Chitinases As The Key To The Interaction Between Plants And Microorganisms

Gleba jest środowiskiem życia wielu mikroorganizmów takich jak bakterie czy grzyby strzępkowe. Wśród nich są drobnoustroje patogenne, ale duża ich część wchodzi w symbiozę z roślinami [72]. Symbiotyczne mikroorganizmy stymulują wzrost roślin poprzez mechanizmy pośrednie i bezpośrednie. Do pośrednich mechanizmów promocji wzrostu zalicza się indukcję odporności oraz zwalczanie patogenów. Z kolei bezpośrednia promocja wzrostu polega na syntezie hormonów roślinnych, udostępnianiu roślinom żelaza, fosforu oraz azotu [8, 54, 70].

Rośliny bobowate mają zdolność do wytwarzania brodawek korzeniowych, w których znajdują się symbiotyczne bakterie (ryzobia), należące m.in. do rodzaju Rhizobium, Bradyrhizobium i Sinorhizobium [13, 59]. Kolonizacja powierzchni korzeni przez bakterie powoduje wydzielanie przez komórki korzeni flawonoidów. W odpowiedzi ryzobia wytwarzają oligosacharydy lipochityny określane jako czynniki brodawkowania – NF (Nod factors, nodulation factors). Zapoczątkowują one specyficzne odpowiedzi makroorganizmu prowadzące do powstania brodawek [32, 71]. Czynniki Nod zbudowane są z łańcucha powtarzających się cząsteczek N-acetylglukozoaminy i ze względu na strukturalne podobieństwo do cząsteczki chityny, mogą być hydrolizowane przez chitynazy znajdujące się w komórkach roślinnych, co prowadzi do inaktywacji tychże czynników. Prawdopodobnie w ten sposób enzymy kontrolują proces infekcji [80]. Rośliną modelową wykorzystywaną do badania interakcji symbiotycznych jest Medicago truncatula. Badania dowodzą, że kluczową rolę w indukcji symbiozy pomiędzy roślinami a ryzobiami odgrywają białka roślinne podobne do chitynaz z klasy V. Inokulacja korzeni wpływa na zwiększenie ekspresji genu kodującego MtNFH1 (Medicago truncatula Nod factor hydrolase 1) Enzym ten wykazuje strukturalne podobieństwo do chitynaz z klasy V [12, 92, 106]. Salzer i wsp. [79] wykazali, że Sinorhizobium meliloti wpływa na ciągły wzrost ekspresji chitynazy V w korzeniach M. truncatula w kolejnych dniach po inokulacji. Również potraktowanie roślin tylko czynnikami brodawkowania dało podobny efekt. Po inokulacji obserwowano u M. trucatula wzrost ekspresji genu kodującego chitynazy z klasy III i IV [78].

Mikoryza arbuskularna jest przykładem interakcji pomiędzy roślinami a drobnoustrojami, w której biorą udział chitynazy roślinne. Partnerami grzybów arbuskularnych (Glomeromycota) są przede wszystkim rośliny zielne oraz niektóre gatunki drzew. Podobnie jak bakterie symbiotyczne tworzą one specyficzne struktury w korzeniach roślin zwane arbuskulami [7, 109]. Wykazano, że grzyby arbuskularne indukują w roślinach ekspresję genu kodującego chitynazę klasy III [9, 18, 50]. Ekspresjonowana w korzeniach dębu (Quercus robur) chitynaza III najprawdopodobniej jest związana z początkowymi etapami zawiązywania ektomikoryzy [19]. Znaczenie chitynaz w mikroryzie może być dwojakie. Przypuszcza się, że enzym inaktywuje chitynowe elicytory uwalniane ze ściany komórkowej grzybów. W ten sposób nie dopuszcza do rozwinięcia się mechanizmów obronnych rośliny [9, 77]. Inna hipoteza sugeruje, że chitynazy stymulują kiełkowanie zarodników grzybowych [18].

Chociaż wiadomo już, że bakterie również są obecne podczas mikoryzy (np. jako endofityczne bakterie grzybów mikroryzowych) jednak do tej pory nie jest jeszcze poznana ich rola ani mechanizmy uruchamiane w tym procesie [14].

Rośliny w toku ewolucji wykształciły mechanizmy chroniące je przed atakiem patogenów grzybowych. Należą do nich m.in. wzmacnianie i pogrubianie ściany komórkowej [57], wybuch wolnych rodników [76], wytwarzanie związków chemicznych takich jak fitoaleksyny [27], saponiny [6], glikozydy cyjanogenne i związki fenolowe [21]. Do białek aktywowanych podczas odpowiedzi na czynniki stresowe należą białka związane z patogenezą zwane białkami PR (PR – Pathogenesis Related). Na podstawie homologii sekwencji aminokwasowych, właściwości biochemicznej i aktywności biologicznej podzielono je na 17 rodzin [87]. Do grupy białek PR zaliczane są również chitynazy, które przyporządkowano do rodziny PR-3, PR-4, PR-8, PR-11 (Tabela II). Synteza enzymów chitynolitycznych jest więc ważnym elementem odporności roślin [22, 44, 98].

Poziom chitynaz w niezainfekowanych komórkach roślinnych zwykle jest niski, a synteza chitynaz oraz β-1,3-glukanaz jest w znacznym stopniu indukowana infekcją patogenu [28]. Wzmożoną ekspresję genów kodujących chitynazy powodują dodatkowo kwas jasmonowy (JA) i kwas abscysynowy (ABA) [69]. Chitynazy obecne w apoplaście komórek roślinnych odgrywają ważną rolę we wczesnych etapach patogenezy. Jak już wspomniano, rozkładając ścianę komórkową powodują uwolnienie oligomerów chityny, które stają się cząsteczkami sygnalnymi. Komórki roślinne rozpoznają je dzięki obecności receptorów kinazo podobnych LysM RLK (LysM Receptor-Like Kinase). Cząsteczki LysMRLK po rozpoznaniu przez receptory w komórkach roślinnych powodują aktywację chitynaz występujących w wakuoli, które degradują nowo syntezowane łańcuchy chityny, ograniczając wzrost grzyba [83].

Zaobserwowano, że mutacja w genie kodującym ten receptor u Arabidopsis prowadzi do zmniejszonej ekspresji genów kodujących białka obronne (w tym chitynaz), co powoduje większą wrażliwość roślin na infekcje grzybowe [97]. Udział chitynaz w transdukcji sygnału możliwy jest również dzięki temu, że substratem dla tych enzymów są reszty N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) białek arabinogalaktanowych (AGP), które znajdują się w ścianach komórkowych i uczestniczą w szlakach sygnalnych [85]. Potwierdzono, iż białka AGP mogą być hydrolizowane przez chitynazy oraz glukanazy do oligosacharydów, co prowadzi do rozluźnienia struktury ścian komórkowych. Powstałe w ten sposób chitooligosacharydy stają się cząsteczkami sygnalnymi biorącymi udział w wielu procesach w roślinach [85]. AGP pełnią funkcję strukturalną łącząc ściany komórkowe z błoną plazmatyczną i cytoszkieletem oraz uczestniczą w wielu procesach biologicznych, w tym podziale komórek, embriogenezie, zaprogramowanej śmierci komórki, różnicowaniu i ekspansji komórek oraz interakcjach żywiciel/drobnoustrój [56]. Powstałe po hydrolizie AGP oligosacharydy β-1,3-glukanu i chityny stają się elicytorami uczestniczącymi w transdukcji sygnału, co prowadzi do uruchomienia miejscowej i ogólnoustrojowej reakcji obronnej [5].

Aby potwierdzić rolę chitynaz w reakcjach obronnych roślin na patogeny grzybowe przeprowadzono doświadczenia na ciecierzycy (Cicer arietinum L.), pomidorze (Lycopersicum) oraz trzcinie cukrowej (Saccharum officinarum) [17, 90, 103]. Badania dowiodły, że w kontakcie z patogenem dochodzi do ekspresji genów kodujących I oraz III klasę roślinnych chitynaz. Białko wyizolowane z nasion fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris) [98] i traganka błoniastego (Astragalus membranaceus) [46] hamowało wzrost m.in. Botrytis cinerea i Fusarium oxysporum, natomiast w ekstrakcie liściowym morwy papierowej (Broussonetia papyrifera) obecna była chitynaza klasy I skuteczna wobec Trichoderma viridae [108]. Aktywność chitynazy wyizolowanej z lateksu wilca Ipomoea carnea subsp. fistulosa potwierdzono na płytkach z glikolem chityny [73]. U kukurydzy, chitynaza 2 powodowała odporność na grzyba Fusarium graminearum [16]. Wytypowano aż 8 genów kodujących chitynazy pięciu klas u bawełny (Gossypium barbadense), które mogą być odpowiedzialne za jej odporność przeciwko patogenowi grzybowemu Verticillium dahliae. Ekspresja sześciu genów w tym należących do klasy I (Chi2, Chi17), klasy V (Chi14, Chi23), klasy IV (Chi28) i klasy II (Chi32) znacząco wzrosła po inokulacji V dahliae, osiągając szczyt w 96 godzinie, dwa pozostałe geny z klasy III (Chi25) i klasy V (Chi47) osiągnęły szczyt ekspresji w 48 godziny po inokulacji. Potwierdzono, iż geny Chi25 i Chi47 odgrywają znaczącą rolę jako geny oporności na zakażenia bawełny patogenem V dahliae i można je wykorzystać do hodowli bawełny odpornej na choroby [101].

Co ciekawe endofityczne symbiotyczne grzyby z rodzaju Trichoderma mają właściwość stymulacji odporności roślin przeciwko innym grzybom poprzez wpływ na ekspresję genów kodujących chitynazy u roślin. Shoresh i Harman [84] przeprowadzili doświadczenia na kukurydzy (Zea mays L.). Wykazali, że rośliny zainokulowane T harzianum w większym stopniu hamowały wzrost patogena grzybowego Penicillium digitatum niż rośliny kontrolne. Było to wynikiem zwiększonej aktywności chitynaz w roślinie. Zauważono też zmiany w heterodimerze chitynazy złożonym z egzo- i endoenzymu, gdzie część endo różniła się między roślinami skolonizowanymi T. harzianum i roślinami kontrolnymi i wykazywała wyższą aktywność antygrzybiczą.

Chitynazy roślinne znalazły również szerokie zastosowanie w biotechnologiach, w tym w zielonej biotechnologii. Fitopatogeny grzybowe stanowią duże zagrożenie dla plonów roślin uprawnych. Stosowane przez rolników środki ochrony roślin mogą wywierać negatywny wpływ na środowisko oraz prowadzić do rozwoju odporności. W związku z tym prowadzi się próby modyfikacji roślin metodami inżynierii genetycznej w celu ograniczenia ich wrażliwości na atak patogenów grzybowych, co w konsekwencji prowadzi do mniejszych strat w plonach. Gen chitynazy pochodzący z ryżu (Rchit) został wprowadzony do trzech odmian orzeszków ziemnych (Arachis hypogaea L.). Spowodowało to zwiększoną aktywność chitynolityczną w orzeszkach, które wykazywały wyższy poziom odporności na zakażenia Aspergillus flavus [74] oraz Cercospora arachidicola [35]. U herbaty (Camellia sinensis L.) transformowanej chitynazą klasy I pochodzącą z ziemniaka (Solanum tuberosum) wykazano pozytywną korelację pomiędzy poziomem ekspresji transgenu a stopniem odporności na infekcje Exobasidium vexans, co spowodowało wzrost jej odporności na patogen grzybowy powodujący nekrotyczne zmiany na liściach [86]. Chitynazą klasy II pochodzącą z jęczmienia (Hordeum vulgare) o potwierdzonej w warunkach in vitro aktywności antygrzybiczej przeciwko Alternaria solani transformowano ziemniaka, który następnie wykazywał odporność na porażenie tym patogenem [38].

W celu komercyjnego wykorzystania chitynaz należy pozyskać białka w znaczących ilościach wykorzystując tzw. systemy ekspresyjne. W ten sposób pozyskiwano także rekombinowane chitynazy pochodzenia roślinnego o aktywności antygrzybiczej. Wykorzystując jako system ekspresyjny drożdże Pichia pastoris pozyskano chitynazy klasy I z wspięgi wężowatej (Vigna unguiculata) o aktywności przeciwko Penicillium herquei [48], z kukurydzy o aktywności przeciwko Fusarium graminearum [16]. Wykorzystując bakteryjny system ekspresyjny jakim jest Escherichia coli uzyskano chitynazę z klasy I pochodzącą z pietruszki (Hordeum vulgare L.) o potwierdzonej aktywności przeciwko Alternaria solani, Fusarium spp., Rhizoctonia solani i Verticillum dahliae [93].

Potwierdzono kluczową rolę chitynaz roślinnych w symbiozie z bakteriami jednak na temat roli chitynaz bakteryjnych w tym procesie nadal niewiele wiadomo. Szczepy bakterii symbiotycznych izolowanych z brodawek cechują się aktywnością chitynolityczną co może wskazywać na znaczenie dla samego procesu. Spośród 26 szczepów Rhizobium wyizolowanych z brodawek korzeniowych Sesbania sesban 12 szczepów wykazywało aktywność chitynaz. Jeden z tych szczepów sprawdzono pod kątem aktywności przeciwgrzybiczej przeciwko Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Curvularia lunata, Fusarium oxysporum i Fusarium udum. Wyniki sugerują rolę ochronną enzymów podczas symbiozy [88]. W brodawkach korzeniowych innych roślin w tym Vigna trilobata stwierdzono występowanie endofitycznych, niesymbiotycznych bakterii jak Bacillus altitudinis, Paenibacillus sp., Ensifer xinjiangense i Agrobacterium tumefaciens, u których potwierdzono produkcję chitynazy [47].

Zajmowanie przez bakterie i grzyby wspólnych siedlisk doprowadziło do powstawania mieszanych społeczności. Społeczności takie występują w prawie wszystkich ekosystemach i obejmują gatunki drobnoustrojów z wielu różnych rodzin grzybów i bakterii. Interakcje między nimi nazwano bakteryjno-grzybowymi (BFI – Bacterial-Fungal Interactions) [15, 20]. Jednym z takich ekosystemów gdzie kształtują się zależności między bakteriami i grzybami jest gleba, być może dzięki temu jest ona jednocześnie największym źródłem bakterii chitynolitycznych, ponieważ chitynazy bakteryjne dzięki zdolności do hydrolizy chityny są w stanie trawić ściany komórkowe grzybów.

Wśród najważniejszych taksonów w mikrobiologicznej społeczności gleby znajdują się promieniowce (Actinobacteria), które jednocześnie znane są z produkcji antybiotyków i metabolitów wtórnych [26]. Ponadto z analizy publicznych baz danych wynika, że prawie połowa genomów bakterii zawierających chitynazę należy właśnie do promieniowców. Autorzy uważają, że glebowe promieniowce są najlepiej przystosowane do korzystania z szerokiej gamy zasobów chityny, ponieważ w swoim genomie posiadają największą liczbę genów kodujących chitynazy oraz najwyższą różnorodność modułów wiążących węglowodany [4]. Niezwykła skuteczność chitynaz w przypadku promieniowców należących do rodzaju Streptomyces, wynika w dużej mierze z powodu ich zdolności do penetrowania chityny strzępkami [4]. Ponadto produkują one więcej niż jedną chitynazę, często też jednocześnie chitynazy należące do dwu rodzin hydrolaz glikozydowych GH 18 i GH 19, jak w przypadku Streptomyces coelicolor czy Nocardiopsis prasina [37, 94]. Szczepy należące do Streptomyces oraz wyizolowane z nich chitynazy wykazują silne właściwości antygrzybicze. Oczyszczona chitynaza pochodząca ze Streptomyces rimosus wykazywała przeciwgrzybicze właściwości in vitro przeciw Fusarium solani i Alternaria alternata [11]. Potwierdzono, że chitynazy należące do rodziny GH 19 również wykazują silne działanie antygrzybicze, jak w przypadku siedmiu szczepów syntetyzujących chitynazy GH 19 o właściwościach przeciwgrzybiczych przeciwko jednemu lub więcej grzybów należących do Fusarium oxysporum, Pythium aristosporum, Colletotrichum gossypii i Rhizoctonia solani [24].

Wśród bakterii należących do typu Firmicutes również znajduje się wiele szczepów produkujących chitynazy, najczęściej szczepy należące do Bacillus thuringiensis [4, 96]. Wykazano ich szeroką aktywność antygrzybową przeciwko m.in. Rhizoctonia solani, Trichoderma harzianum, Fusarium, Penicillum, Aspergillus, Pythium [25, 53].

Do aktywności chitynolitycznej zdolne są także Proteobakterie. Bakterie należące do rodzaju Serratia, Pseudomonas i Enterobacter wykazują szerokie działanie antygrzybicze. Obok promieniowców do najlepiej poznanych bakterii produkujących chitynazy należą szczepy Serratia marcescens. Bakterie te są w stanie uruchomić do hydrolizy chityny cały układ enzymatyczny i produkować jednocześnie kilka chitynaz należące do rodziny GH 18, z podrodziny A, B i C, co zwiększa wydajność hydrolizy chityny [91]. Wykazano skuteczność chitynazy pochodzącej ze szczepów S. marcescens przeciwko Botrytis cinerea [89], a także pochodzącą z S. marcescens B4A przeciwko Rhizoctonia solani, Bipolaris sp, Alternaria raphani, Alternaria brassicicola [104]. Wiele bakterii z rodzaju Pseudomonas jest zdolnych do produkcji chitynaz i aktywności przeciwko grzybom. Aktywność taką potwierdzono u Pseudomonas stutzeri YPL-1, który został wyizolowany z ryzosfery żeńszenia. Filtrat z hodowli prowadzonej z dodatkiem chityny, cechował się zdolnością do hamowania wzrostu Fusarium solani o ponad 57%, podczas gdy filtrat pozbawiony białek tylko o 10%. Dodatkowo poprzez mutacje w genie kodującym chitynazy potwierdzono ich znaczny udział w hydrolizie ścian komórkowych F. solani, które aż w 47% składają się z chityny [52]. Z kolei produkujący chitynazy Pseudomonas sp. MSSRFD41 ograniczał wzrost Phacelia grisea [82]. Również szczepy fluorescencyjne należące do Pseudomonas wykazywały aktywność przeciwko patogenom grzybowym, m.in. Phytophthora capsici, Botrytis cirenea, Rhizoctonia solani, Magnaporthe grisea [3, 33, 67].

Dzięki zdolności chitynaz bakteryjnych do ograniczenia rozwoju grzybów mogą być one wykorzystywane jako biofungicydy do zwalczania fitopatogenów grzybowych co stanowi alternatywę dla chemicznych środków ochrony roślin [43].

Bardzo specyficzną i zarazem najmniej poznaną interakcją pomiędzy mikroorganizmami jest z pewnością występowanie bakterii endosymbiontów, które przebywają w komórkach grzybów. Endosymbionty bakteryjne występują głównie w grzybach typu Mucoromycota i obejmują Betaproteobacteria (np. Burkhoderia) i Mollicutes (np. Mycoplasma) [10, 15]. Mechanizmy, dzięki którym bakterie endogenne kolonizują swoich gospodarzy, zostały do tej pory opisane tylko kilkukrotnie. Okazuje się, że w tym przypadku kluczowe zadanie także odgrywają chitynazy. Paraburkholderia rhizoxinica aktywnie wydziela enzymy chitynolityczne za pomocą układu wydzielniczego typu II, aby przeniknąć strzępki grzyba, który jest gospodarzem Rhizopus microsporus [63]. Jest to zarazem przykład trójstronnej interakcji niekorzystnej dla rośliny gdyż B. rhizoxinica i R. microsporus współdziałają, dzięki czemu są zdolne do wytwarzania i wydzielania rizoksyny, która jest silną fitotoksyną i czynnikiem wirulencji indukującym zarazę sadzonek ryżu [81]. Sugeruje się również złożoną trzypoziomową interakcję pomiędzy bakteriami zasiedlającymi gospodarza, którym jest grzyb mikoryzowy (AMF – Arbuscular Mycorrhizal Fungi), który z kolei kolonizuje rośliny. Pojawiające się wyniki pokazują, że pewne korzyści ze strony endobakterii jakie wynikają dla gospodarza grzybowego związanego z rośliną mogą rozprzestrzeniać się na samą roślinę [14]. Ewentualna rola chitynaz w tych procesach nie została jeszcze zbadana.