Former and Contemporary Methods for Wine Stabilization

Dwutlenek siarki (SO₂) jest dodatkiem powszechnie stosowanym do kontroli mikrobiologicznej żywności, w szczególności żywności kwaśnej, takiej jak soki owocowe i wino [61]. Stosowanie siarki w przemyśle winiarskim wynika z szerokiego spektrum działania tego związku, przede wszystkim zdolności kontroli mikrobiologicznej, właściwości antyseptycznych, przeciwutleniających i chroniących aromaty wina, i odbywa się na różnych etapach produkcji [66]. SO₂ dodawany do winogron i moszczu, przed rozpoczęciem fermentacji alkoholowej, hamuje wzrost niepożądanych drożdży spoza rodzaju Saccharomyces (ang. non-Saccharomyces yeasts), bakterii kwasu octowego AAB (ang. acetic acid bacteria) i bakterii kwasu mlekowego LAB (ang. lactic acid bacteria) [39, 46, 73, 99] oraz przeciwdziała utlenianiu moszczu [46]. Ponadto wpływa na efektywność uwalniania związków fenolowych ze skórek winogron i nasion podczas maceracji [39]. Zapobieganie utlenianiu enzymatycznemu i chemicznemu wina w konsekwencji stabilizuje jego właściwości sensoryczne podczas przechowywania i leżakowania [39, 46, 99]. Poza tym obecność siarki w procesie filtracji, dekantacji i dojrzewania wina, poza działaniem przeciwutleniającym [91], zapewnia także ochronę przeciwdrobnoustrojową, ukierunkowaną zwłaszcza na Brettanomyces spp., Candida spp., Pichia spp. oraz bakterie z grupy AAB [77, 88, 91]. Natomiast siarkowanie win słodkich stanowi istotne zabezpieczenie przed wtórną fermentacją prowadzoną przez Saccharomyces cerevisiae [41].

Należy podkreślić, że obecność SO₂ w winie nie wynika jedynie z egzogennego dodatku tego związku podczas produkcji, ale jest konsekwencją fermentacji alkoholowej, tzw. „biologiczny SO₂”. Drożdże wykorzystują siarkę obecną w moszczu do syntezy aminokwasów, a poziom produkowanych przez nie siarczynów podczas fermentacji jest silnie uzależniony od szczepu drożdży i odmiany winorośli [61].

Siarczyny dodawane do moszczu gronowego lub wina mogą mieć postać płynną lub gazową: dwutlenek siarki, siarczyn sodu, wodorosiarczyn sodu, pirosiarczyn sodu, pirosiarczyn potasu, siarczyn wapnia, wodorosiarczyn wapnia i wodorosiarczyn potasu [39, 89].

W uprawie winorośli i przetwórstwie występuje szereg gatunków mikrobiologicznych. Wśród bakterii kwasu octowego AAB, dominującymi gatunkami na winogronach, zwłaszcza tych o gorszej kondycji, są szczepy z rodzajów Gluconobacter, Acetobacter, Gluconacetobacter i Komagataeibacter. Proliferacja AAB, zwłaszcza szczepów z rodzaju Acetobacter, prowadzi do procesów oksydacyjnych, z niepożądanymi konsekwencjami dla jakości wina. Z tego względu kontrola AAB odbywa się przy użyciu SO₂ oraz ograniczeniu lub uniemożliwieniu kontaktu wina z tlenem [48]. Natomiast wśród bakterii kwasu mlekowego LAB, dominujące gatunki należą do rodzajów Oenococcus, Pediococcus i Lactobacillus [39]. Oenococcus oeni odpowiedzialny głównie za fermentację malolaktyczną (MLF) w winie, jest w stanie przezwyciężyć stresujące warunki panujące w winie (niskie pH, wysoka zawartość etanolu), ale ma dużą wrażliwość na SO₂ [62]. Wrażliwość O. oeni na SO₂ jest cechą pozytywną w kontekście produkcji win białych, w których MLF nie jest pożądany. W przypadku win czerwonych MLF sprzyja częściowo przetrwaniu bakterii, ale w postaci niehodowalnej (VBNC, ang. viable but nonculturable), a inokulacja kultur starterowych promuje szybką biokonwersję [62, 89]. Poza wymienionymi zaletami, stosowanie SO₂ w produkcji wina może mieć także niekorzystne skutki. Pozostałości tego związku w wysokim stężeniu mogą powodować nieprzyjemny smak wina [39]. Co więcej, nadmierne spożycie SO₂ może skutkować różnymi objawami chorobowymi, takimi jak np. skurcz oskrzeli, bradykardia, objawy żołądkowo-jelitowe, bóle głowy, wysypki skórne, niedociśnienie, a w rzadkich przypadkach nawet reakcją anafilaktyczną [25, 38]. W związku z niepożądanymi skutkami ubocznymi wywoływanymi przez siarczyny istnieje obowiązek zamieszczania na etykiecie informacji o ich obecności, w przypadku poziomu przekraczającego 10 mg/L (Dyrektywa 2003/89/WE). Zgodnie z prawem europejskim dopuszczalne stężenia SO₂ w winie nie powinny przekraczać 150 mg/L i 200 mg/L, odpowiednio dla win czerwonych i białych. Z kolei w winach deserowych, w których stężenie cukru resztkowego wynosi co najmniej 5 g/L, dozwolony poziom SO₂ może być dodatkowo zwiększony o 50 mg/L (Rozporządzenie UE nr 606/2009).

Wraz z obawami o zdrowie człowieka i troską o środowisko rośnie zapotrzebowanie konsumentów na wina o niskiej zawartości lub bez dodatku siarczynów, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej jakości i pożądanych cech organoleptycznych [25, 84, 99]. Istnieje szereg rozwiązań alternatywnych dla SO₂ [26, 99], jednak część enologów uważa, że związek ten jest jedynym właściwym, który może zapewnić produkcję win gatunkowych o odpowiedniej trwałości [10].

Lizozym, kwas sorbinowy, diwęglan dimetylu, chitozan i związki fenolowe to dodatki chemiczne o działaniu przeciwdrobnoustrojowym i antyoksydacyjnym, dopuszczone do produkcji wina, zgodnie z Rozp. WE nr 606/2009 z późniejszymi zmianami i mogące mieć status alternatywy dla SO₂ [34, 39, 46].

Lizozym jest enzymem muramidazy wyizolowanym z białka jaja (EC 3.2.1.17). Enzym ten zrywa wiązania glikozydowe między kwasem N-acetylomuraminowym i N-glukozaminą w ścianie komórki bakteryjnej powodując jej lizę i śmierć [45]. Jest aktywny przeciw bakteriom Gram-dodatnim i nie wykazuje lub wykazuje słabą aktywność wobec bakterii Gram-ujemnych i drożdży [27]. W produkcji wina lizozym wykorzystywany jest do częściowego zastąpienia dwutlenku siarki na różnych etapach procesu technologicznego oraz jako środek klarujący [68]. W moszczu winogronowym lizozym zmniejsza populację komórek LAB [4], bez wpływu na aktywność drożdży i postęp fermentacji. Do LAB odpowiedzialnych za kontaminację moszczu należą szczepy Pediococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc mesenteroides i O. oeni [36]. Wykazują one różne stopnie wrażliwości lub oporności na lizozym, na przykład O. oeni jest stosunkowo wrażliwy, a Lactobacillus spp. i Pediococcus spp. tolerują wyższe stężenia [27].

Dodatek lizozymu pozwala na kontrolę LAB i zahamowanie MLF [36], co jest istotne w produkcji białego wina. Natomiast w winach czerwonych lizozym jest mało skuteczny, ponieważ związki polifenolowe mogą hamować jego działanie [7]. Jednakże pozwala uniknąć wzrostu kwasowości lotnej, ogranicza proliferację LAB podczas wydłużonego czasu maceracji i ułatwia późniejsze zaszczepienie wybranego startera malolaktycznego [4].

Dodatek lizozymu nie prowadzi do zmian w zawartości alkoholu, pH i właściwościach organoleptycznych wina. W winach czerwonych białka jaja zawierające lizozym wiążą garbniki na drodze oddziaływań elektrostatycznych, zapobiegając utracie barwy wina [68], natomiast zastosowanie lizozymu wraz z dodatkiem tanin enologicznych poprawia aromat wina dzięki większej zawartości estrów i kwasów [83]. Ustalono także, że wina otrzymane przy użyciu kombinacji lizozymu i diwęglanu dimetylu (DMDC), innego związku proponowanego jako alternatywa dla SO₂, mają lepsze właściwości aromatyczne, niż wina poddane działaniu samego SO₂ [60].

Rozporządzenie CE nr 606/2009 narzuca limit 500 mg/L dodatku lizozymu do moszczu. Należy podkreślić, iż lizozym stosowany w produkcji wina jest izolowany z białka jaja i został oznaczony jako alergen Gal4, więc może wywoływać reakcję alergiczną, nawet w niewielkich ilościach, zwłaszcza gdy jest obecny w winach nietraktowanych bentonitem [96]. W związku z powyższym, przepisy europejskie (dyrektywa 2007/68/WE) wymagają, aby obecność lizozymu od stężenia wynoszącego 0,25 mg/L była zgłaszana na etykiecie.

Podsumowując, zastosowanie lizozymu może prowadzić do redukcji SO₂ w winie, ale nie może zastąpić siarczynów, ponieważ ma tylko działanie przeciwbakteryjne wobec LAB, nie jest w stanie kontrolować proliferacji zanieczyszczających drożdży oraz bakterii Gram-ujemnych, ani zjawiska utleniania w moszczach i winach. Ponadto zastosowanie lizozymu w produkcji wina musi być rozważne z uwagi na możliwe reakcje alergiczne u konsumentów.

Kwas sorbowy jest krótkołańcuchowym nienasyconym kwasem tłuszczowym, słabo rozpuszczalnym w wodzie, rozpuszczalnym w etanolu, stosowanym jako środek przeciwdrobnoustrojowy i przeciwgrzybiczy w konserwacji żywności. W produkcji wina jest używany jako sorbinian potasu, który zawiera 75% kwasu sorbinowego i jest rozpuszczalny w wodzie [73]. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa kwasu sorbowego wynika z połączenia tego związku z grupą wodorosiarczkową układu enzymatycznego mikroorganizmów, prowadząc do jego dezaktywacji [30].

Rozporządzenie UE nr 606/2009 nakłada limit 200 mg/L stężenia kwasu sorbowego w winie. Taka zawartość jest dobrze tolerowana przez kilka zanieczyszczających drożdży obecnych podczas produkcji, takich jak Z. bailii [86], Brettanomyces spp. [80, 91] oraz Saccharomycodes spp. [90]. Ponadto wykazuje brak aktywności wobec bakterii AAB i LAB, na które istotny wpływ mają dopiero stężenia powyżej 0,5–1 g/L [73]. Jednakże w połączeniu z SO₂ kwas sorbowy wykazuje aktywność przeciwko drożdżom, takim jak S. cerevisiae, co pozwala uniknąć wtórnej fermentacji win słodkich w butelkach [85] oraz przeciwko drożdżom flor (Candida spp.), zdolnym rozwijać się na powierzchni wina [73]. Chociaż kwas sorbowy w ograniczonych prawem stężeniach nie modyfikuje właściwości organoleptycznych wina, LAB w winach czerwonych są w stanie reagować z kwasem sorbowym, wytwarzając niepożądane związki lotne odpowiedzialne za „zapach geranium” [73].

Diwęglan dimetylu (DMDC) jest związkiem organicznym o działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Unia Europejska zezwoliła na jego stosowanie w produkcji wina, w maksymalnej dawce 200 mg/L (rozporządzenie CE nr 606/2009). Najczęstszym zastosowaniem komercyjnym jest dodawanie DMDC tuż przed butelkowaniem do win o zawartości cukru co najmniej 5 g/L [24]. W winie DMDC jest szybko hydrolizowany do metanolu i dwutlenku węgla (w ciągu 12 do 24 godzin), jednak bez konsekwencji toksykologicznych i wpływu na właściwości organoleptyczne wina [27].

Mechanizm działania przeciwdrobnoustrojowego DMDC polega na reakcji z grupami aminowymi niektórych enzymów w komórce, takich jak dehydrogenaza alkoholowa i 3-fosforan gliceraldehydu, powodując metoksykarbonylację reszt nukleinowych i prowadząc do śmierci komórki drobnoustroju [72].

DMDC jest skuteczniejszy niż SO₂ wobec drożdży, ponieważ nie indukuje przejścia komórek drożdży w postać zdolną do życia, ale niehodowalną (VBNC), jak to ma miejsce w przypadku SO₂, ale prowadzi do śmierci komórki. Jednak stosowanie tego związku zamiast SO₂ nie jest zalecane, ponieważ DMDC nie ma aktywności przeciwutleniającej, a w zatwierdzonych dawkach jest nieskuteczny wobec bakterii. Dopiero bardzo wysokie dawki mają działanie bakteriostatyczne, np. wzrost Acetobacter aceti, czy Lactobacillus spp. hamują stężenia, odpowiednio, 1000 mg/L i 500 mg/L [27].

Gatunkami drożdży najbardziej wrażliwymi na DMDC są: Zygosaccharomyces bailii, Zygoascus hellenicus i Lachancea thermotolerans, podczas gdy inne gatunki, takie jak Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, Dekkera bruxellensis i Pichia guilliermondii są również wrażliwe, ale w nieco wyższych stężeniach [24]. Generalnie, Zygosaccharomyces spp. wykazują większą wrażliwość na DMDC, niż drożdże z rodzaju Candida, Metschnikowia, Meyerozyma lub Wickerhamomyces [100].

Chitozan jest główną pochodną chityny, biopolimeru składającego się z jednostek N-acetyloglukozaminy połączonych wiązaniami β (1 → 4). Polisacharyd ten występuje bardzo powszechnie w naturze, głównie w mięczakach i skorupiakach, ale także w grzybach i owadach [33]. Jego zastosowanie jako potencjalnego środka konserwującego żywność wynika z szerokiej aktywności biologicznej, w tym przeciwdrobnoustrojowej wobec grzybów strzępkowych, drożdży i bakterii [76]. Chitozan został dopuszczony przez Komisję Europejską (Rozporządzenie CE 53/2011) do produkcji wina, jako środek klarujący. W tym zastosowaniu dopuszcza się jedynie chitozan pochodzący z Aspergillus niger, aby uniknąć wszelkich potencjalnych obaw o alergenność skorelowaną z surowcem ze skorupiaków. W zależności od zastosowania chitozanu stosuje się go w różnych dawkach [89].

Dodatek 100 g/hL chitozanu jest stosowany w celu zapobiegania zamgleniu wina i zmniejszenia stężenia metali ciężkich (Fe, Pb, Cd, Cu) [20, 22]. Dawki 500 g/hlmają na celu ograniczenie zanieczyszczenia ochratoksyną A (OTA), mikotoksyną wytwarzaną przez grzyby z rodzajów Aspergillus i Penicillium, która może być obecna w winie w maksymalnej dawce 2 μg/l (EC 2005) [71]. Z kolei ilość 10 g/hL jest dozwolona w celu zmniejszenia stężenia niepożądanych mikroorganizmów, zwłaszcza drożdży Brettanomyces spp.

Różne gatunki LAB wykazują zróżnicowaną wrażliwość na chitozan, np. Lactobacillus spp. wykazuje wyższą oporność na chitozan, niż Pediococcus spp., a Lactobacillus plantarum jest bardziej oporny niż Lactobacillus hilgardii, O. oeni i Pediococcus spp. [5]. Skuteczność chitozanu wobec AAB jest podobna do skuteczności siarczynów [92].

Związki fenolowe lub polifenole, naturalnie występujące w winogronach i winach, są dodatkami chemicznymi dopuszczonymi w enologii przez UE (Rozp. WE nr 606/2009 i późniejszymi zmianami), gdy ich ilość w winogronach i winach jest zbyt mała [77]. Naturalne stężenie związków fenolowych w winie zależy od różnych czynników związanych z jakością winogron (odmiana, czas zbioru, gleba, klimat itp.) i praktykami enologicznymi (czas i temperatura maceracji, fermentacja ze skórkami i nasionami, dodatek enzymów, tłoczenie, MLF itp.) [75]. Głównymi związkami fenolowymi obecnymi w winie są kwasy fenolowe (hydroksycynamonowy i hydroksybenzoesowy), flawonoidy, skondensowane taniny, antocyjany i stilbeny (resweratrol). Związki te odpowiadają za właściwości organoleptyczne win, takie jak kolor i cierpkość [94]. Ponadto, obecność polifenoli w winach wiąże się z korzyściami zdrowotnymi, wynikającymi z ich dobrze znanego działania przeciwutleniającego, przeciwnowotworowego i przeciwzapalnego [97]. Wykazano też aktywność związków fenolowych wobec LAB, Candida albicans i patogenów oportunistycznych, takich jak Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Enteritidis i Pseudomonas aeruginosa, sugerując ich potencjalne zastosowanie jako naturalnych środków przeciwdrobnoustrojowych w produkcji wina [65, 81]. Mechanizm przeciwdrobnoustrojowego działania związków fenolowych nie został w pełni wyjaśniony. Ustalono jednak, że fenole zwiększają przepuszczalność błony cytoplazmatycznej z wyciekiem składników wewnątrzkomórkowych bakterii, a także mogą zmieniać skład kwasów tłuszczowych [74]. Wykazano także ich zdolność do hamowania syntezy peptydoglikanu, składnika ściany komórkowej bakterii oraz syntezy kwasów nukleinowych [16, 87].

Wśród związków fenolowych, interesującym i innowacyjnym substytutem SO₂ w czerwonych winach wydaje się resweratrol, który należy do stilbenów, ze względu na jego działanie przeciwutleniające i przeciwdrobnoustrojowe wobec AAB, LAB powodujących psucie się wina oraz drożdży z rodzajów Dekkera, Zygosaccharomyces i Hanseniaspora [93].

Obróbka termiczna i filtracja to główne fizyczne metody stosowane w celu zmniejszenia mikrobiologicznej kontaminacji moszczów i win. Temperatura, oprócz właściwości bójczych wobec bakterii i drożdży, sprzyja ekstrakcji antocyjanów i innych polifenoli, hamuje aktywność enzymów oksydacyjnych i stabilizuje wina słodkie [43, 46]. Filtracja ma jednocześnie zastosowanie do klarowania, stabilizacji i sterylizacji wina. W zależności o rodzaju filtrów działa na LAB, AAB i drożdże [34, 46].

Wymienione metody mogą też negatywnie wpływać na właściwości organoleptyczne wina [95, 99]. Obróbka termiczna w winach czerwonych może skutkować zmianą smaku i degradacją wrażliwych na ciepło polifenoli i innych składników bioaktywnych. Natomiast w winach białych wyższa temperatura obniża stężenie lotnych związków aromatycznych [43]. Z kolei filtracja to proces kosztowny i silnie utleniający wino. Wpływa na obniżenie stężenia związków aromatycznych, smakowych i barwnych [34, 46], przez co może powodować zmniejszenie intensywności barwy, ilości antocyjanów i garbników w winach czerwonych, oraz pogorszenie profilu aromatycznego w winach białych [95].

Spośród innych metod fizycznych stabilizacji wina stosowane są, np. wysokie ciśnienie hydrostatyczne, ultradźwięki, promieniowanie ultrafioletowe i pulsacyjne pole elektryczne [46, 99]. Są to metody skuteczne w kontekście walki z mikroorganizmami powodującymi psucie się wina oraz zachowania jego jakości, jednakże nie zapewniają ochrony antyoksydacyjnej [99]. Skutecznie eliminują LAB i drożdże [57], a promieniowanie UV jest dodatkowo aktywne wobec AAB [43, 46, 78].

Wysokie ciśnienie hydrostatyczne ma nieznaczny wpływ na właściwości fizykochemiczne i organoleptyczne wina [34, 43]. Stosowanie utradźwięków przyspiesza dojrzewanie wina oraz wzmaga ekstrakcję związków fenolowych w winach czerwonych i redukuje aktywność enzymów oksydacyjnych [43, 77]. Promieniowanie UV również wspomaga ekstrakcję związków fenolowych w winach czerwonych oraz zwiększa zawartość związków bioaktywnych (stilbenów) [34, 43, 77]. Z kolei pulsacyjne pole elektryczne ma minimalny wpływ na jakość wina, ale pozwala skrócić czas maceracji, przyspiesza dojrzewanie wina, inaktywuje drożdże w winie słodkim oraz zmniejsza aktywność enzymów oksydacyjnych [34, 46, 77].

Strategia alternatywna do chemicznych i fizycznych metod kontroli mikroorganizmów powodujących psucie się wina opiera się na wykorzystaniu interakcji i metabolizmu drobnoustrojów [99]. Jednym z mikrobiologicznych rozwiązań problemu psucia się wina jest bioochrona moszczu winogronowego, polegająca na celowym zaszczepieniu gatunków drożdży zdolnych do szybkiej kolonizacji, co zapobiega rozwojowi niepożądanych mikroorganizmów [12, 58]. Najczęściej do bioochrony wina stosowany jest Saccharomyces cerevisiae [17, 82], gatunek drożdży zalecany przez Międzynarodową Organizację ds. Winorośli i Wina (OIV, ang. International Organisation of Vine and Wine) do wczesnego zaszczepiania moszczu w celu uniknięcia psucia się wina. Wykazano jednak, że pozytywny wpływ na złożoność i jakość sensoryczną win mogą mieć także inne drożdże [23, 64].

Inne koncepcje ochrony wina przed psuciem, stanowiące propozycję alternatywy dla dodatku SO₂, opierają się na wykorzystaniu szczepów starterowych drożdży, zdolnych do wytwarzania metabolitów o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, takich jak mykocyny, krótko i średnio-łańcuchowe kwasy tłuszczowe, czy peptydy przeciwdrobnoustrojowe [46]. Mykocyny wykazują aktywność wobec drożdży powodujących psucie się wina oraz stanowiących zanieczyszczenie podczas produkcji. Są bezpieczne do spożycia dla ludzi, jednak badania nad zastosowaniem oczyszczonych toksyn w produkcji wina są jak dotąd nieliczne [18, 46, 99]. Z kolei krótko i średnio-łańcuchowe kwasy tłuszczowe hamują wzrost drożdży oraz są aktywne wobec LAB. Monolauryna, która jest monoglicerydem kwasu laurowego, posiada status GRAS (ogólnie uznane za bezpieczne, ang. generally recognized as safe) i została zatwierdzona przez OIV jako środek przeciw pieniący w produkcji wina. Udowodniono też wpływ estrów kwasów tłuszczowych na owocowy zapach wina. Poza korzystnym oddziaływaniem kwasów tłuszczowych, są one odpowiedzialne za nieprzyjemne, serowe, tłuste i zjełczałe aromaty w winie [46, 99]. Innymi metabolitami proponowanymi do zastąpienia siarczynów w produkcji wina są przeciwdrobnoustrojowe peptydy z drożdży winiarskich. Są one nietoksyczne dla ludzi i aktywne wobec LAB oraz drożdży odpowiedzialnych za psucie się wina i tworzących biofilm [46, 98, 99].

Naprzeciw koncepcjom produkcji wina o niskiej zawartości SO₂ wychodzą badania nad potencjalnym zastosowaniem Saccharomyces cerevisiae [99]. Dotyczą one szlaków metabolicznych związanych z produkcją związków zawierających siarkę przez drożdże winiarskie i ich tolerancją na siarczyny, począwszy od produkcji siarczynu i glutationu do detoksykacji siarczynów poprzez wypływ błonowy oraz produkcji związków wiążących SO₂ [99].