Systematyka i Analizy Genomiczne Bakterii z Rodzaju Azotobacter

Bakterie z rodzajów Azotobacter i Pseudomonas charakteryzuje duża plastyczność struktury genomów oraz zdolność adaptacji do różnych warunków bytowania. Bakterie te nie tylko zasiedlają podobne środowiska, lecz również mają wiele wspólnych cech, czego przykładem jest zdolność do wiązania azotu atmosferycznego i produkcji alginianu [12, 88]. Pierwotnie uważano, że bakterie należące do rodzaju Pseudomonas nie wiążą azotu [58], jednak w toku badań wykazano, że niektóre szczepy mają tę zdolność, a geny odpowiedzialne za ten proces są bardzo podobne do genów występujących u A. vinelandii [88, 90]. Alginiany wytwarzane są zarówno przez bakterie Azotobacter spp., jak i przez kilka gatunków z rodzaju Pseudomonas, a przykład stanowi Pseudomonas aeruginosa, u którego alginiany są produktem ubocznym metabolizmu i odkładane są w płucach ludzi chorych na mukowiscydozę [26]. Do cech odróżniających te dwa rodzaje można zaliczyć morfologię i ruchliwość komórek [58]. Pewne różnice w fenotypach tych bakterii wynikają prawdopodobnie ze specyficznych właściwości adaptacyjnych, na co wskazuje obecność w genomach pokrewnych zestawów genów metabolizmu podstawowego oraz genów kon-serwatywnych, zachowanych w obu grupach bakterii w toku ewolucji [90].

Liczne badania, oparte m.in. na analizach sekwencji genów metabolizmu podstawowego i genu 16S rRNA bakterii potwierdzają bliskie pokrewieństwo rodzajów Azotobacter i Pseudomonas. Rediers i wsp. [64] badali zależności filogenetyczne pomiędzy A. vinelandii a bakteriami z rodzaju Pseudomonas, opierając się na wynikach sekwencjonowania fragmentu genu 16S rRNA tych bakterii. Na podstawie uzyskanych danych stwierdzono, że szczep A. vinelandii OP należy do tej samej grupy genetycznej co Pseudomonas aeruginosa PAO1, a poziom identyczności sekwencji badanego fragmentu genu 16S rRNA obu szczepów wynosił 96%. Anzai i wsp. [2] na podstawie wyników uzyskanych z podobnych analiz również odnotowali bliskie pokrewieństwo bakterii Azotobacter spp. i Pseudomonas spp. Young i Park [90] analizując sekwencje genów 16S rRNA tych bakterii zauważyli, że badane gatunki Azotobacter (A. beijerinckii, A. chroococcum, A. paspali i A. vinelandii) są najbliżej spokrewnione z P. aeruginosa i P. resinovoran. Co więcej, analiza sekwencji genów atpD, carA i recA wykazała, że szczepy należące do rodzaju Azotobacter stanowią pojedynczą, niejednorodnągrupę na drzewie filogenetycznym, bardzo blisko spokrewnioną z ww. gatunkami. Do podobnych wniosków doszli Özen i Ussery [55], którzy przeprowadzili szczegółowe analizy porównawcze stopnia genetycznego podobieństwa pomiędzy A. vinelandii, a szczepami bakterii z rodzaju Pseudomonas. Wyniki tych analiz potwierdziły, że wysoki poziom podobieństwa pomiędzy szczepami może świadczyć o przynależności tego gatunku do rodzaju Pseudomonas. Setubal i wsp. [73] opierając się na wynikach analiz filogenetycznych i poznanej sekwencji genomu A. vinelandii DJ wykazali, że gatunek ten jest najbliżej spokrewniony z bakteriami z rodziny Pseudomonadaceae, a najbliższym krewnym okazał się gatunek wiążący azot atmosferyczny – Pseudomonas stutzeri A1501. W 2015 roku Setubal i Almeida [74], wykorzystując zdeponowane w bazie GenBank sekwencje genomowe wybranych szczepów bakterii z rodzaju Azotobacter i Pseudomonas, uzyskali drzewa filogenetyczne obrazujące genetyczne podobieństwo pomiędzy badanymi szczepami. Analiza uzyskanych dendrogramów wyraźnie pokazała, że bakterie z rodzaju Azotobacter tworzą odrębną grupę genetyczną. Bliskie pokrewieństwo bakterii należących do rodzajów Azotobacter oraz Pseudomonas potwierdziła również niedawno wykonana analiza porównawcza sekwencji genu 16S rRNA szczepu Azotobacter bryophylli L461^T. Wykazano jej najwyższe podobieństwo (97,82%) do homologicznej sekwencji A. beijerinckii JCM 20725^T, a także A. chroococcum ATCC 9043^T (97,34%), Pseudomonas guguanensis CC-G9A^T (96,84%), Pseudomonas panipatensis Esp-1^T (96,77%), A. paspali ATCC 23833^T (96,16%) i A. nigricans subsp. nigricans IAM 15005^T (95,98%). Wyniki przeprowadzonych analiz wskazują, że szczep A. bryophylli L461^T usytuowany jest na oddzielnej gałęzi drzewa filogenetycznego rodzaju Azotobacter, w bliskim sąsiedztwie A. beijerinckii JCM 20725^T i A. chroococcum ATCC 9043^T [45]. Wyniki te wskazują także na bliskie pokrewieństwo bakterii z rodzajów Azotobacter i Pseudomonas, które klasyfikowane są wspólnie w rodzinie Pseudomonadaceae.

Szybki rozwój metod biologii molekularnej przyczynił się do usprawnienia procesu identyfikacji mikroorganizmów, w tym także bakterii z rodzaju Azotobacter. Autorzy publikacji naukowych, wykorzystując różne metody molekularne, podejmują próby identyfikacji i oceny zróżnicowania genetycznego szczepów bakterii Azotobacter spp. izolowanych z próbek środowiskowych.

W roku 2012 Lenart [41] zbadała zróżnicowanie genetyczne 43 szczepów bakterii, wstępnie zaklasyfikowanych do gatunku Azotobacter chroococcum, wyizolowanych ze 100 próbek glebowych pobranych na terenie województwa małopolskiego i śląskiego. W celu potwierdzenia pozycji taksonomicznej tych izolatów przeprowadzono analizę restrykcyjną bakteryjnego regionu ITS (internal transcribed spacer) położonego między genami 16S i 23S rRNA. Wykorzystano technikę ITS-RFLP (ITS Restriction Fragment Length Polymorphism). Analiza restrykcyjna amplifikowanych fragmentów 16S-23S rDNA badanych szczepów nie wykazała jednak zróżnicowania izolatów, zatem, wykorzystano dwie inne metody genetycznego odcisku palca (fingerprinting) – PCR MP (PCR Melting Profile) i RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Metody te bardzo często stosowane są w ocenie zmienności mikroorganizmów, a do ich zalet można zaliczyć: wysoką siłę dyskryminacji, powtarzalność i łatwość interpretacji wyników. Wyniki uzyskane tymi metodami okazały się porównywalne i wykazały wysoki stopień zróżnicowania bakterii A. chroococcum. Porównując technikę ITS-RFLP z metodami typowania genetycznego – MP PCR oraz RAPD stwierdzono, że dwie ostatnie metody są bardziej użyteczne w przypadku różnicowania wewnątrzgatunkowego A. chroococcum, natomiast pierwsza z wymienionych może być stosowana do szybkiej identyfikacji tych bakterii na poziomie gatunku.

W 2014 roku Lenart-Boroń i wsp. [42] określili przynależność gatunkową szczepów Azotobacter spp. wyizolowanych z gleb przemysłowych i rolniczych pobranych z terenów Nowej Huty w Krakowie. Identyfikacja taksonomiczna izolatów wykazała obecność w pobranych próbkach glebowych trzech gatunków – A. chroococcum, A. salinestris i A. vinelandii. Różnorodność bakterii należących do wyżej wymienionych gatunków określono przy użyciu metod – RAPD i Rep-PCR (BOX). Przeprowadzone badania wykazały wysokie zróżnicowanie wewnątrzgatunkowe bakterii. Metodę RAPD wykorzystali również w swoich badaniach Marwa i wsp. [50], w celu oceny stopnia zróżnicowania szczepów A. chroococcum wyizolowanych w Egipcie. Zastosowanie tej metody pozwoliło na określenie stopnia genetycznego podobieństwa pomiędzy wyizolowanymi szczepami A. chroococcum, a także szczepem referencyjnym użytym w doświadczeniu. Z kolei metodę Rep-PCR wykorzystali Rubio i wsp. [69]. Potwierdzili, iż Rep-PCR jest odpowiednią metodą do klasyfikacji taksonomicznej izolatów Azotobacter spp. i oceny różnorodności genetycznej pomiędzy gatunkami A. chroococcum, A. salinestris i A. armeniacus.

Kolejną metodą służącą do określenia zróżnicowania szczepów Azotobacter spp. jest technika ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) zastosowana w 2014 roku przez Mazinani i Asgharzadeh [51]. Materiałem do badań była gleba ryzosferowa pobrana na terenach środkowego Iranu. Na podstawie uzyskanych wyników, naukowcy stwierdzili, że metoda ARDRA, charakteryzująca się odpowiednio wysoką siłą dyskryminacji, jest użyteczna do identyfikacji bakterii z rodzaju Azotobacter, a także do oceny poziomu podobieństwa pomiędzy wyodrębnionymi grupami genetycznymi. Wykorzystując tę metodę również Aquilanti i wsp. [3] określili przynależność gatunkową 196 szczepów bakterii wyizolowanych z 35 próbek glebowych pobranych we Włoszech. Zastosowanie dwóch enzymów restrykcyjnych, RsaI i HhaI, pozwoliło na wyraźne zróżnicowanie wszystkich badanych szczepów bakterii na podstawie porównania profili genetycznych charakterystycznych dla poszczególnych gatunków. Otrzymane wyniki pozwoliły stwierdzić, że wśród wyizolowanych bakterii przeważał gatunek A. chroococcum. Tę samą metodę zastosowali ponownie Aquilanti i wsp. [4] do oceny zmienności 76 szczepów środowiskowych. W obrębie analizowanych bakterii znalazło się 28 szczepów referencyjnych z rodzajów: Azotobacter, Azomonas, Azospirillum, Beijerinckia, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium i Pseudomonas, a także 48 izolatów pozyskanych z gleb środkowych Włoch. Analizując dendrogram wykreślony na podstawie wyników uzyskanych z wykorzystaniem metody ARDRA, naukowcy zaobserwowali wyraźne podobieństwo między rodzajami: Azotobacter, Azomonas, Azospirillum i Beijerinckia. Gatunkami najbardziej podobnymi w obrębie rodzaju Azotobacter okazały się: A. vinelandii i A. paspali. Jiménez i wsp. [28] również wykorzystali technikę ARDRA do identyfikacji i oceny zróżnicowania genetycznego szczepów bakterii należących do rodzaju Azotobacter wyizolowanych z gleb spod upraw warzyw w Kolumbii.

W roku 2020 ukazała się praca Khosravi i Dolatabad [37], w której porównano kilka metod molekularnych oznaczania różnorodności bakterii. Analizie poddano 12 izolatów Azotobacter spp. zaliczonych na podstawie cech morfologicznych i fizjologicznych, do gatunku A. chroococcum. Badania wykonano z użyciem technik: Rep-PCR, ERIC-PCR, BOX-PCR, a także ARDRA, z zastosowaniem 3 enzymów restrykcyjnych HpaII, RsaI i AluI. Na podstawie przeprowadzonych analiz stwierdzono, że tylko 4 z 12 izolatów należą do gatunku A. chroococcum, a pozostałe zidentyfikowano jako A. salinestris. Wykazano, że trawienie regionu 16S rDNA enzymem restrykcyjnym HpaII pozwala na rozróżnienie tych gatunków. Ponadto metody Rep-PCR i BOX-PCR skutecznie różniły A. chroococcum i A. salinestris. Markery BOX i REP pozwoliły także zróżnicować izolaty należące do tego samego gatunku, dlatego zalecane są do określania zmienności wewnątrzgatunkowej A. chroococcum i A. salinestris.

Jeszcze jedną, często stosowaną metodą służącą do identyfikacji i sprawdzania stopnia genetyczne podobieństwa między szczepami Azotobacter spp., jest sekwencjonowanie genu 16S rRNA. Obele i wsp. [54] wyizolowali i zidentyfikowali przy użyciu standardowych metod mikrobiologicznych 8 szczepów z rodzaju Azotobacter. Analiza sekwencji genu 16S rRNA jednego z nich wykazała 96% stopień podobieństwo genetycznego w stosunku do szczepu referencyjnego A. chroococcum zdeponowanego w bazie RDP Gen Bank. Z kolei, Liu i wsp. [45] bazując na wynikach sekwencjonowania genów 16S rRNA znanych gatunków bakterii należących do rodzaju Azotobacter i Pseudomonas określili poziom podobieństwa genetycznego pomiędzy tymi bakteriami, a nowo wyizolowanym gatunkiem A. bryophylli.

Dynamiczny rozwój technik biologii molekularnej przyczynia się do ciągłego rozwoju i udoskonalania metod typowania molekularnego. Wśród opisywanych w literaturze metod różnicowania bakterii Azotobacter spp. trudno jest znaleźć metodę idealną. Z badań wynika, że najlepsze rezultaty można otrzymać stosując jednocześnie dwie lub trzy metody molekularnego odcisku palca. Do najważniejszych parametrów, którymi powinny charakteryzować się metody genotypowania należą: duża moc dyskryminacyjna, jednoznaczność otrzymanych wyników, prostota wykonania, szybkość wykonania oraz powtarzalność wyników [40].

Gatunek A. vinelandii od wielu lat jest przedmiotem badań i można go uznać za modelowy mikroorganizm w badaniach nad biochemią wiązania N₂, strukturą przestrzenną i funkcjonowaniem nitrogenazy oraz genetyczną regulacją biologicznego wiązania azotu atmosferycznego [53, 59]. Aktualnie prowadzone badania bazujące na metodach molekularnych opierają się na poznanej w roku 2009 pełnej sekwencji genomu A. vinelandii DJ [73, 74]. Szczep ten ma pojedynczy, kolisty chromosom o wielkości 5 365 318 pz. Chromosom A. vinelandii DJ zawiera 6 kompletnych operonów rRNA, a także 64 genów tRNA. Zawartość par zasad G+C w sekwencji nukleotydowej chromosomu wynosi 65,7%. Badania genomu A. vinelandii DJ pozwoliły jak dotąd zidentyfikować 5051 genów kodujących białka spośród których 46% wykazuje podobieństwo do genów Pseudomonas stutzeri A1501 [73, 74].

Z kolei przedstawiciel gatunku Azotobacter chroococcum, szczep A. chroococcum NCIMB 8003, został wyizolowany w USA w 1934 roku [77]. Pierwsze badania, w których wykorzystano ten szczep, dotyczyły zapotrzebowania bakterii z rodzaju Azotobacter na pierwiastki śladowe [78]. Szczep ten został szczegółowo opisany przez Thomsona i Skermana [84] i jest prawdopodobnie najlepiej dotąd scharakteryzowanym szczepem gatunku A. chroococcum. Wykorzystany został w badaniach nad budową i funkcjonowaniem nitrogenazy zawierającej jako kofaktor molibden [30, 31, 89] i wanad [66, 67], poznaniem fizjologicznych mechanizmów chroniących nitrogenazę przed szkodliwym wpływem O₂ in vivo [14, 15, 20, 62, 65], syntezą poli-β-hydroksymaślanu [80] oraz syntezą alginanu [60]. W 2015 roku Robson i wsp. [68] opublikowali pełną sekwencję genomu A. chroococcum NCMIB 8003 (ATTC 4412). Genom tej bakterii składa się z 7 kolistych replikonów o sumarycznej wielkości 5 192 291 pz obejmujących: kolisty chromosom (4 591 803 pz) oraz sześć plazmidów oznaczonych symbolami pAcX50 a–f o wielkości w zakresie od 10 kb do 311,7 kb. Chromosom A. chroococcum NCIMB 8003 zawiera 6 kompletnych operonów rRNA, podobnie jak chromosom A. vinelandii DJ, a także 66 genów tRNA, zatem o dwa więcej niż omawiany szczep A. vinelandii (jeden z tych genów znajduje się w obrębie profaga). Zawartość par zasad G+C w sekwencji nukleotydowej chromosomu wynosi 66,27%, natomiast w przypadku plazmidów zawiera się w zakresie od 58,12% do 62,67%. Wyróżniono 4 628 genów kodujących białka spośród których 568 (12,2%) to geny plazmidowe. Około 65% genomu (3 048 genów kodujących białka) wykazuje wysoki stopień identyczności sekwencji (85%) z sekwencją genów A. vinelandii DJ, a około 23% genomu (1 071 genów kodujących białka) wykazuje podobieństwa z genami różnych gatunków z rodzaju Pseudomonas, 43 geny z gatunkami z rodzaju Burkholderia i mniejsza liczba genów z przedstawicielami rodzajów: Halomonas, Escherichia, Azoarcus, Singulospharea, Aromatoleum, Ralstonia, Cuprividus, Polaromas i Acidovorax [68].

W wyniku analizy porównawczej dwóch dostępnych sekwencji genomowych stwierdzono, że genom rdzeniowy, wspólny dla obu Azotobacter spp., obejmuje około 3000 genów. W genomie A. vinelandii DJ znajduje się około 2000 genów unikatowych dla tego szczepu, które nie występują w NCIMB 8003, a w genomie A. chroococcum NCIMB 8003 takich specyficznych dla szczepu genów jest nieco mniej – 1700. Genom rdzeniowy obejmuje geny niezbędne dla przebiegu wielu szlaków metabolicznych, zawiera również geny odpowiadające za charakterystyczne cechy fenotypowe Azotobacter spp., np. determinujące zakres wykorzystanych przez te bakterie źródeł węgla i energii, a także wysoce konserwatywne i dobrze przebadane grupy genów nif i vnf kodujące nitrogenazę, odpowiednio, typu I i II. Geny te usytuowane są w kilku regionach genomów tych bakterii. A. vinelandii posiada również geny anf, specyficzne dla nitrogenazy III, zawierającej jako kofaktor tylko jony żelaza [68].

Szczep Azotobacter vinelandii DJ nie zawiera plazmidów. Nie należy jednak wykluczyć, iż gatunek pozbawiony jest całkowicie plazmidomu, ponieważ w roku 1988 badacze Maia i wsp. [46] z wykorzystaniem 32 szczepów A. vinelandii wykazali, że w 6 z nich występowały plazmidy, o wielkości w zakresie od 13 kb do 78 kb. Z kolei, w genomie A. chroococcum NCIMB 8003 występuje duża liczba różnorodnych plazmidow oraz elementów transpozycyjnych – sekwencji inercyjnych (IS) i transpozonów (Tn). Badając fragmenty IS w ponad 100 genomach bakteryjnych Touchon i Rocha [87] doszli do wniosku, że wielkość genomu i warunki środowiskowe, były głównymi czynnikami, które pozytywnie korelowały z liczbą IS w genomach bakteryjnych. Potwierdziło to fakt, że rodziny IS nie są na ogół specyficzne dla danego taksonu bakterii i są często nabywane oraz tracone w toku ewolucji. Elementy te mogą odgrywać istotną rolę w determinowaniu zmienności i ewolucji genomu poprzez promowanie rearan-żacji i mutacji, np. typu delecji i duplikacji [75]. Inne badania wykazały, iż w obrębie ruchomych elementów genetycznych Azotobacter mogą występować takie, których aktywność prowadzi do powstania białek lub związków, wydalanych przez bakterie do środowiska. Może to mieć korzystny lub szkodliwy wpływ na inne współwystępujące organizmy [63]. Na przykład występowanie na plazmidzie pAcX50f szczepu NCIMB 8003 genów kompletnego szlaku syntezy pierścienia korynowego może być korzystne nie tylko dla komórek gospodarza, lecz także, dla organizmów, które muszą pozyskiwać witaminę B12 ze środowiska. El-Essawy i wsp. [21] opisali naturalny szczep A. chroococcum nadprodukujący witaminę B12. Warto również zauważyć, że obecność zależnej od witaminy B12 reduktazy rybonukleotydowej, zarówno w genomie A. chroococcum NCIMB 8003, jak i A. vinelandii DJ, a także w genomach 3 z 8 gatunków bakterii z rodzaju Pseudomonas [91], mogłoby umożliwić syntezę deoksyrybonukleotydów, zwłaszcza w warunkach tlenowych [86], co dodatkowo potwierdza, że bakterie należące do rodzaju Azotobacter są typowymi aerobami [73].

Analiza plazmidomu szczepu A. chroococcum NCIMB 8003 wykazała, że w większości przypadków geny plazmidowe kodują białka podobne do tych, spotykanych u bakterii z rodzaju Pseudomonas. Jedynie plazmid pAcX50c wykazał cechy charakterystyczne dla plazmidów spotykanych u bakterii Burkholderia. Wielkości plazmidów wahają się od największego pAcX50f, 311 724 pz, zawierającego 292 geny kodujące białka, do najmniejszego pAcX50a, 10 435 pz, na którym zlokalizowano 9 genów kodujących białka.

Najszerzej scharakteryzowaną grupą genów występujących u przedstawicieli rodzaju Azotobacter są geny związane z mechanizmem wiązania azotu atmosferycznego [13, 16, 52, 68, 85]. Enzymem mającym decydujące znaczenie w tym procesie jest nitrogenaza. A. vinelandii może wytwarzać aż trzy rodzaje nitrogenazy, w zależności od warunków środowiskowych:

nitrogenazę I (geny nifD, nifK, nifH), zawierającą koenzym Fe-Mo-Co (jest wytwarzana, gdy w środowisku występują jony molibdenu),

W wyniku porównania pełnej sekwencji genomów szczepów A. chroococcm NCIMB 8003 i A. vinelandii DJ stwierdzono, iż geny anf są specyficzne jedynie dla szczepu DJ. Z kolei geny nif A. chroococcum 8003 wykazują wysoki stopień identyczności sekwencji z sekwencją genów A. vinelandii DJ, a jedną z różnic jest obecność w genomie szczepu 8003 genu kodującego ferrodoksynę 4Fe-4S. Poza strukturalnymi genami kodującymi reduktazę dinitrogenazy (nifH) i dinitrogenazę (nifD, nifK), do istotnych genów nif należą geny regulatorowe nifL i nifA oraz geny biorące udział w transporcie molibdenu i biosyntezie kofaktora nitrogenazy (nifB, nifQ) [68]. Wśród genów związanych z aktywnością nitrogenazy znalazły się również geny alg kodujące alginiany. Alginiany odgrywają istotną rolę w ochronie nitrogenazy przed szkodliwym wpływem tlenu oraz w procesie tworzenia cyst [11, 71, 72]. W genomach obu szczepów potwierdzono obecność 12 genów alg uczestniczących w syntezie alginianu, liniowego kopolimeru kwasu β-D-mannuronowego i kwasu α-L-guluronowego. W przypadku A. vinelandii DJ, siedem spośród tych genów koduje epimerazy mannuronanowe C-5 (algE1, algE2, algE3, algE4, algE5, algE6 i algE7), które modyfikują polimer poza komórkami bakterii. Z kolei pięć innych genów koduje regulatory syntezy alginianu (algR, algB, algP, algQ i amrZ). W genomie A. chroococcum NCIMB 8003 wykryto jedynie cztery geny algE (algE1, algE2, algE3 i algE4). Do innych regulatorów syntezy alginianu należą: operon algUmucABCD, geny proteazy algW, mucP i prc oraz gen cyklazy diguanylanowej mucR [73]. Geny mucABCD są takie same u obu szczepów, natomiast w genie algU A. vinelandii DJ wykryto sekwencję insercyjną o długości około 1 kb zlokalizowaną blisko regionu kodującego N-terminalny region białka [68].

Inną ważną grupą genów występujących u omawianych szczepów bakterii, są geny zaangażowane w produkcję sideroforów biorących udział w wychwytywaniu żelaza. Pozyskiwanie Fe ze środowiska jest ważnym czynnikiem wpływającym na wzrost i rozwój drobnoustrojów, w tym także tych z rodzaju Azotobacter [52]. A. vinelandii w warunkach niedoboru żelaza w środowisku wydziela żółtozielone fluorescencyjne siderofory (azotobaktynę), należące do rodziny piowerdyn [16]. Szczepy A. vinelandii DJ są również znane z produkcji różnych sideroforów katecholowych [13, 85]. Z kolei w genomie A. chroococcum NCIMB 8003 nie wykryto genów odpowiadających genom ent A. vinelandii DJ, co świadczy o tym, że szczep ten nie wytwarza sideroforu typu katecholowego. Warto jednak zauważyć, że w genomach obu szczepów obecny jest wysoce konserwatywny zespół pięciu genów, wykazujących wysoki stopień homologii do genów operonu pvsABCDE odpowiedzialnych za syntezę sideroforu polihydroksykarboksylanu, zwanego u Vibrio parahaemolyticu vibrioferyną [81]. Synteza azotobaktyny jest determinowana przez grupę 12 genów pvd o sumarycznej długości ok. 60 kb. W tej grupie genów występują geny kodujące: cztery nierybosomalne syntetazy peptydowe, 6-monoxygenazę ornityny, tioesterazę, transaminazę diaminomaślano-2-oksoglutaranową, receptor sideroforowy TonB, regulator transkrypcji z rodziny TauD/TfdA i czynnik głodu żelazowego PvdS [68].

Szczep A. chroococcum NCIMB 8003 nie wytwarza fluorescencyjnych sideroforów. Genom NCIMB 8003 zawiera jednak kilka zespołów genów potencjalnie zaangażowanych w produkcję sideroforów. Największy z nich (41 kb) obejmuje 19 genów chromosomalnych, kodujących białka, które prawdopodobnie biorą udział w tworzeniu sideroforu podobnego do piowerdyny. Klaster ten zawiera geny dla: czterech nierybosomalnych syntetaz peptydowych, syntazy poliketydowej, tioesterazy, dwóch transporterów wypływu, L-ornityno-5-monooksygenazy, dwóch zależnych od żelaza receptorów sideroforowych TonB i czynnika Sigma 70. Genom tej bakterii zawiera także dwa inne loci, które mogą być zaangażowane w syntezę sideroforów peptydowych. Jedna grupa 8 genów znajduje się na plazmidzie pAcX50f, a druga (10 genów) na chromosomie i koduje stosunkowo niewielką nierybosomalną syntetazę peptydową oraz kilka pomp wyrzutu (efflux pump), których komponenty wykazują najwyższy stopień identyczności sekwencji z pompami bakterii z gatunku Pseudogulbenkia (klasa β­Proteobacteria). Dwa geny, z których jeden koduje receptor sideroforowy podobny do TonB, wykazują najwyższy stopień identyczności sekwencji z genami A. vinelandii DJ [68].