Biomedical properties of chitosan: Application in tissue engineering.

Liczne badania wykazały zdolnośćmateriałów chitozanowych do utrzymywania i indukowania fenotypów komórkowych, a chitozan promował różnicowanie hodowanych komórek. Prowadzenie hodowli, m.in.: melanocytów, keratynocytów, komórek nabłonkowych pochodzących z dróg oddechowych czy astrocytów w obecności chitozanu pozwalało uzyskać charakterystyczne cechy fenotypowe dla hodowanych linii komórek. Wykazano, że materiały na bazie chityny były również zdolne do utrzymania macierzystości i indukowania różnicowania wielu komórek progenitorowych, zachowując ich cechy fenotypowe [22]. W przypadku komórek więzadła krzyżowego przedniego (ACL) możliwe jest indukowanie funkcji komórek za pomocą chitozanu. Dotychczas przeprowadzone badania wykazały duży wpływ tego biopolimeru na wzrost chondrocytów. Zastosowanie rusztowań na bazie chitozanu i polikaprolaktonu (PCL) spowodowało zwiększenie ekspresji genu swoistego dla gojenia się ran i syntezy kolagenu (TGF-β1). Stwierdzono, że na takim rusztowaniu skutecznej regulacji podlega morfologia (komórki miały dobrze rozwinięty i zorganizowany cytoszkielet), żywotność (komórki wykazywały zwiększoną zdolność do proliferacji), a także ekspresja genów ludzkich komórek ACL (wykazywały wyższy poziom ekspresji mRNA TGF-β1 i kolagenu typu III już w ciągu trzydniowej hodowli). Podobnie chitozan promował różnicowanie komórek nabłonkowych błony śluzowej pochodzących z dróg oddechowych [23, 24]. Komórki macierzyste hodowane razem z komórkami śródbłonka na rusztowaniach chitozanowych wykazywały aktywność adhezyjną i migrację komórek. Głównymi czynnikami sprzyjającymi temu zjawisku są jonowe interakcje między rusztowaniem chitozanowym a składnikami komórek oraz zdolność chitozanu do regulacji aktywności czynników wzrostu i cytokin wewnątrz rusztowania tkankowego. Migracja i adhezja komórek do podłoża jest możliwa również dzięki dużej porowatości chitozanu. Według dotychczas przeprowadzonych badań chitozan wykazuje potencjał w rozwoju rusztowań tkankowoswoistych do regulacji fenotypu komórkowego [25].

Chitozan może modulować funkcje różnych aktywnych biocząsteczek przez oddziaływanie elektrostatyczne i hydrofobowe. Badania wykazały zwiększoną aktywność m.in. nabłonkowych czynników morfogenetycznych: czynnika wzrostu fibroblastów 7 (FGF7), czynnika wzrostu fibroblastów 10 (FGF10) i czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) w obecności chitozanu. Czynniki te promowały swoistą morfogenezę nabłonkową, jak również dużą aktywność proliferacyjną oraz chemotaktyczną. Chitozan może chronić czynniki wzrostu fibroblastów przed inaktywacją, przedłużając ich działanie. Materiały na bazie chityny mogą pobudzać funkcje czynników bioaktywnych, podstawowych w tworzeniu tkanek, dlatego też mogą być z sukcesem wykorzystane w tworzeniu wielofunkcyjnych rusztowań [26, 27, 28].

Do przeżycia komórek oraz organizacji i genezy tkanek wymagane jest jednoczesne wytwarzanie i osadzanie ECM swoistych dla tkanek. Dlatego biomateriały, takie jak chitozan, stosowane do regeneracji tkanek powinny modulować komórki wytwarzające ECM. Materiały na bazie chityny wykorzystywane do procesu gojenia się ran indukowały tworzenie włókien kolagenu, co było zauważone, jako znaczna synteza kolagenu typu I, III i IV w implantach wykonanych z materiałów na bazie chityny. Wynika z tego, że wytwarzanie ECM przez hodowane komórki może być regulowane przez rusztowania chitozanowe [29, 30]. Udowodniono także ich działanie na inne elementy ECM, wymagane do regeneracji tkanek. Przykładem mogą być hodowle ludzkich fibroblastów żylnych na rusztowaniu chitynowym, które przyczyniło się do zwiększonej zawartości glikozaminoglikanów (GAG) po hodowli. GAG służy również jako rezerwuar niezbędnych czynników bioaktywnych i łącząc się z białkami, tworzy proteoglikany. Materiały na bazie chityny pomagają zaszczepionym komórkom w regeneracji tkanek, odgrywając rolę w regulowaniu syntezy głównych elementów ECM, dlatego też mogą być wykorzystane w inżynierii nabłonkowej i tkanek miękkich [21, 31, 32].

Zwykle mniej niż 10% całkowitej objętości żelu to faza stała, pozostała część to faza ciekła. Fazą ciekłą w hydrożelach jest najczęściej woda (a czasem adiuwanty). Dzięki fazie stałej, która zapewnia konsystencję żelu, mogą wchłonąć znaczne ilości wody, pozostając nierozpuszczalnymi w fazie ciekłej. Z powodu dużej zawartości wody hydrożele są ważnymi biomateriałami kompatybilnymi z większością tkanek. Są miękkie i podatne na zginanie, a ich właściwości mechaniczne są tożsame z właściwościami tkanek miękkich. Dlatego hydrożele są często stosowane jako rusztowania biomedyczne [35]. Chitozan może być albo fizycznie powiązany/skoordynowany z jonami metali, albo nieodwracalnie/chemicznie sieciowany w hydrożele, które wykazują odwracalne lub nieodwracalne żelowanie [36].

Odwracalne oddziaływania, które mogą zachodzić między łańcuchami polimerów, prowadzą do tworzenia ,,fizycznych” hydrożeli. Oddziaływania mają charakter niekowalencyjny, elektrostatyczny, hydrofobowy lub też są wiązaniami wodorowymi i mogą zależeć od takich parametrów jak: pH, stężenie i temperatura. Z tego powodu nie są wystarczająco stabilne i wykazują odwracalne żelowanie. Im mniej interakcji zachodzi, tym żel jest bardziej miękki, a im większa liczba interakcji, tym jest mocniejszy i sztywniejszy. Chitozan może utworzyć żel, a proces ten polega na neutralizacji jego grup aminowych i hamowaniu odpychania między łańcuchami chitozanu. Hydrożel tworzy się przez wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe [37]. Hydrożele chitozanu można również tworzyć przez zmieszanie chitozanu z innymi polimerami niejonowymi, rozpuszczalnymi w wodzie, np. poli- (alkohol winylowy) (PVA). Zmieszanie chitozanu z solami poliolowymi, takimi jak sól disodowa fosforanu glicerolu, powoduje powstanie termowrażliwych hydrożeli chitozanu. Szczepiony kopolimer chitozan-PEG może ulegać samoorganizacji w zależności od temperatury, tworząc stabilne hydrożele. Dzięki polikationowemu charakterowi chitozanu w warunkach kwasowych, możliwe jest tworzenie hydrożeli przez oddziaływania elektrostatyczne z udziałem polianionów, ale także polielektrolitów. Dodatnio naładowany chitozan będzie również tworzył żele z ujemnie naładowanymi cząsteczkami (jony fosforanowe, siarczanowe i cytrynianowe) [38, 39].

Przygotowanie jonowych hydrożeli chitozanowych umożliwia pominięcie katalizatora lub toksycznego reagenta, które są substratami niepożądanymi przy tworzeniu biorusztowań. Dzięki łatwości żelowania chitozanu bez konieczności stosowania toksycznych dodatków opracowano roztwory, które wykazują przejście zolu/żelu po wstrzyknięciu do organizmu. Dzięki temu rozwiązaniu można kształtowaćżel w obrębie chorej tkanki jako rusztowanie dla komórek. Niestety wytrzymałość mechaniczna hydrożeli fizycznych jest dość ograniczona i trudno jest dokładnie kontrolować wielkość ich porów. Dlatego opracowane zostały również metody nieodwracalnego chemicznego sieciowania hydrożeli [40].

Chemiczne sieciowanie hydrożeli odbywa się przez kowalencyjne wiązanie między łańcuchami polimerowymi i jest nieodwracalne, ale otrzymuje się znacznie stabilniejszą formę. Ta metoda może jednak zmieniać początkowe właściwości chitozanu, szczególnie jeśli w reakcję zaangażowane są grupy aminowe oraz może być źródłem zanieczyszczenia toksycznymi resztkowymi reagentami lub śladowymi ilościami katalizatora. Grupa – aminowa i hydroksylowa chitozanu mogą tworzyć różne wiązania, np. amidowe czy estrowe, a to może powodować tworzenie hydrożeli [41, 42]. Sieciowanie chitozanu następuje w reakcji fotoindukowanej lub w reakcjach katalizowanych enzymatycznie. Zastosowanie dialdehydowych środków sieciujących, takich jak glioksal i aldehyd glutarowy, umożliwia otrzymanie hydrożeli nieodwracalnych, dzięki reakcji z grupami aminowymi jednostek D-glukozaminy i grupami hydroksylowymi chitozanu [43, 44]. Jako środki sieciujące stosowane są także: tripolifosforan, glikol etylenowy, eter diglicydylowy i di-izocyjanian, jednak wszystkie wyżej wymienione środki mogą nadawać toksyczność utworzonym hydrożelom, która wyklucza te materiały do wykorzystania w medycynie. Należy podkreślić również, że chemiczne sieciowanie chitozanu, przez modyfikacje pierwszorzędowej aminy chitozanowej, może zmieniać właściwości i aktywność biologiczną chitozanu [45].

Gąbki to stałe struktury o dużej porowatości, które mogą wchłonąć znaczną ilość płynów (nawet 20-krotność ich suchej masy). Otrzymuje się je głównie przez liofilizację. W inżynierii tkanek wykorzystywane są dzięki dobrej interakcji z komórkami, zachowując miękkość i elastyczność [46]. Dzięki dobrej chłonności gąbki chitozanowe wykorzystywane są jako materiały opatrunkowe mogące wchłaniać wysięk rany, przyspieszając regenerację tkanek. W inżynierii kostnej gąbki chitozanowe znajdują zastosowanie jako materiał wypełniający ubytki kostne. Przykładem mogą być gąbki chitozanowo-kolagenowe wykorzystywane jako rusztowania do regeneracji kości [47, 48]. Gąbki kompozytowe chitozan-ZnO bardzo dobrze pęcznieją, są aktywne przeciwbakteryjnie i hemostatycznie w procesie gojenia i opatrywania ran. W celu polepszenia właściwości przeciwbakteryjnych opatrunków chitozanowych stosowano również dodatki antybiotyków, dzięki którym proces gojenia ran był szybszy, a ryzyko zakażeń zminimalizowane [49].

Folie chitozanowe można wytworzyć z roztworów soli chitozanu, które wylewa się na specjalnie przygotowaną gładką powierzchnię odlewniczą, a następnie suszy, zwykle w piecu lub w podczerwieni (IR). Przykładem komercyjnie dostępnego filmu chitozanowego jest bandaż HemCon® – preparat octanu chitozanu, który stosowany jest jako opatrunek hemostatyczny [50]. Aby poprawić właściwości użytkowe filmów chitozanowych, stosuje się różne techniki. Obróbka błon chitozanowych plazmą azotową lub argonową zwiększa szorstkość powierzchni błony i poprawia adhezję oraz proliferację komórek. Ozon lub promieniowanie UV powoduje depolimeryzację chitozanu. Wprowadzenie cząstek krzemionki lub poliglikolu etylenowego do folii chitozanowych umożliwia modyfikowanie ich porowatości na poziomie makro-i mikroporów [51, 52, 53]. W celu polepszenia ciągliwości folii, chitozan polimeryzuje z poliglikolem etylenowym (PEG) [54]. Amidacja filmów chitozanowych prowadzi do ich wzmocnienia przez zmniejszenie rozpuszczalności w środowisku wodnym [55]. Dodatek skrobi dialdehydowej czy glikolu polietylenowego poprawia właściwości mechaniczne i pęcznienie w wodzie [56]. Fosforylowane filmy chitozanowe otrzymane z reakcji kwasu ortofosforowego i mocznika w DMF wykazują lepszą przewodność jonową niż filmy chitozanowe otrzymywane metodami standardowymi. Dodatek chlorowodorku minocykliny poprawia właściwości regeneracyjne folii chitozanowych, wykorzystywanych jako opatrunki przyspieszające gojenie oparzeń [57, 58]. Chemiczna modyfikacja filmu chitozanowego może regulować jego właściwości powierzchniowe, takie jak zwiększona hydrofobowość czy zdolności adsorpcyjne cząsteczek białkowych. Przeprowadzenie reakcji błon chitozanowych z bezwodnikiem bursztynowym lub bezwodnikiem ftalowym zwiększało warstwowość sprzyjającąadsorpcji lizozymu. W celu poprawienia właściwości przeciwbakteryjnych możliwe jest również włączenie cząstek nieorganicznych do folii, np. nanocząsteczek srebra lub ZnO, które są nietoksyczne, działają przeciwbakteryjnie oraz fotokatalitycznie. Tak zmodyfikowane folie są często stosowane w dostępnych na rynku opatrunkach na rany [59, 60].

Włókna chitozanowe po raz pierwszy wytworzono już w 1926 r., powstawały dzięki zastosowaniu metody przędzenia na sucho i na mokro z roztworu kwasu octowego. Stosowano także chlorek litu/-N,N-dimetyloacetamid jako rozpuszczalnik [61, 62]. Aby zmniejszyć koszty produkcji i poprawić właściwości włókien, stosowano także mieszanki chitozanu z innymi polimerami, m.in. z: alginianem sodu, tropokolagenem, celulozą, hialuronianem sodu, heparyną sodową, siarczanem chondroityny sodu czy też z polikwasem akrylowym [63, 64]. Nowszą i bardziej wszechstronną techniką otrzymywania włókien polimerowych stało się w ostatnich latach elektroprzędzenie (ESP), dzięki któremu można otrzymać włókna o średnicy od kilku nanometrów do mikronów, w zależności od warunków przetwarzania. Technika ta wykorzystuje wysokie napięcie do wytworzenia strumienia roztworu lub stopu polimeru o naładowaniu elektrycznym. Otrzymane włókna nadają rusztowaniom dużą porowatość i mogą naśladować naturalną macierz zewnątrzkomórkową. Dlatego też nanowłókna chitozanowe znajdują wiele zastosowań w opracowaniu opatrunków na rany oraz w inżynierii tkankowej jako biorusztowania [9]. Ze względu na to, że w środowisku kwaśnym chitozan jest polielektrolitem, jego elektroprzędzenie staje się problematyczne. W wyniku przyłożenia pola elektrycznego w szkielecie polimerowym powstają siły odpychające, co ogranicza powstawanie ciągłych włókien. Najłatwiejszym sposobem wytwarzania nanowłókien chitozanu jest jego elektroprzędzenie z dodatkiem innego polimeru, co znacząco wpływa również na poprawę właściwości uzyskanych włókien (właściwości mechanicznych, biokompatybilności i działania przeciwbakteryjnego) [65]. Częstym przykładem takiego podejścia jest stosowanie politlenku etylenu, polialkoholu winylowego (PVA), politereftalanu etylenu (PET), poliwinylopirolidonu (PVP) i polikwasu mlekowego (PLA). Uzyskanie struktury włóknistej z chitozanu sprzyja adhezji komórek, przy jednoczesnym zachowaniu ich morfologii i żywotności. Nanowłókna chitozan/PVA są często stosowane w inżynierii tkankowej, ponieważ są biokompatybilne, a nanowłókna chitozan/PET mają dobre właściwości przeciwbakteryjne. Rusztowania z elektroprzędzonych nanowłókien chitozanowych są zatem obiecującym biomateriałem do szerokich zastosowań w medycynie regeneracyjnej i inżynierii tkankowej [66].

Stworzenie rusztowania do regeneracji kości oraz chrząstki musi spełniać warunki biokompatybilności i biodegradowalności, jak również wykazywać bardzo ważne właściwości mechaniczne i porowatość struktury. Taka powierzchnia wewnętrzna gwarantuje szybkie tempo namnażania i różnicowania komórek w wyspecjalizowane osteocyty i chondrocyty. Czasami nie jest możliwe przygotowanie biomateriału o takich cechach z użyciem tylko jednego polimeru. Dlatego powstają rusztowania kompozytowe lub hybrydowe [68]. Leczenie i regeneracja uszkodzeń tkanki chrzęstnej jest trudna ze względu na specyfikę komórek. Ten typ tkanek jest pozbawiony naczyń, ma złożoną strukturę i cechuje się dużą niejednorodnością [10]. Chitozan był stosowany w inżynierii tkankowej chrząstki dzięki szerokiemu zakresowi możliwości modyfikacji jego struktury i formy. Był używany, m.in. w postaci włókna, gąbki i hydrożelu. Ważnym aspektem kwalifikującym ten polimer do wykorzystania w ubytkach tkanki chrzestnej jest jego powinowactwo do GAG [69]. Chitozan jako naturalny materiał o podobieństwie strukturalnym do siarczanowanych glikozoaminoglikanów zapewnia stabilne mikrośrodowisko do proliferacji chondrocytów i syntezy ECM, powodując chondrogenną i swoistą ekspresję białka chrząstki. Biorusztowania na bazie chitozanu są często stosowane w uszkodzeniach tkanki chrzęstnej, ponieważ ich trójwymiarowa struktura spełnia ważne wymagania stawiane prawidłowej proliferacji chondrocytów [68]. Dla poprawy właściwości mechanicznych i funkcji biologicznych tworzy się biorusztowania kompozytowe/hybrydowe. W tym celu chitozan może zostać połączony z innymi naturalnymi polimerami (kolagen, kwas hialuronowy, fibroina, jedwab), polimerami syntetycznymi (polikaprolakton, kwas polimlekowy i poli (tlenek etylenu)), a także z bioceramikami (fosforan wapnia, polifosforan wapnia lub hydroksyapatyt). Takie materiały kompozytowe lub hybrydowe wspomagają utrzymanie niezbędnych właściwości mechanicznych, odpowiednie środowisko do odkładania macierzy pozakomórkowej, żywotność komórek i ich różnicowanie oraz odpowiednią biokompatybilność w celu indukowania regeneracji kości i tkanki chrzęstnej [70].

Rycina 2.

Osteogeneza to proces, w którym komórki osteoblastów namnażają się z komórek mezenchymalnych i osadzają swoją macierz zewnątrzkomórkową, aby w końcowym etapie uformować się w dojrzałe osteocyty. Proces osteogenezy jest regulowany przez skomplikowany, współzależny system ekspresji wielu markerów kostnych i enzymów, które są zaangażowane w dojrzewanie nowo powstałych komórek i zwapnienie kości. Kompozyty chitozanu stosowane w uszkodzonych tkankach kostnych, z powodzeniem zostały przetestowane w wielu modelach doświadczalnych. Właściwości mechaniczne rusztowań chitozanowych są zwykle zwiększane przez dodanie hydroksyapatytu, który wykazuje biologiczne podobieństwo do nieorganicznego składnika kości. Oprócz hydroksyapatytu powstały także takie połączenia jak: chitozan-nanotlenek cyrkonu, chitozan-cyrkonian nanowapnia, a także połączenia zmodyfikowane strontem chitozan-montmorylonit, które miały dużą stabilność i wytrzymałość mechaniczną. W hodowli tkanki kostnej takie połączenie ma na celu uzyskanie organicznych i nieorganicznych kompozytów, które symulują strukturę kości [71]. Zaobserwowano, że komórki preosteoblastyczne, które hodowano na testowanych podłożach chitozanowych z dodatkiem polikaprolaktonu, mają znacznie większą aktywność fosfatazy alkalicznej, osadzanie się wapnia i syntezę ECM. Dane literaturowe wskazują także na dużą aktywność biologiczną liofilizowanych rusztowań chitozan-żelatyna usieciowanych aldehydem glutarowym lub genipiną. Taki kompozyt wspierał regenerację kości in vivo u myszy, indukując wytwarzanie ECM przy minimalnych reakcjach zapalnych [72]. Kompozyty na bazie chitozanu mogą regulować proces osteogenezy, wpływając na aktywność jej czynników indukujących, m.in. zwiększając uwalnianie morfogenicznego białka kości typu 2, a dzięki porowatej strukturze takich rusztowań możliwe jest prawidłowe namnażanie i kształtowanie struktury tkanki kostnej [73].

Wśród wielu problemów stomatologicznych choroba przyzębia jest jedną z najczęstszych i może doprowadzić do nieodwracalnego zaniku tkanek przyzębia aż do utraty zębów. Dolegliwościom tym często towarzyszy przewlekły i bolesny stan zapalny. Dlatego naukowcy szukali odpowiedniego rozwiązania, które byłoby skuteczną i nieinwazyjną metodą leczenia schorzeń stomatologicznych. Kompozyty chitozanowe sprawdziły się w procesie leczenia stanów zapalnych jamy ustnej oraz stanów chorobowych zębów i dziąseł. Stosuje się je w remineralizacji szkliwa, we wspomaganiu wzrostu i odbudowy zębiny, w materiałach do odbudowy zębów, a także jako ochronną aktywną powłokę implantów dentystycznych [74]. W ciągu ostatnich 10 lat badano i analizowano różne postaci chitozanu, jak również jego zdolność do łączenia się z innymi materiałami organicznymi i nieorganicznymi, które byłyby skuteczne w różnych schorzeniach stomatologicznych. Usieciowane tripolifosforanem gąbki chitozanowe zawierające związek aktywny – tetracyklinę – działały silnie przeciwbakteryjnie po aplikacji w zainfekowanym rdzeniu zębowym. Dużą aktywność biologiczną wykazywały również żele chitozanowe z dodatkiem hydroksyapatytu, które po aplikacji w rdzeniu zębowym stymulowały proliferację komórek oraz mineralizację, aktywnie regenerując tkankę przyzębia objętą stanem zapalnym [75, 76]. Korzystne wyniki w regeneracji uszkodzonej tkanki przyzębia otrzymano również w matrycach o porowatej strukturze chitozan-kolagen z dodatkiem plazmidu DNA kodującego czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi. Stałe, kontrolowane uwalnianie czynnika z matrycy polimerowej przez prawie 6 tygodni spowodowało pobudzenie wzrostu i regenerację tkanek przyzębia, zmniejszając ubytek i stan zapalny. Membrany chitozanowe z bioaktywnymi nanocząstkami szklanymi mogą aktywnie regenerować uszkodzone tkanki przyzębia, indukując regenerację kości. Zatem rusztowania chitozanowe również w stomatologii są obiecującym materiałem wspomagającym regenerację tkanek oraz leczenie stanów zapalnych w jamie ustnej. Materiały na bazie chityny mogą zapewnić środowisko sprzyjające odnowie tkanek przyzębia, działając przeciwbakteryjnie [77, 78].

Układ naczyniowy jest niezbędny do prawidłowego ukrwienia, dotlenienia i odżywienia wszystkich tkanek. Zainicjowanie procesu angiogenezy i neowaskularyzacji jest konieczne do podtrzymania funkcji tkanek. Często występujące choroby naczyń krwionośnych, które mogą powodować nieodwracalne uszkodzenia, stały się przedmiotem zainteresowania inżynierii tkankowej. Poszukuje się nowoczesnych biomateriałów, które służyłyby jako substytuty przeszczepów naczyniowych i mogłyby również indukować proces angiogenezy w ustroju. Jednak powinny one spełniać pewne warunki. Ze względu na kontakt z krwią materiały te muszą być biokompatybilne, w przeciwnym razie mogą wywołać stan zapalny i zwapnienia aż do lokalnej martwicy tkanek. Degradacja takich biomateriałów musi być kontrolowana, nie może być zbyt szybka, gdyż spowoduje zmiany morfologiczne protezy. Nie może też być zbyt wolna, ponieważ utrudni to proliferację i integrację komórek [22].

Rusztowania na bazie chityny były dokładnie badane pod kątem zastosowania ich jako substytutów naczyniowych. Rusztowania z kolagenu i chitozanu, heparynowo-chitozanowe, chitozan-PVA czy też PLLA-chitozan-kolagen prawdopodobnie mogą być wykorzystane w inżynierii tkanek naczyniowych. Badania in vitro potwierdzają ich zdolność do wspierania adhezji, wzrostu oraz proliferacji komórek. Mają właściwości mechaniczne zbliżone do właściwości naczyń krwionośnych, wykazują bardzo dobrą biokompatybilność po wszczepieniu i mogą przyspieszać wzrost komórek tkanek łącznych, co jest korzystne w procesie neowaskularyzacji. Rusztowania heparynowo-chitozanowe można stosować w inżynierii tkanek naczyniowych również ze względu na zdolność biologiczną heparyny do skutecznego zmniejszania zakrzepic i aktywności jej czynników wzrostu. Materiały na bazie chityny mogą dostarczać bioaktywne cząsteczki pomocne w regeneracji naczyń [79, 80]. Chitozan w postaci hydrożelu z wbudowanymi czynnikami angiogennymi (np. z FGF2), stopniowo go uwalniania i degraduje do nietoksycznych związków. Aktywność biomolekuł zamkniętych w rusztowaniach chitozanowych pozostaje stabilna. Testy in vivo na modelach zwierzęcych wykazują, że po wstrzyknięciu hydrożelu następuje znaczny wzrost nowo powstałych naczyń krwionośnych i tkanki włóknistej, a kontrolowane uwalnianie czynników angiogennych skutecznie przywraca zaburzone krążenie. Opracowano również zmodyfikowaną genetycznie tkankę na bazie chityny, do której wprowadzono materiał kodujący czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), który w testach in vitro był pozytywny, powodując powstanie wielu dojrzałych naczyń krwionośnych [81]. Uwaga badaczy skupiła się także na sposobie wytwarzania naczyń krwionośnych o wysokim stosunku powierzchni do objętości przy zastosowaniu technik elektroprzędzenia. Opracowano naczynie krwionośne w postaci rurki z mieszanym elektroprzędzonym włóknem PLLA-chitozan-kolagen. Wytworzona rurka spowodowała duż ążywotność komórek oraz hemokompatybilność, miała bardzo dobrą wytrzymałość na rozciąganie oraz na ciśnienie rozprężające. Ponadto spełniała standardy dobrej hemokompatybilności i niewielkiej cytotoksyczności [82].

Regeneracja skóry jest złożonym i dynamicznym procesem, który obejmuje fazę hemostazy, stanu zapalnego, proliferacji oraz przebudowy tkanek. Dlatego też do ran potrzebny jest opatrunek spełniający wiele funkcji: fizyczną ochronę rany, przyspieszenie procesu gojenia, ochronę przeciwbakteryjną oraz minimalizowanie ryzyka powstania blizn. Chitozan w postaci proszku, roztworu czy też hydrożelu może być stosowany w tamowaniu dużych krwawień i gojeniu głębokich ran, bezpośrednio nakładany na krwawiące powierzchnie. Działanie lecznicze zależy od zastosowanej techniki aplikacji, a także rodzaju rany, na którą zostanie nałożony preparat [83]. Chitozan może wywołać adhezję płytek krwi, aktywując kaskadę sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, pobudzającej glikoproteiny IIb/IIa oraz tromboksan A2/ADP. Dzięki temu zwiększa się liczba płytek krwi, które wzmacniają stabilność adhezji. Zdolności hemostatyczne chitozanu podlegają bezpośredniej interakcji z płytkami krwi, głównie w ziarnistościach alfa. Sygnalizacja wewnątrzkomórkowa indukuje uwalnianie płytkowego czynnika wzrostu PDGF-AB i TGF-β1. W badaniach in vitro po zastosowaniu chitozanu stwierdzono wzrost aż o 130% wskaźnika PDGF-AB w porównaniu z grupą kontrolną [84]. Liczba grup aminowych w chitozanie, którego stopień deacetylacji jest na poziomie umiarkowanym (około 68%), ma bezpośredni wpływ na krzepnięcie krwi, sprzyjając tworzeniu struktur porowatych, dzięki czemu chitozan dużo łatwiej integruje ze składnikami krwi. Wyższy stopień deacetylacji powoduje silniejsze wiązania wodorowe w chitozanie, powodując tworzenie krystalicznej struktury, która ogranicza zdolność interakcji polimeru ze składnikami morfologicznymi krwi. Natomiast większa masa cząsteczkowa chitozanu zwiększa działanie prokoagulacyjne. Chitozan wpływa również na etapy gojenia poprzez indukcję migracji neutrofili, immunomodulację i zmniejszanie stanów zapalnych, stymulację wzrostu fibroblastów skórnych oraz działanie silnie przeciwdrobnoustrojowe, chroniące przed zakażeniem rany w czasie jej gojenia [85, 83, 87]. Biomateriały stosowane na rany często są wzbogacane o dodatkowe składniki w celu poprawy ich właściwości terapeutycznych. Dodawanie nanocząstek srebra do hydrożeli powoduje dużą aktywność przeciwdrobnoustrojową wobec szczepów Staphylococcus aureus opornych na metycylinę (MRSA). Aby przyspieszyć proces gojenia, biomateriały chitozanowe wzbogaca się również o dodatkowe cząstki bioaktywne, takie jak czynniki wzrostu i cytokiny [88].

Istnieje wiele opatrunków hemostatycznych na bazie chitozanu, które zostały zatwierdzone przez FDA, m.in.: Celox®, HemCon®, Axiostat®, Chitoflex®i Chitoseal®. Pierwszym komercyjnym opatrunkiem na bazie chityny był Beschitin®, który wprowadzono w 1982 r. na rynek japoński. Opatrunek miał postać włókniny, która przez pobudzanie ziarninowania przyspieszała proces gojenia. Dużo badań przeprowadza się również w Polsce, gdzie wyprodukowano pierwszy polski opatrunek hemostatyczny pierwszej pomocy na bazie chitozanu o nazwie Tromboguard®, który został nagrodzony złotym medalem na Międzynarodowych Targach Poznańskich w 2011 r. Wyrób składa się z trzech warstw – pierwsza warstwa kontaktowa to kompleks chitozanu i alginianu, które skracają czas krwawienia przez reakcję ze składnikami morfologicznymi krwi na powierzchni rany. Druga warstwa chłonna z pianki poliuretanowej pochłania oraz magazynuje w swoich strukturach krew, nawet w warunkach ucisku. Natomiast trzecia warstwa zabezpieczająca jest wykonana z poliuretanowej membrany wodoodpornej, która chroni przed czynnikami zewnętrznymi [89].

Wyniki wskazują, że nowoczesne biomateriały mogą być wykorzystane jako substytuty przeszczepów naczyniowych i są zdolne do indukcji procesu angiogenezy w ustroju. Stosowanie biomateriałów z chitozanem wpływa także na wzrost fibroblastów i tworzenie tkanki ziarninowej, przyspieszając proces naprawy naskórka i skóry właściwej, dlatego chitozan w różnej postaci może spełniać funkcje opatrunku hemostatycznego.

Substytuty skóry i rusztowania oparte na biomateriałach mogą wspomagać gojenie i regenerację skóry. Wspomaganie procesu regeneracji nabłonka ma duże znaczenie przy prawidłowym odtwarzaniu struktury tkanki. Przeszczepy skóry od obcego dawcy często kończą się niepowodzeniem i odrzuceniem, gdyż mogąindukować drażliwośći stanyzapalne, pobudzając odpowiedź immunologiczną organizmu [90]. Najbardziej zewnętrzna warstwa, czyli tkanka nabłonkowa, zapewnia ochronę przed czynnikami środowiskowymi, jak również pełni ważne funkcje wydzielnicze. Choroby oraz urazy spowodowane utratą skóry, np. rozległe oparzenia lub trudno gojące i przewlekłe rany do niedawna były dużym wyzwaniem. Biomateriały biokompatybilne, niealergenne, działające przeciwdrobnoustrojowo i przyspieszające gojenie są obecnie przedmiotem zainteresowania inżynierii tkankowej skóry. Materiały na bazie chityny są szeroko stosowane do naprawy ubytku tkanki skórnej, przede wszystkim ze względu na zdolność pobudzania proliferacji komórek, wytwarzania ECM, silne właściwości przeciwdrobnoustrojowe oraz hemostatyczne. Wykazano, że obecność chitozanu w środowisku hodowli komórek nabłonkowych wpływa na wzrost stężenia nabłonkowych czynników morfogenetycznych, głównie czynnika wzrostu fibroblastów 7 (FGF7), wzrostu fibroblastów 10 (FGF10) oraz wzrostu hepatocytów (HGF) [23, 91]. Ponadto biomateriały chitozanowe mają lepsze właściwości adhezyjne i przepuszczalność gazów, a obecne czwartorzędowe grupy aminowe skutecznie oddziałują z komórkami. Rusztowania na bazie chitozanu można łatwo połączyć z innymi polimerami poprzez sieciowanie, co pozwala uzyskać nowe, lepsze właściwości użytkowe, m.in. większą wytrzymałość mechaniczną. Chitozan usieciowany cząstkami krzemionki (SiO₂), został wykorzystany do stworzenia mikroporowatych błon do hodowli fibroblastów skórnych, które w testach in vitro nie wykazywały cytotoksyczności oraz sprzyjały adhezji i proliferacji komórek. Opracowane materiały na bazie chityny miały duży potencjał w indukowaniu różnych fenotypów komórkowych, m.in.: w hodowli melanocytów, keratynocytów skóry czy rogówki.

Bielactwo jest jedną z chorób skóry, którą można zwalczyć dzięki inżynierii tkankowej. Rozległe zmiany skórne wymagają przeszczepu melanocytów, który jest możliwy dzięki hodowli melanocytów na odpowiednich biomateriałach i uzyskaniu tzw. plastra komórkowego, gotowego do wszczepienia. Wykorzystanie chitozanu przyspiesza wzrost i fenotypowe utrzymanie melanocytów, zachowując ich żywotność i funkcje [10, 21]. Na porowatym rusztowaniu kolagen-glikozaminoglikan-chitozan możliwe jest również wyhodowanie tkanki błony śluzowej jamy ustnej przez współhodowanie ludzkich komórek nabłonka jamy ustnej i fibroblastów. Skonstruowaną tkankę błony śluzowej można zastosować do zamknięcia ran jamy ustnej spowodowanych chorobami o różnym podłożu lub zabiegami medycznymi. Większość powierzchni w drogach oddechowych jest pokryta nabłonkiem rzęskowym. Bez tej wyściółki nabłonkowej mogłyby wystąpić zapalenia i krwawienia, uszkadzające delikatną strukturę tkanki. Rusztowania kolagenowo-chitozanowe sprawdziły się w inżynierii tkankowej nabłonka oddechowego. Mogły regulować wzrost, adhezję i różnicowanie śluzówkowo-rzęskowe komórek nabłonka oddechowego [92, 93, 94]. Zdolność chitozanu do wiązania z kolagenem wykorzystano również do projektowania klejów tkankowych [14, 70].

Dane literaturowe potwierdzają skuteczność hydrożeli i siatek chitozanowych w zapobieganiu bliznowaceniu pooperacyjnym. Termowrażliwy hydroksybutylochitozan (HBC) to nowa pochodna chitozanu, która reaguje na zmiany temperatury i może być stosowana w profilaktyce pooperacyjnej, jako skuteczny środek antyadhezyjny. Badania przeprowadzone na przepuklinowych siatkach polipropylenowo-chitozanowych wykazały dużą biokompa-tybilność i brak działań drażniących, o czym świadczy niski wskaźnik reakcji zapalnej [95, 96]. Ponadto zastosowanie rusztowania z mieszanki fibroiny jedwabiu i chitozanu w badanych modelach zwierzęcych było skuteczne w przepuklinach brzusznych. Udowodniono przebudowę tkanek we wszystkich trzech wymiarach, z zachowaniem odpowiedniej wytrzymałości mechanicznej, a rusztowanie to sprzyjało odkładaniu się nowej macierzy zewnątrzkomórkowej i prawidłowemu unaczynieniu. Korzystne było zastosowanie filmu chitozanowego, modyfikowanego dodatkowym filmem z mieszanką chitozanowo-żelatynową, w zapobieganiu zrostom otrzewnej wywołanym przez ranę, niedokrwienie i infekcję [97, 98]. Zbadano też możliwości wykorzystania chitozanu w trwałych uszkodzeniach, często mających podłoże nowotworowe. Hodowla in vitro mięśni gładkich okrężnicy królika na rusztowaniach chitozanowo-kolagenowych w kształcie rurek dała pozytywne wyniki. Nowo powstałe komórki wykazywały prawidłową morfologię, zachowując markery fenotypowe mięśni gładkich, a późniejsze pełne rusztowania mięśniowe kurczyły się w odpowiedzi na acetylocholinę (Ach) oraz chlorek potasu (KCl) i rozluźniały w odpowiedzi na wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP). Wyniki te potwierdzają możliwość wykorzystania chitozanu w scaffoldach jelitowych, dzięki którym możliwe będzie ich wykorzystanie w wielu nieodwracalnych dotąd uszkodzeniach tkanki lub całego narządu [99].

Obecne standardowe leczenie uszkodzeń tkanki nerwowej polega na zastosowaniu autologicznego przeszczepu nerwu, dzięki temu ubytek zostaje uzupełniony, a to sprzyja regeneracji, powodując ponowne połączenie nerwów. Dostępne źródła literaturowe dostarczają dowodów na duży potencjał terapeutyczny materiałów na bazie chityny, które mogą pobudzać wzrost neuronów. Badania in vivo wskazują, że membrany chitozanowe sprawdzają się w inżynierii nerwów obwodowych, dzięki porowatej strukturze oraz dużym pod względem chemicznym możliwościom modyfikacyjnym [104]. Dodatek różnych substratów i bioaktywnych cząsteczek zwiększa ich powinowactwo do komórek nerwowych. Wykorzystanie nanowłókien chitozanowych wspierało adhezję, migrację i proliferację komórek Schwanna, dzięki czemu następowała szybka regeneracja aksonów w obwodowym układzie nerwowym [105, 106]. Chitozanowe rusztowania komórkowe powodowały wzrost neurytów, uwalniając czynniki neurotroficzne i swoiste ligandy neuronów. Połączenia hybrydowe chitozanowo-hialuronowe w postaci przeszczepionych błon miały dobrą cytokompatybilność, odpowiednie środowisko do adhezji komórkowej, proliferacji i wytwarzania błony zewnątrzkomórkowej (ECM), wspierając tym samym prawidłowe biologiczne działanie zaszczepionych komórek [107].

Lipid A warunkuje biologiczną aktywność lipopolisacharydu i jest jego konserwatywnym fragmentem, zbudowany głównie z nasyconych kwasów tłuszczowych. W tej części lipidu pojawia się również element polarny, jakim jest cukier D-glukozaminylo-D-glukozamina [117]. Obecność ujemnie naładowanych reszt w części lipidu A oraz oligocukru rdzenia wewnętrznego ma duży wpływ na oddziaływanie z dwuwartościowymi kationami obecnymi w środowisku zewnętrznym oraz determinację interakcji wewnętrznych występujących między sąsiadującymi częściami lipidowymi. Wiązania wodorowe utrzymują lipid A i całą cząsteczkę LPS w odpowiednim ułożeniu w warstwie zewnętrznej błony komórkowej bakterii [113]. Chitozan zawiera dużą liczbę grup hydroksylowych i aminowych, jest polimerem kationowym, który w środowisku kwaśnym tworzy polikationy i zdolny jest do reakcji z ujemnie naładowanymi cząsteczkami lub makrocząsteczkami [60, 118]. Miejsca reaktywne chemicznie w cząsteczce chitozanu przedstawiono na ryc. 3. Ładunek dodatni determinują grupy aminowe, które mogą wchodzić w interakcje z substancjami anionowymi (ryc. 4) [119]. Proces produkcji chitozanu ma duży wpływ na jego właściwości. Kontrola procesu deacetylacji chityny jest istotna dla późniejszych właściwości biologicznych chitozanu, gdyż liczba powstałych w tym etapie wolnych grup aminowych decyduje o reaktywności całego polimeru. Biokompatybilność chitozanu wzrasta wraz z liczbą ładunków dodatnich [120]. Grupy funkcyjne oraz naturalne właściwości chelatujące chitozanu umożliwiają mu wiązanie i usuwanie jonów metali, takich jak miedź, ołów, rtęć i uran. Jest to wykorzystane, m.in. w procesie oczyszczania ścieków, gdzie chitozan odgrywa ważną rolę. Jest również zastosowany do usuwania barwników, tłuszczów i innych ujemnie naładowanych cząstek stałych, dzięki czemu jest cenny również w przemyśle spożywczym. Dzięki protonowaniu grup aminowych może się wiązać z ujemnymi cząstkami wchodzącymi w skład mucyny, poprawiając właściwości śluzotwórcze nabłonka oddechowego. Udowodniono również jego działanie hemostatyczne, dzięki wiązaniu z ujemnymi ładunkami na krwinkach czerwonych (RBC), jak również z ujemnymi ładunkami na powierzchni komórek bakteryjnych, co wywołuje jego dużą aktywność antybakteryjną [121, 122].

Potwierdzono również jego zdolność do wiązania tłuszczu, która wzrasta wraz ze stopniem deacetylacji i masą cząsteczkową. Jego reaktywność jest tym większa im wyższy jest stopień deacetylacji oraz jego masa cząsteczkowa. Aktywność hipocholesterolemiczną chitozanu udowodniono w badaniach na modelach szczurzych, gdzie określany był wpływ chitozanu na regulację poziomu lipidów w osoczu i wątrobie oraz łagodzenie objawów hipercholesterolemii u tych zwierząt. Wyniki wykazały, że chitozan o stopniu deacetylacji powyżej 90% powodował wiązanie kwasów tłuszczowych oraz żółciowych, spowodowane prawdopodobnie przyciąganiem elektrostatycznym między chitozanem a nasyconymi grupami alkilowymi i karbonylowymi w cząsteczce kwasu tłuszczowego. Ponadto zastosowanie sproszkowanego chitozanu o porowatej strukturze zwiększyło jego zdolności chłonne [123]. Proces adsorpcji kwasów tłuszczowych przez chitozan można schematycznie przedstawić za pomocą ogólnego wzoru (ryc. 4).

Rycina 3.

Rycina 4.

Dzięki dużej aktywności biologicznej oraz zdolności do wiązania mikro-i makrocząstek chitozan może być wykorzystany w procesie oczyszczania produktów białkowych z niebezpiecznej dla zdrowia endotoksyny. Ze względu na rozbudowaną i bogatą w grupy funkcyjne o ujemnych ładunkach cząstkę LPS możliwe mogłoby być jej związanie z dodatnio naładowanymi grupami w cząsteczce chitozanu. Ważnym atutem, mającym znaczenie w procesie oczyszczania białek terapeutycznych jest to, iż chitozan to polimer naturalny o dużej biozgodności. Jest nietoksyczny i biodegradowalny, dlatego też istnieje duże bezpieczeństwo jego użycia do celów medycznych, farmaceutycznych oraz spożywczych. Dzięki wielu modyfikacjom chemicznym oraz fizycznym tego polimeru możliwe jest wytworzenie z niego różnych form użytkowych w zależności od potrzeb i wymagań. Przykładem może być forma kulek na bazie mleczanu chitozanu modyfikowanego środkiem sieciującym – trifosoranem pentasodu (TPP, ryc. 5), jako złoże biopolimerowe o dużym potencjale wykorzystania w procesie oczyszczania białek biotechnologicznych z LPS-u. Dobrze opracowane systemy heterologicznej ekspresji białek i peptydów są obecnie dużą konkurencją dla syntezy chemicznej. Pozwalają też na wprowadzenie zmian poprawiających biodostępność, okres półtrwania czy aktywność biologiczną produktu. Jako metoda szybka i wydajna umożliwia produkcję na większą skalę, pozwalając na uzyskanie znacznych ilości polipeptydów. Dlatego też tak ważny jest współistniejący, dobrze opracowany system oczyszczania produktu białkowego, który nie zmieni jego istotnych właściwości. Obecnie na szeroką skalę produkuje się terapeutyki o charakterze białek rekombinowanych, m.in. leki z grupy cytokin, hormonów, czynników krzepliwości i inhibitorów, enzymów, szczepionek oraz białek fuzyjnych, a wciąż poszukiwane są nowe o dużym potencjale wykorzystania w terapiach celowanych, inżynierii tkankowej i szeroko pojętej medycynie regeneracyjnej [112, 124].