The Role Of The Stringent Components In The Regulation Of Virulence

Alarmon odpowiedzi ścisłej reguluje poziom ekspresji genów bakteryjnych poprzez kontrolę transkrypcji za pomocą pośrednich i bezpośrednich mechanizmów, umożliwiając komórce przetrwanie czasu stresu. Badania strukturalne wykazały, że czterofosforan guanozyny oddziałuje bezpośrednio z polimerazą RNA [51, 93] wpływając na jej centrum katalityczne i w konsekwencji na stabilność kompleksów tworzonych przez polimerazę RNA i rejon promotorowy genu podczas inicjacji transkrypcji. (p)ppGpp może wywierać pozytywny, jak i negatywny wpływ na ekspresję genów [18], w rezultacie prowadząc do zahamowania procesów związanych z wysokim nakładem energii, np. wzrostem i podziałem komórki, syntezą stabilnych RNA (rRNA) czy kwasów tłuszczowych [21, 69]. Działanie (p)ppGpp, poza bezpośrednim wiązaniem z polimerazą RNA, może być także pośrednie, przez wpływ na inne regulatory lub czynniki sigma (ich poziom i zdolność dołączania się do rdzenia polimerazy RNA).

Działanie (p)ppGpp na potencjał transkrypcyjny komórki może być modulowane przez białko DksA, będące czynnikiem transkrypcyjnym wiążącym się z polimerazą RNA. W przypadku E. coli, białko DksA, uważane jest głównie za czynnik wspomagający działanie (p)ppGpp zarówno w jego aktywującym, jak i hamującym działaniu [64, 65]. Nie wykazano obecności białka DksA u wielu gatunków bakterii.

U Bacillus subtilis, modelowego gatunku bakterii typu Firmicutes, działanie (p)ppGpp nie przebiega za pośrednictwem polimerazy RNA. Wpływ (p)ppGpp na metabolizm B. subtilis zachodzi głównie poprzez regulację poziomu GTP w komórce, na skutek obniżania poziomu tego nukleotydu przez zużycie podczas syntezy (p)ppGpp oraz wskutek zahamowania aktywności enzymów uczestniczących w syntezie GTP, Gmk i HprT [44]. Obniżenie poziomu GTP, nukleotydu startowego dla rRNA, powoduje zmniejszenie tempa inicjacji ich transkrypcji [43]. Dodatkowo, niski poziom GTP wpływa na aktywność regulatora transkrypcji CodY, jednego z ważnych czynników transkrypcyjnych B. subtilis [44]. Taki mechanizm działania (p)ppGpp został wykazany także dla innych gatunków i jest prawdopodobnie wspólny dla bakterii Gram-dodatnich.

Poza wpływem na transkrypcję, celem działania (p) ppGpp jest również replikacja DNA, gdzie alarmony te mogą wpływać na poziom białka inicjatorowego DnaA [15]. Ponadto, również proces elongacji replikacji może być regulowany przez (p)ppGpp, poprzez działanie na prymazę DNA, białko DnaG, co wykazano zarówno dla E. coli, jak i B. subtilis [47, 88].

Ryc. 1.

Większość szczepów E. coli występuje w jelicie człowieka jako komensale, wśród nich znajdują się jednak także szczepy patogenne. Wyjątkowo zjadliwy enterokrwotoczny szczep EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) produkuje toksyny Shiga (Stx), powodujące szerokie spektrum objawów chorobowych, m.in. zespół hemolityczno mocznicowy (HUS, Haemolytic-Uremic Syndrome). Zespół ten charakteryzuje się ostrą niewydolnością nerek, anemią hemolityczną i małopłytkowością. Niektóre czynniki wirulencji kodowane są na wyspie patogenności LEE (Locus of Enterocyte Effacement). Do czynników tych należą geny związane z adhezją bakterii, niszczeniem ludzkich erytrocytów, czy geny kodujące system sekrecji typu III (T3SS) [72]. Ekspresja genów LEE aktywowana jest przez białko Ler, jak również przez regulatory Pch, które jednocześnie aktywują transkrypcję ler. Dodatkowo ekspresja regulowana jest przez czynniki środowiskowe, poprzez działanie czynników transkrypcyjnych [40]. Adaptacja do zmieniających się warunków środowiskowych jest niezbędna do przeżycia bakterii i infekcji, co możliwe jest dzięki indukcji odpowiedzi ścisłej. W komórkach E. coli do syntezy (p)ppGpp dochodzi z wykorzystaniem dwóch dróg syntezy (p) ppGpp: RelA-zależnej i SpoT-zależnej. Akumulacja czterofosforanu guanozyny w komórkach EHEC aktywuje ekspresję genów operonów LEE i zwiększa zdolność adhezji bakterii [58]. Białko Ler, kodowane przez pierwszy gen operonu LEE1, koordynuje aktywację ekspresji pozostałych czterech operonów LEE, jak również aktywację efektorów związanych z systemem sekrecji T3SS [52]. Zależność aktywacji ekspresji operonu LEE od (p) ppGpp została opisana przez Nakanishi i wsp. [58]. Po indukcji ekspresji relA transkrypcja genów LEE została aktywowana w ciągu 20 minut, obserwowano to także bez wprowadzenia hodowli w stan głodu. Ekspresja regulatorów transkrypcji LEE: ler i pchABC, była aktywowana przez ppGpp. Dodatkowo promotory ler i pch były bezpośrednio aktywowane przez ppGpp w układzie transkrypcyjnym in vitro. Odkrycia te sugerują, że regulacja ekspresji genów wirulencji u bakterii EHEC jest zintegrowana z mechanizmem odpowiedzi ścisłej [58]. Jednakże, analiza mechanizmu ekspresji genów stx prowadzi do wniosków, że nie zawsze (p)ppGpp jest czynnikiem regulującym pozytywnie syntezę czynników wirulencji. W przeciwieństwie do innych czynników wirulencji, toksyny Shiga kodowane są w genomie bakteriofagów lambdoidalnych występujących w szczepach EHEC w postaci profagów [46]. Ekspresja genów stx następuje po indukcji profaga i rozpoczęciu przez niego rozwoju litycznego. Dochodzi do masowej produkcji toksyny, która uwalniana jest w wyniku lizy komórki bakteryjnej, prowadząc do charakterystycznych objawów chorobowych. W związku z tym, w zwalczaniu zakażeń wywołanych przez EHEC użycie antybiotyków może przynieść efekty odwrotne do zamierzonych. Wiele antybiotyków, prowadząc do uszkodzeń DNA, powoduje indukcję systemu SOS, a co za tym idzie, indukcję profagów z genomu gospodarza E. coli, prowadząc do uwalniania toksyny w jelitach mimo zahamowania wzrostu bakterii. Zastosowanie izotiocyjanianów (ITC, substancji produkowanych przez rośliny z rodzaju Brassicaceae): fenetylu (PEITC), benzylu (BITC), allilu (AITC) oraz sulforafanu, jako substancji antybakteryjnych, prowadziło nie tylko do efektywnego działania bakteriobójczego, ale także zahamowania ekspresji genów toksyny Shiga [60]. Badania wykazały, że podstawą mechanizmu działania antybakteryjnego ITC była indukcja odpowiedzi ścisłej na drodze głodzenia aminokwasowego i zahamowanie transkrypcji z promotorów fagowych, i konsekwentnie, produkcji toksyn [60].

Zakażenia układu moczowego stanowią jeden z najważniejszych problemów klinicznych. W Polsce klasyfikowane są one na drugim miejscu (po infekcjach układu oddechowego). Najczęstszym czynnikiem etiologicznym tych zakażeń są uropatogenne szczepy E. coli (UPEC). Czynniki ich wirulencji zazwyczaj zlokalizowane są na chromosomie bakteryjnym [56]. Do najważniejszych należą adhezyny i inwazyny umożliwiające bakteriom kolonizację komórek gospodarza oraz toksyny, np. alfa-hemolizyny lub cytotoksyczny czynnik nekrozy 1 (CNF1) [20]. Adhezyny warunkują przyleganie bakterii do komórek nabłonka dróg moczowych, zapobiegając wypłukiwaniu drobnoustrojów. Dodatkowo, w wyniku adhezji, dochodzi do aktywacji szlaków sygnalizacyjnych, ułatwiając oddziaływanie toksyn na komórki gospodarza [53]. Dla patogenów, takich jak UPEC, kluczową adhezyną jest fimbria typu 1 [39]. Geny kodujące fimbrie typu 1 kodowane są w operonie fimAICDFGH. Liczne badania wykazały, że odpowiedź komórki na stres środowiskowy, wysoka osmolarność, pH, czy zmiany temperatury wpływają na ekspresję genów kodujących fimbrie typu 1 [76]. Zaobserwowano także, że w szczepach ppGpp⁰ formowanie biofilmu było zredukowane, co związane jest z regulacją ekspresji genów fim przez ppGpp [1].

Wewnętrzny patogen S. flexnerii jest Gram-ujemną, nieurzęsioną pałeczką, która odpowiada za szigelozę (czerwonkę bakteryjną), objawiającą się biegunką, gorączką i bólem brzucha [74]. Zidentyfikowano wiele czynników wirulencji S. flexnerii kodowanych zarówno na chromosomie, jak i plazmidzie tego gatunku bakterii [61]. Rozprzestrzenianie się bakterii w komórkach jelita cienkiego jest kluczowym elementem wirulencji S. flexnerii. Bakteria do tego celu wykorzystuje białko błony zewnętrznej IcsA. W kontroli ekspresji wielu genów wirulencji w komórkach S. flexnerii zaangażowane jest białko DksA. Jest ono niezbędne do wydajnej transkrypcji białka Hfq w komórkach S. flexnerii [78]. Pierwotnie Hfq odkryto w komórkach E. coli, jako czynnik gospodarza, który wykorzystywany jest przez replikazę bakteriofaga RNA Qb do inicjacji syntezy dodatnich nici [27]. Białko to jest plejotropowym, potranskrypcyjnym regulatorem, który działa jak białko opiekuńcze RNA, kontrolując stabilność mRNA, wpływając na różnorodne funkcje komórki, m.in. szybkość wzrostu, czas tworzenia biofilmu, wiązanie azotu czy przetrwanie w warunkach stresowych [91]. Do rozprzestrzenienia się S. flexnerii wymaga aktywności DksA, które bezpośrednio aktywuje transkrypcję Hfq. Badania przeprowadzone przez Sharma i Payne wykazały, że ekspresja genu białka Hfq była obniżona u mutanta AdksA w porównaniu do szczepu typu dzikiego. Naukowcy w teście transkrypcji in vitro określili, że dodanie DksA zwiększyło ekspresję hfq a efekt ten był dodatkowo zwiększany w obecności ppGpp [78].

Enterotoksyczna bakteria Vibrio cholerae, będąca czynnikiem etiologicznym cholery, wytworzyła szereg przystosowań umożliwiających jej przeżycie zarówno w zbiornikach wodnych jak i układzie pokarmowym. Do czynników wirulencji przecinkowca cholery należą toksyna RTX (Repeats In Toxin), toksyna cholery (CT), hemoglutynina (Hap), hemolizyna (HlyA) czy pilus związany z toksyną (TCP) (potrzebny do adhezji i kolonizacji jelita cienkiego) [50]. Podobnie, jak w przypadku innych bakterii Gram-ujemnych, poziom (p)ppGpp regulowany jest przez produkty genów relA i spoT. Dodatkowo w komórkach V. cholerae w przypadku głodu wywołanego niedoborem kwasów tłuszczowych i glukozy, indukcja odpowiedzi ścisłej zachodzi przy udziale produktu genu relV [62]. Zauważono, że regulacja ekspresji genów wirulencji związana może być ze zmianami w środowisku, w którym rosną bakterie. Wykazano, że zagęszczenie bakterii wpływa na ekspresję genów wirulencji, kontrolowanych przez system QS (Quorum Sensing), a odpowiedź ścisła kontroluje powiązanie czynników wirulencji z fazą wzrostu, w której znajdują się komórki. Badania Boardmana i wsp. wykazały, że toksyna RTX nie jest wydzielana na zewnątrz w czasie stacjonarnej fazy wzrostu, co było spowodowane negatywnym wpływem ppGpp na promotory genów związanych z produkcją toksyny; wynikający z obecności w rejonie promotorowym sekwencji dyskryminatora bogatej w pary GC [12]. Wskazywano, że syntetazą ppGpp zaangażowaną w wirulencję jest RelA [36]. Szczepy z mutacją w genie relA niezdolne do akumulacji ppGpp podczas głodu aminokwasowego [79] wykazywały obniżony poziom ekspresji genów toksyny cholery oraz pilusa związanego z toksyną (TCP), zmieniony poziom poryn OmpU i OmpT, ograniczoną zdolność ruchu, a także zredukowaną zdolność kolonizacji w jelicie myszy [36]. Geny kodujące czynniki wirulencji V. cholerae są wspólnie regulowane tworząc regulon ToxR [11]. Jego indukcja rozpoczyna się od aktywacji ekspresji tcpPH przez związanie do jego promotora AphA i AphB. Następnie TcpP w połączeniu z ToxR, aktywują ekspresję genów toksyny ctxAB. Bezpośrednio na aktywację ekspresji genów kodujących CT i TCP wpływa ToxT [11]. W badaniach transkrypcji genów CT i TCP w mutantach ArelA zaobserwowano spadek poziomu ekspresji tych genów wynikający z obniżenia efektywności transkrypcji genu toxR [36]. Oprócz tego wykazano, że syntetaza (p)ppGpp niezbędna jest do transkrypcji genów kodujących egzopolisacharydy biofilmu vpsR i vpsT w komórkach V cholerae [37]. Istotną rolę w wirulencji V. cholerae odgrywa także białko DksA. Jego synergistyczna rola w regulacji ekspresji genów znajdujących się pod kontrolą odpowiedzi ścisłej (opisana w szczegółach dla E. coli) przejawia się u V. cholerae w postaci pozytywnej regulacji procesów związanych z wirulencją, takich jak ruchliwość, produkcja hemaglutyniny czy ekspresji genów toksyny cholery [63]. Co ciekawe, ostatnio wykazano, iż produkcja toksyny cholery jest regulowana przez DksA także post-transkrypcyjnie [9].

Bakteria Salmonella enterica należy do Gram-ujemnych, względnie beztlenowych patogenów zdolnych do ruchu za pomocą flagelli. Główną niszą kolonizowaną przez S. enterica jest układ pokarmowy człowieka i zwierząt hodowlanych, skąd gatunek ten wraz z odchodami dostaje się do wody, gdzie może infekować inne organizmy [3]. Po kolonizacji jelita, S. enterica dzięki zdolności aktywnego atakowania komórek fagocytujących i niefagocytujących poprzez układ sekrecyjny 1 typu III (T3SS1), którego geny kodowane są na wyspie patogenności 1 (SPI1 – Salmonella Pathogenicity Island 1), dostaje się do erytrocytów, komórek M i komórek dendrytycznych w nabłonku jelita. Następnie zostaje pochłonięta przez makrofagi i szybko przetransportowana przez krew do węzłów chłonnych i śledziony [73]. Wykorzystanie układu wydzielniczego T3SS1 jest ściśle regulowane przez ekspresję wielu czynników. Zaangażowane są w to białka efektorowe (SipA, SipC, SopB/SigD, SopD, SopE2 i SptP) [86]. Cykl życiowy S. enterica w komórkach gospodarza wymaga dostosowania się do różnych warunków środowiskowych, tak aby nastąpiła ekspresja genów zaangażowanych w proces wirulencji. Czynnikiem koordynującym te procesy jest czterofosforan guanozyny, za którego metabolizm odpowiada u S. enterica zarówno RelA, jak i SpoT [66] . Badania zespołu Pizzaro-Cerda i Tedin wykazały, iż mutant ΔrelA ΔspoT był awirulentny in vitro a jego wirulencja badana w modelu mysim była bardzo obniżona. Ponadto, zauważono, że mutant ΔrelA ΔspoT utracił zdolność do kolonizacji wątroby i śledziony [66]. W celu skoordynowania infekcji komórek nabłonka jelita, S. enterica odpowiada na bodźce zewnętrze poprzez aktywację ekspresji genów znajdujących się w obrębie SPI1. Indukcja genów spil zachodzi poprzez odpowiedź na poziom ppGpp syntetyzowanego przez produkt genu spoT. Z kolei głód węglowy i ograniczenie ilości tlenu powoduje zależną od ppGpp aktywację ekspresji genu hilA [66]. Białko HilA jest jednym z głównych czynników regulujących ekspresję genów wyspy patogenności SPI1, reguluje także ekspresję drugiego ważnego regulatora transkrypcji, białka InvF [66]. Do wirulencji S. enterica subsp. enterica ser. Typhimurium przyczynia się również białko DksA. Mutanty ΔdksA wykazują mniejszą zdolność kolonizacji zwierząt, a w mysim modelu badawczym obserwowano 5-krotne obniżenie poziomu infekcji [89]. DksA pełni ważną rolę w formowaniu biofilmu, ruchliwości bakterii i ekspresji genów SPI1, stanowiąc istotny czynnik reguluj ący pro – cesy wirulencji u S. enterica [7].

Oprócz zdolności do przetrwania w różnych niszach ekologicznych, włączając glebę i wodę, pałeczka ropy błękitnej jest patogenem oportunistycznym, zarówno dla roślin, jak i najgroźniejszym drobnoustrojem powodującym zakażenia szpitalne, szczególnie groźne dla pacjentów chorych na mukowiscydozę. Bakteria Pseudomonas aeruginosa posiada wiele czynników odpowiadających za patogenezę. Głównymi czynnikami chorobotwórczymi są: otoczka alginianowa, działająca jako czynnik adhezyjny, pilina związana ze wstępną kolonizacją, proteazy i toksyny, m.in. enterotoksyna czy egzotoksyna A. Pałeczka ropy błękitnej wytwarza piocyjaninę, powodującą zahamowanie wzrostu innych gatunków bakterii [22]. Komórki bakteryjne komunikują się ze sobą z wykorzystaniem mechanizmu QS [31]. Systemy wyczuwania tego mechanizmu wykorzystują w komórkach bakterii Gram-ujemnych zwykle N-acetylo-homoserynolakton, który bezpośrednio wiąże się i aktywuje białko LasR regulujące transkrypcję [42]. Dzięki systemowi QS, P. aeruginosa koordynuje wydzielanie czynników wirulencji. Podobnie, jak E. coli, P. aeruginosa posiada dwufunkcyjne białko SpoT oraz białko RelA zaangażowane w akumulację ppGpp podczas głodu aminokwasowego. Mutanty ΔrelA P. aeruginosa wykazały mniejszą wirulencję w modelu badawczym Drosophila melanogaster [26], co może mieć związek z quorum sensing. Bakteria ta posiada również inny system QS, związany z p-chinolonem, który współpracuje z N-acetylo-homoserynolaktonem i kontroluje produkcję czynników wirulencji w stacjonarnej fazie wzrostu [42]. Zaobserwowano, że ilość piocyjaniny, aktywność elastazy, czy ekspresja białek T3SS były obniżone w szczepie pozbawionym RelA i SpoT [92]. Poza naturalną opornością na wiele antybiotyków, P. aeuroginosa posiada zdolność tworzenia biofilmu, dzięki któremu jest jeszcze bardziej oporny na antybiotykoterapię. Badania Stewarta i wsp. wykazały, że mutanty ΔrelA ΔspoT pomimo tworzenia biofilmu tej samej gęstości, co komórki typu dzikiego, wykazywały większą podatność na antybiotyk – cyprofloksacynę [83]. Wyżej wymienione wyniki wskazują, że ppGpp wymagany jest do regulacji wirulencji u P. aeruginosa.

Bakteria Francisella tularensis jest zjadliwym patogenem, bardzo łatwo rozprzestrzeniającym się drogą powietrzną, ze względu na niską dawkę infekcyjną [23]. Gatunek ten powoduje tularemię, będącą ostrą chorobą zakaźną ludzi i zwierząt. Tularemia u człowieka przyjmuje różne formy: wrzodziejącą, węzłową i płucną [4]. Geny wirulencji bakterii są zlokalizowane w obrębie ruchomych elementów genetycznych. Bakteria wytwarza otoczkę chroniącą ją przed układem immunologicznym, z kolei lipopolisacharyd, zwany endotoksyną bakteryjną, jest jednym z najbardziej istotnych komponentów wpływającym na przebieg infekcji. Ważnym czynnikiem wirulencji wielu bakterii Gram-ujemnych są pile typu IV. Biorą one udział w adhezji, mobilności i tworzeniu biofilmu. Po dostaniu się do organizmu ssaków F. tularensis wnika do makrofagów, gdzie dochodzi do indukcji ekspresji genu mglA, który niezbędny jest do wewnątrzkomórkowego wzrostu. Produkcja białka MglA indukowana jest w przeciągu 90 min. MglA wiąże się z innym białkiem – SspA. Kompleks ten współpracuje z RNAP kontrolując transkrypcję genów zlokalizowanych na wyspie patogenności FPI [29]. Obecność MglA jest niezbędna do wzrostu bakterii w makrofagach, jak również wpływa na chorobotwórczość. Wykazano, że kompleks MglA-SspA działa wspólnie z hipotetycznym białkiem PigR. Białko to wiąże DNA z alarmonem odpowiedzi ścisłej w celu regulacji ekspresji docelowych genów, takich jak iglA (kodujący białko systemu sekrecji typu IV-IglA) czy pdpA (Pathogenicity Determinant Protein) [14]. Patogen F. tularensis posiada zarówno białko RelA, jak i SpoT. U F. tularensis ssp. holarctica, mutanty ΔrelA ΔspoT pozbawione zdolności do syntezy ppGpp wykazują obniżoną ekspresję genów wyspy patogenności, zmniejszoną zdolność do wzrostu w makrofagach, czy wirulencję w mysim modelu badawczym. Poziom ppGpp zależny od białka SpoT jest wystarczający do zjadliwości bakterii, ponieważ mutanty ΔrelA wykazują jedynie niewielkie defekty wirulencji. Dodatkowo ppGpp nie wpływa na interakcję pomiędzy MglA-SspA a RNAP, ale kontroluje ekspresję genów mglA i sspA zależną od PigR [14]. Poza tym, ppGpp wpływa także na białka regulatorowe kontrolujące wirulencję F. tularensis podczas infekcji.

Pałeczka krztuśca jest Gram-ujemnym patogenem człowieka wywołującym chorobę układu oddechowego. Do czynników zjadliwości należą adhezyny: hemaglutynina filamentowa, pertaktyna, białka fimbrii, LPS oraz toksyny, takie jak toksyna krztuścowa i tchawicza. Czynniki zjadliwości umożliwiają bakteriom adhezję do nabłonka błony śluzowej dróg oddechowych, bezpośrednią inwazję komórek nabłonka, niszczenie rzęsek układu oddechowego czy modulowanie odpowiedzi immunologicznej [24]. Ekspresja genów wirulencji regulowana jest przez system BvgAS. Białko BvgAS aktywuje produkcję czynników wirulencji: filamentację, hemaglutyninę, toksynę krztuśca i cyklazę adenylową [25]. Podobnie jak w komórkach E. coli podczas głodu aminokwasowego, alarmon odpowiedzi ścisłej syntetyzowany jest przez białka RelA i SpoT. Pałeczka krztuśca wytwarza fimbrie Fim3 [6], które kodowane są przez geny fimBCD. Badania Stanley i wsp. wykazały, że ekspresja genów kodujących białka Fim3 była obniżona w podwójnych mutantach ΔrelA ΔspoT [81]. Kolejnym ważnym procesem związanym z patogennością tych bakterii jest tworzenie biofilmu. Jest to wieloetapowy proces tworzenia mikrokolonii i rozwoju wielowarstwowej struktury [81]. Rozwój biofilmu związany jest z adaptacją i przetrwaniem pałeczki krztuśca podczas infekcji [77]. Wykazano, że (p)ppGpp zaangażowany jest w regulację tworzenia biofilmu na podłożu. Mutant szczepu ppGpp⁰ nie jest zdolny do przeżycia w warunkach głodu aminokwasowego, a także wykazuje zwiększoną podatność na stres oksydacyjny. W związku z tym, tworzenie biofilmu przez mutanty pozbawione odpowiedzi ścisłej jest ograniczone w porównaniu do szczepu typu dzikiego [84]. Struktury filamentów biofilmu szczepu typu dzikiego wykazują różnice w długości i morfologii, podczas gdy nie obserwowano takiego zróżnicowania u mutantów ppGpp⁰ [84].

Paciorkowiec kałowy należący do bakterii Gram-dodatnich, występuje w przewodzie pokarmowym człowieka i innych ssaków. Może powodować zagrażające życiu zakażenia. Paciorkowiec kałowy E. faecalis posiada kilka czynników wirulencji, z których jedne sprzyjają kolonizacji, inne toksycznie działają na komórkę gospodarza. Do najważniejszych czynników zjadliwości należy substancja agregująca – AS (Aggregation Substance), która odpowiada za przyleganie enterokoków do komórek eukariotycznych. Cytolizyna (Cyl) jest jedną z toksyn produkowanych przez enterokoki. Powoduje ona rozpad erytrocytów, leukocytów i makrofagów [71]. Wykazano, że w komórkach E. faecalis głód aminokwasowy również prowadzi do akumulacji czterofosforanu guanozyny. W komórkach E. faecalis oprócz dwufunkcyjnego białka Rel produkowana jest także mała syntetaza RelQ [32]. Mutanty Arel są bardziej podatne na stres, taki jak szok temperaturowy, niskie pH, wysoką osmolarność, czy stres oksydacyjny [2]. Badania wskazują, że odpowiedź ścisła może być związana z wirulencją E. faecalis. Wykazano, że podwójne mutanty ppGpp⁰ (ΔrelA ΔrelQ) charakteryzowały się obniżonym poziomem wirulencji w modelu infekcyjnym Caenorhabditis elegans [2]. W doświadczeniu kontrolnym z użyciem pojedynczych mutantów Δrel i ΔrelQ nie zaobserwowano zmniejszenia wirulencji bakterii. Dodatkowo zauważono, że inaktywacja enzymu RelQ w mutancie Δrel przywraca zdolność białka RelA do hydrolizy ppGpp. Ponadto, mutanty Δrel wykazywały większą odporność na niskie pH, czy traktowanie komórek etanolem [94].

Laseczka wąglika jest bakterią Gram-dodatnią, rosnącą w warunkach tlenowych. Posiada zdolność wytwarzania przetrwalników. Do zakażenia zwierząt dochodzi w wyniku spożycia zanieczyszczonej przetrwalnikami paszy bądź wody. Główne czynniki wirulencji zlokalizowane są na dwóch plazmidach pXO1 i pXO2 [35]. Cykl życiowy Bacillus anthracis rozpoczyna się po spożyciu przetrwalników przez ssaki. Kolejno dochodzi do kiełkowania zarodników wewnątrz organizmu żywiciela i syntezy czynników wirulencji. Najważniejszym czynnikiem wirulencji jest toksyna będąca mieszaniną trzech białek – antygenu ochronnego PA (Protective Antigene), czynnika obrzęku EF (Edema Factor) i czynnika letalnego LF (Lethal Factor) [54]. PA umożliwia wniknięcie toksyny wąglika do wnętrza komórek. Czynnik EF to białko zależne od wapnia, które zwiększając poziom cAMP w komórce zaburza jej homeostazę. Z kolei LF to zależna od cynku proteaza, przecinająca kinazy z rodzaju MAPKK, prowadząc do zaburzeń szlaków przekazywania sygnału w komórce i do apoptozy. Ekspresja genów wirulencji regulowana jest przez główny czynnik regulacyjny AtxA. Doświadczalnie wykazano, że największa ekspresja genów toksyny laseczki wąglika występuje podczas wejścia bakterii w stacjonarną fazę wzrostu, co sugeruje, że ograniczenie składników odżywczych jest środowiskowym sygnałem, który indukuje produkcję toksyn [75]. Mutant relA B. anthracis nie wykazuje zmniejszonej ekspresji genów wirulencji, ale liczba endospor mutantów relA jest około 10 000 razy niższa niż w przypadku szczepu typu dzikiego [75]. Zależność pomiędzy syntezą (p)ppGpp a sporulacją wskazuje, że odpowiedź ścisła przyczynia się do przetrwania B. anthracis w środowisku naturalnym [75]. W komórkach B. anthracis wykazano także obecność drugiego genu – homologa rsh, którego produkt, Rsh_Bant, uczestniczy w powstawaniu (p)ppGpp i może być związany z wirulencją bakterii [41].

Gronkowiec złocisty jest jednym z głównych patogenów człowieka. Powoduje ropne zapalenia skóry, zatrucia pokarmowe, zapalenie płuc czy zespół wstrząsu toksycznego [28]. Gronkowiec Staphylococcus aureus wytwarza wiele czynników zjadliwości, takich jak białka powierzchniowe, toksyny uszkadzające tkanki, czy prowadzące do wstrząsy septycznego i białka hamujące chemotaksję [28]. Produkcja czynników jest ściśle regulowana podczas wzrostu bakterii. Jednym z mechanizmów tej regulacji jest system quorum sensing. Patogen ten posiada trzy syntetazy (p)ppGpp: bifunkcjonalne RSH oraz białka RelP i RelQ [59]. Dowiedziono, że mutanty ΔrelP i ΔrelQ wykazują obniżoną zdolność do przetrwania w obecności wysokich dawek antybiotyków niszczących ściany komórkowe w porównaniu do szczepu typu dzikiego [33]. Ponadto, wyniki wskazały, że mutanty niezdolne do syntezy (p)ppGpp mają obniżoną wirulencję [33].

Paciorkowiec Streptococcus pyogenes jest Gram-dodatnim ziarniakiem, zaliczanym do paciorkowców P-hemolizujących grupy A. Bakteria jest patogenem człowieka, posiadającym zdolność całkowitej hemolizy typu β [85], powoduje zapalenia gardła, anginę, jak również zapalenia skóry (liszajec) oraz płonicę [13]. Do czynników wirulencji S. pyogenes należy egzotoksyna B (speB), streptolizyna S i streptokinaza (covRS) [34]. Podobnie, jak inne Gram-dodatnie bakterie, S. pyogenes posiada białka RelQ i RelP oraz bifunkcjonalne RSH [45]. Badania wykazały, że głodzenie aminokwasowe prowadziło do nadmiernej indukcji operonu fas (regulującego wirulencję) oraz wzrostu ekspresji genu autoinduktora 2 [82]. Podczas analizy wyników RT-PCR okazało się, że ekspresja genów relA, graB (wiąże białko G), xpt (fosforybozylotransferaza ksantynowa), braB (białko transportujące aminokwasy), pbuX (permeaza putynowa), speH (egotoksyna pirogenna H), pyrR (białko regulujące syntetazę pirymidyny), pncA (nikotynoamidaza) była negatywnie kontrolowana przez odpowiedź ścisłą [49].

Gram-dodatnia Listeria monocytogenes jest zjadliwym patogenem przenoszonym drogą pokarmową. Atakuje przede wszystkim ludzi starszych, dzieci i obiety w ciąży prowadząc do listeriozy. Zakażenie rozpoczynane jest przez adhezję bakterii do powierzchni komórek, następnie na drodze fagocytozy dochodzi do wniknięcia bakterii do komórek gospodarza. Kluczowymi czynnikami wirulencji są listeriolizyna umożliwiająca lizę fagosomu oraz dwie fosfolipazy [55]. Głód aminokwasowy u L. monocytogenes wywołuje syntezę (p)ppGpp, za którą odpowiedzialny jest dwufunkcyjny produkt genu ΔrelA [87]. Zdolność L. monocytogenes do adhezji do powierzchni abiotycznej i tworzenia biofilmu, jak również infekcji organizmu myszy jest ograniczona w mutantach ArelA [87]. U bakterii Gram-dodatnich, globalny regulator CodY negatywnie reguluje ekspresję genów niezbędnych do adaptacji w warunkach ograniczonego dostępu składników odżywczych. Regulon CodY L. monocytogenes obejmuje geny zaangażowane w metabolizm aminokwasów, asymilację azotu, wirulencję, jak również wejście bakterii w stacjonarną fazę wzrostu [10]. Prawdopodobnie obniżony poziom patogenności mutantów ΔrelA może być spowodowany niezdolnością bakterii do wirulencji powiązaną z regulacją poziomu białka CodY. Zależność ta wyjaśniana jest represją transkrypcji genów regulonu CodY w mutantach ΔrelA [10]. Zatem, ppGpp wpływa na patogenność L. monocytogenes na wiele różnych sposobów.