Biologia syntetyczna to nowa dziedzina nauki, w której organizmy żywe są genetycznie programowane do wykonywania określonych zadań. Organizmy takie planuje się zastosować między innymi w medycynie, rolnictwie, energetyce, przemyśle oraz badaniach podstawowych w biologii. Modyfikacje genetyczne mogą dotyczyć zarówno bakterii, powszechnie uznanych za posiadające właściwości probiotyczne (na przykład bakterii z rodzaju
Terminem mikrobiota określa się wszystkie drobnoustroje występujące w organizmie ludzkim w rejonach pokrytych komórkami nabłonkowymi – w obrębie błon śluzowych oraz na skórze człowieka [15, 48]. Szczególnie dużo drobnoustrojów bytuje w przewodzie pokarmowym i w kobiecej pochwie [6, 44]. Drobnoustroje w jelicie grubym to w większości bakterie bezwzględnie beztlenowe z rodzaju
Efekty prozdrowotne prawidłowej mikrobioty człowieka
Zjawisko | Efekt prozdrowotny |
---|---|
normalizacja mikrobioty jelita | • ochrona przed kolonizacją patogenami |
• zapobieganie infekcjom jelit | |
• zapobieganie biegunce | |
• przyspieszenie wymiany enterocytów | |
• stabilizacja bariery jelitowej | |
normalizacja mikrobioty pochwy | • ochrona przed kolonizacją patogenami |
• zapobieganie zakażeniom pochwy w tym również infekcjom wirusowym (HIV/HPV) | |
efekty metaboliczne | • ułatwienie metabolizmu laktozy |
• synteza krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) i niektórych witamin | |
• trawienie długołańcuchowych węglowodanów i błonnika pokarmowego | |
• uczestnictwo w przemianach kwasów żółciowych i ich wydaleniu | |
• wpływ na pasaż jelitowy | |
• detoksykacja/usuwanie ksenobiotyków i kancerogenów | |
• obniżenie poziomu toksycznych i mutagennych substancji w jelicie | |
• redukcja ryzyka rozwoju otyłości, cukrzycy typu 2 i zespołu metabolicznego oraz raka jelita grubego | |
immunomodulacja | • zapewnienie prawidłowego rozwoju układu odpornościowego |
• regulacja odpowiedzi immunologicznej | |
wpływ na funkcjonowanie centralnego układu nerwowego | • produkcja neurotransmiterów i neuromodulatorów [kwas gamma-aminomasłowy (GABA), norepinefryna, serotonina, dopamina, acetylocholina, kynurenina] |
• zapobieganie nieprawidłowościom w funkcjonowaniu układu nerwowego (oś jelitowo-mózgowa) |
Określenie „dysbioza” oznacza zaburzenie składu, proporcji oraz funkcji drobnoustrojów tworzących mikrobiotę [8]. Konsekwencją dysbiozy jest rozluźnienie połączeń ścisłych między enterocytami i zwiększenie przesiąkliwości nabłonka jelitowego (leaky gut syndrome), co może sprzyjać między innymi chronicznym stanom zapalnym bezpośrednio pod warstwą komórek nabłonkowych (mikrozapalenie), endotoksemii, jak również zmianom chorobowym w odległych obszarach ustroju, zaliczanym do grupy chorób niezakaźnych (non-communicable diseases) [2]. Zatem dysbioza oraz uszkodzenie bariery nabłonkowej stanowią czynnik sprzyjający rozwojowi takich schorzeń jak: nieswoiste choroby zapalne jelit (IBD, z ang. inflammatory bowel disease), zaburzenia czynnościowe przewodu pokarmowego (biegunki, zaparcia, wzdęcia), zespół jelita drażliwego, choroby alergiczne, choroby autoimmunizacyjne, cukrzyca typu drugiego (T2D), otyłość, zespół metaboliczny, choroba stłuszczeniowa wątroby, miażdżyca, choroby neurodegeneracyjne, depresja, zaburzenia ze spektrum autyzmu, choroba Parkinsona, choroba Alzheimera oraz schizofrenia [2]. Najważniejsze czynniki, sprzyjające rozwojowi dysbiozy to dieta, niektóre choroby oraz stosowane leki [4, 34, 49].
Jednym ze sposobów utrzymania równowagi w składzie mikrobioty człowieka jest stosowanie probiotyków. Probiotyki to żywe mikroorganizmy, które podawane w odpowiedniej ilości wywierają korzystny wpływ na zdrowie gospodarza. Metody sprzyjające uzyskaniu bioróżnorodności mikrobioty obejmują nie tylko stosowanie probiotyków, ale również wykorzystanie prebiotyków, synbiotyków i postbiotyków. Prebiotyki to składniki żywności, między innymi fruktooligosacharydy, inulina czy skrobia oporna, które wspierają rozwój bakterii probiotycznych, przykładowo bakterii kwasu mlekowego (
Właściwości prozdrowotne probiotyków w profilaktyce i terapii wielu schorzeń są powszechnie znane. Do najczęściej stosowanych drobnoustrojów probiotycznych należą bakterie z rodzajów
Zgodnie z wytycznymi ISAPP (The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics) wyróżniono trzy główne mechanizmy działania probiotyków pod względem częstości ich występowania wśród badanych szczepów. Powszechnie występujące mechanizmy (dotyczą rodzaju bakterii) obejmują ochronę przed kolonizacją przez patogeny, wytwarzanie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA, short chain fatty acids), stabilizację i normalizację mikrobioty jelitowej, wpływ na zwiększoną wymianę enterocytów oraz regulację pasażu jelitowego. Często występujące mechanizmy (dotyczą gatunku bakterii) polegają na wytwarzaniu witamin, stabilizacji bariery jelitowej, antagonizmie w stosunku do patogenów, metabolizmie soli kwasów żółciowych, aktywności enzymatycznej i neutralizacji karcynogenów. Rzadko występujące mechanizmy (dotyczą szczepu bakterii) to modulacja odpowiedzi immunologicznej, wytwarzanie specyficznych substancji bioaktywnych oraz działanie endokrynne i neurogenne. Różne szczepy bakterii wykazują nieco inne właściwości probiotyczne, a więc należy dobierać konkretny szczep probiotyczny do leczenia konkretnego schorzenia [11, 15, 40].
Probiotyki naturalne, będące niezmodyfikowanymi genetycznie drobnoustrojami (PN), są wykorzystywane między innymi w zapobieganiu i leczeniu biegunki poantybiotykowej, zapobieganiu biegunce spowodowanej
W literaturze coraz częściej pojawia się również pojęcie probiotyków następnej generacji (NGP, next generation probiotics). Są to mikroorganizmy, dotychczas nie stosowane jako probiotyki, jednak wykazujące obiecujące właściwości zdrowotne dla człowieka. Do takich mikroorganizmów zalicza się obecnie między innymi
Korzyści płynące ze stosowania probiotyków naturalnych są wielorakie. W odróżnieniu od tradycyjnych leków podawanych doustnie PN dostarczają lokalnie substancje biologicznie aktywne bezpośrednio do zmienionych chorobowo tkanek, co skutkuje zwiększoną ich skutecznością przy jednoczesnym zmniejszeniu ogólnoustrojowych skutków ubocznych. PN wytwarzają substancje biologicznie aktywne „na miejscu”, co eliminuje potrzebę stosowania kosztownych etapów oczyszczania leku po jego syntezie i umożliwia użycie niższej jego dawki [21, 24]. Przykładem są substancje o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, takie jak: kwasy organiczne (obniżają pH), nadtlenek wodoru, związki systemu laktoperoksydazy, diacetyl czy bakteriocyny, a także witaminy z grupy B i K, hydrolazy (wpływające na metabolizm tłuszczów w wątrobie) czy SCFA i maślan (pełniące funkcje odżywcze w stosunku do komórek nabłonka jelita) [29].
Stosowanie PN wiąże się jednak z pewnymi ograniczeniami. PN charakteryzują się wysoką wrażliwością na czynniki fizyko-chemiczne. Większość szczepów probiotycznych ginie w temperaturze 60–85°C. Klasyczne metody uodparniania szczepów na trudne warunki procesów technologicznych polegają na poddaniu ich uprzedniemu działaniu sub-letalnego czynnika stresowego. Może to jednak prowadzić do uszkodzenia komórek i utraty żywotności kultur probiotycznych, prowadząc tym samym do zmniejszenia aktywności podawanego probiotyku [16, 19, 28]. Ponadto doustne przyjmowanie probiotyków jest związane z koniecznością ich przejścia przez żołądek i dwunastnicę, gdzie są narażone na działanie kwasu żołądkowego oraz enzymów trawiennych i żółci. Dopiero w jelicie krętym i okrężnicy panują korzystne dla nich warunki bytowe. Korzyści zdrowotne po zastosowaniu probiotyku w wielu przypadkach uzyskuje się tylko wtedy, gdy szczep probiotyczny dotrze do jelit w stanie metabolicznie aktywnym i w wystarczającej dawce. Trudno jest jednak określić, jaka dawka probiotyku dostaje się do jelit oraz czy jest ona wystarczająca dla osiągnięcia efektu biologicznego [3, 7, 28, 47, 54]. Wskaźniki przeżywalności dla wybranych szczepów oszacowano na 20–40%, przy czym głównymi przeszkodami w ich przeżyciu jest obecność kwasu solnego w żołądku i działanie soli żółciowych [7].
Cały czas poszukuje się nowych rozwiązań biotechnologicznych, które zapewnią ochronę probiotykom przed niekorzystnymi warunkami środowiska zewnętrznego i wewnętrznego oraz rozszerzą zakres ich wykorzystania [28, 47].
Próby modyfikacji genetycznych znanych probiotyków, jak i innych bakterii, które mogłyby w przyszłości pełnić szeroko pojętą rolę prozdrowotną, stają się obecnie jedną z dróg rozwoju nowoczesnej medycyny.
Wprowadzenie modyfikacji genetycznych do komórek bakterii probiotycznych umożliwia zdecydowane podwyższenie ich odporności na warunki fizyko-chemiczne panujące podczas procesów technologicznych oraz w środowisku przewodu pokarmowego.
Przykładowo dowiedziono, że gen
W przyszłości modyfikacje genetyczne bakterii, nie tylko tych o obecnie znanych właściwościach probiotycznych, pozwolą również na rozszerzenie mechanizmów ich biologicznego działania i, co za tym idzie, rozszerzenie możliwości ich zastosowania w diagnostyce oraz terapii. Dobrze zdefiniowane szlaki genetyczne i sieci regulacyjne genów, mają spowodować niezawodność zmodyfikowanych bakterii w produkcji ściśle zdefiniowanych związków biologicznie aktywnych. Bakterie modyfikowane genetycznie (BMG) mogą produkować kilka substancji biologicznie aktywnych, w czasie, dawce i sekwencji możliwej do kontrolowania. W przypadku PN mamy do czynienia raczej z nieokreśloną mieszaniną związków bioaktywnych, których efekty działania są trudne do oceny. Ciągłe modyfikacje BMG umożliwiają ich udoskonalanie, a co za tym idzie, ich skuteczność oraz liczba chorób, w leczeniu których można je stosować, również wzrośnie [24, 32, 42]. Ponadto BMG mogą docierać do miejsc w organizmie, które są nieosiągalne dla PN. Może to z kolei umożliwiać stosowanie niższych dawek leku i obniżyć prawdopodobieństwo wystąpienia skutków ubocznych u pacjenta [21]. Wreszcie BMG mogą być wykorzystywane do produkcji szczepionek. Po podaniu doustnym bakterii zmodyfikowanych genetycznie, zawierających w swym genomie gen kodujący określony antygen, dochodzi do jego ekspresji i rozwinięcia procesu immunizacji w organizmie gospodarza. Ten typ szczepionki jest odporny na warunki transportu i przechowywania, łatwy i higieniczny do podania pacjentowi, a raz wytworzony staje się stosunkowo tani w produkcji [14].
O ile bezpieczeństwo stosowania PN jest powszechnie uznane, to bezpieczeństwo stosowania BMG w diagnostyce i terapii chorób nie jest jednak już tak oczywiste. Jednym z postulowanych niebezpieczeństw jest wydostanie się BMG z przewodu pokarmowego pacjenta do środowiska zewnętrznego, gdzie mogłyby wywołać trudne do przewidzenia skutki. Mechanizmem zabezpieczającym przed takim zdarzeniem może być wprowadzenie do genomu BMG genów, których produkt białkowy kieruje komórkę na szlak apoptozy („automatyczne włączniki śmierci”). Gen ten ulega ekspresji po zmianie warunków środowiska, w którym znajdują się zmodyfikowane bakterie. Próbuje się również tak zmodyfikować genetycznie bakterie, aby nie były w stanie przeżyć w środowisku zewnętrznym, w którym brakuje określonej, niezbędnej dla ich przeżycia substancji (zjawisko auksotrofii). Pomimo, że skomplikowane układy genetyczne umożliwiają uwalnianie terapeutyku w odpowiednim organie, w stosownym do stanu zdrowotnego tkanki czasie i stężeniu, to jednak istnieje pewne niebezpieczeństwo rozregulowania tego systemu i związanych z tym komplikacji [5, 25]. BMG muszą cechować się określoną czułością i selektywnością w stosunku do wykrywanych substancji, być stabilne w różnych typach środowiska (m.in. dieta, mikrobiota gospodarza) oraz być niepodatne na mutacje [26, 36]. Poszukiwanie procedur i rozwiązań mających zapewnić maksymalne bezpieczeństwo stosowania farmabiotyków w medycynie jest czasochłonne i kosztowne [1].
Obecnie duże nadzieje w diagnostyce i terapii wiąże się z BMG. Posługując się metodami inżynierii genetycznej możliwe stały się różnorodne modyfikacje materiału genetycznego takie jak dodawanie, usuwanie czy przenoszenie fragmentów DNA pomiędzy organizmami. W ten sposób otrzymuje się genetycznie modyfikowane organizmy (GMO), posiadające pożądane cechy. Najczęściej wykorzystywane bakterie modyfikowane genetycznie o znaczeniu medycznym stanowią bakterie z rodzaju
Trzy główne rodzaje BMG to bakterie pełniące funkcje diagnostyczne (tak zwane biosensory), bakterie produkujące terapeutyk w sposób ciągły oraz bakterie produkujące terapeutyk w odpowiedzi na określony bodziec zewnętrzny tzw. „inteligentny” probiotyk (IP) (Rys. 1, na podstawie [5]).
BMG pełniące funkcje diagnostyczne posiadają zdolność detekcji różnego typu biomarkerów, na przykład biomarkerów stanu zapalnego. Biomarker ten aktywuje ekspresję genu, który koduje białko, na przykład o właściwościach fluorescencyjnych, wykrywane następnie w kale. Z kolei BMG pełniące funkcje terapeutyczne posiadają zdolność ciągłej produkcji leku, który jest uwalniany w miejscu toczącego się procesu chorobowego. Rozwiązanie przyszłości to IP, czyli probiotyk łączący w sobie cechy BMG o działaniu diagnostycznym i terapeutycznym. IP wykrywa jeden lub kilka związków chemicznych, analizuje ich obecność i kombinacje, a następnie reaguje, dostarczając precyzyjną dawkę jednego lub większej liczby odpowiednich leków do chorego narządu. Zasadę działania IP można określić jako ciąg zdarzeń: detekcja(D)/analiza(A)/odpowiedź(O). Opis szczegółowych biotechnologicznych zasad konstruowania obwodów genetycznych można znaleźć między innymi w pracach Landry’ i wsp., Yadav i wsp. lub Rottinghaus i wsp. [24, 36, 52]. Związkami chemicznymi, ulegającymi detekcji, mogą być zarówno czynniki zewnętrzne, dodawane do wody lub pożywienia, jak i określone biomarkery produkowane
Bakterie modyfikowane genetycznie mogą zostać wprowadzone do organizmu doustnie, dożylnie, doodbytniczo, dopochwowo czy poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie do konkretnej tkanki, na przykład do guza nowotworowego. Następnie bakterie docierają do pożądanego miejsca w organizmie, co związane jest z preferencyjnym gromadzeniem się określonych szczepów bakterii w różnych tkankach, na przykład w obrębie tkanki nowotworowej [26].
W diagnostyce chorób przewodu pokarmowego przeprowadza się próby wykorzystania BMG, które posiadają zdolność przekształcania substancji, charakterystycznych dla stanu zapalnego w jelicie, w substancje będące biomarkerami, łatwo ulegającymi detekcji w kale, na przykład w postaci związku dającego sygnał fluorescencyjny. Prowadzone są próby nad wykryciem jonów S4O62− i S2O32−, a także detekcją NO, H2S, H2O2 i innych związków w kale osób cierpiących na stany zapalne jelit. Z kolei krwawienia w jelicie próbuje się diagnozować dzięki wykrywaniu obecności hemu. Na podobnej zasadzie opiera się wykrycie związków i substancji pochodnych w kale, które pełnią rolę biomarkerów infekcji charakterystycznych dla określonych patogenów (na przyk ład
W doświadczeniach związanych z wykorzystaniem BMG w terapii dominują schorzenia zlokalizowane w obrębie przewodu pokarmowego. Choroby zapalne jelit, obejmujące wrzodziejące zapalenie jelita grubego i chorobę Leśniowskiego-Crohna, są wywołane nieprawidłowym funkcjonowaniem układu immunologicznego w obrębie przewodu pokarmowego. Związki o charakterze przeciwzapalnym, takie jak kortykosteroidy, tiopuryny czy przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko czynnikowi martwicy nowotworu (TNF-α, tumor necrosis factor) są stosowane w leczeniu tej grupy schorzeń. Przeciwciała anty-TNF-α charakteryzują się wysoką skutecznością w łagodzeniu objawów chorób zapalnych jelit, ale również znacznymi efektami ubocznymi oraz wysokim kosztem leczenia. Genetycznie modyfikowane LAB, które produkują przeciwciała skierowane przeciwko TNF-α, mogą stanowić terapię alternatywną w stosunku do terapii konwencjonalnej. Skuteczność tej terapii została potwierdzona przy wykorzystaniu zwierzęcych modeli chorób zapalnych jelit. Zaobserwowano, że doustne podanie
Rekombinowane LAB mogą również posłużyć do dostarczania antygenów typowych dla wirusów, bakterii, grzybów oraz pasożytów w celu uzyskania odpowiedzi immunologicznej na błonach śluzowych. Celem tak podanej szczepionki jest wywołanie produkcji przeciwciał klasy IgA w układzie MALT, jednak ogólnoustrojowa odpowiedź immunologiczna również została zaobserwowana. Rozważane jest skonstruowanie takiej szczepionki między innymi przeciwko wirusowi ptasiej grypy, rotawirusom, wirusowi HIV oraz wirusowi zapalenia wątroby typu A [1, 33]. W badaniach na myszach wykazano, że doustne podanie zrekombinowanej bakterii z rodzaju
Obecnie leczenie wielu infekcji staje się coraz trudniejsze, głównie ze względu na wzrastającą oporność bakterii na antybiotyki. Podejmowane są próby zastosowania BMG w leczeniu infekcji, poprzez wykorzystanie ich wysokiej specyficzności oraz braku równoczesnego, negatywnego wpływu na mikrobiotę gospodarza. W warunkach
Spośród chorób metabolicznych, w których najczęściej wskazuje się na możliwość wykorzystania BMG, wymienia się fenyloketonurię oraz hiperamonemię. Jest to możliwe dzięki dostarczeniu do organizmu enzymów zaangażowanych w przemiany szkodliwych substancji [1, 55]. Kolejnym sposobem na wykorzystanie BMG jest leczenie schorzeń alergicznych, cukrzycy typu I, otyłości oraz nadciśnienia [26, 30, 53, 55].
Szczególne nadzieje wiąże się z wykorzystaniem właściwości BMG w terapii przeciwnowotworowej. Niektóre bakterie np. atenuowane szczepy
Szybki rozwój narzędzi inżynierii genetycznej i biologii syntetycznej umożliwia konstruowanie coraz skuteczniejszych i bezpieczniejszych farmabiotyków, pełniących zarówno funkcje diagnostyczne, jak i terapeutyczne. Bakterie modyfikowane genetycznie stanowią jedną z możliwości rozwoju medycyny spersonalizowanej, która zakłada indywidualne zastosowanie ściśle dobranej substancji leczniczej do stanu chorobowego każdego pacjenta. Taki wysoki poziom personalizacji jest możliwy do osiągnięcia poprzez stosowanie „inteligentnych probiotyków”. Co więcej, farmabiotyki umożliwiają również leczenie miejscowe, co ogranicza efekty uboczne, widoczne w czasie leczenia ogólnoustrojowego. Pomimo tak obiecujących perspektyw trudno jest określić, kiedy bakterie zmodyfikowane genetycznie znajdą powszechne zastosowanie w praktyce klinicznej. Liczba badań znajdująca się w fazie klinicznej jest ograniczona, co w dużej mierze jest związane z ograniczeniami i obawami związanymi z wykorzystaniem organizmów zmodyfikowanych genetycznie w medycynie [1, 26, 32].