Application of fibrin in tissue engineering. Achievements and perspectives

Jednym z częściej stosowanych w inżynierii tkankowej białek fibrylarnych jest fibryna powstająca z fibrynogenu (FBN) pod wpływem trombiny (TRB) [1, 6]. FBN w postaci proszku stosowano w tamowaniu krwawienia ran zewnętrznych skóry i zębodołów poekstrakcyjnych [83]. Zyskał on szczególne znaczenie podczas drugiej wojny światowej w hamowaniu krwawienia [24]. Następnym krokiem było wykorzystanie FBN w tamowaniu krwawień wewnętrznych [31], czy też w terapii zastępczej niedoboru FBN [63].

Obecnie w celach terapeutycznych nie stosuje się właściwie samego FBN, tylko fibrynę otrzymaną z FBN i TRB. Proces polimeryzacji fibryny jest zoptymalizowany do warunków in vitro [51, 76].

Szerokie wykorzystywanie fibryny w inżynierii tkankowej wynika z jej naturalnych właściwości biostatycznych (tworzenie trójwymiarowego rusztowania dla komórek, podtrzymywanie tkanek) i bioaktywnych (indukcja angiogenezy, indukcja syntezy składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i cytokin, nasilenie migracji leukocytów i proliferacji komórek). Istotnym atutem wykorzystania tego białka jako podłoża jest biozgodność fibryny i jej produktów biodegradacji. Ponadto fibryna umożliwia wypełnianie ubytków w tkankach i narządach, ich spajanie i uszczelnianie, inkorporację i pułapkowanie czynników wzrostu oraz substancji leczniczych. Co więcej, modyfikacja struktury stwarza możliwości kontrolowania degradacji, a tym samym wpływ na czas uwalniania substancji leczniczych i makromolekuł [12, 27, 48, 53, 57, 67, 77].

Właściwości fizykochemiczne i reologiczne umożliwiają formulację różnych postaci fibryny (skafoldów, kształtek) w temperaturze ciała człowieka, bez udziału rozpuszczalników organicznych i cytotoksycznych inicjatorów polimeryzacji [51, 92].

Otrzymywanie fibryny in vitro dla potrzeb inżynierii tkankowej, opiera się na znanych procesach biochemicznych zachodzących in vivo podczas gojenia się ran, polegających na enzymatycznej transformacji rozpuszczalnych monomerów FBN (ryc. 1) do nierozpuszczalnej sieci fibryny. Zarówno in vivo jak i in vitro fibryna powstaje według tego samego mechanizmu.

Fibryna otrzymywana jest w wyniku wieloetapowej reakcji polimeryzacji FBN, ulegającego aktywacji pod wpływem hydrolitycznej aktywności TRB (ryc. 2) [59]. Pierwszym etapem powstawania sieci fibrynowej jest uwolnienie fibrynopeptydów A i B (fbpA i fbpB; ryc. 2 – I etap) pod wpływem TRB, rezultatem czego jest odsłonięcie węzłów A i B [92].

W kolejnym etapie następuje polimeryzacja aktywowanych cząsteczek FBN do liniowych protofibryli w wyniku oddziaływań między dołkami a i b oraz odsłoniętymi węzłami A i B (ryc. 2 – II etap) [92].

Następnie uwolnieniu ulegają domeny αC, które przez wzajemną komplementarność sieciują powstające protofibryle (ryc. 2 – III i IV etap) [26].

W ostatnim, najwolniejszym etapie polimeryzacji fibryny, nadawana jest ostateczna wytrzymałość formującej się sieci fibrynowej. TRB wraz z jonami wapnia aktywuje czynnik XIII kaskady krzepnięcia krwi do aktywnej formy (FXIIIa), która wykazuje aktywność transglutaminazy w stosunku do określonego fragmentu peptydowego (NQEQVSPL), obecnego w niciach α i γ fibryny (ryc. 1) [52]. Umożliwia to tworzenie połączeń pomiędzy łańcuchami FBN (α-α; α-γ; γ-γ) z przewagą wiązań łańcuchów γ-γ (ryc. 2 –V etap) [52].

Ryc. 1

Prowadzenie procesu in vitro pozwala dodatkowo na regulację właściwości strukturalnych i biochemicznych białka [17, 67, 85]. W przypadku fibryny stopień usieciowania może być regulowany przez zmianę stężenia FBN i TRB. Wzrost stężenia jednego lub obu tych czynników powoduje wzrost gęstości sieci fibrynowej. Na jej zagęszczenie wpływa także wzrost stężenia fibronektyny, jednak w znacznie mniejszym stopniu [65].

Do celów technologicznych fibryna otrzymywana jest z FBN pochodzenia zarówno autologicznego jak i allogenicznego [76]. Osocze autologiczne jest obecnie wykorzystywane do izolacji FBN na małą skalę [98], natomiast głównym źródłem komercyjnym FBN jest ludzkie osocze pochodzące od jednego lub wielu dawców [18]. Jednak, ze względu na ryzyko transmisji chorób wirusowych, w przypadku tego materiału prowadzone są rutynowo badania w kierunku obecności wirusów (HBV, HIV i parwowirusa B19) oraz prionów (choroba Creutzfeldta-Jakoba) [34, 39, 43]. Bezwzględnie unika się już stosowania FBN ksenogenicznego ze względu na ryzyko odpowiedzi immunologicznej [33, 79].

Ryc. 2

Najprostszą i najczęściej wykorzystywaną komercyjnie metodą izolacji FBN jest krioprecypitacja. Pozostałe metody, wymagające użycia siarczanu amonu, poli(tlenku etylenu) (PEG), etanolu oraz chromatografii powinowactwa, mają marginalne znaczenie komercyjne i są stosowane do izolacji FBN na mniejszą skalę. Wskazane metody pozwalają na uzyskanie różnego stopnia czystości produktu (42-92%) w postaci roztworu [18, 76].

Zaproponowano również w pełni funkcjonalny model komórkowy umożliwiający otrzymanie rekombinowanego FBN w wysokich stężeniach. Obecnie nie ma on jednak większego znaczenia komercyjnego [36].

W inżynierii tkankowej najczęściej proponowanymi postaciami fibryny są żele, dyski, filmy i maty [40, 96, 102, 103]. Należy podkreślić, że żele przygotowywane są w większości ex tempore, natomiast pozostałe postacie stają się żelem na skutek pochłaniania wody już po wprowadzeniu do organizmu. Nazwy handlowe fibryny zarejestrowanej jako wyrób medyczny, często zawierają sposób zastosowania żelu (klej, uszczelniacz, hemostat) [33, 87].

Żele, dyski, filmy i maty są uzyskiwane różnymi metodami, wszystkie jednak zapewniają efektywne mieszanie FBN i TRB. Istotne jest, że sposób łączenia poszczególnych składników nie wpływa na strukturę fibryny. W otrzymywaniu z niej wyrobów medycznych unika się natomiast podwyższonych temperatur (powyżej 100°C) i rozpuszczalników organicznych [84, 92, 94].

Najprostszym sposobem otrzymywania żelu fibrynowego jest mieszanie roztworów FBN i TRB na folii aluminiowej. Natomiast do bardziej popularnych metod należą systemy dwustrzykawkowe, zawierające osobno roztwory FBN i TRB. Stężenia obu składników są zoptymalizowane w taki sposób, aby fibryna tworzyła się na wyjściu igły dozującej [95, 96, 103].

Postać dysków i filmów otrzymuje się przez wylanie z żelu fibryny do odpowiednich form. W przypadku dysków najczęściej są to płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych lub formy silikonowe [40, 73, 74, 104]. Natomiast maty fibrynowe w postaci włóknin uzyskuje się metodą elektroprzędzenia z wykorzystaniem systemów dwustrzykawkowych [5, 80, 96].

Istotnym rozwiązaniem jest zastosowanie druku 3D w otrzymywaniu fibryny. Metoda opiera się na stosowaniu tuszu FBN w roztworze TRB i vice versa, jak również na inkubacji wydrukowanej matrycy FBN w roztworze TRB. Sposób ten pozwala na otrzymanie fibryny w dowolnym kształcie [16, 35, 99, 100].

Poszczególne postacie mają różne zastosowanie terapeutyczne. Postać żelu umożliwia małoinwazyjną aplikację fibryny do trudno dostępnych miejsc w takich tkankach jak: nerwowa, kostna, chrzęstna i mięśniowa serca. Naprawa uszkodzonych tkanek jest wspomagana komórkami i adekwatnymi czynnikami wzrostu wprowadzonymi do żelu [12, 40, 71, 81, 95, 97, 103].

Dyski fibrynowe są stałą postacią fibryny, wykorzystywaną głównie jako rusztowanie komórkowe, uwalniające czynniki wzrostu w terapii uszkodzeń kostnych [71, 73, 74, 98, 104].

Filmy fibrynowe są stosowane w formie łat w zabiegach naprawczych ubytków sercowo-naczyniowych [90], a także jako substytuty skóry [37, 101].

Maty fibrynowe otrzymane metodą elektroprzędzenia, mają bardziej optymalną strukturę wewnętrzną przy tworzeniu podłoży trójwymiarowych wykorzystywanych w zabiegach naprawczych skóry. Stosowane są również jako opatrunki w gojeniu ran i jako materiał hemostatyczny [5, 80, 96].

Właściwości fibryny zapewniają wiele korzyści wynikających z jej aktywności biostatycznej i bioaktywnej. Dzięki temu fibryna in vivo oprócz roli rusztowania komórkowego aktywnie wpływa na proliferację komórek.

Fibryna posiada cenne właściwości w spełnianiu roli podłoża w inżynierii tkankowej. Z jednej strony nie jest wystarczająco wytrzymała do przenoszenia dużych obciążeń, ale z drugiej strony właściwości elastyczne dają możliwość do rozciągnięcia fibryny do ponad 2-krotności początkowej długości. Polepszenie wytrzymałości osiągane jest przez łączenie fibryny z innymi materiałami, takimi jak: nanowłókna węglowe, chitozan, polikaprolakton, polilaktyd, poliglikolid, poli(laktyd-ko-glikolid) (PLGA) i PEG [3, 9, 47, 49, 78, 89].

Matryce fibrynowe posiadają trójwymiarową strukturę wewnętrzną, zapewniającą optymalne warunki do wzrostu różnych komórek, w tym dla fibroblastów, chondrocytów czy też komórek nerwowych [56, 95, 97, 104].

Fibryna jako naturalny stymulator naprawy uszkodzonej tkanki stanowi również odpowiedni dodatek do biomimetycznych rusztowań opartych na: elastynie, fibroinie, heparynie, keratynie, kolagenie i kwasie hialuronowym [14, 42, 51, 64, 66]. Wskazane rusztowania lepiej naśladują strukturę ECM, poprawiając szybkość odnowy uszkodzeń [66].

Klinicznie wykorzystanie fibryny skraca czas operacji oraz zmniejsza intensywność stanu zapalnego [8, 21, 46]. Ze względu na swoje właściwości fibryna znalazła bardzo szerokie zastosowanie terapeutyczne w wielu specjalnościach zabiegowych, m.in. jako uszczelniacz ran, klej tkankowy i rusztowanie komórkowe [22, 53, 54, 79]. Fibryna skutecznie zastępuje również klasyczne szwy chirurgiczne podczas operacji gałki ocznej, rdzenia kręgowego lub przepukliny [21, 46].

Właściwości bioaktywne fibryny umożliwiają optymalizację leczenia uszkodzeń tkanek w istotny sposób. W strukturze fibryny występują miejsca wiążące integryny, fibronektynę, fibulinę i czynnik von Willebranda. Są to białka kluczowe w przebiegu naprawy tkanek. Ta wieloskładnikowa struktura imituje ECM i zwiększa adhezyjność komórek [32, 50, 93]. Ponadto domena wiążąca heparynę (HBD) w FBN pozwala na wiązanie czynników wzrostu z następujących rodzin:

Fibryna pełni przez to funkcję rezerwuaru wielu czynników wzrostu, wielokierunkowo przyspieszając naprawę tkanek m.in. przez nasilenie angiogenezy, hamowanie nekrozy wynikającej z niedokrwienia, nasilenia wzrostu komórek nerwowych oraz przebudowy i odnowy właściwej struktury tkanek [20, 56, 57, 81].

W pierwszym etapie polimeryzacji fibryny oddzieleniu ulegają fbpA i fbpB pod wpływem TRB (ryc. 2). Oba składniki pozostają jednak w materiale polimerowym i odgrywają ważną rolę w naprawie tkanek. Fibrynopeptydy wykazują właściwości chemotaktyczne względem fibroblastów, leukocytów, neutrofili i monocytów oraz właściwości proangiogeniczne i proproliferacyjne, przyspieszając odnowę uszkodzonej tkanki [28, 44, 68, 75]. TRB aktywuje szlaki mitogenne fibroblastów, komórek endotelialnych i mięśni naczyń krwionośnych. Uzupełnienie hodowli komórkowej o TRB może w znacznym stopniu wpłynąć na przyspieszenie proliferacji komórek [25, 29].

Stopniowa degradacja rusztowania fibrynowego stymuluje etapową naprawę tkanek gospodarza. Produkty fibrynolizy aktywują bowiem szlaki komórkowe odpowiedzialne za pobudzenie angiogenezy i syntezę składników ECM, migrację leukocytów i wydzielanie cytokin, co prowadzi do uzyskania pełnowartościowej struktury tkankowej [15, 38, 69, 77, 82]. W przypadku zbyt szybkiej degradacji proces ten można spowolnić przez inkorporacje jonów wapnia lub swoistych inhibitorów fibrynolizy, tj. aprotyniny, kwasu ε-aminokapronowego oraz kwasu traneksamowego do FBN lub TRB [11, 88, 91].

Właściwości fibryny pozwalają na inkorporację czynników wzrostu, umożliwiając ich przedłużone i kontrolowane uwalnianie. Wydłużenie ekspozycji komórek na czynniki wzrostu zwiększa efektywność ich bioaktywnego wpływu na procesy naprawcze tkanek. Inkorporację czynników wzrostu do fibryny można osiągnąć różnymi metodami tj.:

Najprostszą metodą inkorporacji czynników wzrostu do matrycy fibrynowej jest ich pułapkowanie, następujące w czasie sieciowania składników fibryny, zawierających czynniki wzrostu (ryc. 3 – I). Nie zapewnia to jednak pełnej kontroli nad ich uwalnianiem, ponieważ czynniki wzrostu uwalniane są przez dyfuzję w stosunkowo krótkim czasie [45, 97]. Zjawisko pułapkowania i braku pełnej kontroli nad tym procesem obserwowane jest również w przypadku innych białek m.in. kolagenu [86].

Do zwiększenia kontroli nad przedłużonym uwalnianiem czynników wzrostu, stosuje się fibrynę, z którą czynniki wzrostu są związane za pomocą łączników, które to łączą się z fibryną wiązaniami niekowalencyjnymi lub kowalencyjnymi.

Metody niekowalencyjne wiązania czynników są znacznie mniej popularne i rzadziej wykorzystywane ze względu na to, iż są mniej trwałe niż kowalencyjne i szybciej uwalniają wprowadzony do matrycy czynnik. Należy do nich zastosowanie:

Niekowalencyjne wiązanie czynników wzrostu można osiągnąć przez ich związanie z PPACK (ryc. 3 – II) lub domeną Kringle 4, mającymi wysokie powinowactwo odpowiednio do TRB lub do plazminogenu i protrombiny, tworzącymi elementy sieci fibrynowej [58, 104]. Przykładowo związanie domeny Kringle 4 z FGF-2 przedłuża jego uwalnianie do 5 dni [58, 104].

Różnoimienne ładunki DNA i fibryny są natomiast odpowiedzialne za powstanie oddziaływań elektrostatycznych. Zjawisko to wykorzystano do niekowalencyjnego związania plazmidu kodującego IL-10 i wydłużenia jego uwalniania in vitro [58].

Częściej stosowanymi metodami wiązania czynników wzrostu do fibryny są metody kowalencyjne, do których należy wykorzystanie:

EDC jest znanym aktywatorem grup karboksylowych, warunkując tworzenie nowych wiązań aminowych pomiędzy dwoma aminami pierwszorzędowymi. Tym sposobem czynnik wzrostu można związać do fibryny bezpośrednio lub przez odpowiednie białko, mające powinowactwo do fibryny np. fibronektynę (ryc. 3 – III) [61].

Inną metodą pozwalającą na kowalencyjne związanie czynnika wzrostu polega na dodaniu do niego ogona aminokwasowego o sekwencji NQEQVSPL, który ulega sieciowaniu pod wpływem FXIIIa z identycznymi sekwencjami występującymi naturalnie w fibrynie (ryc. 3 – IV i ryc. 4 – I). Późniejsze uwalnianie czynników wzrostu jest związane z degradacją matrycy fibrynowej [70].

Ogon aminokwasowy NQEQVSPL jest podstawą do opracowania bardziej złożonych metod kowalencyjnego łączenia czynników wzrostu z fibryną (ryc. 4). Jedną z nich jest koniugacja ogona NQEQVSPL z HBD, która umożliwia wprowadzenie do struktury fibryny czynnika wzrostu lub heparyny związanej z tym czynnikiem (ryc. 4 – II i III) [12, 95, 97]. Modyfikacja proporcji: NQEQVSPL-HBD : heparyna : czynnik wzrostu, zapewnia regulację szybkości uwalniania czynników wzrostu [45, 95, 97]. Uwalnianie czynników wzrostu, związanych w przedstawiony sposób zachodzi na zasadzie dyfuzji, jednak liczba wolnych czynników wzrostu jest limitowana przez oddziaływania heparyny z fibryną [97].

Konstrukt NQEQVSPL-LIKMKP-czynnik wzrostu jest innym rozwiązaniem pozwalającym na łączenie czynnika wzrostu z fibryną. Sekwencja aminokwasowa LIKMKP jest miejscem specyficznym dla działania plazminy, której działanie tym samym reguluje uwalnianie czynników wzrostu. W ten sposób uwalnianie czynników jest skorelowane z degradacją fibryny przez plazminę (ryc. 4 – IV) [4, 73].

Innym sposobem jest wykorzystanie bifunkcjonalnych cząsteczek PEG do wiązania czynników wzrostu w sieci fibrynowej. Metoda ta opiera się na kowalencyjnym związaniu zarówno fibryny, jak i czynnika wzrostu do zmodyfikowanego PEG. Uwalnianie związanych w ten sposób czynników wzrostu jest uzależnione od degradacji fibryny [19, 103].

Ryc. 3

Ryc. 4

Dane literaturowe informują głównie o proponowanych rozwiązaniach terapeutycznych fibryny oraz w mniejszym stopniu o rozwiązaniach komercyjnych i eksperymentach medycznych w rekonstrukcji tkanki kostnej, nerwowej oraz mięśni poprzecznie prążkowanych [37, 101, 102] (tabela 1). Wśród najczęściej wykorzystanych czynników wzrostu najliczniej występuje białko morfogenetyczne kości (BMP-2), kwaśny czynnik wzrostu fibroblastów (FGF-1), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (FGF-2), neurotropina 3 (NT-3) i czynnik wzrostu nerwów β (βNGF) [37, 101, 102].

Jednym z terapeutycznych zastosowań fibryny jest naprawa uszkodzeń kostnych przez dostarczenie pułapkowanego BMP-2 lub BMP-2 z dołączonym ogonem LIKMPK-NQEQVSPL, również w postaciach nieglikozylowanych (nglBMP-2) i rekombinowanych (rhBMP-2) oraz znacznie rzadziej VEGF i parathormonu. Najczęściej fibrynę w rekonstrukcji tej tkanki wykorzystuje się w postaciach dysków i żelu. Wynika to z prostego sposobu aplikacji oraz możliwości łatwego dopasowania tej formy do uszkodzeń [40, 56, 73, 105].

W terapii uszkodzeń tkanki nerwowej najbardziej popularnymi czynnikami wzrostu dostarczanymi za pomocą fibryny jest αFGF, NT-3 oraz βNGF w formie rekombinowanej (rhβNGF). Do zwiększenia skuteczności terapeutycznej fibryny zastosowano również odpowiednie peptydy zwiększające adhezję i proliferację komórek [72].

W przypadku terapii mięśni poprzecznie prążkowanych wykorzystano zrębowy czynnik wzrostu 1 (SDF-1) [102].

Dodatkowe wzmocnienie efektów terapeutycznych jest osiągane przez kontrolę czasu uwalniania czynników wzrostu, z których najpopularniejsze to wykorzystanie HBD oraz ogona NQEQVSPL [10, 45, 81, 95, 97].

Fibryna spełnia wiele kryteriów stawianych przed biomateriałami wykorzystywanymi w inżynierii tkankowej. Współczesna wiedza umożliwia kontrolowanie reakcji polimeryzacji fibryny w warunkach in vitro, z możliwością modyfikacji jej struktury w celu kontrolowania degradacji i uwalniania czynników wzrostu. Prowadzenie procesu bez rozpuszczalników organicznych i w fizjologicznym zakresie temperatur zapewnia zachowanie biologicznej aktywności czynników wzrostu. Pozwala to na celowe wykorzystanie bioaktywnych właściwości fibryny do odbudowy tkanek, wspomagane czynnikami wzrostu. Dalsze zwiększanie użyteczności fibryny, przez wprowadzanie odpowiednich cząsteczek adhezyjnych oraz możliwość kontrolowanego uwalniania czynników wzrostu i cząsteczek DNA, stwarzają obiecujące możliwości rozwoju nowych terapii [13, 32, 41].

Właściwości fizykochemiczne i reologiczne oraz wykorzystanie metod druku 3D i elektroprzędzenia, umożliwiają formulacje różnych postaci fibryny wraz z dopasowaniem ich kształtu do miejsca uszkodzenia bez utraty bioaktywnych funkcji fibryny. Obecne możliwości druku 3D pozwalają na druk komórek zawieszonych w macierzy fibrynowej, co w niedługim czasie powinno umożliwić druk większych fragmentów funkcjonalnych tkanek, a docelowo całych organów [2, 23]. Wspomniane metody formulacji umożliwiają poprawę właściwości mechanicznych fibryny przez tworzenie biomateriałów, zawierających inny materiał polimerowy, czego przykładem są włókniny fibryny z PLGA [5]. Powstanie bardziej wytrzymałych materiałów fibrynowych jest niezbędne do przyspieszonej i prawidłowej naprawy uszkodzeń, takich tkanek jak kostna czy też chrzęstna [7, 30, 60, 62]. Obecne metody pozyskiwania fibrynogenu są uzależnione od krwi. Rozwój biotechnologicznych metod otrzymywania fibrynogenu umożliwi zmniejszenie kosztów i może się przyczynić do znacznego wzrostu popularności fibryny w niedalekiej przyszłości [36].

Właściwości biostatyczne i bioaktywne fibryny predysponują ją do szerokiego zastosowania w inżynierii tkankowej. Oprócz pełnienia roli rusztowania dla komórek, fibryna inicjuje proces odnowy uszkodzeń, jak również pełni rolę stymulatora komórek. Ponadto jej struktura pozwala na pułapkowanie i wiązanie czynników wzrostu, co stwarza możliwości wykorzystania jej jako systemu ich kontrolowanego uwalniania.

Przeprowadzone eksperymenty lecznicze wskazują, że podłoża fibrynowe uwalniające czynniki wzrostu umożliwiają zwiększenie skuteczności terapeutycznej naprawy tkanek.

W najbliższej dekadzie wyroby medyczne otrzymywane za pomocą druku 3D i elektroprzędzenia mogą zwiększyć efektywność terapeutyczną, dzięki dopasowaniu materiału do uszkodzenia tkanek i synergistycznego wykorzystania bioaktywnych właściwości fibryny z czynnikami wzrostu do odbudowy tkanek.

Praca powstała dzięki wsparciu finansowemu SUM, nr umowy: KNW-1-040/N/9/O