Mixed Oral Biofilm

Już w 1933 roku Arthur T. Henrici obserwując bakterie w środowisku wodnym, zauważył, że większość z nich to agregaty przylegające do zanurzonych w wodzie przedmiotów [34, 70]. Podobne obserwacje poczynili w 1940 r. H. Heukelekian i A. Heller [30]. Już wtedy zauważono, że bakterie tworzące trwałe struktury zaczynają wykazywać odmienne właściwości aniżeli te same drobnoustroje występujące pod postacią pojedynczych komórek [13, 70]. Warto dodać, że prawdziwą naturę biofilmu najprawdopodobniej odkrył już Antoni van Leeuwenhoek, co ciekawe, niewiele wiedząc o bakteriach [70].

Od momentu zainicjowania badań nad biofilmem widzenie tej specyficznej formy bytowania bakterii i grzybów zmieniało się. Początkowo określany jako mikroorganizmy otoczone śluzem, obecnie jako złożony organizm, zdolny do reakcji na wszystko to co dzieje się w jego otoczeniu. Najczęściej biofilm jest określany jako skupiska komórek, które związane są z powierzchnią stałą i otoczone wydzielanymi substancjami zewnątrzkomórkowymi. Bakterie i grzyby bytujące pod postacią tej zorganizowanej społeczności potrafią umiejętnie porozumiewać się między sobą, co daje możliwość szybkiej odpowiedzi na docierające z otoczenia sygnały [34, 44]. Przez długi czas sądzono, że biofilm powstaje tylko na podłożu abiotycznym lub na tkankach w ustroju gospodarza. Obecnie wiadomo, że niektóre mikroorganizmy mają zdolność tworzenia biofilmu bez udziału powierzchni stałej [34, 39].

W naturalnym środowisku bytowania ponad 99% bakterii występuje w formie biofilmu [75] i obecnie ten „styl życia bakterii” należy uznać za główny traktując występowanie w formie pojedynczych komórek jako fazę przejściową [15]. Bakterie w biofilmie charakteryzują się znacznie większym potencjałem przetrwania [15].

Biofilmy są wszechobecne [15], znacząco wpływając na nasze zdrowie jak i przemysł [13]. Ich rozwój może przynosić zarówno korzyści jak i skutki negatywne. Wykazano ich obecność na różnych powierzchniach, w różnych środowiskach, zarówno tych naturalnych jak i stworzonych przez człowieka, w tym również w środowisku szpitalnym [13, 30]. Obecność w tym ostatnim szczególnie martwi, ponieważ wiąże się niewątpliwie z ryzykiem zakażeń szpitalnych [30]. Jest to bardzo istotne, ponieważ prawie 80% zakażeń jest związana z tworzeniem struktur biofilmu [71]. Tego rodzaju zakażenia, często o przewlekłym i nawracającym charakterze, wymagają indywidualnego podejścia. Wynika to przede wszystkim z różnic we właściwościach bakterii tworzących biofilm w porównaniu do tych samych mikroorganizmów, ale bytujących pod postacią pojedynczych komórek [70].

Z punktu klinicznego najważniejsze, cechy biofilmu to jego duża oporność na związki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, szczególnie na antybiotyki. Okazuje się, że drobnoustroje w formie biofilmu mogą być nawet 1000x bardziej oporne w porównaniu do ich odpowiednika w formie planktonowej (pojedyncze, rozproszone komórki) [40, 59, 71]. Poza tym z biofilmem, a dokładnie z mikroorganizmami, które go tworzą, nie radzi sobie nasz układ immunologiczny. Biofilm chroni komórki bakterii przed mechanizmami obronnymi układu immunologicznego człowieka [40] utrudniając penetrację przeciwciał w głąb jego struktur a także uniemożliwiając proces fagocytozy. Problemem jest także fakt, że dojrzały biofilm może ulegać fragmentacji a oderwane agregaty biofilmu lub pojedyncze komórki go tworzące mogą się osadzać w zupełnie nowym miejscu, często odległym od pierwotnej lokalizacji toczącego się zakażenia [59].

Większość autorów uważa, że proces tworzenia biofilmu składa się z 5 etapów [71]. Dwa pierwsze, czyli adhezja niespecyficzna i specyficzna, wydają się kluczowe. Kolejne fazy to: tworzenie mikrokolonii (akumulacja), dojrzewanie (maturacja), oderwanie komórek z dojrzałego biofilmu i ich wędrówka w poszukiwaniu nowych miejsc do zasiedlenia (dyspersja) [41, 71].

Adhezja nieswoista, inaczej „faza łączenia”, to głównie interakcje fizykochemiczne jakie zachodzą pomiędzy powierzchnią abiotyczną lub tkanką a komórką drobnoustroju. Ta odwracalna faza zachodzi najczęściej w wyniku oddziaływań elektrostatycznych, oddziaływań hydrofobowych lub Lewisa, wiązań van der Waalsa i napięcia powierzchniowego lub udziału sił grawitacyjnych [41].

W „fazie unieruchomienia”, czyli inaczej adhezji specyficznej mają miejsce natomiast nieodwracalne, swoiste interakcje typu receptor-ligand, które zachodzą pomiędzy zewnątrzkomórkowymi strukturami bakterii (adhezyny, lektyny) a komórkowymi receptorami. W przypadku biomateriału istotnym wydaje się fakt pokrywania jego powierzchni przez warstwę białek macierzy pozakomórkowej, co ma miejsce po kontakcie biomateriału z płynami ustrojowymi i tkankami [41].

Akumulacja zachodzi dzięki proliferacji komórkowej, adhezji między komórkami drobnoustrojów i wydzielaniem przez nie zewnątrzkomórkowego śluzu. Pod wpływem śluzu bakterie zaczynają zlepiać się między sobą, w dalszym etapie śluz zaczyna pokrywać również zaadherowane komórki. Pokryte śluzem bakterie ulegają zmianom i zróżnicowaniu. Bakterie, które bytują głęboko we wnętrzu biofilmu mają ograniczony dostęp tlenu i ograniczony dostęp składników odżywczych – zaczynają u nich dominować beztlenowe szlaki metaboliczne [1, 41].

Maturacja to zmiany i zróżnicowania pomiędzy komórkami mikroorganizmów, które tworzą biofilm. Widoczne są różnice w metabolizmie tych drobnoustrojów, które znajdują się w głębszych warstwach biofilmu (metabolizm beztlenowy) w porównaniu z komórkami warstw szczytowych (metabolizm tlenowy). Biofilm staje się bardzo różnorodny pod względem aktywności komórek go tworzących: obecne są zarówno komórki martwe, komórki w stanie uśpienia, komórki o metabolizmie beztlenowym jak i komórki o metabolizmie tlenowym [59].

Kiedy biofilm staje się dojrzały i osiąga krytyczną dla siebie wielkość następuje oddzielenie i przemieszczanie się do środowiska całych jego fragmentów lub bakterii uwolnionych z jego dystalnych warstw (dyspersja). Nie do końca znane są mechanizmy jakie prowadzą do dyspersji biofilmu. Kluczowe wydają się niekorzystne dla bakterii warunki jakie panują w obrębie biofilmu – brak składników odżywczych lub utrudniony ich przepływ a także silna konkurencja – które „zmuszają” do poszukiwania bardziej korzystnych nisz [58]. Oderwane fragmenty mogą przemieszczać się np. ze strumieniem krwi i zapoczątkować infekcję w zupełnie innym, nowym miejscu. Efektem tego mogą być zakażenia narządowe i ogólnoustrojowe [10, 41, 59, 71].

Ogromną rolę w procesie tworzenia biofilmu jak i w jego funkcjonowaniu odgrywa system chemicznej komunikacji między mikroorganizmami. Fenomen porozumiewania się drobnoustrojów, istotny dla przeprowadzenia wielu procesów fizjologicznych, został odkryty w 1970 roku [5]. Quorum sensing (QS), bo o nim mowa, to zjawisko chemicznej komunikacji bakterii przy udziale cząsteczek sygnalizujących (autoinduktorów). Proces ten daje możliwość dynamicznego reagowania na zmiany zachodzące w środowisku zewnętrznym a także na procesy mające miejsce we wnętrzu biofilmu. Poprzez autoinduktor mikroorganizmy w sposób kontrolowany regulują przebieg procesów fizjologicznych lub ekspresję czynników chorobotwórczości w zależności od liczebności bakterii. Kiedy bakterie osiągną właściwą liczbę, inaczej kworum, a co za tym idzie stężenie autoinduktora przekroczy wartość progową, następuje kontrolowana zmiana ekspresji genów co daje możliwość współdziałania danej populacji bakterii [59].

Warto dodać, że system quorum sensing występuje u bakterii tego samego jak i innych gatunków i daje szansę, skoordynowanej regulacji istotnych procesów życiowych w całej populacji.

Tak jak zaznaczono wcześniej biofilmy są wszechobecne [15] a ich rozwój może przynosić zarówno korzyści jak i skutki negatywne. Wielogatunkowy biofilm w organizmie człowieka jest tworzony przez mikrobiotę bytującą w jamie ustnej – głównie na powierzchni zębów, w jelitach, w pochwie lub na skórze [60, 68, 69].

Mikroflorę przewodu pokarmowego stanowi ponad 1000 gatunków mikroorganizmów. Komensalne wielogatunkowe drobnoustroje biofilmu jelitowego, chronią przed przewlekłymi chorobami przewodu pokarmowego, zatrzymują wodę w organizmie, stymulują odporność gospodarza, produkują witaminy (witamina K, biotyna), biorą udział w rozkładzie pokarmu. Biofilm jelit tworzą m. in. bakterie z rodzaju Bacteroides, Bifidobacterium, Enterococcus i Streptococcus [14, 35].

Zdolność tworzenia biofilmu jest charakterystyczna także dla bakterii mlekowych z rodzaju Lactobacillus. Bakterie te kolonizują jelita, pochwę i chronią przed zakażeniami przewodu pokarmowego, zakażeniami układu moczowego a także chorobami przenoszonymi drogą płciową [35]. Występujące w pochwie Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsoni i Lactobacillus iners, pomagają w ochronie błony śluzowej przed patogenami, ponieważ ich metabolity (kwasy organiczne, nadtlenek wodoru, bakteriocyny) działają przeciwdrobnoustrojowo [17, 35, 63].

Biofilm jest również dominującą formą bytowania drobnoustrojów występujących na powierzchni zdrowej skóry. Do drobnoustrojów obecnych na skórze osób dorosłych możemy zaliczyć gronkowce koagulazo-ujemne, (z przewagą Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus warneri, Staphylococcus hominis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus i Staphylococcus capitis) bakterie z rodzaju Corynebacterium i Pseudomonas a także Cutibacterium acnes. Naturalna mikroflora skóry spełnia funkcję ochronną i immunomodulacyjną [60].

Biofilm został uznany za problem medyczny pod koniec lat 60. XX w. [46]. Do chorób związanych z tworzeniem biofilmu należą m.in. choroby przyzębia (będą one omówione w dalszej części pracy) a także infekcje płuc u pacjentów z mukowiscydozą. Biofilm może być obecny w ranie przewlekłej, w przewlekłych infekcjach dotyczących układu moczowo-płciowego, w chorobach otolaryngologiącznych, w infekcjach oka [2, 3, 14, 17, 21, 23, 26, 38, 46, 55, 60, 65]. Biofilm utworzony na elementach obcych, czyli biomateriałach wprowadzonych do organizmu człowieka (np. implanty stomatologiczne, cewniki naczyniowe, implanty ortopedyczne, cewniki moczowe, wewnątrzmaciczne wkładki antykoncepcyjne, implanty kardiologiczne) może prowadzić do choroby okołoimplantowej [3, 21, 46, 53].

Mukowiscydoza to rzadka choroba genetyczna spowodowana mutacją genu CFTR, który odpowiada za właściwy transport soli i wody w komórkach. W rezultacie organizm chorego wytwarza w płucach nadmiernie lepki i gęsty śluz, który zalega w oskrzelach i staje się doskonałym podłożem dla rozwoju bakterii [14]. Dominującym patogenem przewlekłego zapalenia płuc u chorych na mukowiscydozę jest Pseudomonas aeruginosa. Bakteria ta ma doskonałe mechanizmy adaptacyjne, jest oporna na antybiotykoterapię i niestety proces leczenia nie jest w stanie wyeliminować tych pałeczek z płuc. Biofilm utworzony przez P. aeruginosa jest w stanie osiągnąć średnicę większą niż 100 μm [46]. Często obserwuje się koinfekcję P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae i Candida albicans [21]. Podczas przewlekłego zakażenia o etiologii P. aeruginosa następuje ciągłe niszczenie tkanki płuc, co w konsekwencji doprowadza do spadku czynności tego narządu [14].

Czynnikami etiologicznymi infekcji ran są często drobnoustroje wchodzące w skład mikrobiomu skóry. Zwykle w ranach dochodzi do zakażeń mieszanych, w których uczestniczą drobnoustroje tlenowe, jak i beztlenowe. Mieszane zakażenie również może rozwinąć się przez początkową infekcję grzybiczą, prowadzącą do pęknięć naskórka, co znacznie ułatwia bakteriom wniknięcie do głębiej położonych tkanek. Ostatecznie dochodzi do powstania trudno gojących się ran przewlekłych, często skolonizowanych przez wiele gatunków drobnoustrojów [2]. Biofilm w ranie utrudnia proces gojenia głównie poprzez zaburzone procesy immunologiczne, zakłócony mechanizm odbudowy skóry, ziarninowanie i naskórkowanie rany [2]. Do najczęściej występujących ran przewlekłych należą: odleżyny (powstające w następstwie długotrwałego ucisku, u osób unieruchomionych, leżących), owrzodzenia żylne podudzi (będące wynikiem zmniejszonego dopływu krwi do kończyn dolnych w wyniku miażdżycy) lub zespół stopy cukrzycowej [14, 23, 65].

W ranach przewlekłych biofilm może obejmować tkanki powierzchniowe, w których jako pierwszy kolonizuje S. aureus jak również tkanki głębokie, które preferuje P. aeruginosa [14, 23, 65]. Egzopolisacharyd PIA (ang. polysaccharide intracellular adhesin) wytwarzany przez gronkowca złocistego wpływa na pogorszenie stanu rany [2]. Możliwość przeżycia P. aeruginosa w mieszanym biofilmie zależy od jego zdolności wytwarzania piocyjaniny lub cyjanowodoru, które hamują wzrost S. aureus. Pałeczka ropy błękitnej podobnie antagonistycznie działa na S. epidermidis [2]. W ranach przewlekłych strukturę bofilmu mogą tworzyć także Enterococcus spp., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Seratia marcescens, Enterobacter spp., Proteus spp., Acientobacter baumanii a także bakterie beztlenowe Bacteroides fragilis, Peptostreptococcus spp. i Actinomyces spp. [2, 23]. W stopie cukrzycowej C. albicans wspiera wzrost bakterii beztlenowych B. fragilis a także Clostridium perfringens [23].

Biofilm może również być obecny w ranie oparzeniowej. Głównym czynnikiem etiologicznym zakażeń ran oparzeniowych jest P. aeruginosa [65]. W ranach tych często biofilm rozwija C. albicans oraz S. aureus. Warto zaznaczyć, że sterole wydzielane przez C. albicans przyczyniają się do wzrostu S. aureus w biofilmie, natomiast farnezol hamuje tworzenie biofilmu przez gronkowca złocistego.

Zakażenia układu moczowego (ZUM) związane z tworzeniem struktur biofilmu należą do przewlekłych i nawracających [17, 21, 38, 53]. Na tego rodzaju infekcje narażeni są głównie pacjenci cewnikowani [21, 53]. Najczęstszymi czynnikami etiologicznymi ZUM są głównie Gram-ujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae. Wśród nich należy wymienić Escherichia coli, P. mirabilis, P. vulgaris, Providencia stuartii, K. pneumoniae, bakterie z rodzaju Seratia oraz pałeczki niefermentujące P. aeruginosa i Acinetobacter spp. [21, 46]. S. aureus i S. epidermidis odpowiedzialne są za koło 50–70% infekcji związanych z tworzeniem biofilmu na cewnikach moczowych [53].

Bakteryjne zapalenie pochwy (waginoza bakteryjna) związane jest z obecnością mieszanego biofilmu na nabłonku pochwy. Najczęściej dotyczy kobiet w wieku rozrodczym. Może być przyczyną poronień, przedwczesnych porodów lub niepłodności. W zakażeniu tym dominuje Gardnerella vaginalis [17]. Prawdopodobnie należy ona do wczesnych gatunków kolonizujących. Inne beztlenowce takie jak Prevotella bivia, Atopobium vaginae i Megasphaera współistnieją w biofilmie jako późni kolonizatorzy. Tak jak w wyżej opisywanych infekcjach bakteryjnych tak i w przypadku waginozy bakteryjnej leczenie przynosi krótkotrwałą poprawę a w większości przypadków następuje nawrót choroby [38].

Tworzenie biofilmu może być przyczyną nawracających infekcji ucha środkowego. Za infekcje te odpowiedzialne są Streptococcus pneumoniae, H. influenzae, Moraxella catarrhalis, S. epidermidis i P. aeruginosa [21]. Natomiast czynnikiem etiologicznym w przewlekłym zapaleniu błony śluzowej nosa jest S. aureus i P. aeruginosa. Wszystkie te gatunki mogą tworzyć biofilm na błonach śluzowych, co utrudnia znacznie proces leczenia. Tworzenie biofilmu istotne jest również w patogenezie przewlekłego zapalenia zatok przynosowych. Dolegliwości chorobowe wywołane są przez P. aeruginosa, S. aureus, H. influenzae i grzyby Candida spp. [3].

Do przewlekłych infekcji związanych z tworzeniem biofilmu należą także infekcje oka. Występują przede wszystkim u osób noszących szkła kontaktowe [21, 26]. Bakteryjne infekcje oka obejmują zapalenie wnętrza gałki ocznej, zapalenie spojówek, zapalenie rogówki, zapalenie powiek, oczodołowe zapalenie tkanki łącznej. Mikroorganizmy odpowiedzialne za tego rodzaju infekcje należą zarówno do bakterii Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych. Głównymi patogenami są S. aureus i S. epidermidis, P. aeruginosa, S. marcescens, Moraxella spp., H. influenzae, S. pneumoniae [26]. S. aureus, P. aeruginosa i S. marcescens są główną przyczyną tworzenia biofilmów na powierzchni soczewek kontaktowych [21, 26].

Zakażenia okołowszczepowe są wywoływane przez drobnoustroje, które przyłączając się do powierzchni implantu żyją w postaci biofilmu. Do zakażenia dochodzi najczęściej podczas procedury implantacji a źródłem mikroorganizmów jest skóra pacjenta. Najczęstszymi czynnikami etiologicznymi zakażeń okołoimplantowych są gronkowce: S. aureus i S. epidermidis [58]. Leczenie tego rodzaju zakażeń często wymaga przedłużonej antybiotykoterapii i interwencji chirurgicznej. Mogą być także przyczyną wielu powikłań takich jak nieprawidłowy zrost odłamów kostnych, zapalenie skóry lub błon śluzowych a także zakażenia systemowe [58].

Jama ustna dziecka tuż po urodzeniu jest wolna od mikroorganizmów. Źródłem drobnoustrojów, które z czasem zaczną kolonizować jamę ustną, jest przede wszystkim matka, ale może też być środowisko lub personel medyczny [19].

Mikrobiota jamy ustnej zmienia się w zależności od naszego wieku i tym samym stanu uzębienia. Jako pierwsze jamę ustną zasiedlają paciorkowce, często określane drobnoustrojami pionierskimi. Ich obecność stwarza dobre warunki do kolonizacji przez inne mikroorganizmy. U rocznego dziecka do głównych składników mikrobioty jamy ustnej należą paciorkowce, gronkowce, bakterie z rodzaju Lactobacillus i Neisseria oraz niektóre beztlenowce. Podczas wyrzynania zębów, kiedy pojawiają się kolejne nisze – powierzchnia szkliwa i szczelina dziąsłowa – zachodzą kolejne zmiany. Paciorkowce i inne drobnoustroje preferujące tkanki twarde kolonizują szkliwo zęba, te zaś dla wzrostu których konieczne jest środowisko beztlenowe zasiedlają szczelinę dziąsłową (np. bakterie z rodzaju Prevotella lub Porphyromonas). Gdy wraz z wiekem zaczynamy tracić zęby skład mikrobioty jamy ustnej jest zbliżony do tego z którym mamy do czynienia u małego dziecka jeszcze przed pojawieniem się zębów. Pojawiające się na tym etapie uzupełnienia protetyczne wpływają na zwiększenie się liczby grzybów z rodzaju Candida [19, 33].

Według wielu badaczy, mikrobiota jamy ustnej jest na tyle dobrze zorganizowana, że może być traktowana jak rodzaj prymitywnego organizmu wielokomórkowego. Wykazuje właściwości, których nie można przypisać pojedynczym gatunkom. Złożoność procesów zachodzących pomiędzy poszczególnymi składowymi mikrobioty jamy ustnej zapewnia wyjątkową oporność na zmiany warunków środowiska co ma istotny wpływ na utrzymanie zdrowia jamy ustnej [47].

Mikrobiotę jamy ustnej u człowieka dorosłego tworzy ponad 700 gatunków bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, zarówno tlenowych jak i beztlenowych. Bakterie kolonizują twardą powierzchnię zębów, tkanki miękkie błony śluzowej jamy ustnej, bruzdę dziąsłową, język, policzki, podniebienie i migdałki [11, 57]. Najczęstszymi bakteriami wchodzącymi w skład mikrobioty zdrowej jamy ustnej są bakterie z rodzaju Streptococcus, Veillonella, Granulicatella, Gemella, Actinomyces, Corynebacterium, Rothia, Fusobacterium, Porphyromonas, Prevotella, Capnocytophaga, Neisseria, Haemophilus, Treponema, Lactobacterium, Eikenella, Leptotrichia, Peptostreptococcus, Staphylococcus, Eubacterium i Propionibacterium [11]. Skład mikroorganizmów różni się u poszczególnych osób i tak jak wspomniano wcześniej także zmienia się wraz z wiekiem [66].

Na profil mikroorganizmów wpływa wiele czynników, wśród których wymienić należy m.in. reaktywność układu odpornościowego gospodarza, stan zdrowia, przebyte terapie lekami bakteriobójczymi lub bakteriostatycznymi, poziom wydzielania śliny, rodzaj stosowanej diety, położenie geograficzne, status społeczny oraz dbałość o higienę jamy ustnej [47, 50]. Przykładem naturalnego biofilmu jest płytka nazębna. Chroni ona przed patogenami wnikającymi z zewnątrz, przy prawidłowym przepływie śliny i odpowiedniej higienie jamy ustnej. Gdy te czynniki zostają zaburzone płytka nazębna rozrastając się zaburza normalny przepływ śliny co przyczynia się do kolonizacji patogennych mikroorganizmów [74].

Rozwój płytki nazębnej to wieloetapowy proces, w którym różne gatunki mają przypisane określone funkcje, umożliwiające tworzenie i rozwój rozbudowanego wielogatunkowego biofilmu [47]. Rozpoczyna się od pokrycia powierzchni zęba błonką nabytą (pellicule). Proces ten zachodzi w ciągu kilku minut po wyszczotkowaniu zębów. Błonka zawiera głównie glikoproteiny śliny (mucyna), aglutyniny, fosfoproteiny, enzymy (amylaza), oraz receptory dla adhezyn bakteryjnych [11, 18, 48, 74]. W kolejnym etapie drobnoustroje zaczynają przylegać do powierzchni błonki. „Wcześni kolonizatorzy” adherują do osłonki nabytej za pomocą specyficznych mechanizmów receptor-adhezyna. Są to głównie bakterie z rodzaju Streptococcus, Eikenella, Streptococcus, Neiseria, Haemophilus, Prevotella, Capnocytophaga, Prppionibacterium, Veillonella [74]. Ten etap jest odwracalny do momentu, kiedy bakterie pionierskie, przede wszystkim Streptococcus mutans, zaczną wydzielać polimery białkowo-cukrowe do otoczenia. Dochodzi wówczas do adhezji nieodwracalnej, gdzie komórki bakterii przylegają ściśle do błonki nabytej i wzajemnie do siebie [74]. „Późni kolonizatorzy” rozpoznają na powierzchni bakterii pionierskich polisacharydy i białka receptorowe i przyłączają się do nich tworząc koagregaty. Zdolności takie przypisuje się bakteriom z rodzaju Eubacterium, Actinomyces, Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium [74]. Następuje przyrost biomasy i dojrzewanie biofilmu [11, 16, 47]. Płytka nazębna potrzebuje kilku tygodni, żeby “dojrzała”, czyli ustaliła się w niej równowaga gatunkowa [51]. Wraz z dojrzewaniem biofilmu zmienia się jego skład. Zmniejsza się liczba bakterii należąca do wczesnych kolonizatorów (m.in. Streptococcus spp.) a zwiększa liczba późnych kolonizatorów (m.in. bakterie z rodzaju Actinomyces i Corynebacterium) [14, 57]. Z czasem biofilm ulega mineralizacji i powstaje kamień nazębny, który jest mocno związany z powierzchnią zęba a jego kryształy są podobne do tych, które tworzą szkliwo i zębinę. Tworzenie kamienia dodatkowo przyspieszane jest przez obecność obumarłych bakterii oraz metabolitów bakteryjnych. Warto zaznaczyć, że kamień sprzyja retencji płytki nazębnej oraz ma negatywny wpływ na przyzębie [20, 58].

Skład biofilmu mocno różni się w zależności od lokalizacji [36]. Czynnikami selekcyjnymi są tu m.in. dostępność składników odżywczych, niedostępność tlenu oraz tzw. przecieki koronowe śliny [20, 43]. Mikroorganizmy występujące na szczycie zęba tworzą biofilm pod- i naddziąsłowy. Płytka naddziąsłowa zdominowana jest przez paciorkowce Gram-dodatnie np. S. mutans, Streptococcus salivarius i bakterie z rodzaju Lactobacillus. Najczęściej spotyka się w niej 15 rodzajów bakterii, pośród nich m.in. bakterie z rodzaju Actinomyces, Campylobacter, Capnocytophaga, Corynebacterium, Fusobacterium, Granulicatella, Neisseria, Prevotella, Streptococcus, Veillonella [12, 36]. Przestrzeń poddziąsłowa odcięta jest od dopływu bogatej w składniki odżywcze śliny, zamiast tego odżywiana jest przez płyn szczelinowy dziąsłowy bogaty m.in. w białka i glikoproteiny [8, 32, 36, 37]. W płytce poddziąsłowej dominują bakterie proteolityczne i anaerobowe G (–), głównie bakterie z rodzaju Actinobacillus, Campylobacter, Filifactor, Fusobacterium, Parvimonas, Porphyromonas, Prevotella, Tannerella i Treponema [32].

Między drobnoustrojami tworzącymi biofilm zachodzi wiele interakcji co wpływa na gęstość bakterii w dojrzałej płytce. Są to zależności zarówno antagonistyczne jak konkurencja (o składniki pokarmowe, miejsce przyłączenia się), ale również synergistyczne, czyli kooperacja [29]. W reakcjach konkurencji biorą udział bakteriocyny, kwasy organiczne, nadtlenek wodoru a także różnego rodzaju enzymy [19, 47, 52, 74]. Przykładem oddziaływania synergistycznego jest np. komunikacja metaboliczna.

Bakteriocyny wytwarzane przez S. mutans i S. salivarius, mają działanie bakteriobójcze na szereg bakterii obecnych w jamy ustnej [37]. Innym przykładem wzajemnego oddziaływania mikroorganizmów jest synergizm między S. mutans i C. albicans. Zauważono wzmocnienie inwazyjności C. albicans oraz promowanie rozrostu biomasy bakteryjnej [18, 25, 29]. Wytwarzany nadtlenek wodoru przez paciorkowce, głównie S. sanguinis może mieć znaczenie podczas tworzenia płytki nazębnej poddziąsłowej. Obecność środka utleniającego ogranicza rozwój bakterii beztlenowych (np. Porphyromonas gingivalis) [37]. Synergizm między C. albicans i S. mutans może zwiększać zjadliwość mieszanych biofilmów tworzących się na powierzchni zębów, przy czym S. mutans ma hamujący wpływ na filamentacje C. albicans w biofilmach mieszanych [5].

Paciorkowce jamy ustnej pośredniczą w adhezji do tkanek jamy ustnej, jak również do innych bakterii i grzybów. Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis i Streptococcus sanguinis, mogą bezpośrednio oddziaływać z C. albicans. Wykazano, że S. oralis i C. albicans razem tworzą silniejsze biofilmy, niż każdy z tych mikroorganizmów osobno. Koinfekcja S. oralis i C. albicans prowadzi do wzmożonej inwazji tkanek błony śluzowej. Może to być wynikiem uwolnienia kalpainy, degradujacej połączenia E-kadheryn w komórkach nabłonka, umożliwiając dostęp do nabłonka zarówno komórkom grzybów jak i bakterii. S. oralis jest również zdolny do indukowania filamentacji C. albicans. S. gordonii może wiązać się bezpośrednio z P. gingivalis i komunikować się z nim za pośrednictwem wydzielanych czynników, nasilając jego patogenne działanie prowadzące do chorób przyzębia. S. gordonii bierze udział w silnej interakcji koagregacyjnej z Actinomyces oris [50].

Wraz z różnymi gatunkami paciorkowców Actinomyces spp. należą do pierwszych kolonizatorów powierzchni i tkanek jamy ustnej. Actinomyces viscosus, Actinomyces naeslundii, Actinomyces odontolyticus i Actinomyces oris współagregują z C. albicans. Wykazano, że niektóre metabolity wytwarzane przez A. naeslundii i A. viscosus i wydzielane w dużych stężeniach hamują wzrost C. albicans. Gdy stężenie metabolitów jest mniejsze zaobserwowano pobudzenie wzrostu grzybów z rodzaju Candida. Actinomyces spp. mogą także koagregować z paciorkowcami jamy ustnej, głównie z S. oralis. Wskazuje to na możliwość współdziałania C. albicans zarówno z S. oralis, jak i z bakteriami z rodzaju Actinomyces.

Wykazano, że Fusobactreium nucleatum hamuje tworzenie strzępek u grzybów z rodzaju Candida. Grzyby natomiast osłabiają odpowiedź makrofagów indukowanych przez F. nucleatum. To wzajemne osłabienie zjadliwości może przynieść korzyści obu mikroorganizmom – długoterminowy komensalizmowi w jamie ustnej. Trzeba zaznaczyć, że F. nucleatum koagreguje z prawie wszystkimi innymi bakteriami jamy ustnej.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans, główny czynnik etiologiczny przewlekłego zapalenia przyzębia może hamować tworzenie strzępek u C. albicans. C. albicans natomiast zwiększa inwazję P. gingivalis odpowiedzialnego za choroby przyzębia [50].

W biofilmie mieszanym wytwarzane przez mikroorganizmy (głównie paciorkowce) metabolity pomagają innym gatunkom czerpać energię potrzebną do wzrostu. Kwas mlekowy będący produktem przemiany materii paciorkowców i pałeczek kwasu mlekowego, jest głównym źródłem energii dla A. actinomycetemcomitans i Veillonellae [37].

Wiele interakcji międzygatunkowych między bakteriami jamy ustnej prowadzi do zmian w ekspresji genów w jednym lub obu organizmach partnerskich. W przypadku interakcji między Veillonellae a paciorkowcami, regulacja genów najwyraźniej wpływa na magazynowanie węglowodanów przez paciorkowce [37].

Jeśli biofilm się rozwinie, może się nieprawidłowo rozrastać i powodować zakażenia. W sprzyjających warunkach istnieje ryzyko rozwinięcia zapalenia dziąseł, parodontozy, peri-implantitis. Zakażenia jamy ustnej mogą także szerzyć się drogą krwiopochodną i powodować zakażenia ogólnoustrojowe [43].

W wyniku nadmiernego spożycia węglowodanów, niedostatecznej higieny jamy ustnej oraz spadku przepływu śliny dochodzi do rozwoju zmian próchniczych. Węglowodany fermentują do kwasów organicznych, co zapewnia zakwaszenie mikrośrodowiska, a w konsekwencji przewagę gatunków kwasotwórczych i kwasoopornych w biofilmie przy spadku ogólnej różnorodności gatunkowej. Organizmy kwasotwórcze i kwasooporne posiadają zdolność budowania pozakomórkowych polisacharydów z cukrów dostarczanych z pożywieniem. Biorą one udział w tworzeniu macierzy międzykomórkowej biofilmu, zapewniają ustabilizowanie płytki na powierzchni zęba lub są zapasowymi substancjami wykorzystywanymi do pozyskiwania energii w przypadku ograniczonego dostępu do cukrów [43, 64]. Za główne bakterie próchnicotwórcze uważa się: S. mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus spp., Bifidobacterium dentium, Scardovia wiggsiae. Nowe doniesienia mówią także o udziale w zmianach próchniczych bakterii z rodzaju Schlegelella oraz Pseudoramibacter. Należy zaznaczyć, że sama obecność wymienionych gatunków nie jest równoznaczna z wystąpieniem zmian próchniczych, ponadto próchnica może wystąpić bez udziału każdego z nich. Nadrzędne znaczenie ma zaburzenie homeostazy biofilmu nazębnego na korzyść bakterii kwasotwórczych [43]. Nieleczona próchnica może powodować penetrację bakterii związanych z biofilmem w głąb zęba, powodując w konsekwencji zapalenie miazgi zębowej, która może doprowadzić do martwicy zęba [7, 19, 43, 64].

Biofilm kanałów korzeniowych w warunkach fizjologicznych jest zdominowany przez bakterie tlenowe i fakultatywne beztlenowce. W wyniku zmian pH lub niedostatecznej ilości tlenu w kanale korzeniowym dochodzi do zmiany fenotypu biofilmu, z przewagą bakterii bezwzględnie beztlenowych oraz do rozwoju zakażeń, w tym parodontozy [24, 43, 52]. Za zakażenia te odpowiadają głównie bakterie z rodzajów: Bacteroides spp., Prophyromonas spp., Prevotella spp., Fusobacterium spp., Treponema spp., Peptostreptococcus spp., Eubacterium spp., i Campylobacter spp. W niektórych przypadkach może dojść do przedostania się bakterii z ognisk zakażenia w kanałach korzeniowych do fizjologicznie jałowej miazgi zębowej, powodując jej zapalenie. W wyniku niepowodzenia leczenia endodontycznego, nieleczonej próchnicy lub przetrwałego zakażenia tkanek okołowierzchołkowych mogą rozwinąć się zakażenia wtórne kanałów korzeniowych oraz miazgi, a profil bakteryjny tych zakażeń jest różny w zależności od przyczyny pierwotnej [19, 43, 52]. Kiedy infekcja występuje wskutek postępującej próchnicy, w początkowych etapach zakażenia biorą głównie udział bakterie próchnicotwórcze. Z czasem, z powodu niedostatecznej ilości tlenu, tlenowe bakterie próchnicotwórcze zostaną wyparte przez bakterie bezwzględnie beztlenowe. Flora bakteryjna kanałów korzeniowych znacznie zmienia się pod wpływem leczenia kanałowego. Główną przyczyną niepowodzeń w leczeniu endodontycznym jest przeciek koronowy. Do jego powstania może doprowadzić złamanie odbudowy zęba, nieszczelne wypełnienie lub korona. Przeciek koronowy umożliwia dostarczenie substancji odżywczych, co pomaga odżyć uśpionym organizmom w niewypełnionych przestrzeniach kanałów. „Wprowadza” również nowe organizmy. W ten sposób można także tłumaczyć nawrót zapalenia po leczeniu endodontycznym [24]. Bakterie wywołujące zakażenia wtórne charakteryzują się wysoką tolerancją na szeroki zakres pH oraz niedobór substancji odżywczych. Bakteriami dominującymi są w tym przypadku bakterie z rodzajów: Enterococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces oraz grzyby, zwłaszcza Candida spp. [52].

Kumulacja płytki nazębnej w okolicy dziąseł prowadzi do zapalenia dziąseł i zwiększonej ilości komórek zapalnych, nasilających odpowiedź immunologiczną gospodarza, doprowadzając w konsekwencji do destrukcji tkanek przyzębia. Mikroorganizmy, które są związane ze schorzeniami przyzębia, wykorzystują białka oraz glikoproteiny gospodarza do celów odżywczych. Są to Gram (–) bakterie beztlenowe: P. gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia, A. actinomycetemcomitans, Prevotella spp., F. nucleatum [43, 64]. W tym przypadku dochodzi do wzrostu ogólnej różnorodności gatunkowej biofilmu [64]. Choroba objawia się bólem, krwawieniem i obrzękiem dziąseł. Jest ona w pełni odwracalna poprzez usunięcie biofilmu z powierzchni zęba oraz utrzymanie odpowiedniej higieny jamy ustnej. Postępująca choroba oraz nasilenie odpowiedzi immunologicznej powodują uszkodzenie tkanek głębszych, w tym więzadeł przyzębia. Rozwija się parodontoza, dochodzi do tworzenia się kieszeni dziąseł i przyzębia oraz wypadania zębów. Leczenie polega na wszczepieniu implantów zębów [7, 43].

Implanty są bardziej podatne na powstawanie biofilmu na ich powierzchni niż zęby naturalne. U wielu pacjentów rozwija się zapalenie tkanek okołoimplantowych, tzw. peri-implantitis, które może być wczesne lub późne. Peri-implantitis wczesne jest spowodowane nieprawidłową osteointegracją implantów, co może być skutkiem użycia wadliwego materiału, zakażenia śródoperacyjnego, nieskutecznego gojenia wskutek zakażenia systemowego. Peri-implantitis późne natomiast jest to zaburzenie funkcji prawidłowo zaimplantowanego implantu, towarzyszy mu przewlekłe zakażenie tkanek otaczających. Odpowiednikiem zapalenia dziąsła w odniesieniu do tkanek okołoimplantowych jest tzw. peri-implant mucositis, gdzie stan zapalny dotyczy wyłącznie tkanek miękkich, nie kości. Rozwój zakażenia może prowadzić do stopniowej destrukcji kości – peri-implantitis – odpowiednik parodontozy [7, 43]. Zakażenia związane z implantami zębowymi dotyczą 5–8% pacjentów i są powodowane w większości przez: S. aureus, Enterococcus spp., Peptostreptococcus micros, Bacteroides forsythus, A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, Campylobacter rectus, Eikenella corrodens, T. denticola, Prevotella intermedia, T. forsytha, F. nucleatum, Prevotella nicrescens, Bacteroides spp.

Ze względu na obfite unaczynienie dziąseł bakterie powodujące zakażenia jamy ustnej często dostają się do krwiobiegu. Bakteriemia może wystąpić na skutek agresywnego szczotkowania zębów, urazu twarzoczaszki, powikłania parodontozy lub zabiegów dentystycznych. Zazwyczaj bakterie są eliminowane z krwiobiegu w przeciągu 30 minut i nie powodują problemów zdrowotnych. Czasami, zwłaszcza u pacjentów z grupy ryzyka, dochodzi jednak do rozwoju zakażeń innych narządów. Najpoważniejszym z nich jest bakteryjne zapalenie wsierdzia, gdzie Streptococci z gr. orale są jednym z najczęstszych czynników etiologicznych tego rodzaju zakażeń [46]. Bakterie powodują uszkodzenie mięśnia sercowego a także elementów sztucznych (sztuczne zastawki aortalne, mitralne, urządzenia wewnątrzsercowe) [28, 65]. Skutkiem zapalenia wsierdzia może być niewydolność serca oraz zatorowość naczyniowo-mózgowa [28]. Ponadto zanotowano zapalenia układu oddechowego, pokarmowego i mózgu [43].

Na uwagę zasługują wzajemne oddziaływanie grzybów i bakterii tworzących biofilm jamy ustnej oraz rola tych relacji w rozwoju zakażeń. W badaniach wykazano, że C. albicans i Streptococcus spp. wzajemnie zwiększają swoją wirulencję. Prowadzą do rozwoju kandydozy jamy ustnej, próchnicy wczesno dziecięcej, peri-implantitis. W przypadku próchnicy wczesno dziecięcej, obecność C. albicans oraz sacharozy synergistycznie zwiększa wirulencję S. mutans, w krótkim czasie doprowadzając do rozległych zmian próchniczych [20]. Zależności te są przedmiotem dalszych badań i obserwacji.

Istnieją także zakażenia związane z tworzeniem biofilmu wyłącznie przez grzyby. Przewlekła kandydoza rumieniowa dotyczy nawet 60% pacjentów stosujących protezy zębowe i jest związana z biofilmem tworzonym przez grzyby z rodzaju Candida. Ogniska zapalne tworzą się na błonie śluzowej podniebienia, w pobliżu powierzchni protezy. Czynnikami predysponującymi do rozwoju zakażenia są m.in.: nieprawidłowa higiena jamy ustnej, cukrzyca, upośledzenie funkcjonowania układu odpornościowego [51].

W naturalnym środowisku bytowania ponad 99% bakterii występuje w formie biofilmu [75]. Dotyczy to również mikroorganizmów wchodzących w skład mikrobioty naszego organizmu, szczególnie jamy ustnej. Nieprawidłowy rozrost biofilmu może prowadzić do zapalenia dziąseł, parodontozy lub periimplantitis.

Terapia zakażeń jamy ustnej związanych z tworzeniem struktur biofilmu stanowi wyzwanie dla współczesnej stomatologii. Nadrzędne znaczenie ma więc zapobieganie tego rodzaju zakażeniom, głównie poprzez ograniczenie powstawania biofilmu.

Znajomość metod profilaktyki, ale także skutecznego usuwania biofilmu są w tym względzie bardzo istotne.