | Czułość | Czas uzyskania wyniku |
|---|---|---|---|---|---|---|
| colifagi somatyczne | wszystkie rodzaje wody, osady, ścieki ekstrakty z mięczaków | jakościowa ilościowa | 1 ml | 1 pfu/objętość | 24–48 godz. | |
| walidacja i przykłady metod zatężania bakteriofagów | wszystkie rodzaje wody | nie dotyczy | zależnie od metody zatężania | zależnie od metody zatężania | zależnie od metody zatężania | |
| colifagi somatyczne, F-specyficzne bakteriofagi RNA | wody podziemne, inne rodzaje wody | jakościowa | 100 ml | 1 pfu/objętość | 24–48 godz. | |
| colifagi somatyczne, F-specyficzne bakteriofagi RNA | wody podziemne, inne rodzaje wody | ilościowa | 100 ml | 1 pfu/objętość | 24 godz. |
Metoda opisana w normie EN-ISO 10705-2:2000 [11] przeznaczona jest do badania wszystkich rodzajów wód oraz osadów i ścieków. Umożliwia oznaczenia ilościowe i jakościowe colifagów somatycznych. Norma wskazuje różne szczepy bakteryjnego gospodarza w zależności od specyfiki badanych próbek. Dla próbek o małej liczbie bakterii gospodarzem jest szczep
Przedstawiona w normie metoda ilościowa oparta jest na metodzie płytek dwuwarstwowych DAL. Objętość próbki badanej wynosi 1 ml lub 5 ml dla próbek o niskiej liczbie fagów. Wyniki uzyskiwane są w czasie około 24 godzin i przedstawiane jako liczba pfp lub pfu w określonej objętości próbki. W przypadku oznaczeń jakościowych wynik uzyskiwany jest w czasie około 48 godz. i odczytywany jest jako obecne/nieobecne w 1 ml. W obu przypadkach możliwe jest badanie próbek o większej objętości, ale konieczne jest wtedy zastosowanie większych objętości pożywek.
Niekiedy bakteriofagi w wodzie mogą być obecne w zbyt niskich stężeniach, aby można było je oznaczać za pomocą bezpośredniej analizy. W takich przypadkach badanie próbek wody w ich kierunku może być procesem wieloetapowym obejmującym etap zatężania, po którym dopiero następuje właściwy etap oznaczania ilościowego [69]. W przypadku metody ilościowej dla próbek o bardzo niskiej liczbie fagów norma wskazuje na konieczność wstępnego zatężania badanych próbek. Również w przypadku próbek o dużej objętości zalecane jest ich zatężanie. Etap zatężania próbek wydłuża dodatkowo całkowity czas potrzebny na uzyskanie wyniku, przy czym jest on różny w zależności od zastosowanej metody zatężania [12]. Ważnym aspektem badania jest wpływ procesu zatężania próbek wody na odzysk bakteriofagów. Poziom odzysku zależy od wielu czynników takich jak metoda zatężania, rodzaj próbki wody (m.in. mętność, poziom zanieczyszczenia), objętość próbki, ilość i różnorodność bakteriofagów w próbce [38]. Etap zatężania został opisany w EN-ISO 10705-3:2003, która określa ogólne zasady oceny przydatności metod zatężania bakteriofagów do danego celu, rodzaju i objętości próbek wody. Norma podaje przykłady metod zatężania, które mogą być stosowane dla wszystkich rodzajów wód, pod warunkiem, że pozwala na to ich specyfika (ilość i charakter zawiesin i substancji rozpuszczonych). Jedną z metod zatężania opisanych w EN ISO 10705-3:2003 jest metoda filtracji membranowej. Metoda ta jest rekomendowana dla zatężania F-specyficznych bakteriofagów RNA w próbkach o objętości 100–1000 ml i mętności < 2 NTU. Dane literaturowe wskazują, że metoda ta może być z powodzeniem wykorzystywana także do zatężania colifagów somatycznych, a ich odzysk osiągany jest na poziomie nieco ponad 80% [37]. W przypadku colifagów somatycznych dobre wyniki zatężania mogą być uzyskiwane również innymi wariantami metody filtracji membranowej [14, 19, 38, 55, 57]. W przypadku próbek o mętności > 2 NTU do zatężania colifagów somatycznych może mieć zastosowanie metoda flokulacji wodorotlenkiem magnezu [12].
Protokół EPA 1602 [14] przedstawia metodę ilościową płytek jednowarstwowych SAL, z kolei protokół EPA 1601 [13] dwuetapową metodę jakościową. Protokoły te przeznaczone są do oznaczania F-specyficznych bakteriofagów RNA oraz colifagów somatycznych. Mogą być stosowane do badania wód podziemnych i innych, przy czym ich walidacja została przeprowadzona tylko dla wód podziemnych. Metoda jakościowa EPA 1601 może być stosowana dodatkowo w formacie NPL, jednak nie została pod tym względem zwalidowana. Gospodarzem bakteryjnym dla colifagów somatycznych jest oporny na kwas nalidyksowy szczep
Alternatywą dla oznaczania colifagów somatycznych klasycznymi metodami hodowlanymi mogą być tzw. szybkie testy. Testy te mogą być oparte na znormalizowanych metodach ISO i EPA. Umożliwiają one oznaczenia jakościowe oraz ilościowe colifagów somatycznych [6, 27, 39, 49, 52, 53]. Ich zastosowanie może obejmować różne matryce, w tym wodę, ścieki i osady. W zależności od rodzaju testu, celu badania i specyfiki próbek, szybkie testy umożliwiają badanie różnych objętości: 1 ml, 10 ml i 100 ml. Czas uzyskania wyników to od kilku do 24 godzin. Trwają prace nad kolejnymi formułami testów umożliwiającymi badanie próbek o objętości 100 ml oraz rozwiązaniami redukującymi czas przygotowania hodowli gospodarza, mającymi bezpośrednie przełożenie na otrzymanie wyników w jeszcze krótszym czasie [47]. Ze względu na różnorodność colifagów somatycznych pewne trudności sprawia zastosowanie do ich oznaczania metod molekularnych i serologicznych. Metody molekularne oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) mogą być wykorzystywane do oznaczania całej subgrupy colifagów lub tylko F-specyficznych bakteriofagów RNA. Metody serologiczne znajdują zastosowanie do wykrywania F-specyficznych bakteriofagów RNA [15]. Prowadzone są również badania w zakresie zastosowania tych metod do badań colifagów somatycznych, a ich wyniki są obiecujące [28]. Warto podkreślić, że prowadzone są badania, których celem jest opracowanie powszechnie akceptowanych standardów i wytycznych dotyczących zatężania i oznaczania fagów, w tym colifagów somatycznych w środowiskach wodnych.
Największe ryzyko zagrożenia dla zdrowia ludzi związane z wodą pochodzi od patogenów kałowych, przenoszonych na skutek nieodpowiednich warunków sanitarnych, braku higieny i ochrony ujęć wody. Patogeny bytujące w wodzie (m.in. wirusy, bakterie, pierwotniaki) mogą powodować poważne i długotrwałe skutki zdrowotne. Głównym celem stosowania wskaźników mikrobiologicznych do oceny jakości wody, jest wskazanie na obecność organizmów patogennych, przede wszystkim pochodzenia kałowego. Obecnie ocena jakości wody do picia pod względem mikrobiologicznym oparta jest przede wszystkim na analizie parametrów bakteriologicznych [29]. O ile wskaźniki bakteryjne takie jak
Przeprowadzona analiza wyników badań opublikowanych w latach 1999–2019, potwierdziła korelację między występowaniem w wodzie wirusów jelitowych i colifagów somatycznych lub colifagów F-RNA [27]. Wśród analizowanych badań, między innymi praca Skraber i wsp. (2004) potwierdziła korelację między obecnością colifagów somatycznych, a występowaniem enterowirusów i norowirusów w wodzie powierzchniowej. Podobnie Mocé-Llivina i wsp. (2005) wykazali korelację między obecnością colifagów somatycznych i enterowirusów w próbkach wody pobranych z rzek, zanieczyszczonych ściekami. Również Lodder i wsp. (2010) w badaniach prowadzonych na ujęciach wody do picia opartych na rzekach, wskazał na korelację między występowaniem enterowirusów oraz colifagów somatycznych i colifagów F-RNA. W przypadku tych badań nie stwierdzono jednak takiej zależności pomiędzy colifagami somatycznymi a innymi wirusami jelitowymi (reowirusami, norowirusami, czy też rotawirusami).
Wśród najważniejszych cech colifagów somatycznych jako organizmów wskaźnikowych można wymienić: podobieństwo do kontrolowanych patogenów (m.in.: budowa, występowanie, wrażliwość na procesy uzdatniania i środki dezynfekcyjne), brak zdolności do namnażania się w wodzie i dostępność prostych metod badawczych, pozwalających uzyskać wiarygodne wyniki w krótkim czasie [8, 11, 13, 14, 18, 66].
Colifagi somatyczne, przypominają ludzkie wirusy jelitowe pod względem pochodzenia i uwalniania się do środowiska. Podobnie jak wirusy jelitowe mogą replikować się tylko w komórkach gospodarza [8]. W przypadku colifagów są to komórki bakterii
Zapewnienie odpowiedniej ochrony ludzi przed patogenami jelitowymi, w szczególności wirusami i pierwotniakami pasożytniczymi, które mogą występować w wodzie do picia wiąże się z koniecznością wprowadzenia dodatkowych wymagań do zaleceń i przepisów prawnych dotyczących tego obszaru. Na ten aspekt zwracają uwagę również eksperci WHO w rekomendacjach z 2017 r., które są wsparciem dla przeglądu załącznika I do dyrektywy Rady 98/83/WE w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi [67]. Opracowanie to wskazuje na potrzebę włączenia innych mikroorganizmów, między innymi takich jak bakteriofagi (colifagi somatyczne, F-specyficzne bakteriofagi RNA) jako bardziej odpowiednich do identyfikacji zagrożeń mikrobiologicznych, które mogą być nie wykryte przez dotychczas stosowane wskaźniki.
Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2020/2184 z dnia 16 grudnia 2020 r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi, wprowadza colifagi somatyczne jako dodatkowy wskaźnik do programu monitoringu operacyjnego, przy czym zwraca uwagę, że powinno to następować w odniesieniu do lokalnych okoliczności i wiedzy naukowej. Okoliczności takie mogą obejmować na przykład wykorzystywanie wody z ujęć zanieczyszczonych wirusami jelitowymi i pasożytami lub przypadki podejrzenia wystąpienia tego typu zanieczyszczenia na skutek dopływu ścieków zawierających odchody ludzkie lub ścieków pochodzących od zwierząt hodowlanych. Wartość dopuszczalna dla colifagów somatycznych w wodzie surowej wynosi 50 pfu w 100 ml. Według zapisów w dyrektywie parametr ten powinien być oznaczany w uzasadnionych przypadkach wynikających z oceny ryzyka. W przypadku wykrycia colifagów somatycznych w wodzie surowej w stężeniach powyżej 50 pfu/100 ml, wskazane jest przeprowadzenie analizy procesów na kolejnych etapach uzdatniania, aby oznaczyć wartość logarytmiczną usuwania colifagów przez występujące bariery oraz ocenić, czy ryzyko przedostania się wirusów chorobotwórczych zostało w wystarczającym stopniu zredukowane [10].
Wprowadzenie badań colifagów somatycznych w wodzie powinno stanowić uzupełnienie informacji pozyskanych w oparciu o wyniki badań parametrów bakteryjnych i dawać dodatkowe potwierdzenie, że procesy uzdatniania oraz dezynfekcji spełniają swoją rolę. Jednocześnie oznaczanie tego dodatkowego parametru może być istotnym krokiem w zwiększeniu bezpieczeństwa wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi.
Metody rekomendowane do oznaczania colifagów somatycznych w próbkach wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi
| Metoda | Parametr/zastosowanie | Matryca | Rodzaj metody | Objętość próbki | Czułość | Czas uzyskania wyniku |
|---|---|---|---|---|---|---|
| colifagi somatyczne | wszystkie rodzaje wody, osady, ścieki ekstrakty z mięczaków | jakościowa ilościowa | 1 ml |
1 pfu/objętość | 24–48 godz. | |
| walidacja i przykłady metod zatężania bakteriofagów | wszystkie rodzaje wody | nie dotyczy | zależnie od metody zatężania | zależnie od metody zatężania | zależnie od metody zatężania | |
| colifagi somatyczne, F-specyficzne bakteriofagi RNA | wody podziemne, inne rodzaje wody | jakościowa | 100 ml |
1 pfu/objętość | 24–48 godz. | |
| colifagi somatyczne, F-specyficzne bakteriofagi RNA | wody podziemne, inne rodzaje wody | ilościowa | 100 ml | 1 pfu/objętość | 24 godz. |
Przedstawiciele i charakterystyka colifagów
| Przykład | Typ | Rodzina | Kwas nukleinowy | Budowa |
|---|---|---|---|---|
| T2, T4 | Colifagi somatyczne | dsDNA | Ogonek składający się z wewnętrznej struktury rdzeniowej otoczonej kurczliwą osłonką | |
| λ, T1 | Colifagi somatyczne i bakteriofagi |
dsDNA | Długi, niekurczliwy ogonek, bez otoczki | |
| P22 | Colifagi somatyczne | dsDNA | Krótki, niekurczliwy ogonek, bez otoczki | |
| phiX174 | Colifagi somatyczne | dsDNA | Bez otoczki, izometryczny | |
| PR772 | F-specyficzne bakteriofagi DNA | dsDNA | Brak ogonka, sześcienny kapsyd bez otoczki | |
| MS2, Qβ | F-specyficzne bakteriofagi RNA | ssRNA | Bez otoczki, izometryczny | |
| M13 | F-specyficzne bakteriofagi DNA | ssDNA | Bez otoczki, pałeczkowaty |