Lipopolysaccharide Pantoea Agglomerans and Atopic Dermatitis, Allergic Contact Dermatitis and Wound Healing

Lipopolisacharyd (LPS) to struktura występująca u bakterii Gram-ujemnych, która indukuje wrodzoną odpowiedź immunologiczną poprzez wiązanie się z receptorem Toll-podobnym 4 (TLR4) [20, 52]. Od dawna LPS jest uznawany za toksyczny składnik bakteryjny i jest stosowany do pobudzania odpowiedzi zapalnych w badaniach in vitro i in vivo, takich jak zapalenie płuc i uszkodzenie jelit, wywołane przez LPS w eksperymentalnych modelach zwierzęcych [17, 73]. Jednak niektóre badania pokazują, że ekspozycja na endotoksyny, w tym LPS w dzieciństwie zmniejsza ryzyko alergii i astmy w dorosłym życiu [6]. Ciekawe zagadnienie stanowi działanie na organizm LPS wyizolowanego z gatunku Pantoea agglomerans. Badania prowadzone na ludziach oraz z zastosowaniem modelu zwierzęcego pokazują, że LPS ten może mieć korzystny wpływ na leczenie niektórych chorób. Nakata i wsp. [45] wykazali, że doustne podanie LPS z P. agglomerans wpływa na aktywację makrofagów (inicjowanie) i chroni przed infekcją i alergią, bez wystąpienia skutków ubocznych. Wykazano także, że LPS P. agglomerans zapobiega tłumieniu funkcji makrofagów w chorobach wywołanych stresem [45]. Doustnie podawany LPS może dotrzeć do otrzewnej i wzmocnić fagocytozę poprzez ścieżkę sygnalizacyjną receptora TLR4 w rezydentnych makrofagach otrzewnowych myszy [24, 28]. Analizy biochemiczne wykazały, że LPS znacznie poprawia tolerancję glukozy i obniża poziomy LDL (lipoproteiny o niskiej gęstości) utlenionego LDL w osoczu oraz znacząco zmniejsza wytwarzanie mediatorów prozapalnych, w tym białka chemotaktycznego monocytów (MCP-1) w osoczu, czynnika martwicy nowotworu-α (TNF-α) i interleukiny-6 (IL-6) w okrężnicy oraz zmniejsza aktywność oksydacyjną w próbce krwi obwodowej [28]. Korzystne skutki terapeutyczne działania LPS P. agglomerans wykazano również w osteoporozie, miażdżycy, chorobach metabolicznych i chorobie Alzheimera. Analizy biochemiczne wykazały, że LPS P. agglomerans wpływa na obniżenie poziomu LDL i utlenionego LDL w osoczu zapobiegając w ten sposób miażdżycy [29, 46].

Olbrzymim wyzwaniem dzisiejszych czasów jest zapobieganie oraz leczenie chorób skóry, w tym atopowego zapalenia skóry (atopic dermatitis, AD), alergicznego kontaktowego zapalenie skóry (allergic contact dermatitis, ACD) oraz trudno gojących się ran. Schorzenia te są częste, uciążliwe dla pacjentów, a ich leczenie kosztowne [27]. Wykazano, że m.in niegojące się rany powodują ogromne wydatki na opiekę zdrowotną, których całkowity koszt szacuje się na ponad 3 miliardy dolarów rocznie [39]. Chociaż wzrost zachorowalności obserwowany jest wszędzie, najbardziej dotknięte są kraje szybko rozwijające się [59]. Stale poszukuje się skutecznych terapii w leczeniu tych schorzeń, bada się ich podłoże chorób oraz ocenia się wpływ poszczególnych czynników na ich zaostrzenie. W badaniach pojawiły się doniesienia o wpływie LPS P. agglomerans na złagodzenie chorób skóry. Choć nie wszystkie dane są spójne, wiele z nich mówi o łagodzeniu stanu zapalnego w chorobach skóry po stosowaniu LPS.

W przeglądzie tym zebrano dane dotyczące wpływu LPS pochodzącego od P. agglomerans na AD, ACD trudno gojące się rany.

Bakterie gatunku Pantoea agglomerans produkujące żółty pigment, są bakteriami Gram-ujemnymi należącymi do rzędu Enterobacteriales, wcześniej były znane jako Enterobacter agglomerans lub Erwinia herbicola [9, 70]. Gatunek ten został przeklasyfikowany do nowego rodzaju w 1989 [61]. P. agglomerans jest organizmem środowiskowym pochodzenia rolniczego, często izolowanym z roślin, gleby, wody i pożywienia [7]. Bakteria fermentuje węglowodany, powoli rozkłada żelatynę i nie ma zdolności do dekarboksylacji aminokwasów. Izolowana jest często od pracowników zakładów zbożowych i jest możliwym czynnikiem etiologicznym (jako fitopatogen) gorączki zbożowej (zespołu toksycznego wywołanego pyłem organicznym). Organizm ten jest patogenem oportunistycznym, aby doszło do infekcji zwykle wymagana jest obniżona odporność żywiciela m.in. nawracające zakażenia, zaburzenia żołądkowo-jelitowe i przedłużone gojenie ran [14]. W wielu doniesieniach literaturowych opisywano wyizolowanie patogennych P. agglomerans w przypadku: infekcji rany, ropnia, bakteriemii, zapalenia płuc, infekcji dróg moczowych, septycznego zapalenia stawów, zapalenia kości i szpiku, zapalenia otrzewnej, kamicy przewodu żółciowego, zapalenia pęcherza moczowego i zapalenia wnętrza gałki ocznej [7, 9, 10, 11, 53, 57]. Jednak coraz częściej opisuje się prozdrowotne właściwości tej bakterii. Wykazano, że woda źródlana Comano (Comano, Włochy), w której bytują m.in. P. agglomerans poprawia regenerację skóry, nie tylko zwiększając proliferację i migrację keratynocytów, ale także modulując zregenerowane włókna kolagenowe i elastyczn w skórze. Jednakże nie można jednoznacznie określić, że za prozdrowotne właściwości wody odpowiada tylko P. agglomerans ponieważ bytują w niej także inne gatunki takie jak Aeromonas hydrophila, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Citrobacter youngae, Chromobacterium violaceum [47].

Rola LPS w alergii jest tematem intensywnych badań. Blümer i wsp. badali samice myszy BALB/c eksponowane na LPS przed zapłodnieniem i w czasie ciąży. Kilka tygodni po urodzeniu potomstwo uwrażliwiono na albuminę jaja kurzego (OVA), a następnie prowokowano alergenem w aerozolu. Niniejsze badanie dostarcza pierwszych eksperymentalnych dowodów na to, że LPS może już działać w życiu prenatalnym w celu modulowania rozwoju alergii u potomstwa [5]. Badanie Tulić i wsp. pokazało, że gdy zwierzęta były eksponowane na LPS od dnia 6 do dnia 10 po uczuleniu, w dniu 12 zaobserwowano obniżony poziom przeciwciał IgG swoistych dla OVA i podwyższony poziom IgE swoistych dla OVA w porównaniu z uczulonymi zwierzętami nienarażonymi na LPS. W badaniu tym, wykazano, że u szczurów narażenie na produkt bakteryjny LPS może zapobiegać uczuleniu na alergen in vivo tylko wtedy, gdy narażenie następuje na wczesnym etapie procesu uczulania, co w tym modelu oznacza do dnia 6 po pierwotnym uczuleniu alergenem. Ekspozycja na LPS po 6 dniu dodatkowo wzmocniła alergiczną odpowiedź zapalną [6, 13, 64, 71].

Atopowe zapalenie skóry to przewlekła i nawracająca choroba zapalna skóry, która często współistnieje z innymi chorobami atopowymi. Patofizjologia atopowego zapalenia skóry jest złożona i wieloczynnikowa, obejmująca elementy dysfunkcji bariery, zmiany w komórkowej odpowiedzi immunologicznej, nadwrażliwość zależną od IgE oraz czynniki środowiskowe. Około 80% pacjentów z AD wykazuje fenotyp immunologiczny charakteryzujący się wysokim poziomem swoistych dla alergenu komórek Th2 i przeciwciał IgE oraz nacieków limfocytów obecnych w skórze [3, 33, 34]. Fenotyp immunologiczny Th2 może przyczyniać się do patologii AD poprzez tłumienie wrodzonych i adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko drobnoustrojom [4, 12]. Istnieją przesłanki, że lizat bakterii Gram-ujemnych takich jak Aeromonas hydrophila, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Citrobacter youngae, Chromobacterium violaceum pochodzących z gorących źródeł jest skutecznym składnikiem do pielęgnacji skóry w zapobieganiu zaostrzenia AD [19]. Ciekawym jest, że Myles i wsp. dowiedli również, że pacjenci z AD mają mniej bakterii Gram-ujemnych na skórze niż osoby zdrowe oraz że przeszczepienie bakterii Gram-ujemnych pobranych ze skóry osób zdrowych na skórę pacjentów z AD osłabiło objawy AD [42]. W badaniu Nakai i wsp. wykazano, że krem nawilżający z dodatkiem LPS (IP-PA1) był przydatny w codziennej pielęgnacji skóry pacjentów z łagodną postacią AD oraz osłabiał objawy choroby [44]. Badania pokazują, że swędzenie znacząco wpływa na pogorszenie jakości życia pacjentów z AD i dodatkowo drapanie wzmacnia objawy AD poprzez zniszczenie funkcji bariery skórnej [74]. Nakai i wsp. wykazali, że krem nawilżający z dodatkiem LPS (IP-PA1) skutecznie zmniejsza uczucie swędzenia w AD [44, 74]. Chociaż limfocyty T regulatorowe (Treg), które tłumią limfocyty T pomocnicze, istnieją w naskórku zdrowej osoby, uważa się, że funkcja Treg jest osłabiona u pacjentów z AD [8, 49, 67]. Wciąż podejmowane są próby wyjaśnienia mechanizmu wpływu LPS na AD, w tym związku LPS z IL-31 a AD. Doniesiono, że Treg stymulowane LPS wpływają immunosupresyjnie na neutrofile, tak że hamują stan zapalny [35]. Na tej podstawie można sobie również wyobrazić, że LPS aktywuje komórki Treg w celu zahamowania pomocniczych komórek T i zmniejszenia ekspresji IL-31, która powoduje stan zapalny i swędzenie [44]. Pomimo, że wiele interakcji między LPS a innymi komórkami obecnymi w naskórku wciąż nie jest poznanych, pojawiły się pewne doniesienia wyjaśniające. Keratynocyty wyrażają TLR, w tym TLR4 i reagują na stymulację LPS. Stymulacja keratynocytów przez LPS zwiększa poziom ekspresji filagryny, białka pełniącego funkcję bariery [25]. Ponadto keratynocyty wytwarzają β-defensynę, substancję przeciwdrobnoustrojową, in vivo w odpowiedzi na stymulację przez LPS [55]. Na podstawie tych ustaleń można założyć, że LPS oddziaływuje na keratynocyty, co wzmacnia barierową funkcję skóry i hamuje niepożądane namnażanie się bakterii [32]. W komórkach Langerhansa nie ma indukcji cytokin zapalnych w odpowiedzi na stymulację LPS [66]. Stymulacja LPS tłumi raczej ekspresję Th2 chemokiny TARC [40]. Sugeruje to, że działanie LPS na komórki Langerhansa prowadzi do stłumienia odpowiedzi alergicznej [44]. W badaniu Wakame i wsp. wykazano, że doustne podanie LPS IP-PA1 może mieć hamujący wpływ na AD. Badania przeprowadzono na myszach szczepu NC/Nga. Sugeruje się, że IP-PA1 może kontrolować reakcję immunologiczną zachodzącą in vivo u myszy NC/Nga na poziomie komórkowym. Dzieje się tak, ponieważ limfocyty T CD4⁺ odgrywają ważną rolę w równowadze immunologicznej reakcji obronnej gospodarza, a potwierdzono, że CD4⁺ i CD8⁺ są obecne w szczególności w komórkach AD penetrujących skórę [69]. Podsumowując, doustne podawanie IP-PA1 wykazuje hamujący wpływ na objawy AD [69].

Alergiczne kontaktowe zapalenie skóry jest reakcją nadwrażliwości typu IV indukowaną przez alergeny kontaktowe [26]. Rozwój alergii kontaktowej wymaga uczulenia na określony alergen, a następnie wywołania odpowiedzi zapalnej po wtórnej ekspozycji na ten sam alergen [68]. Ciągle poszukuje się przyczyn i terapii w ACD, stworzenie mysiego modelu nadwrażliwości kontaktowej (CHS) na hapteny, która jest odpowiednikiem ludzkiego ACD pozwoliło na poznanie wielu mechanizmów tej choroby i daje nadzieję na znalezienie kolejnych możliwych przyczyn jej powstawania oraz ewentualnych skutecznych terapii [1, 2]. W CHS faza sensytyzacji rozpoczyna się po pierwszym kontakcie z haptenem [16]. Wnikający w skórę alergen kontaktowy łatwo wiąże się z wszelkiego rodzaju składnikami skóry, w tym z białkami głównego układu zgodności tkankowej (MHC) [72]. Po kontakcie z alergenem około 40% lokalnych LC ulega aktywacji, opuszcza naskórek i migruje naczyniami limfatycznymi do drenujących węzłów chłonnych, gdzie osadzają się w obszarach przykorowych limfocytów T. Bezpośrednio po kontakcie z alergenem indukowane jest wytwarzanie mRNA interleukiny-1β (IL-β) i uwalnianie białka IL-1β z LC. Z kolei IL-1β stymuluje uwalnianie czynnika martwicy nowotworu-α (TNF-α) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) z keratynocytów. IL-1β i TNF-α hamują ekspresję związanej z błoną E-kadheryny i w ten sposób powodują odłączenie LC od otaczających keratynocytów [16]. Jednocześnie wzrasta ekspresja cząsteczek adhezyjnych, które promują migrację LC poprzez pośredniczenie w oddziaływaniach z macierzą zewnątrzkomórkową i komórkami skóry, takimi jak CD54, integryna α6 i warianty CD44. Również produkcja metaloproteinazy 9, enzymu degradującego błonę podstawną naskórka, jest podwyższona w aktywowanych LC [54]. Zbadano, czy wstrzyknięty śródskórnie LPS zmienia funkcje skórnych DC, prowadząc do zwiększonej nadwrażliwości kontaktowej (CHS). LPS zwiększył indukcję CHS u myszy. LPS nie zwiększył zdolności stymulacyjnej DC w drenujących LN po zastosowaniu haptenu. LPS zmienił gęstość i morfologię naskórkowej komórki I-A⁺ u myszy. LPS zwiększył odsetek komórek I-A⁺ FITC w LN 24 godziny po zastosowaniu FITC [76]. Najnowsze badania nad LPS IP-PA1 pokazują, że może on modulować odpowiedź zapalną i osłabiać odpowiedź immunologiczną w ACD. W badaniu Tanaka i wsp. testowano wpływ miejscowej aplikacji LPS IP-PA1 przed wywołaniem nadwrażliwości u myszy szczepu C57BL/6 poprzez 2,4-dinitrofluorobenzen (DNFB). LPS pochodzący z P. agglomerans nakładano na skórę brzucha myszy lub na skórę ucha przez 2 tygodnie, a następnie uczulano DNFB lub podawano od momentu uczulenia przez 7 dni. Badanie pokazało, że w przypadku podania LPS IP-PA1 przed uczuleniem obrzęk i naciek limfocytów do skóry właściwej został zmniejszony. Następnie oceniono wpływ LPS IP-PA1 na fazę wzbudzenia. W tym przypadku LPS IP-PA1 nie wpłynął na obrzęk ucha. Badanie to pokazało, że miejscowa aplikacja LPS IP-PA1 może wpłynąć na CHS na fazę uczulenia, lecz nie wzbudzenia [60]. Istotnym etapem fazy uczulenia dla CHS jest migracja komórek skóry zawierających hapten do LN drenujących skórę [22, 56]. Obecnie w skórze identyfikowane są komórki Langerhansa i cztery typy DC, z których niektóre mogą migrować przez przewody limfatyczne do LN drenujących skórę w odpowiedzi na stymulację. Stwierdzono, że u myszy traktowanych LPS IP-PA1 liczba komórek FITC-dodatnich bramkowanych na DC CD11c⁺ lub CD11c⁺ CD207⁺, które migrowały ze skóry do drenujących LN po zastosowaniu FITC, znacznie spadła. Jednak na całkowitą liczbę DC11c⁺ lub CD11c⁺ CD207⁺ spływających do LN nie miała wpływu aplikacja LPS IP-PA1. Wyniki te sugerują, że zastosowanie LPS IP-PA1 osłabiło migrację komórek wychwytujących antygen, głównie DC, do LN drenujących skórę, a następnie osłabiło aktywację komórek T w LN [60].

Trudno gojące lub niegojące się rany stanowią istotną przyczynę zachorowalności i śmiertelności dla dużej części populacji. Jednym z podstawowych mechanizmów odpowiedzialnych za niepowodzenie gojenia się ran przewlekłych jest wymykająca się spod kontroli reakcja zapalna, która jest samopodtrzymująca się [39]. Proces gojenia ran składa się z czterech wysoce zintegrowanych i zachodzących na siebie faz: hemostazy, zapalenia, proliferacji i przebudowy lub rozwiązania tkanki [18]. Te fazy i ich funkcje bio-fizjologiczne muszą zachodzić we właściwej kolejności, w określonym momencie i trwać przez określony okres czasu z optymalną intensywnością [38]. Niegojące się rany dotykają około 3 do 6 milionów ludzi w Stanach Zjednoczonych, przy czym osoby w wieku 65 lat i starsze stanowią 85% przypadków [39]. Limfocyty T migrują do ran w ślad za komórkami zapalnymi i makrofagami i osiągają szczyt w fazie późnej proliferacji/wczesnej przebudowy. Rola limfocytów T nie jest do końca poznana i jest obecnie obszarem intensywnych badań. Niektóre badania sugerują, że opóźniona infiltracja limfocytów T wraz ze zmniejszonym stężeniem limfocytów T w miejscu rany jest związana z osłabieniem gojenia ran [58]. W łożysku rany fibroblasty produkują kolagen oraz glikozaminoglikany i proteoglikany, które są głównymi składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Po silnej proliferacji i syntezie ECM gojenie się ran wchodzi w końcową fazę przebudowy, która może trwać latami [21]. Prowadzone są intensywne badania mające na celu znalezienie stymulanta gojenia ran. W raporcie Kostarnoy i wsp. opisano pierwsze badanie wpływu leczenia mysich ran skóry za pomocą miejscowego bakteryjnego LPS, głównego egzogennego ligandu receptora TLR4. Badacze pokazują, że leczenie LPS silnie wpływa na proces gojenia ran poprzez przyspieszenie ustępowania stanu zapalnego, zwiększenie infiltracji makrofagów, zwiększenie syntezy kolagenu oraz zmianę wydzielania szeregu mediatorów biorących udział w procesie regeneracji skóry. Miejscowe leczenie LPS zwiększało wydzielanie cytokin prozapalnych interleukiny (IL)-6, IL-1β i czynnik hamujący białaczkę (LIF) i chemokiny CC: CCL2/MCP-1, CCL7/MCP-3, CCL3/MIP-1α i CCL5/RANTES, ale nie chemokiny CXC (CXCL2/MIP-2 i CXCL9/MIG) [31]. Morishima i wsp. zbadali kilka przypadków trudno gojących się ran i zastosowania LPS IP-P1 w kremie. Wykazano, że gojące rany działanie LPS wynika podobno z jego zdolności do wywoływania działania przeciwzapalnego i funkcji naprawczej tkanek [41]. Naukowcy doszli do wniosku, że migracja keratynocytów jest hamowana przez produkty bakteryjne, wykrywane przez TLR4, a także przez TLR2. Jako, że rany przewlekłe zawsze wykazują obecność pewnych bakterii, odkrycia te dostarczają możliwego wyjaśnienia nie gojenia się wrzodów [36]. Wykazano, że LPS może promować proliferację i syntezę kolagenu fibroblastów w pewnym zakresie niskich dawek, ale zbyt wysoka dawka LPS może hamować proliferację i syntezę kolagenu fibroblastów, w związku z tym sugeruje się, że LPS w pewnych stężeniach może przyczyniać się do gojenia się ran, podczas gdy nadmierne stężenie LPS ma negatywny wpływ na gojenie się ran [75]. Rola LPS w gojeniu ran wymaga jeszcze dokładnego poznania tych mechanizmów. Choć istnieją też sprzeczne z tym doniesienia, że w przypadku przedłużonego gojenia ran pourazowych należy brać pod uwagę obecność ciał obcych pochodzenia roślinnego zakażonych P. agglomerans. Usunięcie takich ciał obcych prowadzi do szybkiego gojenia się ran [65].

Bakterie gatunku P. agglomerans są interesującymi bakteriami Gram-ujemnymi. Z jednej strony stanowią one czynnik ryzyka wystąpienia chorób takich jak: rany, ropnie, bakteriemia, zapalenie płuc, infekcje dróg moczowych, septyczne zapalenie stawów, zapalenie kości i szpiku, zapalenie otrzewnej, a z drugiej strony coraz częściej obserwuje się ich prozdrowotne właściwości w miażdżycy, chorobie Alzheimera, czy osteoporozie. Naukowcy wykazali, że składnik zewnętrznej błony bakterii P. agglomerans LPS IP-P1 ujawnia niezwykle szerokie spektrum właściwości leczniczych, głównie dzięki zdolności do utrzymania homeostazy. LPS IP-P1 działa jako immunomodulator. Mały amfipatyczny IP-PA1 łatwo tworzy micele o małej średnicy, które łatwo przenikają przez błonę śluzową i/lub skórę, wzmacniając pozytywne działanie leczenie po podaniu doustnym lub śródskórnym. Ta endotoksyna wpływa na zahamowanie lub produkcję określonych cytokin i modulację odpowiedzi immunologicznej.

Choroby skóry w tym: AD, ACD i trudno gojące się rany stanowią olbrzymi problem medyczny dzisiejszych czasów, obciążając w ten sposób służbę zdrowia. Obecnie kortykosteroidy są powszechnie stosowane np. w leczeniu AD, chociaż leki te mają potencjalne działania niepożądane. Dlatego istnieje pilna potrzeba zbadania nowych alternatywnych sposobów zapobiegania i leczenia AD. Kolejne doniesienia pokazują, że LPS z P. agglomerans może być przydatny w leczeniu chorób skóry poprzez jego wpływ na odpowiedź immunologiczną. Badania pokazują, że LPS działa na komórki Langerhansa i prowadzi do stłumienia odpowiedzi alergicznej.

Jednak ze względu na kilka doniesień o wyizolowaniu P. agglomerans np. z trudno gojącej się rany potrzebne są dalsze badania na szeroką skalę oceniające jej prozdrowotne właściwości. Koniecznym jest określenie dokładnego mechanizmu, dzięki któremu LPS moduluje odpowiedź immunologiczną w chorobach skóry oraz możliwe określenie odpowiedniej dawki prozdrowotnej aplikowanej pacjentom z chorobami skóry.