Modern Methods of Identification of Protein Vaccine Antigens

O historii wakcynologii nie można opowiedzieć bez wspomnienia postaci Ludwika Pasteura (1822–1895). Opracowanie metod atenuacji mikroorganizmów chorobotwórczych i zakończone sukcesem testy pierwszych preparatów szczepionkowych na zwierzętach doprowadziły go do sformułowania zasad leżących u podstaw większości stosowanych dzisiaj szczepionek (isolate, inactivate, inject). Szczepionki te, powstałe w oparciu o żywe, atenuowane mikroorganizmy oraz mikroorganizmy zabite, umożliwiły ograniczenie występowania wielu chorób zakaźnych (odra, różyczka, tężec, błonica, polio) [12, 42, 56, 68], a nawet ich eradykację (ospa prawdziwa) [18].

Szczepionki zawierające inaktywowane drobnoustroje działają zgodnie z założeniem, że elementy układu odpornościowego człowieka są w stanie rozpoznawać antygeny eksponowane przez dany patogen pomimo zahamowania jego namnażania i metabolizmu. Najczęściej do inaktywacji stosowano wysoką temperaturę, promieniowanie lub czynniki chemiczne takie jak formalina czy formaldehyd [13, 49]. Całkowite zahamowanie replikacji patogenu wyklucza możliwość jego przypadkowej rewersji do typu dzikiego, zwiększając bezpieczeństwo szczepionki. Z praktyki klinicznej wynika jednak, że odpowiedź układu odpornościowego na podanie antygenów w tej formie jest zwykle słabsza i trwa krócej. Stąd wynikała konieczność stosowania adiuwantów, jak również podania większej liczby dawek [61].

Atenuowane patogeny zachowują z reguły wiele biologicznych cech dzikiego szczepu, m.in. zdolność do replikacji, która w przypadku wirusów jest niezbędna do powstania cytotoksycznych limfocytów T gwarantujących skuteczny poziom ochrony. Ich dłuższa obecność w szczepionym organizmie oraz ekspozycja układu odpornościowego na dużą liczbę antygenów zwiększa efektywność szczepienia. W przypadku takich preparatów istnieje jednak możliwość zachowania resztkowej zjadliwości, która jest niebezpieczna dla osób z niedoborami immunologicznymi. Zastosowanie atenuowanych mikroorganizmów wiąże się także z ryzykiem ponownego nabycia przez nie właściwości patogennych [25].

Ponieważ nieliczne z antygenów, jakie niesie dokonujący inwazji mikroorganizm, mają znaczenie dla powstania odporności przeciwzakaźnej, zwrócono się w stronę szczepionek podjednostkowych, a więc zawierających oczyszczony składnik komórki patogenu. W latach 80. XX wieku opracowano pierwszą szczepionkę, w której wykorzystano antygen powierzchniowy wirusa HBV, produkowany w komórkach rekombinowanych drożdży i oczyszczony z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa [36]. Identyfikacja nowych antygenów białkowych, w oparciu o laboratoryjną weryfikację immunogenności tych białek, była jednak czasochłonna i kosztowna. Wymagała również oczyszczenia dużej ilości białka, co znacznie ograniczało pulę potencjalnych antygenów. Co więcej, prawdopodobieństwo spełnienia przez białko oczekiwanych warunków, takich jak wysoki poziom ekspresji, ekspozycja na powierzchni komórki, niska zmienność sekwencji aminokwasowej czy zdolność do wywołania odpowiedzi immunologicznej było stosunkowo niskie.

W ostatnich latach przy konstrukcji szczepionek podjednostkowych zwrócono się w stronę genomu jako źródła pełnej informacji o potencjalnie immunogennych białkach. 200. rocznica urodzin Ludwika Pasteura jest okazją do przedstawienia założeń odwrotnej wakcynologii (reverse vaccinology) – dziedziny, która pozwoli na pokonanie przeszkód hamujących dalszy rozwój klasycznej wakcynologii.

Pierwsza praca opisująca potencjalny wpływ dostępu do pełnych sekwencji genomowych mikroorganizmów patogennych na rozwój wakcynologii została opublikowana w 1997 roku. Zwrócono uwagę, że genomy patogenów niosą informację o kompletnym zestawie antygenów możliwych do wykorzystania w preparatach szczepionkowych i pozwalają na wytypowanie konkretnych genów w celu dokładnej identyfikacji produktów ich ekspresji [43]. Standardowe metody identyfikacji antygenów – mikrobiologiczne, biochemiczne i serologiczne – były kosztowne, wymagały znacznych nakładów pracy i czasu oraz, co najważniejsze, zawodziły w przypadku patogenów o wysokiej zmienności, trudnych w hodowli in vitro oraz tych, które nie miały jasno zdefiniowanych antygenów ochronnych. Nowy kierunek w rozwoju mikrobiologii i medycyny nazwano odwrotną wakcynologią (reverse vaccinology), ponieważ badania nie rozpoczynają się od analizowania samego patogenu, ale od analizy in silico jego pełnej sekwencji genomowej [54].

W pierwszej kolejności przy użyciu narzędzi bioinformatycznych typuje się geny kodujące białka w różny sposób eksponowane na powierzchni komórki lub wydzielane na zewnątrz, a więc potencjalnie rozpoznawane przez składniki układu odpornościowego. W kolejnym etapie, po oczyszczeniu wybranych białek, przeprowadzane są wstępne analizy na modelu zwierzęcym, których celem jest wskazanie antygenów indukujących powstawanie odpowiedzi ochronnej. Dodatkowo, przeprowadzana jest ocena poziomu ekspresji wybranych genów w warunkach in vivo z wykorzystaniem technik takich jak elektroforeza dwuwymiarowa białek czy mikromacierze DNA. W efekcie tych działań z kilku tysięcy białek zostaje wytypowana wąska grupa potencjalnych immunogenów, które możemy poddać dalszym szczegółowym badaniom. Taki sposób identyfikacji antygenów jest więc znacznie bardziej wydajny niż metody tradycyjne i zapewnia praktycznie nieograniczone możliwości badawcze. Ryc. 1. Przedstawia najważniejsze założenia odwrotnej wakcynologii.

Ryc. 1

Odwrotna wakcynologia po raz pierwszy została z powodzeniem zastosowana przy konstrukcji szczepionki skierowanej przeciw Neisseria meningitidis, Gram-ujemnej bakterii występującej w formie dwoinek. Bakterie te kolonizują błony śluzowe górnych dróg oddechowych ludzi. U około 10% występuje bezobjawowe nosicielstwo [8]. Natomiast najgroźniejsze formy zakażenia N. meningitidis, które wiążą się z przełamaniem bariery krew–mózg, przebiegają w postaci sepsy i/lub zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych [21]. Choroba może występować jako groźna w skutkach epidemia lub pojawiać się sporadycznie, zwłaszcza u ludzi z niedoborami immunologicznymi.

Jednym z głównych czynników wirulencji N. meningitidis jest jej polisacharydowa otoczka [64]. Na podstawie różnic w jej budowie wyróżniono 12 serotypów N. meningitidis, z których sześć (A, B, C, W-135, X, Y) odpowiada za zakażenia związane z zagrożeniem życia. Serotyp B (MenB) to jedyny serotyp N. meningitidis, przeciw któremu nie udało się zaprojektować skutecznej szczepionki za pomocą klasycznych metod laboratoryjnych. W odróżnieniu od polisacharydów otoczkowych innych serotypów, polisacharyd B nie indukował bowiem efektywnej odpowiedzi immunologicznej. W 1983 roku wykazano także powinowactwo glikoprotein NCAM (neural cell adhesion molecule) zawierających podjednostki kwasu polisjalowego do przeciwciał surowicy końskiej rozpoznających N. meningitidis ser. B. Badane glikoproteiny występują na powierzchni ludzkich neuronów, komórek glejowych oraz komórek NK i pełnią rolę w procesach adhezji neuronów m.in. do komórek mięśniowych. NCAM jest modyfikowany przez dołączenie kwasu α-2,8-polisjalowego (PSA) przez transferazy ST8Sia IV/PST oraz ST8Sia II/STX. Obecność cząsteczek PSA-NCAM wykazano przede wszystkim w rozwoju prenatalnym, w tkankach mięśniowych serca i szkieletowych, nerkach oraz w mózgu. Te same tkanki u ludzi dorosłych charakteryzują się bardzo niską obecnością lub brakiem zmodyfikowanej formy NCAM [9]. Duże podobieństwo polisacharydu B do cząsteczek PSA było przyczyną wielu dyskusji o bezpieczeństwie tak zaprojektowanej szczepionki, zwłaszcza dla kobiet w ciąży. Płód ma bezpośredni kontakt z przeciwciałami wytwarzanymi przez matkę, więc istniało niebezpieczeństwo zaburzenia rozwoju ośrodkowego układu nerwowego płodu.

Brak możliwości wykorzystania polisacharydu B ani żadnej z jego modyfikacji do produkcji szczepionki powodował konieczność wytypowania nowych antygenów. Kolejnym obiektem badań stało się białko PorA, eksponowane w OMV (outer membrane vesicles). Na rynku pojawiały się szczepionki wtOMV umożliwiające opanowanie lokalnych epidemii. Należy jednak podkreślić, że były one skuteczne jedynie wobec szczepów MenB, które charakteryzowała ekspresja podtypu białka PorA odpowiadającego antygenowi zastosowanemu w szczepionce. Szczepionki wtOMV nie miały potencjału, by stać się szczepionkami globalnymi, ale dostarczyły potwierdzenia, że istnieją inne niż polisacharyd B antygeny, które wywołują efektywną odpowiedź immunologiczną [19].

Prace nad poszukiwaniem antygenów rozpoczęły się, gdy tylko zsekwencjonowano pierwszą część genomu Neisseria meningitidis MC58, szczepu odpowiedzialnego za epidemię w Wielkiej Brytanii. Podejście “odwrotnej wakcynologii” umożliwiło wytypowanie produktów tych genów, których ekspresja zachodziła na niskim poziomie. Większość z wytypowanych kandydatów należała do grupy białek błonowych, eksponowanych na powierzchni komórki, co mogło wskazywać na ich potencjalną zdolność do wywołania reakcji immunologicznej. Schemat prowadzonych badań oraz skrócony opis laboratoryjnej weryfikacji skuteczności wytypowanych antygenów opisuje Ryc. 2.

Ryc. 2

Podstawą do konstrukcji szczepionki przeciw MenB stały się trzy zidentyfikowane antygeny: fHbp, NHBA oraz NadA. fHbp to zakotwiczona w błonie komórkowej lipoproteina o masie ok. 18,5 kDa. Posiada zdolność wiązania ludzkiego czynnika H (Factor H), czyli białka obniżającego aktywność układu dopełniacza poprzez inaktywację składnika C3b oraz konwertazy C3 (C3bBb), która ma kluczowe znaczenie w wytwarzaniu białka C5 i kompleksu atakującego błonę (MAC). Związanie czynnika H na powierzchni N. meningitidis pozwala zatem uniknąć bakteriobójczego działania układu dopełniacza, umożliwia tym samym przetrwanie i namnażanie się bakterii we krwi gospodarza. Co więcej, N. meningitidis upodabnia się do komórek gospodarza, ponieważ boczne łańcuchy białka fHbp imitują rolę glikozaminoglikanów regionu rozpoznającego czynnik H w komórkach śródbłonka [58]. Analiza ponad 7000 izolatów klinicznych pozwoliła również na wyróżnienie ponad 860 podtypów białka fHbp, które podzielono na trzy główne warianty. Indukowane przeciwciała skutecznie rozpoznawały inne podtypy fHbp tylko w obrębie danego wariantu [3]. Badania te potwierdziły więc konieczność wykorzystania więcej niż jednego wariantu białka fHbp w szczepionce przeciw MenB, co zastosowano przy konstrukcji szczepionki Trumenba^® [16].

NHBA jest lipoproteiną o masie ok. 50,5 kDa. Dzięki obecności regionu bogatego w argininę białko jest w stanie in vitro wiązać heparynę, która u ludzi jest czynnikiem zapobiegającym krzepnięciu krwi. Białko ełni również rolę w adhezji do komórek gospodarza, a jego ekspresja jest ściśle skorelowana z przeżywalnością bakterii [59].

NadA to natomiast białko o masie 34 kDa. Występuje tylko u ok. 30% izolatów, najczęściej u hiperwirulentnych szczepów N. meningitidis. Uczestniczy w adhezji i infekcji komórek śródbłonka oraz indukuje powstawanie przeciwciał o silnych właściwościach bakteriobójczych [28]. Poziom ekspresji NadA różni się pomiędzy szczepami i jest kontrolowany przez regulator NadR, który pełni rolę represora transkrypcji. W warunkach hodowli in vitro, ekspresja genu nadA zachodzi na niskim poziomie, co było przyczyną niedoszacowania potencjalnej roli antygenu w konstrukcji szczepionki. Zaobserwowano jednak znaczny wzrost ekspresji białka in vivo. Zdolność wiązania NadR do sekwencji promotorowej genu nadA jest modulowana przez 4-HPA (4-hydroxyphenylacetic acid), związek produkowany przy stanach zapalnych i obecny w ślinie [15].

W celu zwiększenia skuteczności szczepionki oraz zakresu indukowanej ochrony, przeprowadzono fuzję ww. białek z innymi antygenami, wybranymi na podstawie zdolności do indukowania produkcji przeciwciał w modelach zwierzęcych. Zaprojektowano i przeanalizowano ponad 30 fuzji. Fuzja białek fHbp z GNA2091 oraz NHBA z GNA1030 zwiększała aktywność bakteriobójczą indukowanych przez nie przeciwciał. Natomiast NadA po połączeniu z innym białkiem tracił swoją skuteczność, co prawdopodobnie wynikało ze zmian w jego strukturze trzeciorzędowej, w związku z czym zrezygnowano z jego dodatkowej modyfikacji [34].

Szczepionka rMenB zawiera zatem zmodyfikowane białka fHbp i NHBA oraz pojedynczy antygen NadA. Szczepionka indukuje powstawanie przeciwciał wykazujących działanie bakteriobójcze w stosunku do 78% badanych izolatów N. meningitidis. W celu zwiększenia skuteczności szczepionki włączono do niej również PorA, czyli poznany wcześniej antygen eksponowany w OMV bakterii [34]. Szczepionka znana wcześniej jako 4CMenB została zarejestrowana pod nazwą Bexsero^® przez Novartis Vaccines, a w styczniu 2013 roku Komisja Europejska zatwierdziła możliwość stosowania szczepionki od drugiego miesiąca życia.

Większość gatunków mikroorganizmów charakteryzuje duża zmienność, wynikająca m.in. z napływu nowych genów przez transfer horyzontalny lub powstawanie nowych wariantów genów przez mutacje. Stało się jasne, że informacja genetyczna pochodząca od pojedynczych izolatów patogenów jest niewystarczająca, by na jej podstawie zaproponować nowe antygeny do wykorzystania w szczepionkach. Istniała potrzeba przeprowadzenia globalnych analiz porównawczych, które pozwoliłyby na wskazanie tych antygenów, które występują u większości opisanych szczepów. Zaproponowany w 2005 roku termin “pangenom” obejmuje sumaryczną pulę genów występujących u reprezentantów danego gatunku [41, 66]. Wyróżnienie w jego obrębie genów rdzeniowych (core), obecnych w każdym z analizowanych genomów, pozwoliło na uwzględnienie konserwacji oraz rozpowszechnienia antygenów jako ważnych parametrów przy projektowaniu nowych szczepionek.

Narzędzia bioinformatyczne w ciągu ostatniej dekady stały się podstawowymi środkami do poszukiwania nowych celów molekularnych leków lub kandydatów na szczepionki. Opracowany w 2019 roku PanRV jest pierwszym narzędziem umożliwiającym poszukiwanie antygenów in silico w kontekście pełnego pangenomu danego gatunku patogenu, w którym cztery funkcjonalne moduły łączą się w integralną całość. PanRV składa się z modułów: i) PGM (pangenome estimation module), ii) RVM (reverse vaccinology module), iii) FAM (functional annotation module), iv) ARM (antibiotic resistance association module) [45].

Moduł PGM odpowiada za przeprowadzenie analizy pangenomu na podstawie zadanych sekwencji. Umożliwia przeprowadzenie analizy tysięcy sekwencji genomowych przy użyciu jednego narzędzia. Efektem analizy jest podział zidentyfikowanych genów na grupy zgodnie z ich częstością występowania wśród izolatów. Najważniejszą funkcję pełni moduł RVM, który stosując kolejne filtry ostatecznie typuje odpowiednich kandydatów do dalszej analizy. Funkcje stosowanych filtrów opisano w Tabeli I.

Moduł FAM programu PanRV odpowiada za funkcjonalną adnotację analizowanych genów. Pozwala na opisanie biologicznej i molekularnej funkcji białek oraz oszacowanie ich znaczenia dla komórki bakteryjnej. Na podstawie sekwencji białka w formacie FASTA przeprowadzany jest BLAST [1] w odniesieniu do baz UniProt [2] oraz COG [65]. Ostatnim z modułów jest ARM, którego zadaniem jest sprawdzenie powiązań wytypowanych białek ze znanymi mechanizmami antybiotykooporności na podstawie bazy danych CARD (antibiotic resistance database) [37]. Ten krok pozwala na wytypowanie antygenów charakterystycznych dla opornych na antybiotyki szczepów patogenu, m.in. wieloopornych szczepów MDR [45].

W celu przeprowadzenia testu wyżej opisanej procedury analizowano genomy 301 szczepów Staphylococcus aureus, bakterii odpowiedzialnej za przypadki sepsy oraz ostrego uszkodzenia płuc (ALI – acute lung injury), które cechuje się śmiertelnością na poziomie 40% [74]. W wyniku analizy przeprowadzonej przez moduł PGM, spośród puli 11384 genów tworzących pangenom wytypowano 1524 geny rdzeniowe (13%) obecne u wszystkich szczepów. Zastosowanie modułu RVM pozwoliło wskazać wśród nich 7 potencjalnych kandydatów na szczepionkę oraz oszacować ich powinowactwo do receptorów limfocytów T oraz B. Dalsze analizy wykazały istotną rolę każdego z białek w przeżywalności i patogenności bakterii. Zastosowanie analizy pangenomu patogenu i połączenie jej z technikami odwrotnej wakcynologii pozwoliło na znaczne skrócenie czasu prowadzonych badań i wytypowanie antygenów konserwowanych w obrębie gatunku [45].

Kolejnym przykładem zastosowania genomiki porównawczej we współczesnej nauce są badania nad Mycoplasma pneumoniae. Ta beztlenowa bakteria jest jedną z najczęstszych przyczyn infekcji górnych i dolnych dróg oddechowych oraz stanów zapalnych płuc, które rozwijają się u 10–40% zakażonych pacjentów [69]. Ze względu na niezdolność bakterii do syntezy peptydoglikanu, jest naturalnie oporna na antybiotyki β-laktamowe. Z powodu tych właściwości M. pneumoniae stanowi duże zagrożenie w kontekście szerzącej się wśród szczepów patogennych oporności na kolejne grupy antybiotyków. Wobec tego, głównym zadaniem jest identyfikacja nowych celów molekularnych dla leków oraz odnalezienie antygenów możliwych do wykorzystania przy konstrukcji szczepionki [71]. Do porównawczej analizy genomowej wykorzystano 88 kompletnych sekwencji genomowych M. pneumoniae dostępnych w bazie GenBank. Do analizy plików w formacie FASTA wykorzystano narzędzie OrthoFinder. Działanie programu opiera się o algorytmy BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) oraz MCL (Markov Cluster Algorithm), co pozwala na odnalezienie regionów homologicznych oraz wygenerowanie „rodzin” białek na podstawie ich sekwencji [14]. Następnie zidentyfikowane geny podzielono na trzy grupy: i) geny „rdzeniowe” obecne u wszystkich szczepów, ii) geny obecne u części ze szczepów, iii) geny występujące u tylko jednego szczepu bakterii. Za pomocą programu BLASTp przyrównano sekwencje aminokwasowe kodowane przez odnalezione geny patogenu do proteomu człowieka w celu wytypowania tych białek bakteryjnych, które nie wykazują homologii wobec żadnego z białek człowieka. Ten krok umożliwił wyeliminowanie tych antygenów, które mogłyby wywołać reakcję autoimmunologiczną lub nie spowodować żadnej odpowiedzi układu odpornościowego [71].

Bazę DEG (Database of Essential Genes) wykorzystano do zweryfikowania roli odnalezionych białek. Do dalszej analizy wybrano białka, które uznano za niezbędne lub kluczowe w rozwoju i wirulencji bakterii. Lokalizację komórkową białek oszacowano przy użyciu narzędzia SurfG+, a białka zidentyfikowane jako eksponowane na powierzchni komórki lub ulegające sekrecji wykorzystano w dalszej pracy zgodnie z założeniami odwrotnej wakcynologii [71].

Porównawcze analizy genomowe odgrywają szczególną rolę przy konstrukcji szczepionek skierowanych przeciwko tym bakteriom, których tylko niektóre odmiany są patogenne. Przykładem jest Escherichia coli, której niepatogenne warianty są obecne w mikrobiocie jelit ponad 90% populacji [33]. Wśród szczepów E. coli powodujących infekcje wyróżniono m.in. EPEC (enteropathogenic E. coli), STEC (Shigatoxin producing E. coli), EHEC (enterohaemorrhagic E. coli) czy UPEC (uropathogenic E. coli). Odnalezienie antygenów obecnych wyłącznie u patogennych szczepów E. coli jest koniecznym krokiem w konstrukcji szczepionek. Przykładem odnalezionego antygenu jest FimH, adhezyna charakterystyczna dla uropatogennych szczepów E. coli [46].

Kolejnym krokiem w rozwoju odwrotnej wakcynologii stało się projektowanie antygenów na podstawie izolowanych przeciwciał monoklonalnych. Był on możliwy dzięki osiągnięciom technicznym ostatniej dekady. Po pierwsze, udoskonalono metody klonowania ludzkich limfocytów B oraz ich wykorzystania do produkcji rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych lub samych fragmentów Fab zdolnych do wiązania antygenów [26, 63, 75]. Pozwoliło to na opracowanie skuteczniejszych metod szacowania odpowiedzi układu immunologicznego po kontakcie z dowolnym antygenem w trakcie infekcji lub po użyciu szczepionki. Po drugie, techniki mapowania epitopów konformacyjnych, poprzez analizy struktury 3D fragmentów Fab połączonych w kompleksy z ich antygenami, są w stanie opisać je z atomową dokładnością. Wykorzystanie tych danych pozwala na projektowanie nowych immunogenów mających wywołać bardzo precyzyjną odpowiedź immunologiczną celującą w wybrane epitopy [55]. Ryc. 3. przedstawia najważniejsze etapy projektowania nowego antygenu szczepionkowego z wykorzystaniem odwrotnej wakcynologii 2.0.

Ryc. 3

Szczególnie obiecujące wyniki odwrotnej wakcynologii 2.0 uzyskano jak dotąd w przypadku chorób wirusowych. Strategia ta została wykorzystana m.in. do opracowania szczepionki przeciwko syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV). Infekcje wywołane przez RSV mogą prowadzić u dzieci poniżej piątego roku życia do ciężkich zaburzeń oddychania [7]. Wirus ten jest główną przyczyną hospitalizacji w tej grupie wiekowej, powoduje też znaczną śmiertelność u osób starszych w skali podobnej do grypy sezonowej. RSV skutecznie unika mechanizmów odporności. Tak na przykład niestrukturalne białka 1 i 2 hamują funkcje efektorowe interferonu typu I, zaś glikoproteina G działa immunomodulująco i może wpływać na szlaki sygnałowe w komórkach prezentujących antygen [10, 35]. Ponadto infekcja i uwalnianie wirionów na wierzchołkowej powierzchni spolaryzowanego nabłonka dróg oddechowych są względnie izolowane od ogólnoustrojowych odpowiedzi układu odpornościowego.

Szczepionka opracowana w latach 60. XX wieku opierająca się na inaktywowanym wirusie nasilała przebieg zakażenia RSV po naturalnym zachorowaniu, co spowodowało zaprzestanie jej stosowania [60]. Badania in vitro wskazywały, że przeciwciała skierowane przeciw glikoproteinie F skutecznie neutralizują wirusa, ale jednocześnie immunizacja zwierząt doświadczalnych nie prowadziła do uzyskania wysokiego poziomu przeciwciał mających tę zdolność. Z pomocą przyszła odwrotna wakcynologia 2.0. Ludzkie limfocyty B po wyizolowaniu bezpośrednio od ozdrowieńców posłużyły jako źródło przeciwciał monoklonalnych (humAbs). Spośród wszystkich przeciwciał przebadanych pod kątem neutralizacji RSV in vitro, humAb o nazwie D25 było najsilniejsze, 100–150 razy silniejsze niż licencjonowany paliwizumab, jedyne przeciwciało monoklonalne zatwierdzone przez FDA do stosowania w leczeniu RSV u niemowląt [17, 39, 67]. Potwierdziło to zasadność stosowania powierzchniowej glikoproteiny F w charakterze antygenu szczepionkowego, ale dopiero rozwiązanie struktury krystalicznej tego białka w pełni wytłumaczyło uzyskiwane wcześniej wyniki. Białko F występuje w dwóch stanach konformacyjnych: pre-F (przed fuzją) i post-F (po fuzji). Okazało się, że tylko wtedy, gdy glikoproteina F występuje w konformacji pre-F, na powierzchni jej struktury dostępne są wysoce wrażliwe na neutralizację epitopy (miejsca oznaczone jako Ø, II i V) rozpoznawane m.in. przez przeciwciało D25. Samoistna zmiana konformacji na post-F powoduje, że przeciwciało D25 nie jest zdolne do wiązania się z białkiem F. Stwierdzono również, że chociaż przeciwciała (np. palivizumab) skierowane przeciwko miejscom antygenowym II i IV, które są obecne na powierzchni zarówno konformacji pre-F, jak i post-F, mogą osiągnąć wysoką siłę działania, większość z nich ma umiarkowaną aktywność [29, 40].

Glikoproteina F ustabilizowana w konformacji przedfuzyjnej weszła w skład preparatu (DS-Cav1), który po pozytywnych wynikach uzyskanych na różnych modelach zwierzęcych (myszy, makaki), aktualnie przechodzi badania kliniczne I fazy [38, 44].

Powyższa strategia polegająca na wyborze „miejsca wrażliwego na neutralizację” może mieć również zastosowanie w przypadku opracowania szczepionek przeciwko innym wirusom (np. HIV), choć jej powodzenie zależy m. in. od poziomu aktywności neutralizującej wymaganego do uzyskania ochrony jak również zmienności wirusów. Badania te podkreślają również, jak istotne jest opisanie mechanizmu naturalnej odpowiedzi układu odpornościowego człowieka na infekcję.

Powstanie odwrotnej wakcynologii 2.0 umożliwiło dalszy rozwój badań nad szczepionką przeciw N. meningitidis ser. B i odnalezienie nowych antygenów tej bakterii. Od siedmiomiesięcznego dziecka chorego na IMD (invasive meningococca disease) pobrano krew i opisaną metodą otrzymano osiem różnych przeciwciał monoklonalnych. Trzy z nich charakteryzowało działanie bakteriobójcze przeciw szczepom MenB zależne od elementów układu dopełniacza, które jednak nie rozpoznawały antygenów odnalezionych w trakcie analizy genomu bakterii in silico [4].

Odwrotną wakcynologie 2.0 wykorzystano również do identyfikacji funkcjonalnych mAb przeciwko Staphylococcus aureus indukowanych podczas bakteriemii. Cztery z dziesięciu odnalezionych mAb, wzmocniły immunofagocytozę szczepu referencyjnego S. aureus. Jednak tylko trzy z nich rozpoznawały znane wcześniej antygeny [31].

Inny przykład stanowi Streptococcus pneumoniae, którego wysoka zmienność utrudnia zaprojektowanie szczepionki skutecznej przeciw większości wariantów obecnych w populacji. W 2021 roku wyizolowano przeciwciała monoklonalne P13-D9K oraz E12K, których skuteczność następnie przetestowano przeciw 25 szczepom pneumokoków. Wykazano 92% reaktywność obu przeciwciał wobec testowanych serotypów, co sugerowało, że rozpoznają one wysoce konserwowane epitopy. Analiza Western-blot wykazała, że oba typy przeciwciał rozpoznają białko o wielkości około 63 kDa, które nie zostało jeszcze dokładnie opisane – wykazano natomiast bakteriobójcze właściwości przeciwciał in vitro oraz in vivo [62].

Jedną z największych przeszkód przy projektowaniu nowych szczepionek podjednostkowych jest wysoka zmienność antygenów. Elementy układu odpornościowego rozpoznają te epitopy, które są w jakiś sposób eksponowane na powierzchni antygenu – zatem powstawanie nowych wariantów antygenów jest konsekwencją “wyścigu zbrojeń” między patogenami a układem immunologicznym. Może się to wiązać z występowaniem wielu odmian mikroorganizmów patogennych lub częstymi mutacjami powodującymi rozpowszechnienie nowego wariantu antygenu w całej populacji, jak to się dzieje w przypadku wirusa grypy [23]. Być może rozwiązanie tej sytuacji przyniesie właśnie odwrotna wakcynologia 2.0. Strategię tę wykorzystano do opracowania immunogenu, którego celem jest indukcja ochrony przed zakażeniem wirusem HIV. W 2013 roku opisano historię pacjenta, u którego wykształciła się bardzo skuteczna reakcja układu odpornościowego – po ok. 3 latach od infekcji zidentyfikowano przeciwciała szeroko neutralizujące (broadly neutralizing antibodies, bnAb) rozpoznające powierzchniowe białko gp120 wirusa HIV [27, 77]. Badanie repertuaru komórek B izolowanych od osób zainfekowanych HIV umożliwiło wyodrębnienie kilku szeroko neutralizujących przeciwciał, które powstają w wyniku naturalnej infekcji, m.in. przeciwciał klasy VRC01 [73]. Charakteryzują się one wysokim stopniem hipermutacji somatycznej w stosunku do linii zarodkowej, co sugeruje, że ich rozwój wymaga długotrwałej ekspozycji na antygen. Informacje o strukturze wykazującego ogromną zmienność białka gp120 oraz jego interakcjach z wyizolowanymi bnAb zostały wykorzystane do identyfikacji jego konserwowanych epitopów. Zaprojektowano immunogen eOD-GT8, który ma za zadanie aktywować prekursorowe komórki B linii zarodkowej. Dzięki zastosowaniu odwrotnej wakcynologii 2.0 jesteśmy więc w stanie zidentyfikować konkretne epitopy wiążące przeciwciała, co w sytuacji, ogromnej niekiedy, zmienności strukturalnej antygenów pozwoli na konstrukcję preparatów o większym potencjale immunogennym [6, 20].

Rozwijanie i stosowanie nowych strategii projektowania antygenów szczepionkowych jest nierozerwalnie związane z poznaniem mechanizmów odpowiedzi swoistej (nabytej), która wiąże się z produkcją specyficznych przeciwciał w odpowiedzi na kontakt z antygenem. Niedawne wyniki badań wskazują jednak na istnienie zjawiska “wytrenowanej odporności nieswoistej” (trained innate immunity), którego efektem jest wzmocnienie niespecyficznej odpowiedzi immunologicznej przy wtórnym zakażeniu – dokładny mechanizm molekularny tego procesu nie został jeszcze dokładnie poznany. Kolejne wyzwania dotyczą m.in.: (a) odnalezienia nowych adiuwantów w celu zwiększenia potencjału immunogennego szczepionek, [47, 53], (b) opracowania wektorów dla szczepionek podjednostkowych [11], (c) stworzenia szczepionek przeciw bakteriom patogennym, wśród których rozprzestrzeniają się mechanizmy oporności na antybiotyki [22, 24], (d) poznania molekularnych podstaw różnic w skuteczności szczepień w populacji [48, 50, 51] oraz (e) zniwelowanie występowania niepożądanych odczynów poszczepiennych [52, 72].

Poziom zaufania społecznego do szczepionek jest równie istotny, co postępy w dziedzinach wakcynologii, immunologii i genomiki. Brak pewności co do bezpieczeństwa dostępnych preparatów i obawa przed wystąpieniem poważnych skutków ubocznych to jedna z najważniejszych przyczyn zaniechania szczepień ochronnych (vaccine hesitancy). Zwiększenie liczby kontroli i testów nie ma przełożenia na wzrost bezpieczeństwa leków, zatem ich jakość musi zostać zaprojektowana. Podejście to, nazwane Quality by Design (QbD), może być wykorzystane również przy projektowaniu szczepionek nowej generacji. Opracowanie protokołów postępowania zawierających minimalną ilość zmiennych przyczyni się do zmniejszenia liczby nieprzewidzianych skutków szczepienia. Szczególną uwagę zwraca się na szczepionki zawierające kwasy nukleinowe, ponieważ w ich przypadku jedyną istotną zmienną jest sekwencja DNA lub mRNA wykorzystywanego w preparacie. Rolą odwrotnej wakcynologii jest wskazanie kandydatów na antygeny szczepionkowe na podstawie analiz genomowych, natomiast zastosowanie schematów działania z uwzględnieniem QbD może umożliwić szybkie przejście do fazy testów klinicznych. Pierwszy z takich schematów został opracowany na podstawie badań związanych z epidemią COVID-19 i zaproponowany w kwietniu 2021 roku [70]. Odpowiednia komunikacja osiągnięć współczesnej wakcynologii dzięki współpracy naukowców, specjalistów zdrowia publicznego i dziennikarzy naukowych jest warunkiem koniecznym, by odbudować zaufanie społeczne do obowiązkowych i dobrowolnych szczepień ochronnych.