Cronobacter Spp. – The Serious Risk In A Baby Food

Bakterie Cronobacter spp. to Gram-ujemne, względnie beztlenowe, ruchliwe, nieprzetrwalnikujące pałeczki, należące do rodziny Enterobacteriaceae [38, 56, 85]. Uznawane są za oportunistyczne patogeny we wszystkich grupach wiekowych, szczególnie u wcześniaków, niemowląt z niską masą urodzeniową, osób w wieku podeszłym i osób z obniżoną odpornością [2, 43, 97]. Nazwa rodzaju Cronobacter pochodzi od imienia jednego z greckich tytanów Kronosa, który połykał wszystkie swoje dzieci po urodzeniu. Obecnie rodzaj Cronobacter obejmuje siedem gatunków: C. sakazakii, C. malonaticus, C. turicensis, C. muytjesii, C. universalis, C. dublinensis i C. condimenti. Trzy pierwsze gatunki Cronobacter zostały skojarzone z infekcjami klinicznymi noworodków i wcześniaków. C. dublinensis, C. muytjesii i C. condimenti mają prawdopodobnie małe lub znikome znaczenie kliniczne [2, 97].

Bakterie z rodzaju Cronobacter spp. zalicza się do patogenów odpowiedzialnych za występowanie na całym świecie rzadkich, ale zagrażających życiu chorób: zapalenia opon mózgowych, bakteriemii, kilku form martwiczego zapalenia jelit [2]. W roku 2002 International Commission for Microbiological Specifications for Food nadała C. sakazakii „status zagrożenia, w przypadku wybranych populacji, zagrażającego życiu lub powodującego znaczące przewlekłe, długoterminowe konsekwencje” zaliczając do tej samej kategorii patogenów żywnościowych co Clostridium botulinum (typ A i B), Cryptosporidium parvum i Listeria monocytogenes [2, 3, 38].

W roku 2005 weszło w życie Rozporządzenie Komisji (WE) 2073/2005 (zmienione w 2010 roku Rozporządzeniem (EU) 365/2010) w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych na mocy, którego istnieje obowiązek badania preparatów w proszku dla niemowląt (PIF-powdered infant formula) oraz żywności dietetycznej w proszku specjalnego medycznego przeznaczenia, stosowanej w żywieniu niemowląt do 6 miesiąca życia na obecność Cronobacter spp. Według tego Rozporządzenia bakterie Cronobacter spp. muszą być nieobecne w trzydziestu 10-gramowych porcjach produktu. Pozytywne na obecność Cronobacter spp. partie mieszanek mlekozastępczych powinny zostać wycofane z rynku bez konieczności wykonywania analiz przynależności do gatunku [2, 7, 38].

W pracy podjęto temat oceny występowania zagrożenia powodowanego przez bakterie Cronobacter spp. w żywności w świetle obowiązujących wymagań.

Najbardziej narażone na zakażenia wywołane przez bakterie z rodzaju Cronobacter są noworodki poniżej 28 dnia życia, noworodki urodzone przedwcześnie, niemowlęta o niskiej masie urodzeniowej (poniżej 2,5 kg) i niemowlęta z upośledzeniem odporności [24, 43, 74]. W USA zgłaszana zapadalność (częstość występowania infekcji wywołanych przez Cronobacter na 100 tysięcy niemowląt) wynosi 1, natomiast w przypadku niemowląt z niską masą urodzeniową ryzyko zakażenia wzrasta do 9,4 na 100 tysięcy niemowląt [33].

Po przekroczeniu bariery krew-mózg niektóre gatunki Cronobacter, m.in. C. sakazakii mogą wywołać zapalenie komórek nerwowych, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych oraz tworzyć ropnie i torbiele mózgu prowadzące do wodogłowia. Pierwsze przypadki zaplenia opon mózgowo-rdzeniowych związanych ze spożyciem zakażonych bakterią C. sakazakii mieszanek mleko zastępczych opisano w 1961 r. [93]. Wskaźnik śmiertelności niemowląt związany z noworodkowym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych szacuje się na około 40–80% [18, 38]. W 94% przypadków u niemowląt, które przeżyły ropne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, wywołane zakażeniem C. sakazakii, choroba ta pozostawiała nieodwracalne powikłania neurologiczne m.in. wodogłowie, zaburzenia słuchu i wzroku oraz niedowład kończyn [18].

Pierwsze przypadki zakażeń bakterią C. sakazakii stwierdzono w Holandii w latach 1977–1981. Doszło wówczas do zakażenia ośmiorga niemowląt bakterią C. sakazakii, z których przeżyło dwoje [65]. W Islandii w latach 1986–1987 odnotowano trzy przypadki zakażenia C. sakazakii. Jedno z niemowląt nie przeżyło. U drugiego dziecka doszło do znaczącego upośledzenia rozwoju psychicznego i fizycznego. U trzeciego niemowlęcia stwierdzono powikłania w postaci zespołu napadów padaczkowych i opóźnień w rozwoju [9]. W latach 1993–1998 odnotowano 4 przypadki zakażeń niemowląt w Izraelu. Bakterie z gatunku C. sakazakii wyizolowano m.in. z miksera używanego do przygotowania mieszanki mlekozastępczej [10]. W okresie od czerwca do lipca 1998 roku doszło do zakażenia dwunastu noworodków w Belgii. Dzieci miały masę urodzeniową < 2000 g i karmione były mieszanką mlekozastępczą. Dwoje noworodków zmarło [94].

Pozostałe, wybrane przypadki infekcji wywołane bakteriami z rodzaju Cronobacter spp. przedstawiono w tabeli I. Mimo rosnącej świadomości zagrożenia zachorowania wciąż się zdarzają, potwierdza to m.in. przypadek z 2015 roku z Australii, gdzie w wyniku zakażenia C. sakazakii zmarło niemowlę. Bakterię wyizolowano z mleka matki, które było odciągane ręcznym laktatorem. Izolaty bakterii obecne we krwi niemowlaka i w mleku matki były identyczne, co potwierdza, że noworodek był narażony na patogen, poprzez konsumpcję mleka kobiecego (Tab. I) [61]. W 2016 roku w USA zdiagnozowano u noworodka sepsę. Niemowlę karmione było mlekiem kobiecym uzyskanym od dawczyni. Próby pobrane z płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi wykazały obecność C. sakazakii. Bakterię wyizolowano również z laktatora używanego do odciągania pokarmu kobiecego (Tab. I) [11]. W 2017 roku w Brazylii w wyniku zakażenia Cronobacter spp. zmarł noworodek (urodził się w 35 tygodniu ciąży, karmiony był mlekiem matki oraz mieszanką mleko zastępczą). Wyizolowany z krwi Cronobacter spp. zidentyfikowano jako C. sakazakii ST494 [14]. Zeng i wsp. [101] opisali przypadek zakażenia chłopca bakterią Cronobacter spp. w Chinach. W płynie mózgowo-rdzeniowym wykryto liczne leukocyty, a w mózgu ropnie. Podawano dożylnie antybiotyki: cetazydym, a następnie meropenem. Objawy kliniczne ustąpiły, jednak po 3 tygodniach stwierdzono upośledzony rozwój umysłowy i fizyczny dziecka. Z płynu mózgowo-rdzeniowego wyizolowano C. sakazakii ST256 serotyp O1 [101].

Komunikację ryzyka, związanego z występowaniem bakterii Cronobacter spp. w żywności dla niemowląt, w Rozporządzeniu (WE) 2073 w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych z 15 listopada 2005 poprzedziły spotkania Komitetów Kodeksu Żywnościowego ds. Higieny Żywności (35 sesja w 2003) oraz Żywienia i Żywności Specjalnego Dietetycznego Przeznaczenia (24 sesja w 2003). Zadecydowano o rewizji obowiązującego Kodu Praktyk Higienicznych Żywności dla Niemowląt i Dzieci i zwrócono się do FAO i WHO o jak najszybsze zwołanie spotkania ekspertów w sprawie występowania E. sakazakii w mieszankach mlekozastępczych (PIF). Spotkanie ekspertów FAO/WHO odbyło się w lutym 2004 roku w Genewie. Poświęcone zostało bezpieczeństwu żywności dla niemowląt i małych dzieci oraz zapobieganiu potencjalnie ciężkim zakażeniom u niemowląt. Patogeny związane z mieszankami mlekozastępczymi, w wyniku przeprowadzonej oceny ryzyka, podzielono na trzy grupy wg ryzyka wystąpienia i skutków zdrowotnych. Pierwsza grupa to kategoria A – wysoki związek przyczynowo skutkowy zakażeń niemowląt w wyniku spożycia mieszanek mlekozastępczych. Do tej kategorii zaliczono Salmonella i Cronobacter spp. Do kategorii B – związek przyczynowo-skutkowy jest prawdopodobny, ale nie potwierdzony, zaliczono: Escherichia coli, Escherichia vulneris, Citrobacter koseri, Enterobacter cloacae, Hafnia alvei, Pantoea agglomerans, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Acinetobacter spp. Kategoria C – związek przyczynowo-skutkowy mniej prawdopodobny lub jeszcze nie wykazany, to: Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes i Bacillus cereus. Opracowano model oceny ryzyka w celu opisania czynników prowadzących do zakażenia E. sakazakii (Cronobacter spp.) u niemowląt oraz zidentyfikowania potencjalnych strategii ograniczania ryzyka. Opracowany model oceny ryzyka ułatwia także porównanie poziomu zanieczyszczenia produktu w zależności od sposobu przygotowania produktu, obrotu i karmienia. Ponadto zapewnia środki do oceny kryteriów mikrobiologicznych i planu pobierania próbek pod względem redukcji ryzyka i odsetka odrzuconych partii produktów. Model oceny ryzyka szacuje względne ryzyko choroby wywołane przez E. sakazakii (Cronobacter spp.) dla niemowląt z wewnętrznie skażonego PIF, nie bierze pod uwagę zanieczyszczenia i rekontaminacji ze środowiska lub innych źródeł po wytworzeniu. Ponadto opracowano szereg rekomendacji dla krajów członkowskich i organizacji pozarządowych (NGOs) uwzględniających m.in ustalenie odpowiednich specyfikacji mikrobiologicznych dla E. sakazakii w mieszankach mlekozastępczych oraz wskazanie Enterobacteriaceae zamiast E. coli, jako kryterium oceny higieny środowiska produkcyjnego [22].

Podczas kolejnego spotkania technicznego grupy ekspertów w 2006 roku dokonano oceny opracowanego modelu oceny ryzyka [21]. Wynik tej pracy dostarczył porad i wytycznych zmniejszających ryzyko zakażenia niemowląt w wyniku konsumpcji mleka modyfikowanego w proszku (PIF). Spotkanie ekspertów FAO/WHO w 2008 dotyczyło podjęcia decyzji w sprawie ustanowienia kryterium bezpieczeństwa mikrobiologicznego dla E. sakazakii (Cronobacter spp.) w przypadku mieszanek do żywienia niemowląt powyżej 12 miesiąca życia (FUF – follow-up formula).

Pracę ekspertów FAO/WHO wspierała Komisja Kodeksu Żywnościowego (Codex Alimentarius Commission – (CAC), Komitet ds. Higieny Żywności (Committe on Food Hygiene – CCFH), który jest odpowiedzialny za opracowanie wytycznych zarządzania ryzykiem w obszarze bezpieczeństwa żywności na poziomie międzynarodowym. Ustalenia ze spotkania technicznego z 2006 r. stanowiły wkład w finalizację Kodeksu Praktyk Higienicznych dla Preparatów w Proszku dla Niemowląt i Małych Dzieci (wraz z Aneksem I i III4) (Codex Code of Hygienic Practice for Powdered Formulae for Infants and Young Children).

W literaturze opisano dwa podstawowe mechanizmy wirulencji Cronobacter spp.: adhezja do komórek nabłonka jelitowego oraz adhezja do komórek śródbłonka naczyń mózgowych [51].

Adhezja bakterii Cronobacter spp. do nabłonka jelitowego powoduje zwiększoną apoptozę komórek nabłonka i utratę integralności bariery nabłonkowej [58]. Bakterie Cronobacter spp. wykorzystują białka powierzchniowe komórek gospodarza np. fibronektynę, aby przyłączyć się do komórek nabłonkowych jelita oraz mikrofilamenty i mikrotobule do atakowania komórek gospodarza [43]. Przyleganie Cronobacter spp. do nabłonka jelitowego wywołuje stan zapalny. Po przekroczeniu bariery jelitowej bakteria może przedostać się do krwioobiegu, powodując sepsę, posocznicę, kilka postaci martwiczego zapalenia jelit, zapalenia migdałków, zapalenia szpiku i kości oraz infekcje dróg moczowych [2, 57, 74].

W warunkach in vitro stwierdzono, że białko błony zewnętrznej A komórek (OmpA) odgrywa kluczową rolę w inwazji na komórki nabłonka jelitowego oraz śródbłonka naczyń mózgowych [50]. Przypuszcza się, ze Cronobacter spp. wnika do komórek nerwowych na zasadzie fagocytozy i zakłóca dojrzewanie komórek dendrytycznych [43]. Uważa się, że geny ibeA, ibeB i yijP C. sakazakii odpowiedzialne są za atakowanie śródbłonka naczyń mózgowych [51]. Kim i wsp. [51] wykryli w szczepie C. sakazakii ATCC 29544^T gen kodujący OmpA oraz gen ibeB.

Chorobotwórczość Cronobacter spp. może być związana także z produkcją enterotoksyny, która może wzmacniać wirulencję i translokację przez barierę krew-mózg i jelita [71]. Raghav i Aggarwal [76] określili, masę cząsteczkową toksyny, która wynosi 66 kDa i jest stabilna w 90°C przez 30 min. Oprócz enterotoksyn Cronobacter spp. produkuje enzymy proteolityczne, które powodują rozkład komórki gospodarza np. metaloproteaza cynkowa deformuje komórki, prowadząc do ich uszkodzenia [71], Cronobacter spp. posiada mechanizm obronny przed układem immunologicznym gospodarza, dzięki tolerancji środowiska makrofagów [43, 91, 92]. Przeżywalność bakterii w makrofagach jest różna w przypadku różnych gatunków Cronobacter. Według Townsend i wsp. Cronobacter spp. może przetrwać w makrofagach od 48 do 96 godzin [91, 92].

Zidentyfikowano trzy przypuszczalne geny wirulencji Cronobacter spp.: cpa (aktywator plazminogenu), sip (białko wchodzące w interakcje siderforów, czyli nośników jonów żelaza) i hly (hemolizyna typu III) [16].

Infekcje wywołane przez Cronobacter sakazakii dotyczą określonych typów sekwencji (ST ang. Sequence Type – sekwencje nukleotydowe dla każdego z fragmentów genu są traktowane jako allele, tworząc profil alleliczny, czy typ sekwencji ST dla badanego szczepu) i złożonych kompleksów klonalnych. C. sakazakii ST12 powiązany jest z wywołaniem martwiczego zapalenia jelit u noworodków. C. sakazakii ST4 i CC4 skojarzono z zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków, CC7 C. malonaticus z infekcjami dorosłych [17, 97]. Analiza typowania sekwencji multilocus (MLST – Multilocus sequence typhing) bakterii C. sakazakii pochodzących z 7 krajów w 41 próbkach klinicznych wykazała obecność tego samego szczepu C. sakazakii ST4 w 20 próbkach zebranych w latach 1977–2008 pochodzących z 6 krajów (Holandia, Francja, USA, Nowa Zelandia, Republika Czeska i Kanada) [46]. Akineden i wsp. [2] donosi o wykryciu wysoce zjadliwego szczepu ST4, w dwóch próbkach mieszanki dla niemowląt w proszku.

Bakterie Cronobacter spp. są oksydazo ujemną, katalazo dodatnią, względnie beztlenową, Gram-ujemną, ruchliwą pałeczką. Redukują azotany, wykorzystują cytrynian, hydrolizują eskulinę i argininę oraz wytwarzają kwas z D-glukozy, D-sacharozy, D-rafinozy, D-melibiozy, D-celobiozy, D-mannitolu, D-mannozy, L-ramnozy, L-arabinozy, D-ksylozy, D-trehalozy, galakturonianu i D-maltozy. Bakterie rodzaju Cronobacter metabolizują substraty: 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-α-D-glukopiranozyd, 4-metyloumbelliferylo-α-D-glukopiranozyd, 4-nitofenylo-α-D-glukopiranozyd, 4-nitofenylo-β-D-glukopiranozyd, 4-nitofenylo-α-D-galaktopiranozyd i 4-nitofenylo-β-D-galaktopiranozyd. Bakterie Cronobacter spp. dają pozytywny wynik w produkcji acetoiny (test Vogesa-Proskauera) i negatywny w przypadku testu czerwieni metylowej. Produkują siarkowodór i hydrolizują mocznik. Rodzaj Cronobacter obejmuje siedem gatunków: C. sakazakii, C. malonaticus, C. turicensis, C. muytjesii, C. universalis, C. dublinensis i C. condimenti [39].

Nazwa gatunkowa C. malanoticus odnosi się do wykorzystania przez bakterię C. malonaticus malonianu. C. malanoticus pierwotnie wyizolowany był z ropnia piersi i jest dostępny pod numerem LMG 23826^T w BCCM/LMG Bacteria Collection w Ghent (Belgia) oraz jako DSMZ 18702^T w Instytucie Leibniza DSMZ w Braunschweig (Niemcy) [39].

Gatunek C. muytjensii nazwany jest na cześć holenderskiego mikrobiologa Harry’ego Muytjensa. C. muytjensii ATCC 51329^T zdeponowano w Mannassas (USA) oraz jako CIP 103581^T dostępny jest w Instytucie Pasteura w Paryżu (Francja) [39].

Nazwa gatunkowa C. dublinensis odnosi się do miasta Dublin, w którym został wyizolowany po raz pierwszy w zakładzie produkcji mleka w proszku i dostępny jest pod numerem LMG 23823^T w BCCM/LMG Bacteria Collection w Ghent (Belgia) oraz pod numerem DSMZ 18705^T w Instytucie Leibniza DSMZ w Braunschweig (Niemcy) [39]. Bakteria z gatunku C. turicensis pierwotnie wyizolowana została ze śmiertelnego przypadku noworodkowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych w Zurychu w 2005 r. Szczep ten dostępny jest pod numerem LMG 23827^T BCCM/LMG Bacteria Collection w Ghent (Belgia) oraz pod numerem DSMZ 18703^T w Instytucie Leibniza DSMZ w Braunschweig (Niemcy). Nazwa gatunkowa C. turicensis odnosi się do łacińskiej nazwy Zurychu-Turicum [39].

Początkowo C. sakazakii określano jako Enterobacter cloacae. W 1980 r. Farmer i wsp. przeklasyfikował Enterobacter cloacae jako nowy gatunek i nazwał na cześć japońskiego mikrobiologa Riichi Sakazakii – Enterobacter sakazakii [23]. Nazwę Rodzaju Cronobacter zaproponowano po analizie sekwencji genu 16S rRNA różnych szczepów należących do gatunku Enterobacter sakazakii w wyniku której wyodrębniono sześć grup genomowych [85]. Gatunek C. sakazakii został wyodrębniony z gatunku Enterobacter cloacae w wyniku różnic w sekwencji DNA. DNA C. sakazakii jest w 53–54% homologiczne z DNA bakterii Enterobacter i Citrobacter. Na podstawie bliższego pokrewieństwa C. sakazakii do E. cloacae, (sekwencja genotypowa C. sakazakii jest w 51% identyczna z E. cloacae oraz w 41% z Citrobacter freundii) [38]. Pierwotny szczep C. sakazakii wyizolowano z gardła dziecka i dostępny jest pod numerem ATCC 29544^T w Mannassas w USA i pod numerem NCTC 11467^T w Londynie [38, 39].

Bakteria C. sakazakii jest jedynym gatunkiem Cronobacter spp., który posiada klaster genu nanAKT, kodujący wykorzystanie egzogennego kwasu sjalowego jako źródła węgla do wzrostu [47]. Grim i wsp. [26] stwierdzili, że szczepy C. sakazakii wykorzystują kwas sjalowy lub jego pochodną kwas N-acetyloneuraminowy, podczas gdy inne gatunki Cronobacter spp. nie wykorzystują tego kwasu. Stwierdzono również obecność dwóch regionów genomowych (GR127 i GR 129) u szczepu C. sakazakii BAA-894, które biorą udział w wykorzystywaniu kwasu sjalowego [26]. Kwas sjalowy występuje w mleku kobiecym, mieszankach mleko zastępczych, mleku modyfikowanym, mucynie wyściełającej jelita i jest składnikiem gangliozydów, które występują w komórce nerwowej i biorą udział w funkcjonowaniu tkanek nerwowych [47].

Bakterie z rodzaju Cronobacter spp. izolowano z preparatów mlekozastępczych wykorzystywanych w początkowym żywieniu niemowląt oraz z szerokiej gamy innych produktów spożywczych: warzyw, zbóż, płatków, ziemniaków, przypraw, mięsa, ryb, sera, tofu, ryżu, makaronu, czekolady, herbaty [8, 11, 24, 25, 33, 38, 56, 59, 85, 87]. W badaniu Berthold-Pluta i wsp. [8] wyizolowano 21 szczepów Cronobacter spp. (13 szczepów C. sakazakii, 4 szczepy C. muytjensii, 2 szczepy C. turicensis, 1 szczep C. malonaticus i 1 szczep C. condimenti) z warzyw liściastych i kiełków. Li i wsp. [56] stwierdzili obecność Cronobacter spp. w produktach zbożowych i przyprawach. Lee i wsp. [54] wykazali, że Cronobacter spp. występuje także w zbożach i produktów zbożowych. Garbowska i wsp. [25] stwierdziły obecność Cronobacter spp. w ziołach (bazylia, oregano, pietruszka) oraz w mieszance przyprawowej (zioła prowansalskie). W badaniu Gurtler i wsp. [28] Cronobacter spp. stwierdzono w ryżu, owsie, mące, okruchach chleba. Obecność Cronobacter spp. w zbożach i produktach zbożowych może wynikać z obecności tej bakterii w środowisku naturalnym oraz z zanieczyszczeń zakładów produkcyjnych [56]. Bakterie Cronobacter spp. izolowano również z próbek pobranych z gospodarstw rolnych, zwierząt hodowlanych [63], a także ze środowiska: kurzu, wody, ścieków, gleby [33]. W Afryce Południowej wyizolowano Cronobacter spp. z 28 różnych prób żywności i środowiska, C. sakazakii stanowił 92,8% wyizolowanych szczepów [88].

Reich i wsp. w swojej pracy z roku 2010 [81] stwierdzili, że zanieczyszczenia mieszanek mlekozastępczych skorelowane były z zanieczyszczeniem środowiska produkcyjnego. Uwzględnia się dwie drogi zanieczyszczenia mieszanek mlekozastępczych: wewnętrzną i zewnętrzną. Wewnętrzna droga zanieczyszczenia dotyczy środowiska produkcyjnego. Podczas procesu produkcyjnego mleka modyfikowanego nieświadomie wykorzystuje się skażone surowce lub dochodzi do zanieczyszczenia krzyżowego. Zanieczyszczenie zewnętrzne spowodowane jest nieprawidłową higieną przygotowania mleka z mieszanek mlekozastępczych [2, 49]. Do nieprawidłowych praktyk higienicznych przygotowania mleka modyfikowanego należą: długie przechowywanie przygotowanej mieszanki, przechowywanie przygotowanej mieszanki w termosach oraz nieprawidłowy sposób mycia butelek i sprzętu służącego do przygotowania mleka. Alternatywą podgrzewania przygotowanej mieszanki w termosie jest możliwość podgrzewania samej wody służącej do przygotowania mleka. Mieszankę powinno dodawać się do wody bezpośrednio przed karmieniem. Pozostałości po karmieniu nie powinny być przechowywane, tylko natychmiast wylewane. Woda służąca do przygotowania mleka z mieszanki mlekozastępczej powinna mieć minimum 70°C [41].

Obecność Cronobacter spp. stwierdzono na powierzchniach, przedmiotach i sprzęcie medycznym w środowisku szpitalnym. Bakterie izolowano m.in. ze stetoskopu lekarskiego, szczotek używanych do mycia butelek oraz sprzętu używanego do przygotowania pokarmu dla niemowląt [33, 102].

Bakterie z rodzaju Cronobacter spp. mogą przeżyć w szerokim zakresie temperatur (od 5 do 44–47°C) oraz w produktach o niskiej aktywności wody [33], w temperaturze 4°C oraz przy aktywności wody od 0,30 do 0,83 może przetrwać nawet do 12 miesięcy [30].

Szczepy Cronobacter spp. w porównaniu z innymi bakteriami z rodziny Enterobacteriaceae wykazują wysoką tolerancję na stres środowiskowy (niskie pH, i a_w, wysoką temperaturę, stres osmotyczny, wysychanie) [18, 57]. Optymalna temperatura wzrostu wynosi 37–39°C, za maksymalną temperaturę wzrostu przyjęto 44–47°C. Należy jednak zauważyć, że C. sakazakii ATCC 29544^T nie wykazuje wzrostu w temperaturze powyżej 42°C [67] jednakże temperatura ta wg ISO/TS 22964 z 2006 roku była temperaturą inkubacji bakterii. W temperaturze pokojowej (21°C) czas podwojenia bakterii Cronobacter spp. w rekonstytuowanej mieszance mlecznej wynosił 75 min., natomiast w temperaturze 10°C około 10 h co oznacza, że jest zdolny do powolnego wzrostu w temperaturach chłodniczych. Wartości D₅₂=54,8 min. i D₆₀=2,5 min. ekstrapolowane do temperatury 72°C wskazują na wysoką termotolerancję bakterii Cronobacter spp. (wartość z = 5,82°C). Wyjaśnia to ich przeżywalność podczas procesu produkcji odwodnionych mieszanek mlekozastępczych [38].

Oporność na wysuszenie szczepów Conobacter spp. jest prawdopodobnie spowodowana nagromadzeniem trehalozy wewnątrz komórek. Trehaloza działa jako środek ochronny [43]. Barron i Forsythe [6] stwierdzili także, że pozakomórkowe polisacharydy chronią komórki bakterii przed wysuszeniem. C. sakazakii produkuje beta-karoten, który chroni komórki bakterii przed rodnikami tlenowymi [45]. Wszystkie szczepy Cronobacter spp. mają geny kodujące trimetyloglicynę i trehalozę [45]. Umożliwia to przetrwanie bakteriom w środowisku i w produktach o niskiej aktywności wody [43]. Dodatkowo zidentyfikowano geny operonu biosyntezy celulozy, operon biosyntetyczny otoczki, gen curli GR55, których ekspresja może zapewnić odporność bakterii na niską aktywność wody [26].

Bakterie z rodzaju Cronobacter spp. są oporne na niskie pH, dlatego może przetrwać w kwaśnym środowisku żołądka. Niemowlęta nie mają w pełni rozwiniętej kwasowości żołądka, co może tłumaczyć zwiększone ryzyko infekcji powodowanych przez Cronobacter. W pH 4,5 w czasie 24 godzin bakterie z rodzaju Cronobacter spp. są zdolne do wzrostu do poziomu około 10⁹ jtk/ml. Obecność genu sodA prawdopodobnie zapewnia oporność bakterii Cronobacter spp. na wewnątrzkomórkową oksydazę makrofagową i warunki kwasowe [43, 57].

Bakterie Cronobacter spp. tworzą biofilm, który może stanowić fizyczną barierę przed niekorzystnymi warunkami środowiskowymi. Tym samym bakterie stają się oporne na brak wody, dezynfekcję, temperaturę i antybiotyki. Bakterie z rodzaju Cronobacter spp. mają zdolność adhezji do szkła, stali nierdzewnej, silikonu, lateksu, poliwęglanu i plastiku. C. sakazakii wykazuje najsilniejszą adhezję do polichlorku winylu, następnie silikonu i stali nierdzewnej [27].

Noworodki urodzone przedwcześnie są często karmione za pomocą rurek nosowo-żołądkowych. Wykazano, iż na rurkach istnieje znaczna ilość biofilmu, który składa się z grzybów i bakterii [34]. Szczep Cronobacter spp. i inne bakterie z rodziny Enterobacteriaceae wyizolowano z rurek nosowo-żołądkowych w ilości 10⁷ jtk/cm [34]. Kinetyka wzrostu i tworzenia się biofilmu C. sakazakii na rurkach enteralnych, wykazała, że C. sakazakii może szybko przyłączyć się do powierzchni i namnażać się na materiale, z którego wykonana jest rurka już po 4 godzinach [34].

Komórki bakterii szybciej przyłączają się do materiałów hydrofobowych (teflon i tworzywa sztuczne), wolniej do powierzchni hydrofilowych (szkoło, metale) [43]. Temperatura i dostępność składników odżywczych wpływają na zdolność adhezji bakterii do powierzchni [27]. Bakterie w środowisku o ograniczonej zawartości substancji odżywczych, chętniej tworzą biofilm. Tworzenie biofilmu jest również procesem regulowanym na poziomie genetycznym [27, 51]. Wykazano, że gen flhE przyczynia się do tworzenia biofilmu przez bakterie C. sakazakii [100]. Gupta i wsp. [127] wykonali badanie przesiewowe genów odpowiedzialnych za powstawanie biofilmu (mgt B, fli D, als S, flg J, cyo D, fts K, bcs C, flh E). Wykazano, że geny fli D, flg J (biorące udział w syntezie rzęski) były obecne we wszystkich badanych szczepach C. sakazakii (27 szczepów). Gen bcs C (odpowiedzialny za syntezę celulozy) był nieobecny w sześciu izolatach C. sakazakii. Przypuszcza się, że białka PPlase, Flge, Dsbc są ważnymi czynnikami biorącymi udział w tworzeniu biofilmu. Białko PPlase bierze udział w fałdowaniu integralnych białek błony zewnętrznej (Omp) i patogenności. Białko FlgE jest niezbędne do kolonizacji i rozwoju biofilmu, natomiast białko DsbC, pod wpływem stresu oksydacyjnego, wykazuje aktywność izomerazy dwusiarczkowej, która odgrywa istotną rolę w procesie fałdowania białka. Uważa się również, że białka ESA_00281 i ESA00_00282 przyczyniają się do tworzenia biofilmu [43, 100].

Na podstawie Rozporządzenia Komisji UE (WE) nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 z późniejszymi zmianami, Cronobacter spp. powinien być nieobecny w trzydziestu 10 g próbkach preparatów w proszku do początkowego żywienia niemowląt i żywności dietetycznej w proszku specjalnego przeznaczenia medycznego, przeznaczonego dla niemowląt w wieku do 6 miesięcy.

W 2017 roku wprowadzono normę EN ISO 22964: 2017 – Mikrobiologia łańcucha żywnościowego – Horyzontalna metoda wykrywania Cronobacter spp., która zastępuje ISO/TS 22964:2006. Zmodyfikowany bulion laurylosiarczanowy (mLST) zastąpiono CSB (Cronobacter Selective Broth), a agar ESIA (Enterobacter sakazakii Isolation Agar) zastąpiono CCI (Chromogenic Cronobacter Izolation Agar). Temperatura inkubacji powinna wynosić 41,5 ± 1°C. Bulion CSB nie zawiera laurylosiarczanu sodu, co może pozytywnie wpływać na odzysk wrażliwych szczepów Cronobacter. Agar CCI zawiera tiosiarczan sodu i cytrynian żelaza (III) amonu, w celu różnicowania Cronobacter spp. od innych Enterobacteriaceae. Dodatkowo agar CCI nie zawiera fioletu krystalicznego, natomiast ilość deoksycholanu sodu została zmniejszona. W normie EN ISO 22964:2017 zmieniono także metodę potwierdzania uzyskanych izolatów bakterii. Wytwarzanie na agarze TSA (Trypton Soy Agar) żółtego, nie dyfundującego do podłoża barwnika, zastąpiono testami biochemicznymi, ponieważ produkcja żółtego barwnika nie jest niezawodnym kryterium identyfikacji. Iversen i wsp. (2007) wykazali że 8% szczepów Cronobacter spp. nie produkowało barwnika, natomiast produkowało go 34% innych przedstawicieli rodzaju Enterobacteriaceae [7, 35, 36].

Wprowadzony w 2017 roku standard EN ISO 22964 wymienia 7 biochemicznych testów do potwierdzania wyników uzyskanych metodą hodowlaną. Sześć z tych testów zawiera zestaw ID 32E dlatego tradycyjne testy biochemiczne mogą zostać zastąpione gotowym zestawem. Jednak dostępne komercyjne zestawy testów biochemicznych ID32E i API 20E nie pozwalają na wiarygodną identyfikację izolatów Cronobacter na poziomie rodzaju. Poleganie na tej metodzie dostarcza fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych wyników. Około 80% szczepów Cronobacter zostało poprawnie zidentyfikowanych na poziomie rodzaju z wykorzystaniem bieżących wersji baz danych ID 32E i API 20E odpowiednio v. 4.0 i v. 5.0. Identyfikacja na poziomie gatunku z wykorzystaniem zestawu ID 32E dała poprawne wyniki w 50%. W przypadku kart Vitek GN wszystkie gatunki Cronobacter zostały zidentyfikowane jako C. sakazakii, do grupy tej zaliczono także przedstawicieli Franconibacter [42, 97].

Technika typowania molekularnego MLST (Multi Locus Sequqnce Typing) początkowo wykorzystywana była do rozróżniania dwóch blisko spokrewnionych genetycznie C. sakazakii i C. malonaticus. Obecnie schemat MLST Cronobacter wykorzystuje sekwencję 7 alleli metabolizmu podstawowego: atpD, fusA, glnS, gltB, gyrB, infB i ppsA dając połączoną sekwencję 3036 pz do analizy filogenetycznej i genomiki porównawczej. Schemat MLST dla Cronobacter został opracowany przez Adama Baldwin’a we współpracy ze Stephanem Forsythe, opublikowany w 2009 roku [3]. Pod adresem http://www.pubMLST.org/cronobacter) dostępna jest bezpłatna baza MLST zawierająca > 2400 szczepów i 350 genomów. Dzięki temu rozwiązaniu rozpoznano kompleksy klonalne (CC) rodzaju Cronobacter spp. co umożliwia prawidłową identyfikację Cronobacter spp., a tym samym zmniejsza możliwość uzyskania wyników fałszywie ujemnych. Ponadto MLST została również wykorzystana do formalnego uznania dwóch nowych gatunków C. universalis i C. condimenti oraz ujawniła silny związek pomiędzy sekwencją typu 4 (ST4) i przypadkami noworodkowego zapalenia opon mózgowych [69, 72]

Techniki identyfikacji oparte o DNA bakterii są uznane za bardziej niezawodne niż techniki oparte o cechy fenotypowe [43, 97]. W ciągu ostatnich kilku lat opracowano różne protokoły reakcji PCR i RT-PCR do identyfikacji bakterii Cronobacter spp. [96]. Wygenerowano kilka starterów PCR do identyfikacji bakterii rodzaju Cronobacter przez amplifikację specyficznych sekwencji i konserwatywnych regionów 16S rRNA bakterii [29, 55]. Jednak identyfikacja Cronobacter spp. z wykorzystaniem genu 16S rRNA jest problematyczna, ponieważ jest on obecny w wielu kopiach, w obrębie jednego genomu, cechujących się mikroheterogennością [3, 41]. Blisko spokrewnione, mające znaczenie kliniczne, gatunki C. sakazakii i C. malonaticus są nierozróżnialne w oparciu o sekwencje 16S rRNA [37]. Chociaż nie ma prawnego obowiązku identyfikacji gatunkowej bakterii z rodzaju Cronobacter spp. [82] to wciąż poszukiwana jest metoda i sekwencja pozwalająca na taką identyfikację. Zróżnicowanie gatunkowe ma kluczowe znaczenie w badaniach epidemiologicznych, ocenie wrażliwości na antybiotyki i środki dezynfekujące. Ponadto producenci mieszanek mlekozastępczych ponoszą koszty związane z odrzuceniem partii produkcyjnej w wyniku fałszywie-dodatniej identyfikacji lub uwolnienia partii jako fałszywie bezpiecznej, co naraża noworodki na infekcję i jej skutki [42]. Sekwencje genów wykorzystywane dotychczas w identyfikacji gatunków Cronobacter spp. to: cycA, gyrB, ompA, rpoB, gluA, fusA, dnaG, zpx, 16S rRNA oraz geny odpowiedzialne za pozyskanie żelaza. Połączenie metod hodowlanych z metodami amplifikacji fragmentów genów pozwalających na wykrycie różnic tak małych jak pojedyncza para zasad wykorzystano do identyfikacji na poziomie gatunku. Vlach i wsp. [95] opracowali protokół PCR-RFLP do różnicowania siedmiu gatunków Cronobacter (C. sakazakii, C. malonaticus, C. turicensis, C. muytjesii, C. universalis, C. dublinensis i C. condimenti). Protokół ten oparty jest na genie rpoB i zastosowaniu trzech endonukleaz restrykcyjnych (Csp 6I, Hin P1I, Mbo I). PCR-RFLP jest prostą, powtarzalną i szybką metodą, którą można wykorzystać do identyfikacji gatunków Cronobacter [95].

Do identyfikacji bakterii Cronobacter spp. można wykorzystać również system spektrofotometrii masowej (MS – Mass Spektrometry) MALDI TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry), którego zasada polega na identyfikacji widm masowych komórek i składników komórkowych [52, 53]. Metoda wykorzystywana jest do identyfikacji drobnoustrojów i analizy pokrewieństwa izolatów tego samego gatunku. W przypadku zastosowania systemu MALDI TOF MS do identyfikacji izolatów Cronobacter spp. najważniejszym czynnikiem gwarantującym wiarygodność i dokładność wyników identyfikacji na poziomie gatunkowym jest referencyjna baza danych zawierająca spektra profili białkowych szczepów C. sakazakii [97].

Przed 1985 r. zakażenia powodowane przez Cronobacter leczono chloramfenikolem, gentamycyną i/lub ampicyliną [43]. W 1988 roku Willis i Robinson zaproponowali łączenie ampicyliny i gentamycyny w leczeniu zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, wywołanego przez Cronobacter. Li i wsp. [56] wykazali, że wyizolowane szczepy Cronobacter spp. były wrażliwe na gentamycynę, tetracyklinę, trimetoprim i kwas nalidyksowy. Jeden z 13 wyizolowanych szczepów był oporny na ampicylinę [56].

W badaniu Berthold-Pluta i wsp. [8] wykazano, że 21 wyizolowanych z warzyw liściastych i kiełków szczepów Cronobacter spp. było wrażliwych na ampicylinę, cefepim, chloramfenikol, gentamycynę, streptomycynę, tetracyklinę, cyprofloksacynę i cotrimoksazol.

Dwa szczepy Cronobacter spp. badane przez Shadlia-Matung i wsp. [83] były oporne na penicylinę i cefalosporynę, a wrażliwe na gentamycynę, tetracyklinę i streptomycynę. W badaniu Oonaka i wsp. [70] dziewięć spośród 36 wyizolowanych szczepów było wrażliwych na cefalosporyny.

Nazarowiec – White i Farber [67] wykazali, że dwa z osiemnastu zbadanych szczepów było opornych na chloramfenikol i tetracykliny. Podobne wyniki uzyskali Lee i wsp. [54] przedstawili badanie, gdzie dwa spośród 66 szczepów Cronobacter spp. wyizolowanych z żywności na terenie Korei były oporne na chloramfenikol a siedem na streptomycynę.

Kim i wsp. [48] wykazali, że dwa szczepy Cronobacter spp. wyizolowane od niemowląt poniżej pierwszego roku życia były wrażliwe na kanamycynę, kwas nalidyksowy, gentamycynę, chloramfenikol, tetracyklinę i cyprofloksacynę oraz oporne na ampicylinę i cefalotynę.

El-Sharoud i wsp [19] badali oporność na antybiotyki 16 izolatów Cronobacter spp. z mleka w proszku. Wszystkie izolaty wrażliwe były na streptomycynę, ampicylinę i gentamycynę. Dwa izolaty oporne były na neomycynę, a jeden na neomycynę i trimetoprim. Xu i wsp. [99] badając 71 szczepów wyizolowanych z żywności typu ready-to-eat na terenie południowo-wschodnich Chin, wykazali, że wszystkie szczepy Cronobacter spp. wrażliwe były na tetracyklinę, kwas naliksydowy, ciprofloksacynę i cefatoksym. Oporność na penicylinę stwierdzono u 84% a na cefalotynę u 46,5% badanych szczepów.

Antybiotyki β-laktamowe (penicyliny, cefalosporyny, karbapenemy, monobaktamy) są największą grupą antybiotyków, używaną do leczenia większości rodzajów zakażeń. Oporność bakterii na β-laktamy jest warunkowana różnorodnymi mechanizmami. Jednym z nich jest wytwarzanie β-laktamaz (enzymów hydrolizujących cząsteczki β-laktamów) [68].

Bakterie z rodzaju Cronobacter spp. mogą wytwarzać enzym β-laktamazę. Pitout i wsp. [75] wykazali, że niektóre szczepy Cronobacter produkują β-laktamazę, ale na niskim poziomie. Caubilla-Barron i wsp. [13] zidentyfikowali dwa izolaty, które produkowały β-laktamazę o rozszerzonym spektrum działania. Zhou i wsp. [102] opisali jeden izolat Cronobacter otrzymany z mieszanek mlekozastępczych, który wytwarzał β-laktamazę o rozszerzonym spektrum działania.

Prowadzone są badania nad mechanizmem antybiotykoodporności Cronobacter spp. W wyniku nadużywania antybiotyków istnieje potencjał uzyskania wysokiej oporności na antybiotyki przez różne szczepy bakterii [49].

Bakterie Cronobacter powszechnie występują w środowisku naturalnym i mogą stanowić poważne zagrożenie dla zdrowia i życia człowieka. Najbardziej narażone na zakażenia wywołane przez bakterie Cronobacter spp. są noworodki poniżej 28 dnia życia, noworodki urodzone przedwcześnie, niemowlęta o niskiej masie urodzeniowej (poniżej 2,5 kg) i niemowlęta z upośledzeniem odporności. Chociaż zakażenia wywołane przez Cronobacter spp. występują rzadko to współczynnik śmiertelności zakażonych pacjentów wynosi 40–80% przypadków. Oszacowane koszty leczenia pojedynczej infekcji wywołanej przez C. sakazakii oraz koszty długoterminowego leczenia powikłań po infekcji przekroczyły 5 milionów dolarów [62]. Szczep C. sakazakii wśród 7 gatunków bakterii zaliczanych do tego rodzaju jest uznawany za najbardziej oportunistyczny patogen odpowiedzialny za bakteremię, zapalenie opon mózgowych i martwicze zapalenie jelit. Dzięki produkcji otoczek i biofilmu, wysokiej termotoleracyjności jest odporny na wysuszenie i wykazuje przeżywalność w mieszankach mlekozastępczych i innych produktach o niskiej aktywności wody. Po wniknięciu do organizmu może atakować komórki nabłonkowe jelit, a nawet komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu wykazując potencjał do wywoływania zapalenia opon mózgowych. Dlatego kontrola oraz regulacje prawne w przypadku C. sakazakii są niezbędne [51]. W ramach zarządzania ryzykiem mikrobiologicznym związanym z występowaniem bakterii Cronobacter spp. w mieszankach mlekozastępczych (PIF i FUF) odbyły się trzy spotkania grupy ekspertów FAO-WHO wspierane przez Komisję Kodeksu Żywnościowego, w wyniku których opracowano model oceny ryzyka, który dostarczył informacji o ryzyku oraz porad i wytycznych zmniejszających ryzyko zakażenia niemowląt w wyniku konsumpcji mleka modyfikowanego w proszku [20, 21, 22]. Wypracowane w 2006 roku na spotkaniach technicznych FAO-WHO rozwiązania zostały sfinalizowane w przyjętym na 31 sesji Komisji Kodeksu Żywnościowego (04.06–04.07.2008) Kodeksie Praktyk Higienicznych dla Preparatów w Proszku dla Niemowląt i Małych Dzieci (CAC 2008a). W roku 2005 na mocy Rozporządzenia Komisji (WE) nr 2073/2005 w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych wprowadzono kryteria dotyczące bezpieczeństwa mikrobiologicznego preparatów w proszku dla niemowląt i żywności dietetycznej w proszku specjalnego przeznaczenia medycznego przeznaczona dla niemowląt w wieku do 6 miesięcy. Bakterie należące do rodzaju Cronobacter muszą być nieobecne w 30 dziesięcio-gramowych próbkach mieszanki mlekozastępczej. Analiza wykonywana jest metodą hodowlaną z potwierdzeniem biochemicznym według zmodyfikowanego protokołu opisanego w standardzie EN ISO 22964:2017 Mikrobiologia łańcucha żywnościowego – Horyzontalna metoda wykrywania Cronobacter spp. Mimo to w dalszym ciągu obserwuje się przypadki zakażeń, co może być spowodowane nieskuteczną diagnostyką. Tradycyjne hodowlane metody mikrobiologiczne są czasochłonne i obarczone błędem. Metody biochemiczne dostarczają fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich wyników w przeciwieństwie do analiz PCR, których wyniki są bardziej niezawodne, jednak są droższe i pracochłonne przez co nie są wykonywane przez producentów mieszanek mlekozastępczych. Do bardziej wiarygodnych i skutecznych metod zaliczana jest metoda MALDI TOF i PCR-RFLP. Najskuteczniejszym narzędziem wykrywania Cronobacter spp. jest kombinacja stosowanych metod, w celu uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. FDA Bacteriological Analytical Manual włącza PCR jako metodę skriningową, jednak wyniki należy potwierdzić metodą hodowlaną. Jako metodę biochemicznej identyfikacji zalecane jest użycie ID32E lub Vitek 2 GN.