Biotechnological And Biomedical Applications Of Fungal Cellobiose Dehydrogenase

Zdolność dehydrogenazy celobiozowej do wytwarzania nadtlenku wodoru przy udziale tlenu cząsteczkowego jako akceptora elektronów uczyniła ten enzym bardzo interesującym kandydatem do opracowywania systemów antybakteryjnych, zapobiegających kolonizacji implantów lub cewników moczowych poprzez hamowanie tworzenia biofilmów [49]. Nadtlenek wodoru to związek, który już w niskich stężeniach rzędu 0,25–3% wykazuje właściwości antyseptyczne i dezynfekujące. Działa on na bakterie m.in. poprzez peroksydację i przerwanie błony komórkowej, utlenianie nukleozydów, hamowanie syntezy białek oraz inhibicję enzymów. Następstwem tych zjawisk jest śmierć komórki [58]. Niewątpliwą zaletą H₂O₂ jest jego niska stabilność w roztworze, która pozwala na precyzyjną lokalizację jego działania. Aktywność systemu wytwarzania H₂O₂ z udziałem CDH może być kontrolowana przez podawanie do środowiska reakcji odpowiedniego substratu. Co więcej wydajność powyższego układu wykazuje stechiometryczną zależność tzn. podanie do układu 2 mM celobiozy powoduje wytworzenie 2 mM nadtlenku wodoru. Prowadzone badania dowodzą, że całkowite zahamowanie wzrostu drobnoustrojów z gatunku Escherichia coli i Staphylococcus aureus można osiągnąć poprzez dodanie do układu 0,8 mM celobiozy, zaś 50% redukcja zachodzi na poziomie odpowiednio 0,25 mM dla E. coli i 0,19 mM dla S. aureus [59]. W ostatnich latach przeprowadzono badania nad możliwym zastosowaniem dehydrogenazy celobiozowej do wytwarzania nadtlenku wodoru, dezynfekującego cewniki moczowe. Są one standardowymi narzędziami medycznymi stosowanymi na całym świecie. Obecnie przeprowadza się u pacjentów częstą wymianę cewników, co powoduje znaczne niedogodności i zwiększa koszty opieki zdrowotnej. Infekcje cewników powodowane są głównie przez drobnoustroje z rodzaju Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Acinetobacter i Enterobacter, które przylegają do powierzchni cewnika w złożonym biofilnie [60]. Badania wykazały, że rekombinacyjnie wytwarzany w Pichia pastoris CDH z Myriococum thermophilum całkowicie hamuje wzrost E. coli i S. aureus zarówno w ciekłym, jak i stałym podłożu, gdy jest ono uzupełnione o 0,8 mM lub 2 mM roztwór celobiozy. W ten sam sposób wzbogacając układ w 1 mM roztwór celobiozy możemy hamować tworzenie się biofilmu na foliach silikonowych. System CDH/celobioza skutecznie hamował wiele mikroorganizmów kolonizujących cewniki, w tym lekooporne szczepy S. aureus, Staphylococcus epidermidis, Proteus mirabilis, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii i Pseudomonas aeruginosa. Co ciekawe, CDH utleniał również zewnątrzkomórkowe polisacharydy (exPS) wytwarzane przez mikroorganizmy, generując nadtlenek wodoru w układzie nie zawierającym celobiozy. Produkcja H₂O₂, a w konsekwencji właściwości przeciwdrobnoustrojowe i antybiofilmowe, wzmocnione zostały przez włączenie do systemu hydrolaz glikozydowych, takich jak α-amylazy. Przeprowadzały one hydrolizę polisacharydów, zwiększając liczbę końcowych substratów dla CDH i destabilizowały strukturę biofilmu [49]. Aby przetestować skuteczność tego systemu w środowisku medycznym zespół badawczy profesora G.S. Nyanhongo wyizolował bakterie powszechnie zasiedlające cewniki, a następnie inkubował je z CDH w obecności celobiozy. Testy in vitro wykazały, że układ zawierający 10 mM roztwór wymienionego wyżej dwucukru i CDH, całkowicie eliminuje S. aureus i A. baumannii oraz intensywnie hamuje wzrost S. epidermidis i S. maltophilia. Badane szczepy bakteryjne, podobnie jak większość organizmów tlenowych, posiadały zdolność do syntezy katalazy, enzymu rozkładającego H₂O₂. Oznacza to, że były one wyposażone w czynnik oporności, który czynił te szczepy niewrażliwymi na nadtlenek wodoru. Wykorzystywanie celobiozy jako substratu w reakcji wytwarzania nadtlenku wodoru z udziałem CDH jest również bardzo korzystne z medycznego punktu widzenia, gdyż cukier ten nie należy do łatwo przyswajalnych źródeł węgla dla mikroorganizmów. Dzięki temu możemy już w pewien sposób ograniczać ich wzrost. Ponadto CDH może wykorzystywać również inne substraty, takie jak oligoi polisacharydy obecne w systemach biomedycznych [59]. Daje nam to możliwość dostosowania rodzaju substratów reakcji do typu środowiska. Zjawisko powstawania biofilmu odgrywa ogromną rolę we współczesnej walce człowieka z patogennymi mikroorganizmami. Stopień ekspansywności tej struktury bakteryjnej obrazuje fakt, iż 80% wszystkich zakażeń drobnoustrojami ma związek z powstaniem biofilmu [61]. Jego wytworzenie sprawia, że konwencjonalne środki przeciwdrobnoustrojowe stają się nieskuteczne. Proces ten zachodzi według następującego schematu: odwracalne przyłączenie bakterii do powierzchni, nieodwracalna adhezja, wzrost i podział bakterii, tworzenie zewnętrznej osłonki i powstanie biofilmu, nabycie przez biofilm struktury trójwymiarowej [62]. Główną funkcją biofilmu jest ochrona drobnoustrojów przed negatywnym wpływem środowiska zewnętrznego [63]. Mikroorganizmy tworzące biofilm są bardziej oporne na antybiotykoterapię i trudniejsze do usunięcia. Z tego względu zapobieganie powstawaniu biofilmu jest kluczowe dla udanej strategii walki z infekcjami wywoływanymi przez mikroorganizmy zasiedlające powierzchnię biomateriałów medycznych [49]. Biofilmy oporne na antybiotykoterapię stają się źródłem ciągle nawracających i przewlekłych zakażeń. Dzieje się tak dlatego, że bakterie żyjące wewnątrz tej struktury są dobrze chronione przed środkami bójczymi, które mają ograniczony dostęp do patogenów. Dochodzi do powstawania opornych fenotypów oraz modyfikacji mikrośrodowiska [64]. Jednym z rozwiązań, które możemy zastosować do walki z biofilmami, jest unieruchomienie na powierzchni chronionych struktur enzymów, które dzięki swoim właściwościom zdolne są do zakłócania ważnych dla komórek bakteryjnych procesów, hamowania ich wzrostu i podziału oraz niszczenia składników niezbędnych do osiągnięcia przez biofilm stabilności [51]. Badacze z zespołu profesora G.S. Nyanhongo przyłączyli dehydrogenazę celobiozową do powierzchni cewników moczowych wykonanych z polidimetylosiloksanu (PDMS) i obserwowali wpływ enzymu na proces tworzenia się biofilmów [59]. Enzym CDH wbudowany został w środek poślizgowy, tradycyjnie stosowany w celu zminimalizowania dyskomfortu podczas cewnikowania [49]. Badania wykazały, że immobilizowany enzym był w stanie zakłócać wczesne etapy powstawania biofilmu (próba na S. aureus). Żywotność komórek bakteryjnych w tym układzie była o 70% niższa niż tych pochodzących z próby kontrolnej, a całkowita biomasa zdeponowana na powierzchni cewników zmniejszyła się o 30%. Inny eksperyment pokazuje, że antybiofilmowe działanie CDH aktywne jest przez dłuższy czas, gdyż po tygodniu umieszczona na cewnikach biomasa bakteryjna zmniejszyła się o 70% [50]. Badania te pokazują, że dehydrogenaza celobiozowa jest enzymem, który w efektywny sposób może być wykorzystywany w takich aplikacjach jak systemy antybiofilmowe i komponenty biomateriałów.

Rany przewlekłe, stanowiące poważny problem zdrowotny, definiuje się jako trudne do wyleczenia i pozostające w fazie zapalnej przez nieprzewidywalny czas. Dużą przeszkodą pojawiającą się podczas próby ich leczenia jest ciągłe uwalnianie proteaz, wolnych rodników, w tym reaktywnych form tlenu (ROS) i reaktywnych form azotu (RNOS) oraz duże ilości wysięków sprzyjających zakażeniom mikrobiologicznym. W ostatnich latach zespół profesora Nyanhongo opracował hydrożel na bazie CDH, który może zrewolucjonizować sektor opatrunków medycznych [65]. Skonstruowano go poprzez włączenie związku fenolowego – katecholu (pełniącego funkcję przeciwutleniacza) i celobiozy do hydrożelu (alginianu i/lub żelatyny), tworząc w ten sposób wielofunkcyjny polimer pomocny w leczeniu chronicznych ran. Hydrożele te wspomagają proces gojenia w dwojaki sposób. CDH włączony do hydrożelu regeneruje cyklicznie przeciwutleniacze po tym, jak zostają one zużyte w procesie neutralizacji wolnych rodników. Równocześnie ciągła produkcja H₂O₂ hamuje rozwój mikroorganizmów i odkaża ranę. Wyniki badań wskazują, że opatrunki te mogą całkowicie zahamować wzrost S. aureus, Cellulosimicrobium cellulans, Bacillus subtilis oraz Pseudomonas putida, umożliwiając tym samym sprawne gojenie się rany [59].

Kwasy aldonowe, zwane także kwasami cukrowymi, to związki, które znajdują szerokie zastosowania biomedyczne. Wykorzystywane są między innymi jako środki nawilżające i bioaktywne w medycynie, a w transplantologii jako składniki roztworów do przechowywania narządów przygotowanych do przeszczepów. Z nich także w przemyśle farmaceutycznym i chemicznym syntetyzuje się biokompatybilne i biodegradowalne systemy dostarczania leków [66]. Proces ich syntezy prowadzony w sposób tradycyjny jest źródłem wielu nieprzyjaznych dla środowiska substancji takich jak wodorotlenki bromu, miedzi lub srebra [67], dlatego tak ważne jest opracowanie alternatywnych metod ich otrzymywania. Jednym z powszechnie używanych związków z tej grupy jest kwas laktobionowy (LBA). Związek ten jest obecnie najbardziej rozpowszechnionym składnikiem systemów chłodniczych stosowanych do stabilizacji narządów przed przeszczepem. Znajduje również zastosowanie w kosmetologii jako środek do wygładzania zmarszczek, ogólnej pielęgnacji skóry i jej wytworów [68, 69]. Jego syntezę można przeprowadzić z udziałem CDH, która w temperaturze 25–50°C biotransformuje laktozę w laktono-δ-lakton, ulegający spontanicznej hydrolizie w roztworach wodnych do LBA. W tych warunkach po 2,5 godz. inkubacji zachodzi 100% przekształcenie wyjściowego cukru w kwas laktobionowy [70]. Enzymatyczne utlenianie laktozy jest znacznie wydajniejsze niż procesy chemicznego otrzymywania LBA [71]. Dehydrogenaza celobiozowa wykazuje jak dotąd najwyższą selektywność (na poziomie 100%) i wydajność (95%) spośród dotychczas testowanych enzymów [72]. Zapewnia to duży spadek kosztów procesu oraz oszczędność czasu.

Celobioza będąca naturalnym substratem dla CDH utleniana jest przez ten enzym do kwasu celobionowego. Związek ten jest wysoce higroskopijny. Właściwość ta została wykorzystana do produkcji nawilżających skórę matryc żelowych. W obecności tego enzymu zachodzą również reakcje utleniania pochodnych celulozy zawierających grupy aminowe, acetamidowe i azydowe [73]. Związki te badane są pod kątem wykorzystania jako biomedyczne systemy dostarczania leków oraz prekursory podczas syntezy substancji pomocniczych w farmakologii [74].

Prebiotyk określa się jako substrat selektywnie wykorzystywany przez mikroorganizmy gospodarza, zapewniający mu korzyści zdrowotne. Termin ten może być stosowany tylko wtedy, gdy korzystny wpływ na zdrowie związany jest z modulacją mikrobioty w określonej lokalizacji [75]. Do substancji prebiotycznych zaliczamy m.in. galakto-oligosacharydy (GOS) będące złożonymi mieszaninami różnych cukrów wytwarzanych poprzez transgalaktozylacje laktozy przy użyciu enzymu β-galaktozydazy [76]. Szczególnie stymulują one wzrost bakterii z grup Bifidobacteria i Lactobacillus. Przyczynia się to do zwiększonego wchłaniania minerałów przez organizm ludzki, hamowania rozwoju patogenów oraz modulacji układu odpornościowego. Jednakże komercyjne GOS-y zawierają w swoim składzie jednostki galaktolaktozy, co stanowi duży problem, ponieważ obecnie około 70% populacji światowej cierpi na niedobór β-galaktozydazy w jelicie cienkim [77]. Defekt ten powoduje zwiększoną wrażliwość na laktozę, której usunięcie z GOS jest trudne i nieopłacalne [59]. Aby rozwiązać ten problem możemy wykorzystać zdolność CDH do biotransformacji laktozy w LBA omówioną w poprzednim podrozdziale. Kwas laktobionowy wytworzony z laktozy w obecności CDH zostaje następnie usunięty z preparatu za pomocą chromatografii jonowymiennej [5].

Dehydrogenazy celobiozowe to wszechstronne biokatalizatory, zdolne do wykrywania węglowodanów, a także chinonów i katecholamin. Biosensory oparte na CDH znalazły swoje zastosowanie w wielu różnych dziedzinach biotechnologii, technologii żywności, rolnictwie, ochronie zdrowia, medycynie czy monitorowaniu zanieczyszczeń [82]. W zależności od źródła z jakiego oczyszczono białko, specyficzne właściwości katalityczne enzymu umożliwiają utlenianie różnych substratów, a zatem użycie różnych analitów w zakresie zastosowań biosensora. Klasa I CDH, syntetyzowana przez grzyby należące do Basidiomycota, wykazuje bardzo wysoką specyficzność w stosunku do substratów połączonych wiązaniem β-1,4-glikozydowym, a zatem są to idealne biokomponenty do wykrywania celobiozy i laktozy [83]. Pierwszy biosensor zawierający CDH skonstruowano na początku lat dziewięćdziesiątych w grupie badawczej Lindquista, na bazie węgla szklistego, CDH (Phanerochaete chrysosporium) oraz osmu, oznaczając ilościowo zawartość celobiozy i laktozy [84]. Ze względu na wysoką toksyczność jonów osmu, praktyczne zastosowanie takiego układu było znacznie ograniczone. Jednakże potrzeba opracowania metody szybkiej detekcji laktozy w środkach spożywczych, wynikająca z coraz częstszych nietolerancji tego disacharydów społeczeństwie, doprowadziła do intensyfikacji badań. Poszukiwano nietoksycznych substancji łączących biokatalizator do powierzchni czujnika. Zastosowanie nanorurek węglowych w analizach elektrochemicznych, doprowadziło do przełomu w badaniach. Amperometryczne biosensory trzeciej generacji, o bardzo dużej czułości, bazujące na CDH z Trametes villosa lub Phanerochaete sordina zostały opracowane do zastosowań w przemyśle mleczarskim [32, 83].

Odkrycie CDH produkowanych przez Ascomycota, należących do klasy II, zdolnych do utleniania także monosacharydów, stworzyło możliwość zaprojektowania bioczujnika glukozowego opartego na dehydrogenazie celobiozowej. Określono właściwości katalityczne oraz profile pH kilku CDH, jednak najbardziej obiecujące, jako składnik biosensora glukozowego, okazały się enzymy z Corynascus thermophilus (CtCDH) [40, 41] i Myriococcum thermophilum (MtCDH) [44, 45], ze względu na zdolność do bezpośredniego przeniesienia elektronów (DET – direct electron transfer) w fizjologicznym dla człowieka pH [85].

Biosensory bazujące na elektrodzie grafitowej zmodyfikowanej CDH stosowane są także do prostego i szybkiego pomiaru zawartości związków fenolowych w środowiska [86]. Możliwe jest również monitorowanie stężenia katecholoamin będących prekursorami neurotransmiterów i hormonów, w medycynie przy leczeniu zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych [78].

Innym, ciekawym zastosowaniem CDH jako elementu detekcyjnego, jest konstrukcja tzw. elektronicznych języków (electronics tongues, ET). Są to systemy wieloczujnikowe wykorzystujące reakcje krzyżowe, które mogą przetwarzać sygnał za pomocą zaawansowanych metod matematycznych opartych na rozpoznawaniu wzorców i/lub wielowymiarowej analizie danych. Umożliwiają one interpretację kompozycji złożonych analitów oraz odróżnianie elementów pierwotnych od zakłócających [87]. Matryce czujnikowe, których sygnały analizowane są przez odpowiednie procedury numeryczne (tzw. elektroniczne języki) charakteryzuje odmienne w stosunku do klasycznej analizy chemicznej podejście. Zamiast oznaczania wybranych substancji w badanych próbkach, matryce najczęściej mają za zadanie określić cechy jakościowe próbek niezwiązane z jej pojedynczymi, analizowanymi oddzielnie składnikami. Dzięki temu możliwe jest na przykład określenie przydatności do spożycia, wartości odżywczej, odpowiedniego czasu leżakowania lub fermentacji. Z tego względu w ciągu ostatnich kilkunastu lat matryce czujnikowe z powodzeniem wykorzystywane były w szeregu aplikacji – od analizy żywności, przez monitoring środowiskowy i procesowy, do diagnostyki medycznej [88, 89]. Systemy ET oparte na cząsteczkach biologicznych, takich jak enzymy, nazywane są językami bioelektronicznymi (bioelectronics tongues, BioET). Zastosowanie CDH w BioET jest związane z dużą różnorodnością form enzymów pochodzących z różnych źródeł, która pozwala na dostosowanie systemu do wykrywania różnych analitycznie istotnych cukrów, takich jak np. laktoza, maltoza i celobioza. Istotna była również, niedawno odkryta zależność poziomu aktywności enzymu od obecności w środowisku kationów, a w szczególności Ca²⁺. Właściwość ta sprawia, że białka z klasy II, które są w większym stopniu regulowane przez Ca²⁺, mogą być używane do określania zawartości jonów wapnia w mleku. Dodatkowo wykorzystując reakcję krzyżową CDH różnego pochodzenia z laktozą i glukozą oraz interferującymi kationami Ca²⁺ można przeprowadzić rozdzielenie tych analitów [42].

Konstrukcja bioogniw paliwowych (biofuel cells, BFC) opartych na działaniu dehydrogenazy celobiozowej, to kolejna aplikacja wykorzystująca bioelektrochemiczne właściwości CDH. Enzym ten dzięki możliwości zarówno bezpośredniego (DET) jak i pośredniego (MET – mediated electron transfer) transferu elektronów, stał się interesującym składnikiem anodowej części bioogniwa paliwowego. Urządzenia te są w stanie przekształcić energię chemiczną w elektryczną przeprowadzając reakcje biochemiczne odbywające się za pomocą biokatalizatorów, katalizujących utlenianie biopaliwa i redukcję utleniacza [90]. Urządzenia zasilane bioogniwami mogą być w prosty sposób miniaturyzowane, dlatego ich potencjał aplikacyjny związany jest głównie z zasilaniem niewielkich wszczepialnych lub przenośnych urządzeń, także biomedycznych [91].

Początkowe prace nad zastosowaniem CDH w bioogniwach paliwowych oparte były na elektrodach grafitowych modyfikowanych zaadsorbowanym enzymem. Białka należące do klasy I CDH produkowane przez Phanerochaete chrysosporium [33, 45], Trametes villona [29, 35] i Dichomera saubinetii [43] oraz klasy II CDH z Myriococcum thermophilum [45] i Corynascus thermophilus [38] zostały użyte we wstępnych badaniach z laktozą i glukozą jako paliwem anodowym [83]. Przykładem takiego bioogniwa jest zaprojektowany przez Comana i wsp. [43] model bioogniwa paliwowego, w którym dehydrogenaza celobiozowa stanowi bioanodę, natomiast na katodzie immobilizowana jest lakaza. W ostatnich latach badania nad bioogniwami paliwowymi prowadzone są bardzo intensywnie, skutkując zgłoszeniami patentowymi obiecujących mikrosystemów stosowanych w dyscyplinach medycznych i inżynieryjnych. Wykazano możliwość tworzenia miniaturowych, samodzielnych biourządzeń zasilanych bioogniwem, w którym CDH unieruchomiono na anodzie a oksydazę bilirubinową (BOD) na katodzie. Ogniwo to umożliwia produkcję nowej generacji bezprzewodowych interfejsów neuronalnych znajdujących zastosowanie kliniczne. Używa się ich również w przeprowadzanych in vivo badaniach neurofizjologicznych. Dzięki połączeniu ogniwa i metody spektroskopii impedancyjnej (EIS) zademonstrowano sprzężenie indukcyjne między urządzeniem a neuronami mózgu szczura [85]. Kolejnym przykładem urządzeń zasilanych energią pochodzącą z BFC jest elektroniczna soczewka kontaktowa. Zastosowany w niej układ CDH/ BOD do wytwarzania prądu wykorzystuje glukozę i tlen rozpuszczone we łzach [92]. Ryc. 2

Ryc. 2.