This work is licensed under the Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
Wprowadzenie
Zdolność do szybkiego reagowania na zmieniające się warunki środowiska wynikająca z regulacji ekspresji genów jest konieczna dla przetrwania wszystkich żywych organizmów. Istnienie zróżnicowanych mechanizmów regulatorowych pozwala na dokładną i natychmiastową odpowiedź na sygnały płynące ze środowiska, co znacząco zwiększa szansę na przetrwanie. Regulacja może zachodzić poprzez wyciszenie lub aktywację ekspresji wybranych genów i biosyntezę wyspecjalizowanych białek. U Prokaryota kontrola ekspresji genów zwykle nie odbywa się dla pojedynczych genów, lecz dla całych grup genów tworzących operony. Ekspresja genów jest podstawowym procesem pozwalającym na odczytywanie informacji genetycznej danego organizmu, a regulacja ekspresji genów jest podstawowym mechanizmem służącym adaptacji do zmiennych warunków środowiska, zapewnieniu wzrostu i zróżnicowania oraz utrzymaniu homeostazy organizmu. Ekspresja genów to proces wieloetapowy, a każdy etap może podlegać regulacji. U Prokaryota produktami ekspresji genów mogą być białka i RNA, tj.: rybosomowy (rRNA), transportujący (tRNA), informacyjny (mRNA), transportująco-informacyjny (tmRNA) czy mały, niekodujący RNA (sRNA) [57].
Wpływ małych, niekodujących RNA na ekspresję genów u bakterii
Małe, niekodujące cząsteczki RNA (sRNA, small non-coding RNA), określane również jako małe, regulatorowe RNA, zostały po raz pierwszy odkryte u bakterii w 1967 roku, ale ich znaczenie i powszechność występowania były długo niedoceniane [86]. Jeszcze do niedawna uważano, że regulacja ekspresji genów jest kontrolowana prawie całkowicie przez białka wiążące się z kwasami nukleinowymi. W ostatnich latach okazało się, że sRNA pełnią znaczącą funkcję na prawie każdym etapie regulacji ekspresji genów, a kontrola przez sRNA jest określana mianem ryboregulacji [33, 105, 109].
Nadal nie jest znana dokładna liczba sRNA u bakterii. W przypadku modelowej bakterii Escherichia coli wytypowano ∼ 100 cząsteczek sRNA (w porównaniu z 4300 białkami), podczas gdy liczby dwa lub trzy razy wyższe zostały zaproponowane dla innych gatunków bakterii. Jeśli w wyliczeniach nie pominięto dużej klasy sRNA pochodzącego z mRNA, wydaje się wysoce prawdopodobne, że u bakterii liczba tego rodzaju RNA oscyluje na poziomie kilkuset cząsteczek. Trudność z ustaleniem dokładnej liczby wynika z faktu, że wiele krótkich transkryptów zostało wykrytych tylko w ramach jednego eksperymentu i nie wykazano ich funkcji [33]. Wydaje się również, że sRNA pełniące określone funkcje regulacyjne są często pomijane w badaniach, ponieważ ulegają ekspresji tylko w bardzo specyficznych warunkach. Ponadto ich budowa i forma sprawiają, że nie są łatwo wykrywalne [9, 33].
Możliwe, że cząsteczki sRNA wyewoluowały bardzo wcześnie, aby uczynić genom bardziej stabilnym. Geny kodujące sRNA wykazują cechy świadczące o ich duplikacji oraz niewątpliwie podlegają horyzontalnemu transferowi. Niewykluczone, że sRNA mogły również ewoluować z tRNA, mRNA lub podczas losowej transkrypcji, aby pomóc w modulowaniu metabolizmu komórkowego, optymalizacji dostępności dla komórki składników odżywczych, czy zwiększeniu prawdopodobieństwa przeżycia mikroorganizmu [33]. Wykazano, że sRNA mogą modulować wirulencję, różnicowanie komórkowe, szlaki metaboliczne oraz wpływać na adaptację bakterii do warunków środowiskowych [69].
Mały, regulatorowy RNA kodowany jest zazwyczaj przez oddzielną, autonomiczną jednostkę transkrypcyjną o długości około 40–500 nukleotydów [55]. Przeważająca część sRNA posiada strukturę spinki oraz regiony nieustrukturyzowane. Często sama sekwencja ujawnia niewiele, zaś funkcjonalność sRNA bądź jego rolę można poznać dopiero podczas głębszych analiz. Pomimo braku wyodrębnienia jednolitych klas bakteryjnych sRNA, istnieją pewne wspólne reguły dotyczące kontroli potranskrypcyjnej, w których biorą one udział [44]. Na tym poziomie kontroli, sRNA należą do najliczniejszej grupy regulatorów u bakterii. Celami dla sRNA są cząsteczki mRNA i białka (Ryc. 1). Cząsteczki sRNA mogą decydować o tym, czy mRNA będzie podlegać translacji bądź też zmieniać aktywność białek regulatorowych (czynników transkrypcyjnych) lub czynników sigma na drodze tzw. mimikry molekularnej. W drugim przypadku sRNA naśladuje cel dla danego białka, przez co ulega ono wymiareczkowaniu i jego aktywność jest hamowana [29].
Ryc. 1
Podział prokariotycznych sRNA w oparciu o sposób działania
W oparciu o sposób działania można wyróżnić dwa rodzaje sRNA: sRNA oddziałujące z częściowo lub w pełni komplementarnymi regionami w innych cząsteczkach RNA (A) oraz wiążące się z białkami (B) Antysensowe RNA może być kodowane in cis, tworzy wtedy pełne dupleksy z docelowym mRNA, lub in trans i tworzy wówczas częściowe, krótkie dupleksy z mRNA. sRNA wiążące białka mogą działać poprzez sekwestrację polimerazy RNA lub sekwestrację regulatorów translacji. We wszystkich przypadkach wiązanie sRNA może aktywować lub hamować translację docelowego mRNAlub funkcję białka, z którym oddziałuje. Na podstawie [30 i 108].
sRNA mogą pozytywnie, jak i negatywnie regulować ekspresję genów. Zazwyczaj dzieje się to poprzez tworzenie komplementarnych par zasad z docelowymi mRNA, z którymi dzielą większą bądź mniejszą komplementarność sekwencji, co prowadzi do zaburzenia stabilności mRNA, a czasem jego degradacji [32]. Można rozróżnić sRNA kodowane in cis oraz in trans. Pierwsze z nich transkrybowane są z nici komplementarnej do nici kodującej pojedyncze docelowe mRNA i w rezultacie wiążą się z nim tworząc dupleks na całej długości sekwencji (Ryc. 1A, lewy panel). W większości przypadków efektem regulatorowym jest inhibicja translacji. Ponieważ zarówno sRNA, jak i docelowy mRNA, są transkrybowane w bliskim sąsiedztwie ze względu na położenie in cis, dochodzi do wysokiej lokalnej koncentracji obu typów cząsteczek. Zjawisko to wraz z ograniczoną dyfuzją transkryptów prowadzi do wydajnej interakcji pomiędzy antysensowym a docelowym RNA, która jest biologicznie efektywna. Przestrzenna bliskość miejsc promotorowych antysensowego i docelowego RNA powoduje także interferencję transkrypcyjną [10, 86]. Bardzo istotnym jest fakt, iż w tym typie regulacji określony sRNA kontroluje ekspresję tylko jednego genu. Większość sRNA kodowanych in cis zlokalizowana jest na plazmidach lub innych mobilnych elementach genetycznych, wtedy też ich rola związania jest z utrzymaniem odpowiedniej liczby kopii tychże elementów genetycznych [10, 107].
W przypadku sRNA kodowanych in trans, sRNA i regulowany gen znajdują się w różnych miejscach na chromosomie bakteryjnym, czasem nawet w bardzo dużej odległości od siebie. Co więcej, taki regulatorowy RNA może zawiadować ekspresją nie jednego genu, lecz nawet bardzo wielu genów, ponieważ parowanie nie jest w pełni komplementarne i zachodzi na krótkim odcinku sekwencji (Ryc. 1A, prawy panel). Te sRNA są podobne do eukariotycznych mikroRNA pod względem zdolności do modulowania aktywności i stabilności wielu mRNA. Jeśli chodzi o efekt regulatorowy, to może nim być, zarówno inhibicja, jak i indukcja translacji. Prawie wszystkie sRNA należące do tej klasy ulegają ekspresji w określonych warunkach wzrostu, począwszy od głodu żelazowego, stresu oksydacyjnego i warunków beztlenowych, do stresu wywołanego zaburzeniem struktury osłon, niskiego stężenia magnezu lub wysokiego stężenia glukozo-6-fosforanu i głodu glukozowego [33].
Ważnym białkiem biorącym często udział w wiązaniu mRNA z sRNA kodowanym in trans jest białko Hfq, które pełni rolę molekularnego „opiekuna” (ang. chaperone). Białko to może jednocześnie wiązać sRNA i mRNA, tym samym ułatwiając efektywne parowanie zasad azotowych pomiędzy dwoma łańcuchami. Hfq również chroni sRNA przed degradacją nim dojdzie do sparowania obu cząsteczek RNA oraz może rekrutować czynniki pomocnicze procesów regulacyjnych (przykładem jest rybonukleaza RNaza E) [44]. W badaniach wykazano, że RNA wiążące Hfq posiadają charakterystyczny motyw w sekwencji nukleotydowej, tj. 5′-AAYAAYA-3′ [56]. Region ten znajduje się na końcu 5′ cząsteczki sRNA i jest miejscem wiązania dla białka Hfq, niezbędnego do funkcjonowania i stabilizacji sRNA [87, 93]. Na końcu 5′ występuje również krótki, często wysoce konserwowany i zwykle jednoniciowy region wykorzystywany do parowania zasad z docelowym mRNA. Z kolei w obrębie końca 3′ nić przybiera strukturę spinki do włosów, po której występuje ogon poli(U). Obecność ogona poli(U) sprzyja terminacji transkrypcji niezależnej od białka Rho i chroni sRNA przed egzonukleazami degradującymi ten koniec. Jest to powszechnie występujący element w transkryptach bakteryjnego RNA, a taka budowa końca 3′ ułatwia rozpoznanie sRNA przez białko opiekuńcze Hfq [87].
Tworzenie komplementarnych par zasad pomiędzy sRNA i mRNA może mieć szereg skutków regulacyjnych. Parowanie zasad w miejscu wiązania rybosomu na mRNA blokuje proces translacji. Co ciekawe, systematyczne przesuwanie regionu zaangażowanego w oddziaływanie sRNA RybB z mRNA ompN u Salmonella enterica wykazało, że RybB może blokować translację nawet wtedy, gdy region parowania znajduje się daleko, bo w obrębie piątego kodonu w otwartej ramce odczytu (ORF) [9]. Translacja może być również zablokowana, gdy region parowania znajduje się 50 lub więcej nukleotydów powyżej miejsca wiązania rybosomu [88]. W większości przypadków, gdy wiązanie rybosomu jest zablokowane, obserwuje się również związany z tym spadek stabilności mRNA. Dla innych docelowych mRNA, tworzenie komplementarnych par zasad z sRNA zachodzi poniżej sekwencji Shine-Dalgarno (SD), tak że wiązanie rybosomu nie zostaje zablokowane. Na przykład parowanie zasad pomiędzy małą cząsteczką RNA MicC i mRNA ompD S. enterica w obrębie kodonów 23–26 przyspiesza rozpad mRNA zależny od RNazy E bez blokowania wiązania rybosomu [73]. Oprócz hamowania sRNA mogą również aktywować proces translacji, w wielu przypadkach zapobiegając tworzeniu struktury drugorzędowej w mRNA hamującej wiązanie rybosomu [58, 66, 77].
Dwuskładnikowe systemy transdukcji sygnału
Proces adaptacji bakterii do dynamicznie zmieniających się parametrów fizycznochemicznych środowiska jest możliwy dzięki obecności zróżnicowanych systemów regulacyjnych. Specyficznymi sygnałami środowiska prowadzącymi do odpowiedzi komórki bakteryjnej są zmiany: pH, osmolarności, gęstości komórek, temperatury czy dostępności tlenu i składników odżywczych. Bakterie nieustanie odbierają sygnały z otoczenia, które przekładają się na zmianę wzoru ekspresji genów, aby sprawnie zaadoptować się do nowych warunków [43, 70].
Systemy transdukcji sygnału, powszechnie określane mianem „dwuskładnikowych” (TCS, two-component system), w swojej najprostszej postaci składają się z pary białek, między którymi dochodzi do transdukcji sygnału, tj. transferu grupy fosforanowej. Bardzo często TCS stanowią złożony szlak fosfotransferu, w którym bierze udział większa liczba komponentów. Systemy te, powszechne u bakterii, obecne są również u niektórych roślin, niższych eukariontów i archeonów [71]. Uczestniczą w regulacji wielu procesów fizjologicznych, do których zaliczamy kompetencję, koniugację, sporulację, bioluminescencję, wirulencję, syntezę antybiotyków, ruchliwość, tworzenie biofilmu, czy transport jonów (np. Fe3+, Mg2+, Ca2+) i substancji odżywczych niezbędnych dla funkcjonowania bakterii [47]. TCS odbierają sygnały chemiczne i fizyczne, takie jak: temperatura, pH, osmolarność, potencjał redoks, stężenie jonów i związków odżywczych, jak również zawartości tlenu [47, 92].
Działanie dwuskładnikowego systemu regulacyjnego jest oparte na transferze grupy fosforanowej pomiędzy kinazą histydynową (HK, histidine kinase), a regulatorem odpowiedzi (RR, response regulator) [28]. Kinazy to jedna z największych i najbardziej znaczących rodzin wśród wszystkich białek. Rozpoznają sygnały pochodzące ze środowiska zewnętrznego, a mechanizm ich działania polega na oddziaływaniu z innymi białkami, co prowadzi do ich przejściowej fosforylacji [1]. Kinaza histydynowa w TCS jest białkiem zakotwiczonym w błonie cytoplazmatycznej, zbudowanym z dwóch domen: N-końcowej pełniącej rolę sensora oraz C-końcowej o funkcji przekaźnika sygnału. Odebranie sygnału powoduje autofosforylację konserwowanej reszty histydynowej w domenie C-końcowej kinazy, z kolei ufosforylowana kinaza pełni rolę donora grupy fosforanowej dla cytoplazmatycznego białka regulatorowego. Podobnie jak kinazy, białka regulatorowe są złożone z domeny N-końcowej, która tutaj pełni rolę odbiornika (fosforylacji ulega konserwowana reszta asparaginianowa) i efektorowej domeny C-końcowej. Przekazanie sygnału polega na przeniesieniu grupy fosforanowej z kinazy histydynowej na domenę N-końcową regulatora odpowiedzi, który w ten sposób ulega aktywacji i najczęściej pełni rolę regulatora transkrypcji wiążąc się z promotorami regulowanych genów za pomocą swojej domeny C-końcowej (Ryc. 2) [11, 28].
Ryc. 2
Budowa typowego dwuskładnikowego systemu transdukcji sygnału
Najprostszy dwuskładnikowy system transdukcji sygnału, składa się z kinazy histydynowej (HK) oraz regulatora odpowiedzi (RR), który najczęściej wiążąc się z DNA pełni rolę aktywatora lub represora transkrypcji regulowanych genów. Po odebraniu sygnału ze środowiska kinaza histydynowa ulega autofosforylacji. Przekazanie sygnału, czyli transfer grupy fosforanowej zachodzi pomiędzy resztą histydyny w kinazie, a asparaginianem w białku regulatorowym. CM – błona cytoplazmatyczna. Na podstawie [12].
Prototypem TCS jest system EnvZ/OmpR. Jest to jeden z najlepiej poznanych i scharakteryzowanych systemów regulacyjnych, występujący u niepatogennego szczepu E. coli K-12. Jego funkcję poznano badając mechanizm regulacji syntezy poryn dyfuzji ogólnej w odpowiedzi na zmiany osmolarności środowiska [91]. Ekspresja genu envZ jest niższa niż genu ompR, pomimo lokalizacji obu genów w operonie ompB, będących pod kontrolą wspólnego promotora oraz ulegających transkrypcji w postaci pojedynczego policistronowego mRNA. Kinaza EnvZ jest zbudowana z 450 reszt aminokwasowych (aa) i zlokalizowana w błonie cytoplazmatycznej w postaci homodimeru. Składa się z peryplazmatycznej domeny receptora (48–162 aa), dwóch regionów transbłonowych (TM1, 16–47 aa oraz TM2, 163–179 aa), regionu łącznika (180–222 aa), jak również cytoplazmatycznej domeny kinazy (223–450 aa). Domena kinazy pełni funkcję, zarówno kinazy, jak i fosfatazy. Wykazano, że jest ona zbudowana z dwóch odrębnych domen funkcjonalnych: A (223–289 aa) i B (290–450 aa). Domena A, zawierająca miejsce autofosforylacji His-243, tworzy stabilny dimer i może być fosforylowana w obecności ATP przez domenę B, która występuje jako monomer. Fosforylowana domena A następnie przenosi wysokoenergetyczną grupę fosforanową na regulator OmpR. Ze względu na swoje unikalne cechy, domeny A i B określane są odpowiednio jako domena DHp (dimeryzacja i fosfotransfer) oraz domena CA (katalityczna i wiążąca ATP) [14]. Z kolei regulator OmpR, aktywowany w wyniku fosforylacji z udziałem kinazy histydynowej, pełni funkcję czynnika transkrypcyjnego. W jego N-końcowej domenie znajduje się konserwowana reszta aminokwasowa, kwas asparaginowy (Asp-55), na który przenoszona jest grupa fosforanowa. Zmiana allosteryczna zachodząca w białku pod wpływem tego procesu skutkuje wzmocnieniem wiązania się regulatora z DNA. Fosforylacja zwiększa dimeryzację OmpR i to wzmocnienie tego procesu jest energetyczną siłą napędową regulacji wiązania OmpR-DNA [28].
Charakterystyka oddziaływań pomiędzy dwuskładnikowymi systemami transdukcji sygnału a sRNA
Dwuskładnikowe systemy transdukcji sygnału tak samo jak małe, regulatorowe RNA są szeroko rozpowszechnionymi bakteryjnymi regulatorami ekspresji genów. W większości przypadków TCS kontrolują transkrypcję, zaś duża klasa sRNA działa jako potranskrypcyjne regulatory ekspresji genów, które modulują translację lub stabilność docelowego mRNA. Między tymi dwoma typami regulatorów wiele oddziaływań zostało ostatnio zbadanych, w wyniku czego powstają mieszane ścieżki regulacyjne TCS-sRNA [14]. Niezwykle często sRNA stanowią brakujące ogniwa pomiędzy TCS a genami docelowymi, a także biorą udział w angażowaniu TCS i ich regulonów do innych systemów regulacyjnych w odpowiedzi na różne bodźce środowiskowe. Wydaje się, że współdziałanie TCS-sRNA jest globalną cechą regulacyjną u wielu organizmów prokariotycznych [30, 74].
Oddziaływania pomiędzy TCS a sRNA występują powszechnie u bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych i zachodzą na różne sposoby (Ryc. 3). W takiej sieci regulatorowej ekspresja sRNA może być kontrolowana przez TCS i odwrotnie sRNA mogą regulować ekspresję genów wchodzących w skład danego systemu dwuskładnikowego [74].
Ryc. 3
Sposoby oddziaływań sRNA z TCS
W odpowiedzi na sygnały środowiskowe dwuskładnikowe systemy transdukcji sygnału wpływają na poziom ekspresji wybranych sRNA, a te z kolei kontrolują ekspresję określonych genów w wieloraki sposób: (A) Kilka homologicznych sRNA działa na jeden cel, przy czym każdy sRNA ma zasadniczo taki sam wpływ na cel, jak wszystkie razem. Utrata jednego lub kilku sRNA jest kompensowana przez podwyższony poziom pozostałych sRNA (działanie zastępcze). (B) W przypadku addytywnie działających sRNA, każdy sRNA przyczynia się do zahamowania ekspresji docelowego genu, a najwyższy poziom hamowania osiąga się wtedy, gdy wszystkie sRNA działają razem. (C) Homologiczne sRNA mogą działać zastępczo na jeden gen, ale addytywnie na inny, ekspresja obu sRNA jest regulowana przez wspólny TCS, ale wyłącznie sRNA1 jest regulowane działaniem drugiego, jego aktywacja z kolei ma wpływ na cel 2, ale nie na cel 1. (D) sRNA1 działa pośrednio poprzez zapobieganie degradacji sRNA2, ten zaś reguluje ekspresję określonego genu. Na podstawie [31].
Zaletą regulacji z udziałem sRNA jest mniejszy koszt energetyczny potrzebny do ich wytworzenia oraz rozkładu, w porównaniu z białkami. Często obserwuje się nadmiarowość genów sRNA. Oznacza to, że utrata jednego konkretnego genu sRNA może być często kompensowana przez pozostałe, funkcjonalnie równoważne sRNA. Zróżnicowana transkrypcja funkcjonalnie powiązanych sRNA umożliwia precyzyjne „dostrojenie” ekspresji genów docelowych, dzięki czemu wiele sygnałów może być ze sobą zintegrowanych (Ryc. 3) [30, 102].
Regulacja ekspresji genów białek błony zewnętrznej z udziałem dwuskładnikowych systemów transdukcji sygnału i sRNA
Błona zewnętrzna (OM, outer membrane) chroni bakterie Gram-ujemne przed szkodliwymi czynnikami środowiska. Stanowi również pierwszą warstwę, którą muszą pokonać składniki odżywcze, aby dostać się do wnętrza komórki. Ułatwiają to odpowiednie kanały ogólnej lub specyficznej dyfuzji zbudowane z białek, zwanych porynami. Modelowy organizm E. coli ma kilka poryn, wśród których istotną funkcję pełnią poryny dyfuzji ogólnej OmpC i OmpF. OmpF to trimeryczne białko tworzące kanał o średnicy 1,2 nm, które umożliwia pasaż dużych (∼ 350 Da) hydrofilowych i hydrofobowych cząstek, natomiast OmpC to trimer tworzący kanał o mniejszej średnicy, a więc wykorzystywany do pobierania mniejszych cząstek [42].
Biorąc pod uwagę znaczenie OM, nie dziwi fakt,że ekspresja poryn podlega złożonej regulacji na wielu poziomach (Ryc. 4). W osmoregulacji ekspresji ompC i ompF zaangażowany jest TCS EnvZ/OmpR. Warunki wysokiej osmolarności prowadzą do autofosforylacji osmosensora EnvZ, co z kolei skutkuje fosforylacją regulatora odpowiedzi OmpR (OmpR-P). Wysoki poziom ufosforylowanego OmpR aktywuje transkrypcję ompC, równocześnie hamując ompF. Ponieważ poryna OmpC jest stosunkowo nieprzepuszczalna dla soli żółci, uważa się, że ta regulacja nadaje E. coli tolerancję na sole żółci w wysokiej osmolarności, a więc w warunkach panujących w jelicie zwierząt i ludzi. Przy niskiej osmolarności poziom OmpR-P spada, co hamuje ekspresję ompC, ale aktywuje ompF. Sprzyja to pobieraniu składników odżywczych przez porynę OmpF w środowisku ubogim w składniki odżywcze, a więc poza organizmem gospodarza [68].
Ryc. 4
Kontrola ekspresji białek błony zewnętrznej u E. coli za pomocą sRNA i TCS EnvZ/OmpR
Potranskrypcyjna modulacja ekspresji poryn jest precyzyjnie kontrolowana przez zestaw sRNA w wyniku działania różnych bodźców odbieranych przez TCS EnvZ/OmpR. Ponadto inne czynniki, takie jak faza wzrostu, dostępność składników odżywczych i temperatura również wpływają na ekspresję genów kodujących sRNA (czarne strzałki). Pozytywną kontrolę ekspresji genów zaznaczono niebieskimi strzałkami, natomiast negatywną czerwonymi liniami tępo zakończonymi, linia kropkowana wskazuje na fosfotransfer. Na podstawie [103].
Na poziomie potranskrypcyjnym w ekspresję poryn zaangażowane są antysensowe RNA, MicC (109 nt) oraz MicF (93 nt). MicC wiąże się komplementarnie z liderowym mRNA ompC w obecności Hfq i tym samym blokuje wiązanie rybosomu. W mutancie ompR zaobserwowano wyższy poziom MicC niż w typie dzikim, co sugeruje, że OmpR bezpośrednio lub pośrednio hamuje ekspresję micC [18]. W podobny sposób sRNA MicF reguluje potranskrypcyjnie ekspresję ompF. Równolegle z ompC, ekspresja micF jest indukowana wysoką osmolarnością z udziałem systemu EnvZ/OmpR. MicF jest komplementarny do miejsca wiązania rybosomu i kodonu start AUG w mRNA ompF, a to oddziaływanie prowadzi do zahamowania translacji. Podobnie jak MicC, MicF wiąże białko Hfq. Różne czynniki środowiskowe, oprócz stresu osmotycznego, mogą indukować ekspresję micF, tj. stres oksydacyjny, wzrost temperatury, bogactwo składników odżywczych, obecność soli żółci, słabych kwasów czy niektórych antybiotyków [117].
Oprócz MicC i MicF system transdukcji sygnału EnvZ/OmpR kontroluje ekspresję sRNA OmrA (88 nt) i OmrB (82 nt) [31]. Są to dwa homologiczne sRNA, które różnią się ok. 30 nukleotydami w środkowej części sekwencji nukleotydowej [35]. Obydwa wiążą Hfq i wiążąc się komplementarnie z docelowym mRNA obniżają jego stabilność lub potencjał translacyjny. Transkrypcja tych sRNA jest pozytywnie regulowana przez TCS EnvZ/OmpR w warunkach wysokiej osmolarności. Słabą ekspresję genów kodujących sRNA OmrA i OmrB zaobserwowano w podłożu minimalnym, natomiast maksymalną w podłożu bogatym, w fazie stacjonarnej dla OmrA oraz w fazie logarytmicznej i stacjonarnej dla OmrB [3, 108]. Ponadto, poziom ekspresji OmrB obniża się w późnej fazie stacjonarnej, natomiast OmrA w tych warunkach ulega akumulacji [106]. Z drugiej strony OmrA/B kontrolują ekspresję genów systemu EnvZ/OmpR [37, 14]. Działanie OmrA i OmrB u E. coli polega na hamowaniu ekspresji genów białek błonowych, CirA i OmpT. Białko CirA bierze udział w procesie transportu żelaza, natomiast OmpT to proteaza zlokalizowana w błonie cytoplazmatycznej. Obydwa sRNA regulują również ekspresję genów białek receptorowych FepA i FecA, które rozpoznają kompleksy żelaza z sideroforami i uczestniczą w transporcie żelaza do komórki. Kompleks TonB-ExbB-ExbD zlokalizowany w osłonach dostarcza energii do transportu [74, 76]. Receptory, które są celem działania OmrA/B, są również wykorzystywane przez bakteriofagi lub kolicyny w celu wniknięcia do komórki bakteryjnej. Wydaje się więc, że obniżanie poziomu białek OM w warunkach podwyższonej osmolarności, czyli w warunkach jakie panują w organizmie gospodarza, może być korzystne ponieważ pozwala to na ochronę bakterii przed szkodliwym działaniem toksyn czy bakteriofagów [78].
Kolejnym białkiem OM odgrywającym istotną rolę, przede wszystkim strukturalną, jest OmpA. Białko to występuje w około 100 000 kopii na komórkę, co czyni je jednym z głównych białek błony zewnętrznej E. coli, które przyczynia się do utrzymania integralności osłon. Białko to ulega translacji z niezwykle stabilnego mRNA o okresie półtrwania ∼ 15 min w fazie logarytmicznego wzrostu. W fazie stacjonarnej okres półtrwania jest skrócony do ∼ 4 min. Stabilność tego mRNA zależy od końca 5′-UTR, z którym wiąże się sRNA MicA (75 nt) w obecności Hfq. Sama ekspresja micA zachodzi silnie w bogatym podłożu, gdy komórki wchodzą w fazę stacjonarną wzrostu. Wysoki poziom MicA blokuje wiązanie rybosomu z mRNA ompA, co ułatwia cięcie przez RNazę E, a następnie rozpad tego mRNA [80, 100]. Wydaje się, że OmpA może odgrywać zarówno pozytywną, jak i negatywną rolę podczas infekcji. Mutanty E. coli pozbawione OmpA są mniej zjadliwe w modelach embrionalnych kurcząt i noworodków szczurzych [111]. Ponadto, OmpA jest specyficznie wiązane przez główne białko surowicy ssaków, amyloid A, zaangażowane w odpowiedź immunologiczną [40] i jest wymagane do zabijania bakterii przez elastazę neutrofili w trakcie zakażenia [5]. Zatem zróżnicowana ekspresja ompA na różnych etapach wzrostu bakterii in vivo może być kluczowa dla zjadliwości. Zmniejszenie bowiem jego ekspresji w odpowiednim czasie może ograniczyć odpowiedź immunologiczną gospodarza.
Wśród innych sRNA, które uczestniczą w regulacji ekspresji poryn znalazły się RybB, IpeX oraz RseX [34]. RybB (sRNA o długości 81 nt) jest syntetyzowany w sposób zależny od σE i oddziałuje z białkiem Hfq [106]. Okazało się, że wśród celów działania tego sRNA są mRNA genów ompC i ompW. Gen ompW koduje porynę wykazującą dużą homologię do OmpC [46]. Kolejny sRNA, IpeX działa potranskrypcyjnie i wpływa na obniżenie ekspresji ompC oraz ompF, ale prawdopodobnie inaczej niż MicC i MicF. Wykazano, że destabilizacja mRNA ompC odbywająca się za pośrednictwem IpeX jest niezależna od Hfq. Ponadto nie stwierdzono występowania komplementarności sekwencji pomiędzy tym sRNA a mRNA ompC, co sugeruje, że hamowanie ekspresji może nie obejmować prostego parowania zasad między dwiema cząsteczkami RNA [17]. Inny sRNA, RseX uczestniczy w obniżaniu ekspresji ompA i ompC, dzięki zdolności do dość rozległego parowania zasad w miejscach wiązania rybosomów zarówno w mRNA ompA, jak i ompC [23].
Ciekawą obserwacją jest to, że dany gen regulatorowego sRNA często znajduje się w pobliżu genu poryny innej niż ta, której ekspresja zależy od tego sRNA. Mianowicie micF i micC znajdują się w chromosomie odpowiednio powyżej genów ompC i ompN, rseX jest położony powyżej genu ompS1, podczas gdy ipeX jest zlokalizowany poniżej nmpC. To bliskie położenie genów poryny i sRNA, które z kolei przyczyniają się do obniżenia syntezy innych poryn, może sugerować, że komórka potrzebuje mechanizmów do utrzymywania pod ścisłą kontrolą całkowitego ładunku poryn w OM. Badania ilościowe wskazują, że chociaż względne poziomy OmpC i OmpF zmieniają się w zależności od warunków wzrostu, sumaryczna ilość tych dwóch poryn jest ogólnie stała [34].
Wpływ dwuskładnikowych systemów transdukcji sygnału i sRNA na proces tworzenia biofilmu
Biofilm jest strukturą tworzoną przez skupiska mikroorganizmów, które przylegają do powierzchni biotycznych i abiotycznych, jak również do siebie nawzajem, a zanurzone są w macierzy zewnątrzkomórkowych polimerów, które chronią mikroorganizmy przed wysychaniem i działaniem substancji toksycznych [22, 38, 104]. Biofilmy mogą być złożone z jednego bądź wielu gatunków bakterii. Charakteryzuje je trójwymiarowość struktury i przestrzenna heterogeniczność, co powoduje powstawanie gradientów odżywczych i chemicznych. Wynikiem tego jest tworzeniem się mikroniszy w obrębie całej społeczności drobnoustrojów, w których dochodzi do zróżnicowanej w czasie i przestrzeni ekspresji genów. Biofilmy odgrywają istotną rolę w patogenezie wielu chorób bakteryjnych. Patogeny rosnąc w postaci biofilmu stają się niewrażliwe na odpowiedź układu immunologicznego czy oporne na działanie antybiotyków [104].
Bakterie E. coli oraz S. enterica zmieniają swój styl życia w odpowiedzi na dostępność składników odżywczych, tj. mogą tworzyć biofilm lub żyć w postaci planktonicznej. Stany te są ogólnie uważane za wzajemnie wykluczające się, co znajduje odzwierciedlenie w złożonych systemach kontroli transkrypcji, które promują jeden stan, jednocześnie hamując drugi. W tych decyzjach kluczową rolę odgrywają aktywatory transkrypcji FlhDC i CsgD, kontrolujące odpowiednio biosyntezę rzęski lub tworzenie biofilmu (synteza fimbrii spiralnych/celulozy) [60, 84]. Rzęska to złożone organellum, które aby powstać wymaga skoordynowanej ekspresji ponad 60 genów zgrupowanych w wielu operonach [25]. Na szczycie tej hierarchicznej kaskady regulacyjnej u E. coli znajduje się aktywator FlhDC, który kontroluje transkrypcję genów klasy II, zależną od głównego czynnika sigma polimerazy RNA (σ70) [20]. W skład tej klasy wchodzą geny kodujące białka strukturalne i pomocnicze konieczne do utworzenia ciała podstawowego i haka, elementów składowych rzęski oraz dwa geny kodujące białka regulatorowe, tj. FlgM i σ28 (FliA). FliA jest pozytywnym regulatorem ekspresji genów klasy III, zwiększa także transkrypcję genów klasy II zależnych od FlhDC. Z kolei FlgM to tzw. czynnik anty-sigma. We wczesnej fazie składania rzęski aktywność FliA jest hamowana przez FlgM, który ściśle wiąże się z FliA. Po złożeniu podstawowego korpusu haka powstaje system sekrecji typu III, który jest zdolny do wydzielania zarówno białkowych podjednostek rzęski, jak i FlgM. Powoduje to uwolnienie FliA, który wiążąc się z rdzeniem polimerazy RNA (RNAP) aktywuje transkrypcję genów klasy III [49].
W przypadku wzrostu bakterii w postaci biofilmu kluczowym regulatorem tego procesu jest CsgD. Białko to moduluje ekspresję, nie tylko operonu csg kodującego komponenty fimbrii spiralnych i procesu ich składania [37], ale także zestawu genów, których produkty umożliwiają adaptację bakterii do osiadłego stylu życia [12, 21]. Cyklaza diguanylowa DgcM ma wpływ na poziom ekspresji csgD. Ten enzym bezpośrednio stymuluje aktywność białka MlrA, uczestniczącego w pozytywnej regulacji transkrypcji csgD (Ryc. 5) [88]. Kontrola ekspresji genów flhDC i csgD kodujących dwa kluczowe regulatory, jest złożonym procesem. Na poziomie transkrypcji istotne funkcje pełnią regulatory MlrA, OmpR i sigma RpoS oraz cykliczny di-GMP [79, 84].
Ryc. 5
Wpływ białka OmpR oraz sRNA OmrA/OmrB na ruchliwość i tworzenie biofilmu u Enterobacteriaceae
Wpływ kluczowych regulatorów na ekspresję genów, których produkty związane są z ruchliwością i tworzeniem biofilmu przedstawiono za pomocą czarnych linii. Czerwone linie przedstawiają potranskrypcyjną inhibicję z udziałem sRNA. Niebieskie linie przedstawiają aktywację z udziałem białka OmpR. Na podstawie [80 i 85].
W regulacji potranskrypcyjnej flhDC lub csg uczestniczą różne sRNA, tj. OmrA/B, McaS, RprA, GcvB, RydC, ArcZ oraz OxyS [59, 60, 63, 84]. Ważną rolę pełnią OmrA/B, które hamują ekspresję genów flhDC, csgD, jak również ompR, flgM oraz dgcM. System EnvZ/OmpR jest aktywatorem ekspresji csgD, jak również omrA i omrB, tworząc w ten sposób pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego [14]. Chociaż ten sam motyw sekwencji zlokalizowany w regionie 5′ sRNA jest używany do tworzenia komplementarnych par zasad ze wszystkimi celami mRNA, to molekularne mechanizmy kontroli z ich udziałem różnią się. W przypadku mRNA ompR, sRNA OmrA/B blokują miejsce wiązania rybosomu, podczas gdy wiążą się daleko powyżej miejsca SD w mRNA csgD, co prowadzi do zahamowania translacji. Natomiast potranskrypcyjna regulacja ekspresji dgcM polega na zależnej od Hfq przebudowie struktury mRNA w celu ułatwienia wiązania OmrA/B. Najnowsze badania wskazują, że OmrA/B hamują ekspresję flgM, czyli pośrednio wzmacniają ekspresję genów rzęskowych klasy III [84]. Można więc stwierdzić, że OmrA i OmrB hamują procesy prowadzące do tworzenia biofilmu, ale z drugiej strony mogą hamować również ruchliwość. Sugeruje to istnienie złożonego potranskrypcyjnego mechanizmu regulacji, który może mieć wpływ, zarówno na osiadły, jak i ruchliwy tryb życia (Ryc. 5). Tak więc regulacja ekspresji genów zależna od OmrA/B łączy ze sobą różne sieci regulatorowe, aby precyzyjnie koordynować stan fizjologiczny bakterii [35, 84].
Jedną z kolejnych bakterii chorobotwórczych, u której zaobserwowano oddziaływania TCS z sRNA w kontroli procesu formowania biofilmu jest Vibrio cholerae. Jest to patogen układu pokarmowego człowieka, czynnik etiologiczny cholery. Za jego wysoką patogenność odpowiada głównie toksyna cholery (CT, Cholera toxin) oraz pilusy typu IV (TCP, toxin co-regulated pilus), które łącząc bakterie w mikrokolonie, chronią je przed układem immunologicznym gospodarza i pozwalają na koncentrację wydzielanej toksyny [96]. W regionach endemicznych, V. cholerae zwykle występuje w zbiornikach wodnych i tam tworzy struktury biofilmu [110]. Na tym etapie istotna jest ekspresja genów vps kodujących egzopolisacharyd (VPS, Vibrio polysaccharide), który uczestniczy w tworzeniu biofilmu. Patogen ten posiada w swoim genomie osiemnaście genów vps, które zgrupowane są w dwóch klastrach. Wykazano, iż mutanty w genach vpsD, vpsI, vpsK i vpsL, charakteryzują się brakiem zdolności do wytwarzania VPS oraz znacznym obniżeniem zdolności do tworzenia biofilmu [26]. V. cholerae wykorzystuje TCS, aby za ich pomocą regulować proces tworzenia biofilmu w odpowiedzi na bodźce pochodzące ze środowiska [26, 97]. W genomie V. cholerae zidentyfikowano geny kodujące potencjalne 43 kinazy histydynowe (HK) i 53 regulatory odpowiedzi (RR) [97]. Wśród nich, białka VpsR, VpsT i LuxO są aktywatorami tworzenia biofilmu, natomiast PhoB, VarA, VieA i CarR są represorami tego procesu [6, 7, 15, 38, 54, 94, 98, 116].
TCS, który hamuje pośrednio tworzenie biofilmu u V. cholerae jest system VarS/A. Bierze on udział w aktywacji ekspresji csrBCD, kodujących sRNA, które z kolei hamują ekspresję globalnego regulatora CsrA [53]. Jest to potranskrypcyjny regulator różnych procesów, w tym metabolizmu węgla i tworzenia biofilmu [82, 83]. Obniżony poziom CsrA przekłada się m.in. na niski poziom Qrr1-4, co prowadzi do odblokowania translacji hapR, a w efekcie do zmniejszonej ekspresji genów vps [53]. Innymi TCS, które hamują proces tworzenia biofilmu są systemy VieS/A, CarS/R oraz NtrB/C. Regulator VieA działa niezależnie od swojej pokrewnej kinazy histydynowej, bowiem domena EAL tego białka, o aktywności fosfodiesterazy diguanylowej, odpowiada za degradację wtórnego przekaźnika c-di-GMP, który jest ważnym pozytywnym regulatorem tworzenia biofilmu [95]. Natomiast system CarS/R negatywnie reguluje ekspresję vps, a transkrypcja genów tego TCS obniża sę w odpowiedzi na wzrost jonów wapnia w środowisku zewnętrznym [7].
Kolejny system TCS, VxrA/B indukuje powstawanie biofilmu [97, 99]. Geny vxrAB wchodzą w skład operonu, który zawiera jeszcze trzy geny o nieznanej funkcji. Mutanty V. cholerae ΔvxrA i ΔvxrB wykazują obniżoną zdolność do tworzenia biofilmu, podczas gdy w mutancie ΔvxrC zaobserwowano zwiększenie tworzenia biofilmu. Z kolei, nadekspresja vxrB prowadzi do zahamowania ruchliwości. Wykazano również pozytywny wpływ systemu VxrA/B na poziom cyklicznego di-GMP (c-di-GMP) oraz ekspresję vpsR i vpsT, kodujących dwa główne regulatory procesu tworzenia biofilmu [97].
Oddziaływania pomiędzy sRNA a TCS zostały również dobrze poznane u Pseudomonas aeruginosa. Jest to bakteria Gram-ujemna, znana pod nazwą pałeczki ropy błękitnej, będąca częstym patogenem izolowanym w środowisku szpitalnym. Powoduje ona infekcje o wysokim wskaźniku śmiertelności, co jest związane z wysoką opornością patogenu na wiele środków przeciwdrobnoustrojowych, która często powoduje oporność wielolekową [75]. P. aeruginosa posiada ponad 400 czynników transkrypcyjnych, 34 sRNA oraz ponad 60 funkcjonalnych TCS. Wszystkie razem te komponenty budują skomplikowaną i rozległą sieć regulatorową [101]. Jednym z istotniejszych TCS u tego patogenu jest system GacS/A [115]. Kinaza histydynowa GacS przenosi grupę fosforanową na regulator odpowiedzi GacA, który ufosforylowany reguluje ekspresję m.in. rsmY i rsmZ, kodujących sRNA. Te zaś mogą zapobiegać wiązaniu się rybosomu z sekwencją SD i hamować translację mRNA rsmA, kodującego regulator transkrypcji, który jest homologiem CsrA [51]. RsmA kontroluje ekspresję genów systemu sekrecji III typu (T3SS), wytwarzania pili IV typu, ruchliwości oraz wytwarzania biofilmu [115]. RetS i LadS to hybrydowe kinazy sensorowe, które uczestniczą w kontroli ekspresji systemu T3SS oraz tworzenia biofilmu [8]. Pomimo intensywnych badań systemu GacS/A, nie zidentyfikowano sygnałów środowiskowych wyzwalających fosforylację kinaz GacS, LadS i RetS [45].
Udział TCS i sRNA w regulacji procesu quorum sensing
Gęstość komórek wpływa na ekspresję genów wirulencji u wielu patogennych bakterii, a odbywa się to za pośrednictwem zjawiska quorum sensing (QS) [65]. Chociaż wiele z tych systemów aktywuje ekspresję genów wirulencji przy wysokiej gęstości komórek, u V. cholerae jest odwrotnie, gdyż QS wpływa na obniżenie ekspresji genów wirulencji w tych warunkach [64, 118]. System ten jest niezwykle złożony, ponieważ obejmuje co najmniej trzy obwody sensoryczne, które aktywują regulator odpowiedzi LuxO. V. cholerae posiada dwa główne autoinduktory: CAI-1, specyficzny dla danego rodzaju bakterii [41, 50, 64] oraz AI-2, wykorzystywany do komunikacji międzygatunkowej [19, 76]. Receptorami dla CAI-1 i AI-2 są odpowiednio CqsS i LuxPQ [4, 64, 67]. W przypadku braku autoinduktora CqsS i LuxPQ działają jako kinazy, które fosforylują białko LuxU, a następnie grupa fosforanowa jest przekazywana na regulator LuxO [27]. Ufosforylowany LuxO aktywuje transkrypcję genów kodujących cztery sRNA: Qrr1-4 [53, 85]. Te sRNA aktywują ekspresję aphA oraz hamują ekspresję hapR, genów kodujących nadrzędne regulatory QS, które działają w sposób zależny od gęstości komórek [53, 85]. Przy niskiej gęstości komórek syntetyzowany jest regulator AphA, ale nie HapR. W warunkach wysokiej gęstości, CqsS i LuxPQ po związaniu ze swoimi autoinduktorami, przełączają się z aktywności kinazy na aktywność fosfatazy i defosforylują LuxO za pośrednictwem LuxU. Z kolei, defosforylowany LuxO jest nieaktywny, więc transkrypcja qrr1-4 nie zachodzi. W przypadku braku Qrr sRNA, nie ma aktywacji translacji aphA, natomiast translacja hapR nie jest już tłumiona, a nagromadzony HapR działa jako represor ekspresji genów vps. Dwa inne receptory QS, CqsR i VpsS, w odpowiedzi na niezidentyfikowane dotychczas ligandy, również przekazują informacje do systemu QS za pośrednictwem LuxU [49, 91]
Powszechnie wiadomo, że odpowiednie stężenie żelaza jest wymagane do przeżycia bakterii [81, 114]. Niemniej jednak żelazo nie jest pierwiastkiem łatwo dostępnym w środowisku naturalnym ze względu na jego niską rozpuszczalność w neutralnym pH [72]. Ponadto, bakteriom chorobotwórczym bardzo trudno jest konkurować o żelazo z komórkami gospodarza, dlatego są one wyposażone w różne mechanizmy skutecznego wychwytu żelaza w środowisku gospodarza [16]. Okazało się, że poziom żelaza wpływa na szlak QS, bowiem pierwiastek ten hamuje wytwarzanie auto-induktora AI-2 [112, 113]. Wydaje się, że jedną z najważniejszych funkcji QS jest kontrolowanie ekspresji genów kodujących czynniki wirulencji patogenu, który atakując komórki gospodarza pozyskuje składniki odżywcze, m.in. żelazo.
Nadrzędnym regulatorem kontrolujących homeostazę żelaza u bakterii, zarówno Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich jest represor Fur [24, 39]. U V. vulnificus, Fur w obecności żelaza hamuje ekspresję genów luxO, smcR oraz genów qrr. Jednakże wprowadzona delecja w genie fur nie znosiła w pełni obserwowanej represji [113]. Okazało się, że istnieją dodatkowe czynniki kontrolujące system QS. Przeprowadzone analizy wykazały udział sRNA RyhB w kontroli ekspresjigenu luxS, którego produkt uczestniczy w biosyntezie AI-2 [52]. Ten rodzaj regulacji zapwenia ciągły podstawowy poziom syntezy AI-2, nawet w obecności żelaza, zamiast gwałtownego hamowania ekspresji przy udziale regulatora Fur. Po raz pierwszy RyhB (90 nt) został zidentyfikowany u E. coli. W toku badań wykazano, że ten sRNA hamuje ekspresję genów, których produkty uczestniczą w magazynowaniu i wykorzystaniu żelaza, kiedy stężenie tego pierwiastka w środowisku jest niskie [63]. Ponadto, ekspresja samego ryhB u E. coli jest hamowana przez Fur w odpowiedzi na wysoki poziom żelaza w środowisku [103]. RyhB zmniejsza stabilność specyficznych transkryptów, gdy wraz z Hfq przyłącza się do komplementarnej sekwencji w docelowej cząsteczce mRNA [63, 103]. W dalszej degradacji, zarówno docelowego mRNA, jak i RyhB, pośredniczą RNaza E i RNaza III [2, 61]. RyhB reguluje ekspresję co najmniej 18 operonów, które zawierają łącznie 56 genów [62]. Może to świadczyć o złożonej roli tego sRNA, nie tylko w metabolizmie, ale również patogenezie wielu enterobakterii.
Podsumowanie
Regulatorowe sRNA, będące od niedawna obiektem intensywnych badań u bakterii, stanowią ważny element kontroli ekspresji genów w złożonych sieciach regulacyjnych. Nowe osiągnięcia technologiczne dostarczyły potężnych narzędzi do badania tych procesów. Ujawniono liczne wzajemne połączenia sRNA ze ścieżkami transdukcji sygnału, co zapewnia patogenom odpowiednio szybką reakcję na zmieniające się warunki środowiska i przetrwanie wewnątrz organizmu żywiciela. Zdobywanie wiedzy na temat molekularnych mechanizmów zaangażowanych w te odpowiedzi adaptacyjne i interakcje patogenów z ich gospodarzami toruje drogę do opracowania nowych strategii przeciwdrobnoustrojowych, co stanowi wyzwanie na nadchodzące lata.
