Entomopathogenic Fungi And Their Biocenotic Importance

Entomopatogeniczne grzyby są prawdopodobnie najbardziej znanymi mikroorganizmami, które infekują szkodniki roślin. Szacuje się, że powodują one około 60% chorób epizootycznych owadów i innych stawonogów. Terminem „grzyby entomopatogeniczne” w najszerszym ujęciu określać można gatunki organizmów wykazujących w swoim rozwoju właściwości chorobotwórcze lub bezpośrednie zależności troficzne o charakterze pasożytniczym względem żywych stawonogów, głównie owadów i roztoczy. Ich rozwój prowadzi do zakłóceń funkcji fizjologicznych u gospodarzy, a w konsekwencji do ich śmierci [10, 76, 91].

Globalizacja rynków i intensyfikacja produkcji w rolnictwie coraz bardziej wskazują na potrzebę opracowania działań łagodzących negatywne skutki dla środowiska i bezpieczeństwa konsumentów. Straty spowodowane przez szkodniki, choroby roślin i chwasty nadal stanowią istotną przeszkodę w zwiększaniu produkcji rolnej, pomimo znacznego wzrostu stosowania pestycydów. Od drugiej wojny światowej stosowanie syntetycznych środków ochrony roślin stanowi podstawowy system kontroli patogenów i pasożytów roślin uprawnych, mimo świadomości skutków ubocznych oraz szkodliwości dla zdrowia ludzkiego i środowiska. W wielu krajach uprzemysłowionych, od pewnego czasu, strategie ochrony roślin zostały ukierunkowane na wykorzystanie roślin transgenicznych, które charakteryzują się odpornością na owady i inne czynniki biotyczne. Działania te zmierzają do ograniczania stosowania preparatów chemicznych. Całkowite systemowe podejście do zmniejszenia stosowania środków chemicznych w rolnictwie powinno opierać się na lepszym zrozumieniu zależności panujących w różnych ekosystemach i modyfikacji krajobrazu w celu stworzenia odpowiednich warunków dla rozwoju mikroorganizmów pożytecznych w środowisku oraz zachowania bioróżnorodności [77, 92].

Wykorzystanie entomopatogenicznych grzybów mogłoby stanowić podstawową metodę ochrony roślin, opartą na ich uzdolnieniach i różnych rolach jakie mogą odgrywać w przyrodzie. Wiele gatunków spośród grzybów owadobójczych oddziaływają endofitycznie i/lub w ryzosferze, zachowuje się jak antagoniści w stosunku do różnych czynników patogenicznych oraz wspomaga wzrost i rozwój roślin. Szersza wiedza na temat oddziaływania grzybów owadobójczych i lepsze zrozumienie interakcji pasożyt–żywiciel–środowisko może ułatwić skuteczniejsze wykorzystanie grzybów w zwalczaniu szkodników. Wiadomo bowiem, że aktywność biologiczna grzybów owadobójczych uzależniona jest m.in. od ich wirulencji, wilgotności powietrza, temperatury, pory roku, obecności antagonistów, dostępności gospodarzy oraz struktury i sposobu użytkowania gleby, w której występują [8, 77, 88, 90, 91].

Pierwsze badania dotyczące grzybów entomopatogenicznych zostały opracowane na początku XIX wieku. Zainspirowany potrzebą kontrolowania epizoocji jedwabników, przyrodnik Agostino Bassi zidentyfikował w 1835 roku czynnik wywołujący chorobę, nazwany później Beauveria bassiana [10]. Odkrycie, że grzyb jest również zdolny do infekowania innych owadów [5], zainicjowało stosowanie entomopatogenów do zwalczania szkodników przez innych wybitnych naukowców, takich jak Pasteur [54] i Le Conte [42]. Pod koniec XIX wieku w Rosji Miecznikow przeprowadził badania nad „zieloną muskardyną”, chorobą chrząszczy pszennych (Anisoplia austriaca) i zidentyfikował Entomophthora anisopliae (Metarhizium anisopliae) jako przyczynę tej choroby. Kilka lat później Krassilszczik [41] wyprodukował pierwszy biopreparat zawierający zarodniki M. anisopliae, co spowodowało wzrost zainteresowania grzybami owadobójczymi [10]. Patogeny te są najczęściej definiowane jako grzyby, które znajduje się na obumarłych owadach i innych stawonogach. Z tak szerokiego znaczenia wynika, że liczba gatunków rośnie w wyniku licznych badań lub sporadycznych izolacji. Dlatego też, chociaż podjęto próby oszacowania liczby gatunków (około 1000) według St. Leger i Wang [80], trudno jednoznacznie ocenić wielkość tej grupy mikroorganizmów. Sosnowska [77] podaje, że na świecie znanych jest ponad 1200 gatunków grzybów owadobójczych, z czego w Polsce poznano 230.

Wprowadzenie technik molekularnych do identyfikacji, przede wszystkim sekwencjonowanie DNA, miało znaczący wpływ na klasyfikację grzybów owadobójczych, rzucając światło na związki filogenetyczne między różnymi grupami taksonomicznymi. Umożliwiło to ustalenie, że entomopatogeny nie stanowią oddzielnej grupy, przeciwnie należą do różnych jednostek taksonomicznych. Większość grzybów entomopatogenicznych klasyfikowana jest w 2 rzędach tj. Entomophthorales (Zygomycota) i Hypocreales (Ascomycota) [8]. Do pierwszego rzędu należą, takie rodzaje jak: Entomophthora, Entomophaga, Erynia, Neozygites, Pandora i Conidiobolus, które reprezentują głównie grzyby monofagiczne i obligatoryjne patogeny małej liczby stawonogów. Z kolei do Hypocreales należą przede wszystkim polifagiczne gatunki grzybów, znane ze swoich zdolności patogenicznych w stosunku do różnych gatunków owadów [10]. Typowy rodzaj Cordyceps, obejmuje wiele gatunków znanych z wytwarzania pod koniec cyklu, prowadzonego kosztem larw owadów, charakterystycznych wydłużonych maczug wystających z powierzchni gleby, które są zbierane i stosowane w medycynie tradycyjnej w Chinach i innych krajach azjatyckich [55]. Do Cordycipitaceae przypisano również gatunki z rodzaju Culicinomyces, zasadniczo związane z larwami komarów [64], natomiast do oddzielnej rodziny (Ophiocordycipitaceae) rodzaje Ophiocordyceps, Hirsutella, Hymenostilbe, Tolypocladium i Polycephalomyces [36] i Purpureocillium lilacinum (Paecilomyces lilacinus) [46]. Z kolei w obrębie rodziny Clavicipitaceae znajduje się rodzaj Metarhizium, z gatunkami M. anisopliae i inne gatunki stosowane w ochronie biologicznej, takie jak: M. acridum, M. brunneum, M. robertsii i M. rileyi (Nomuraea rileyi). Do tej samej rodziny należą także rodzaje Pochonia, Metacordyceps, Torrubiella, Regiocrella i Hypocrella, przy czym ten ostatni obejmuje kilka gatunków lepiej znanych w stadium konidialnym (np. Aschersonia aleyrodis) [85].

Badania molekularne wykazały także, że inne grzyby entomopatogeniczne są filogenetycznie podobne do gatunków z rodziny Cordycipitaceae i dlatego należy je przypisać do tej rodziny. Wśród nich znalazł się rodzaj Akanthomyces, do którego niedawno przypisano kilka gatunków z rodzin Lecanicillium [37], Simplicillium, Gibellula, Beauveria, z gatunkami B. bassiana, B. brongniartii i B. tenella [61] oraz gatunki Isaria tj. I. farinosa (Paecilomyces farinosus) i I. fumosorosea (P. fumosoroseus).

Gatunki entomopatogeniczne również występują w rodzajach z typu Ascomycota, takich: Ascosphaera (Eurotiomycetes, Eurotiales), Myriangium (Dothideomycetes, Myriangiales) [15], Podonectria (Dothideomycetes, Tubeufiales) [65] oraz Sporothrix (Sordariomycetes, Ophiostomatales), które ostatnio nabrały większego znaczenia [14]. Do gatunków o mniejszych własciwościach entomopatogenicznych należą: Aspergillus flavus [32], Clonostachys rosea oraz gatunki należące do rodzajów: Fusarium [84], Acremonium [81], Cladosporium [1] i Alternaria [34] oraz kilka innych gatunków z rodzaju Aspergillus i Penicillium [12].

Cykl rozwojowy patogenów z typów Zygomycota i Ascomycota jest zróżnicowany, ale warunkiem ich przetrwania i rozprzestrzeniania jest zakażenie i uśmiercenie żywiciela. Entomopatogeniczne grzyby infekują swoich gospodarzy za pomocą zarodników, które rozprzestrzeniają się w otaczającym środowisku, tak powszechnie, że ich obecność została również udokumentowana na powłokach pozornie zdrowych osobników [21]. Infekcja jest skuteczna przy odpowiedniej temperaturze i wilgotności powietrza oraz w momencie bezpośredniego kontaktu zarodnika grzyba z ciałem żywiciela. Zarodniki grzybów z typu Ascomycota przenoszone są z wiatrem, a kiełkują tworząc struktury adhezyjne w postaci przyssawek. Następnie strzępki infekcyjne przenikają przez otwory ciała lub egzoszkielet, przy udziale enzymów degradujących naskórek [11]. Po osiągnięciu hemocelu grzyb pokonuje obronę immunologiczną gospodarza, używając broni biochemicznej [88, 89]. Późniejsza kolonizacja tkanek zachodzi w różny sposób w zależności od rodzaju interakcji. Można wyróżnić trzy typy interakcji: biotrofię, w której grzyb odżywia się żywymi komórkami; nekrotrofię, w której grzyb zasadniczo wykorzystuje martwe tkanki i nieco bardziej powszechną hemibiotrofię, gdy grzyb początkowo pasożytuje na żywych tkankach, a następnie korzysta z martwych tkanek. Po śmierci gospodarza grzyb tworzy na zewnątrz oznaki etiologiczne w postaci zarodników, które często pozostają przymocowane do podłoża przez ryzoidy wyłaniające się z powierzchni brzusznej lub z aparatu policzkowego. W wielu przypadkach udokumentowano produkcję i rozproszenie zarodników z ciała wciąż żywych owadów [67].

Do najważniejszych przedstawicieli grzybów owadobójczych z typu Ascomycota należą gatunki z rodzajów: Beauveria, Isaria, Metarhizium oraz Lecanicilium. Rodzaj Beauveria charakteryzuje się białą lub jasno zabarwioną grzybnię z odcieniem żółtym lub lekko różowym, o obficie rozwiniętych strzępkach substratowych i powietrznych. Konidiofory z pojedynczymi fialidami lub skupieniami fialid o kilkakrotnie wygiętej szyjce, na przecięciach której powstają jednokomórkowe, hialitowe, owalne lub elipsoidalne konidia. Gatunki w obrębie rodzaju różnią się głównie wielkością i kształtem konidiów [13, 16, 98].

Jednym z najczęściej opisywanych gatunków jest B. bassiana. Kolonie tego gatunku osiągają średnicę 6–23 mm po 8 dniach hodowli na podłożach agarowych. Grzybnia tworzy murawkę wełnistą, białą, do 2 mm wysokości. W czasie zarodnikowania jest ona proszkowata do wapnowanej, biała lub kremowa. Dolna strona kolonii bezbarwna. Niektóre szczepy tworzą kolonie kłaczkowate lub o strukturze waty ze strzępkami grzybni o wysokości do 1 cm. Na strzępkach powietrznych powstają pojedynczo lub w rzadkich okółkach komórki konididiotwórcze (fialidy), które mogą także tworzyć kuliste skupienia lub pęczki. Fialidy są szeroko butelkowate lub mają postać wydłużonych rozgałęzień, zwężonych u szczytu w cienką szyjkę, na której tworzą się pierwsze konidia. Następne konidium wyrasta ukośnie z szyjki tuż przed pierwszym konidium, które jest przez nie odsuwane na bok. Po kilkakrotnie powtórzonym procesie na końcu fialidy powstaje zygzakowato wygięta szyjka z najstarszym konidium na szczycie. Konidia odpadają łatwo, natomiast zygzakowata szyjka pozostaje niezmieniona. Czasami fialidy tworzą się w dwóch warstwach nad sobą (pierwotne i wtórne), wówczas ich wielkość, a głównie długość znacznie się znacznie. Pierwsze, kuliste mają wymiary 1,5–3,5 μm, a wtórne, walcowate 4–14×2–3 μm. Konidia są gładkie, hialitowe, o średnicy 2–3 μm (ryc. 1). B. bassiana tworzy charakterystyczny biały nalot zarodników na powierzchni martwych owadów zwany białą muskardyną.

Ryc. 1.

Grzyby z rodzaju Isaria (dawniej Paecilomyces spp.) tworzą kolonie wełniste, prószyste, czasami nieco sznurowate. U gatunków pasożytujących na owadach formują się wyraźne koreamia tj. mniej lub bardziej zwarte pęczki trzonków konidialnych, w górnej części rozpierzchłych i zakończonych zarodnikami konidialnymi. Grzybnia biała, żółta, żółtobrunatna, fioletowa, czasami jasnozielona. Konidia powstają na fialidach pojedynczych lub znajdujących się w okółkach na pędzelkowatym konidioforze, czym przypominają gatunki rodzaju Penicillium. Konidia powstają w łańcuchach. Niektóre gatunki tworzą zarodniki przetrwalnikowe – chlamidospory. Do przedstawicieli tego rodzaju należy m.in. Isaria farinosa (syn. Paecilomyces farinosus). Kolonie tego grzyba tworzą obfitą i wysoką grzybnię, wełnistą lub watowatą. Starsza kultura żółknie lub tworzy białe, żółte lub pomarańczowe, długie do 1 cm i wąskie koreamia. Rewers kolonii początkowo bezbarwny, potem żółknie lub staje się pomarańczowy. Konidiofory mają postać albo pojedynczych fialid o wymiarach 5–15 ×0,8–2 μm, albo pojedynczych lub złożonych okółków. Konidia gładkie, elipsoidalne, o wymiarach 2×3× 1–1,8 μm., tworzą się w długich łańcuchach [13, 16, 98] (ryc. 2). Isaria wywołuje różową muskardynę.

Ryc. 2.

Gatunek Metarhizium anisopliae tworzy początkowo białe kolonie z żółtawym odcieniem, które podczas zarodnikowania przybierają zielonkawe zabarwienie. Konidiofory o długości 40–80 μm, często powstają w skupieniach tworząc sporodochia. Fialidy pojedyncze lub skupione, na wierzchołku zaostrzone. Fialidy o wymiarach 9,7–35,3 × 2,1–2,7 μm. Konidia powstają w długich łańcuchach, są bezbarwne, cylindryczne, 1-komórkowe o wymiarach 3,7–10 × 0,7–1,7 μm [98], (ryc. 3). M. anisopliae tworzący zieloną muskardynę.

Ryc. 3.

Z kolei gatunki rodzaju Lecanicillum (syn. Verticillium ) tworzą murawki białe lub jasne, przeważnie z obfitymi strzępkami powietrznymi, często także ze strzępkami substratowymi. Konidiofory proste, rozgałęzione okólkowo, pojedyncze odgałęzienia i fialidy są od siebie odległe. Konidia jednokomórkowe, głównie elipsoidalne lub o owalnym kształcie, pozostające jakiś czas na szczycie fialidy połączone śluzem w rodzaj główki. Najczęściej opisywanym entomopatogenem jest Lecanicillum lecanii (syn. Verticillium lecanii). Kolonie tego grzyba mają barwę białą lub nieco żółtawą, o strukturze waty lub aksamitną, od dołu żółtawą. Na strzępkach formują się silnie wydłużone i ostre fialidy o wymiarach 11,2–30 × 1,7–2,5 μm. Tworzą się one pojedynczo lub w rzadkich okółkach. Na zakończeniu fiali grupują się konidia tworząc skupienia w kształcie główki o średnicy 5–15 μm. Konidia są hialitowe, wydłużone owalnie o wymiarach 3,7–5,5 × 1,8–2,9 μm (ryc. 4).

Ryc. 4.

Grzyby owadomorkowe z typu Zygomycota wytwarzają 2 typy zarodników konidialnych tzw. konidia pierwotne i wtórne. Oba rodzaje zarodników odrzucane są aktywnie dzięki rosnącemu ciśnieniu osmotycznemu w zarodniku i komórce zarodnikotwórczej. Grzyby te mogą także wytwarzać zarodniki przetrwalnikowe, co pozwala im przetrwać niekorzystne warunki lub brak żywiciela. Dzięki temu synchronizują swój rozwój z rozwojem owadów [23].

Grzyby entomopatogeniczne wykazują różnorodne rzystosowania do pasożytowania na owadach, uwzględniając nie tylko zdolność do przezwyciężenia obrony immunologicznej i uzyskania pożywienia, ale także do mniej zbadanych reakcji behawioralnych. Wykazano, że niektóre grzyby zmieniają zachowanie zarażonych owadów, na przykład poprzez stymulowanie ich do wspinania się na szczyt roślin, co ma ułatwiać rozproszenie zarodników. Pod tym względem więcej badań przeprowadzono dla zakażeń wywołanych przez grzyby z rzędu Entomophthorales niż przez gatunki z Hypocreales [66]. Przykładem obrazującym w jaki sposób entomopatogeny wpływają na behawior owadów jest Ophiocordyceps unilateralis. Grzyb ten powoduje, że zarażone mrówki wspinają się na rośliny i umierając zaciskają szczęki, mocując jednocześnie ciało w położeniu ułatwiającym uwalnianie zarodników [3]. W wielu przypadkach większa ekspozycja na zarodniki grzybów entomopatogennych wynika z naturalnego zachowania owada. Na przykład dojrzałe larwy Lymantria mają tendencję do koncentracji w dolnej części roślin lub na ziemi, gdzie kontakt z Entomophaga maimaiga jest najbardziej prawdopodobny [23]. Mogą występować również odwrotne sytuacje. Na przykład mszyca grochowa wykazuje tendencję do oddalania się od kolonii, gdy jest zakażona Pandora neoaphidis. Takie zachowanie może stanowić zarówno korzyść dla kolonii mszyc, zmniejszając do pewnego stopnia postęp epizoocji, jak i dla grzyba, którego zarodniki zostaną uwolnione na większą odległość, tworząc potencjał dla lepszego rozprzestrzeniania [28].

Jednocześnie różne gatunki owadów wykształciły szereg przystosowań w celu skutecznej obrony przed entomopatogenami. Postawę behawioralną mającą na celu unikanie pewnych entomopatogenów udokumentowano m.in. u dziubałka gajowego [48] i biedronki siedmiokropki [50], które unikają zakażania przez B. assiana, podczas gdy australijski termit Coptotermes lacteus ma tendencję do ucieczki przed M. anisopliae [81]. Udowodniono także, że owady w obronie przed zakażeniem mogą wytwarzać różne związki chemiczne na powierzchni oskórka, które hamują kiełkowanie zarodników [7]. Chociaż specyficzny mechanizm leżący u podstaw tego zachowania nie jest znany, te i inne dowody wskazują na zdolność niektórych owadów do rozpoznawania patogenicznych grzybów.

W rzeczywistości zależności ekologiczne grzybów entomopatogenicznych wykraczają daleko poza interakcje z owadami i dotyczą także roślin. W glebie są szeroko rozpowszechnione w ryzosferze, posiadając specyficzną zdolność do współistnienia w tym mikrośrodowisku z wieloma innymi mikroorganizmami, które w kategoriach naukowych definiuje się jako „kompetencje” [79]. Podkreśla to zatem, jak wiele entomopatogenów jest w stanie przetrwać w bliskim kontakcie z roślinami, zapewniając im korzyść w przypadku jakiegokolwiek ataku szkodników. Powiązanie to staje się jeszcze bardziej istotne, jeśli weźmiemy pod uwagę, że wiele entomopatogennych grzybów występujących w ryzosferze posiada zdolność do kolonizacji roślin endofitycznie, co dodatkowo zwiększa ich potencjał ochronny. Oczywiście zakres, w jakim zjawisko to nabiera znaczenia, zależy od wpływu wielu czynników biotycznych i abiotycznych. Na uwagę zasługuje również zdolność przenoszenia pionowego (tj. przez nasiona), co zostało udowodnione w przypadku B. bassiana na sośnie kalifornijskiej [43], sugeruje to jeszcze bardziej specyficzną adaptację, przynajmniej w przypadku niektórych gatunków roślin.

Pierwsze doniesienia na temat endofitycznego występowania grzybów entomopatogenicznych pojawiały się sporadycznie, jednak wkrótce informacje o endofitycznym zasiedlaniu różnych gatunków roślin przez te mikroorganizmy stało się coraz bardziej powszechne [103]. W Stanach Zjednoczonych endofityczne szczepy B. bassiana zidentyfikowano na roślinach kawy arabskiej [56], pomidorze zwyczajnym [52], kakaowcu właściwym [57] oraz kukurydzy zwyczajnej [68]. W Kolumbii M. anisopliae endofitycznie zasiedlał rośliny manioku jadalnego [37] oraz fasoli zwyczajnej [52], a w Niemczech bobu [2]. Powyższe fakty spowodowały, że to co przez długi czas uznawano za coś więcej niż pojedyncze zjawisko ekologiczne, przekształciło się w prawdziwą strategię kontroli biologicznej. Wydaje się zatem, że możliwe jest zapewnienie trwałej ochrony roślin poprzez traktowanie ich w czasie siewu lub uprawy szczepami endofitycznymi zdolnymi do rozwoju w tkankach roślin i działającymi jak naturalna broń w miejscach ataku fitofagów [59].

Ochronne właściwości szczepów endofitycznych przed różnymi czynnikami fitopatogenicznymi mogą przejawiać się w różny sposób. Przykładem może być kilka gatunków z rodzaju Akanthomyces (Lecanicillium), aktywnych jednocześnie przeciwko mszycom i mączniakowi [40] lub L. lecanii, który oprócz owadów może ograniczać rozwój grzyba rdzawnikowego (Hemileia vastatrix) [95]. Aktywność I. fumosorosea stwierdzono w stosunku do mączniaka dyniowatych [35]. Wykazano, że szczepy B. bassiana hamują zgniliznę sadzonek pomidorów i bawełny powodowaną przez grzyby Rhizoctonia solani i Pythium myriotylum, w tym drugim przypadku działając jako prawdziwy mykopasożyt [52]. W przypadku bawełny, endofityczne szczepy B. bassiana były w stanie złagodzić objawy spowodowane przez bakterię Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum [22]. Inne pozytywne efekty osłabienia objawów odnotowano w stosunku do mączniaka rzekomego winorośli [27], a nawet na roślinach dyni dotkniętych wirusem mozaiki żółtej cukinii (Zucchini yellow mosaic virus – ZYMV). Zaobserwowano, że szczepy B. bassiana i Lecanicillium spp. zasiedlające tkanki palm daktylowych stymulują syntezę białek zaangażowanych w reakcję na stres biotyczny [19].

Innym mechanizmem, dzięki któremu grzyby entomopatogeniczne mogą pozytywnie wpływać na reakcje obronne roślin, jest stymulacja produkcji fitoaleksyn. Zjawisko to zaobserwowano u roślin soi zaszczepionych M. anisopliae, w których stwierdzono znaczny wzrost syntezy izoflawonoidów [38]. Ponadto, oprócz ochrony przed czynnikami biotycznymi, endofityczne grzyby entomopatogeniczne mogą mieć działanie wspomagające wzrost roślin dzięki uwalnianiu sideroforów i fitohormonów [38]. Metarhizium robertsii jest w stanie ponownie włączyć część związków azotu pochodzących z degradacji zabitych owadów i udostępnić go roślinom [70].

Większość dostępnych danych eksperymentalnych na temat korzyści wynikających z zasiedlania tkanek roślin przez grzyby entomopatogeniczne odnosi się do działania pojedynczych szczepów. Istnieje zatem potrzeba bardziej szczegółowych badań dotyczących interakcji różnych szczepów, które mogłyby działać synergistycznie [71].

Mykopestycydy definiuje się jako produkty oparte na propagulach grzybów, przeznaczone do zwalczania szkodników za pomocą aplikacji inokulacyjnych. W przeciwieństwie do preparatów opartych na bakteriach i wirusach, które mogą działać tylko po ich spożyciu, większość mykopestycydów działa poprzez kontakt, dzięki adaptacyjnym mechanizmom biochemicznym i fizjologicznym, które obejmują tworzenie struktur zakaźnych, wytwarzanie proteaz i lipaz pozakomórkowo oraz toksyn. Dotychczas opracowano wiele produktów komercyjnych, których składnik aktywny reprezentuje co najmniej jeden z gatunków grzybów, głównie Beauveria, Isaria, Lecanicillium spp. i Metarhizium spp. [76, 77].

Jak dotąd uwaga producentów mykopestycydów skupiała się głównie na wyborze stosunkowo łatwych do produkcji i dystrybucji szczepów, przy rozsądnych kosztach, długoterminowej stabilności i zdolności do szybkiego działania w naturalnych warunkach. Procesy przemysłowe są ukierunkowane na wytwarzanie jednostek dyspersyjnych poprzez indukcję konidiogenezy na sztucznych podłożach, wytwarzanie blastosporów z hodowli drożdży w pożywkach płynnych lub wzrost biomasy strzępkowej na różnych substratach. W celu zwiększenia skuteczności mykopestycydy stanowią najczęściej zawiesinę konidiów, która jest rozpylana, zapewniając pełne pokrycie i maksymalizując prawdopodobieństwo kontaktu i zakażenie docelowych owadów. W celu poprawy dyspersji preparatów, dodaje się środki zwilżające w postaci adiuwantów. Ponieważ na trwałość grzybów na powierzchni liści negatywnie wpływa promieniowanie ultrafioletowe, w wielu przypadkach podejmuje się próby ochrony inokulum grzyba przez włączenie blokerów i środków przeciwsłonecznych [17].

Mykopestycydy mogą być stosowane w krótkich odstępach czasu, lub nawet jednocześnie z wieloma insektycydami, co zostało potwierdzone w wielu doświadczeniach polowych [72]. Pewne ograniczenia w stosowaniu mykopestycydów mogą wynikać z warunków środowiskowych. W rzeczywistości inokulum entomopatogena ma ograniczony okres trwałości i zazwyczaj potrzeba 2–3 tygodnie, aby skutecznie doprowadzić do śmierci owadów. Ponadto aplikowanie musi być przeprowadzane w okresach wysokiej wilgotności względnej powietrza, aby stworzyć warunki dla kiełkowaniu zarodników. Zatem przestrzeganie optymalnych warunków aplikowania ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania udanego zakażenia owadów przez entomopatogeny, a w przypadku szczepów endofitycznych skutecznego zasiedlenia rośliny, aby zagwarantować jej trwałą ochronę [62].

Badania laboratoryjne wykazały, że szczepy B. bassiana i M. anisopliae wybrane do biokontroli nie są ani toksyczne, ani zakaźne dla kręgowców [99, 100]. Chociaż takie badania nie wykazały szkodliwego wpływu grzybów i ich toksyn na ludzi i organizmy nie będące przedmiotem zwalczania, należy jednak zachować ostrożność, aby uniknąć wdychania konidiów podczas pracy z produktem. Wreszcie, biorąc pod uwagę udokumentowaną zdolność produkowania przez większość gatunków grzybów owadobójczych substancji toksycznych, nie należy lekceważyć możliwego zanieczyszczenia mykotoksynami organów roślin przeznaczonych do spożycia [83].

Grzyby entomopatogenicze wykorzystywane są nie tylko do zwalczania wszelkiego rodzaju szkodliwych stawonogów, ale również coraz częściej mają szersze zastosowanie. Przykłady skuteczności gatunków takich jak B. bassiana, M. anisopliae i I. fumosorosea w leczeniu zwierząt hodowlanych udokumentowano w odniesieniu do ptaszyńca kurzego [88] oraz much [44]. Ewentualne zastosowanie w środowisku antropologicznym wynika ze skuteczności przeciwko musze domowej [47] oraz karaluchowi wschodniemu [26]. Wykazano również efekt synergiczny z syntetycznymi insektycydami wobec tych ostatnich owadów [32]. Wykazano również, że grzyby entomopatogeniczne np. M. anisopliae, mogą pasożytować na komarach, więc ich stosowanie wspomaga walkę z malarią [77]. Wyniki licznych badań przeprowadzonych na całym świecie wykazały ogromny potencjał w ograniczaniu wszystkich gatunków komarów zdolnych do przenoszenia wirusów i innych czynników zakaźnych [96].

Statystyki wskazują, że Ameryka Południowa jest kontynentem, na którym występuje największe wykorzystanie mykoinsektycydów, tj. ok. 43% światowej produkcji. Krajem wiodącym jest Brazylia, gdzie obszar poddany działaniu M. anisopliae w celu zwalczania gatunków z rodzaju Mahanarva (Cercopidae) oszacowano na około milion hektarów w 2008 r., z czego 75% dotyczyło plantacji trzciny cukrowej [45]. W Kolumbii zarodniki B. bassiana uzyskane z hodowli na ugotowanym ryżu zostały wykorzystane do ograniczenia populacji ryjkowca kawowego [58]. Innym wiodącym krajem w tym konkretnym sektorze są Chiny, gdzie w ostatnim czasie B. bassiana był używany co roku na powierzchniach do 1,3 miliona hektarów dzięki rozwojowi małych regionalnych firm wykorzystujących tanie substraty do masowej produkcji. Osiągnięto mniej lub bardziej znaczące sukcesy jeśli chodzi o zwalczanie szkodników w leśnictwie i rolnictwie tj.: omacnicy prosowianki, skoczków, ryjkowca ziemniaczanego i gatunków z rodzaju barczatkowate oraz brudnicowate. W Południowych Chinach obszar około miliona hektarów został poddany zabiegom dotyczącym ograniczania ćmy na sosnach [97]. W Polsce prowadzone są próby wykorzystania maczużnika Cordyceps militaria, jako jednej z metod w profilaktyce ochrony lasu przed rozwojem gradacji owadów np. barczatki sosnówki, strzygoni choinówki oraz poprocha cetyniaka. Cordyceps militaris występuje na wszystkich kontynentach i ma w różnym stopniu udokumentowaną rolę w regulacji liczebności populacji niektórych owadów leśnych np. gatunku ćmy z rodziny garbatkowate i barczatki sosnówki w Japonii, Polsce i na Litwie. W literaturze sygnalizowana jest pilna potrzeba kontynuowania badań nad metodami wykorzystania maczużnika Cordyceps militaris w profilaktyce ochrony lasu przed rozwojem gradacji owadów, zwłaszcza w świetle coraz krótszej listy dostępnych środków ochrony roślin służących ograniczaniu ich liczebności oraz konieczności spełniania wielu wymagań stawianych przez prawo przed profesjonalnymi użytkownikami w ich stosowaniu [75].

Najczęściej używanym grzybem w ochronie roślin jest Baeuweria bassiana, zapewne z powodu szczególnie dużej liczby żywicieli, która obejmuje około 700 gatunków stawonogów i zdolności do adaptacji w różnych środowiskach. Grzyb ten jest wszechobecny w glebie, a często izolowany nawet w środowisku morskim [102]. Gatunek ten, chociaż jednolity pod względem morfologicznym, wykazuje konkretne oznaki pasożytniczej specjalizacji, bowiem zidentyfikowano szczepy szczególnie aktywne przeciwko gatunkom roztoczy (Tetranychus spp.) [101]. Patogeniczne właściwości grzyba związane są wytwarzaniem różnych metabolitów wtórnych, takich jak: kwas szczawiowy, oosporeina, bassianina, tenellina, beauvericina, bassianolid, izarolidyna i beauveriolid, które prawdopodobnie regulują wirulencję lub reakcję immunologiczną w różnym stopniu w zależności od gatunku gospodarza. Innym produktem bioaktywnym jest bassiacrydyna, toksyczne białko, które u wędrownej szarańczy wywołuje śmiertelność do 50%. Ma ona związek z melanizacją na poziomie tchawicy, pęcherzyków powietrza i ciał tłuszczowych [59]. Sekwencjonowanie genotypu B. bassiana pozwoliło uzyskać wiedzę na temat genów zaangażowanych w ekspresję wirulencji, które można wykorzystać w biotechnologii. Innym grzybem entomopatogenicznym, którego genotyp został zsekwencjonowany, jest M. anisopliae [18]. Podobnie jak w poprzednim przypadku, gatunek ten jest także wszechobecny, w środowisku, nawet znajdowany był w środowisku morskim [9]. Ponadto zidentyfikowano nowy gatunek, M. blattodeae, który wykazuje szczególną zdolność do zakażania karaluchów [50].

Liczne badania wskazują na dominację B. bassiana w próbach gleby i ściółki leśnej w Polsce, Danii, Finlandii, Hiszpanii, Chinach i na Słowacji [90]. Grzyb ten występuje często na owadach przebywających w glebie lub zimujących w wierzchnich warstwach gleby. Prawdopodobnie dominacja tego gatunku w bogatych w materię organiczną powierzchniowych warstwach gleby wynika z jego zdolności do rozwoju w fazie saprotroficznej [89, 91]. Z kolei w glebach pól uprawnych najczęściej występuje M. anisopliae i I. fumosorosea. Pierwszy z wymienionych gatunków jest najbardziej tolerancyjnym w stosunku do gleb zmienianych działalnością człowieka. Ponadto, gatunek ten najlepiej znosi okresową nieobecność żywiciela w środowisku. Stwierdzono także, że na polach wieloobszarowych, gdzie stosowane są intensywne zabiegi agrotechniczne, maleje różnorodność patogenów stawonogów, podobnie jak pasożytów i drapieżców [33].

Zgodnie z Dyrektywą UE i Metodykami Instytutu Ochrony Roślin – PIB, Integrowana Ochrona Roślin „jest to sposób ochrony roślin uprawnych przed organizmami szkodliwymi (grzybami, bakteriami, wirusami i innymi czynnikami chorobotwórczymi; owadami; roztoczami; nicieniami; chwastami lub zwierzętami kręgowymi), polegający na wykorzystaniu wszystkich dostępnych metod profilaktyki i ochrony roślin, w szczególności metod nie chemicznych, w celu zminimalizowania potencjalnego zagrożenia dla zdrowia ludzi, zwierząt oraz środowiska. Celem Integrowanej Ochrony Roślin jest utrzymanie populacji agrofagów poniżej progów szkodliwości oraz zabezpieczenie efektu ekonomicznego produkcji” [39].

Informacje przedstawione w poprzednich rozdziałach wskazują, że stosowanie grzybów entomopatogenicznych do zwalczania szkodliwych owadów w Europie jest nadal na niskim poziomie, pomimo wielu ich zalet, w porównaniu do produktów chemicznych i innych biologicznych. Jednak postęp wiedzy na temat tych grzybów i możliwości, jakie biotechnologia oferuje dzięki wykorzystywaniu pożądanych cech wybranych szczepów, wydaje się znacząco wpływać na poprawę skuteczności grzybowych środków owadobójczych i zwiększyć ich rolę w najbliższym czasie. Dalsze badania powinny uwzględniać zarówno bezpośrednie działanie grzybów owadobójczych jak i pośrednie oddziaływanie jako antagonistów, induktorów odporności i mikroorganizmów wspomagających wzrost roślin. Daje to możliwość wyselekcjonowania szczepów o wysokiej wirulencji i szerokim spektrum działania na szkodniki roślin. Z drugiej strony, wybór szczepów posiadających określone zdolności, powinien być ukierunkowany także na możliwość ich zastosowania w integrowanej ochronie roślin, razem z produktami syntetycznymi, których stosowanie wydaje się niezbędne do osiągnięcia wysokich plonów, szczególnie w przypadku upraw specjalistycznych. W związku z tym należy zwrócić należytą uwagę, że populacje owadów odporne na niektóre produkty syntetyczne są często bardziej podatne na entomopatogeny [25]. Z tego powodu, duże znaczenie powinna mieć możliwość wykorzystania synergistycznego działania grzybów owadobójczych z różnymi insektycydami. Niektóre badania pokazują, że jest to możliwe, bowiem uzyskano pozytywne wyniki w testach z preparatami: chlorantraniliprolem [29] i pyretroidami [48]. Jednak większość fungicydów hamuje kiełkowanie grzybów owadobójczych [77]. W literaturze wskazuje się również na próby łącznego stosowania grzybów owadobójczych z entomofagami lub z zapylaczami, bowiem np. Isaria fumosorosea nie infekuje trzmieli [77]. Pozytywne wyniki odnotowano także w przypadku ochrony pomidorów i papryki uprawianych w szklarniach przy użyciu trzmieli (Bombus impatiens) w celu roznoszenia preparatu opartego na B. bassiana [74] oraz do zwalczania Otiorhynchus sulcatus przez M. brunneum i B. bassiana [71], chociaż niektórzy autorzy wskazują na szkodliwość B. bassiana dla trzmieli [77].

Zastosowania entomopatogenów jest szczególnie wskazane w uprawach pod osłonami, gdzie osiągnięto największy sukces w stosowaniu bioinsektycydów. W takich warunkach można regulować temperaturę i wilgotność powietrza, a grzyby owadobójcze potrzebują temperatury ok. 25°C i wilgotności 80–90% dla skiełkowania zarodników i dokonania zakażenia [77, 78]. Uprawy pod osłonami są zatem łatwiejsze do ochrony przy pomocy preparatów opartych na grzybach owadobójczych z rzędu Hypocreales, a szczególnie Entomophthorales, które mają wyższe wymagania co do wilgotności, aby były skuteczne. Takie wymagania grzybów oraz trudności techniczne dotyczące głównie produkcji masowej oraz wielkości i stabilności propaguli, ograniczyły rozwój produktów opartych na grzybach owadobójczych, pomimo konkretnych badań przeprowadzonych w celu przezwyciężenia niektórych z wyżej wymienionych problemów [73]. Z tego powodu grzyby owadobójcze mogą być szczególnie przydatne, jeśli wdrażane zostaną strategie mające na celu ochronę rodzimej bioróżnorodności w ekosystemach, m.in. poprzez modyfikację środowiska lub ograniczenie zabiegów agrotechnicznych [77]. Stwierdzono bowiem, że większa różnorodność tych mikroorganizmów występuje w glebach, gdzie prowadzona jest uprawa ekologiczna niż w glebach z tradycyjnej uprawy. Wykazano także, że rozwojowi grzybów owadobójczych sprzyjają siedliska silnie uwilgotnione, lasy, szuwary, zadrzewienia, łąki i uprawy wieloletnie [77].

Obecnie, większość biopreparatów produkowanych na bazie grzybów owadobójczych opiera się na polifagicznych gatunkach grzybów z rzędu Hypocreales, które mają szerokie spektrum gospodarzy. Grzyby owadomorkowe z rzędu Enthomophthorales, które są bardziej wyspecjalizowane w stosunku do żywiciela, trudno rosną na sztucznych podłożach, więc nie znajdują zainteresowania wśród potencjalnych producentów biopreparatów [6]. Na terenie Polski zarejestrowano dwa bioinsektycydy do zwalczania szkodników w uprawach pod osłonami: Preferal, na bazie grzyba I. fumosorosea [90] i Naturalis zawierający szczep ATCC 74040 grzyba B. bassiana [85]. Na świecie asortyment tych środków jest znacznie większy. Najwięcej bioinsektycydów opartych jest na gatunku B. bassiana [77].

Mykoinsektycydy komercyjne oparte na B. bassiana są stosunkowo stabilne w porównaniu z innymi. Dzięki inżynierii genetycznej opracowano metody transformacji dzikich szczepów w celu poprawy ich działania, łącząc cechy różnych zmutowanych szczepów. Na przykład, zaobserwowano, że reakcja fotoreceptora ma znaczący wpływ na konidiogenezę i wirulencję i że tolerancję na promieniowanie ultrafioletowe można znacznie poprawić przez wprowadzenie systemu fotoreceptorów pigmentowych od innych gatunków grzybów [94]. Jeszcze bardziej istotne dla rozwoju hiperwirulentnych szczepów jest pełne zrozumienie dynamiki procesu zakaźnego wpływającego na różne gatunki owadów. Obecnie prowadzonych jest wiele badań nad możliwością transformacji dzikich szczepów w celu zwiększenia ekspresji specyficznych genów, ze szczególnym uwzględnieniem tych kodujących chitynazy i proteinazy oraz regulujących szlaki metaboliczne do produkcji toksyn. Bardzo interesujące wydają się być wyniki badań wskazujące, że ekspresja białka fuzyjnego o połączonej aktywności proteazy i chitynazy zwiększa wirulencję B. bassiana przeciwko mszycy brzoskwiniowej. Nie należy jednak zapominać, że transformowane szczepy ogólnie mają zmniejszoną zdolność adaptacji i trwałość w środowisku, co może obniżać ich skuteczność [94].

Ważnym kryterium oceny mykoinsektycydów jest bezpieczeństwo dla ludzi, środowiska i pożytecznych organizmów. Generalnie uważa się, że grzyby owadobójcze nie powodują objawów fitotoksyczności roślin i są bezpieczne dla zdrowia ludzi oraz środowiska [77]. Niedawno jednak poddano w wątpliwość, czy metabolity produkowane przez gatunki Beauveria i Metarhizium, głównie ze strukturą cyklopeptydu, faktycznie są bezpieczne [86]. Wydaje się, że ryzyko związane ze stosowaniem tych produktów jest minimalne, może raczej wynikać z produkcji mykotoksyn przez grzyby z rodzajów: Cladosporium, Aspergillus i Penicillium, które są znacznie bardziej rozpowszechnione w środowisku. Ciekawym zagadnieniem są także aspekty związane z interakcjami entomopatogennych grzybów z układem odpornościowym owadów. Mechanizmy obrony owadów przed patogenami wskazują na wysokie podobieństwo do układu odpornościowego kręgowców. W związku z tym, w przyszłości wiele zależeć będzie od postępu badań i wiedzy na temat procesów regulujących odporność owadów oraz adaptacji grzybów entomopatogeniczych do pokonania tych barier podczas długiej drogi ewolucji [41].

W pracy zaprezentowano przegląd aktualnych badań nad grzybami owadobójczymi. Entomopatogeny są rozpowszechnione w przyrodzie i stanowią atrakcyjny czynnik biologicznej ochrony. Oprócz możliwości pasożytowania na owadach i roztoczach wykazują także inne, pośrednie mechanizmy oddziaływania, które przyczyniają się do ograniczania populacji szkodników. Wiele gatunków zasiedla endofitycznie tkanki roślin wspomagając ich odporność oraz wzrost i rozwój. Ochronne właściwości szczepów endofitycznych wynikają m.in. ze stymulacji produkcji fitoaleksyn, uwalniania sideroforów i fitohormonów. Szerokie uzdolnienia grzybów owadobójczych wykorzystywane są do produkcji biopreparatów, które mogą być włączone do integrowanej ochrony roślin. Obecnie badania ukierunkowane są na zwiększenie produkcji i wprowadzania bioinsektycydów do środowiska, prowadzone są także działania mające na celu modyfikację środowiska naturalnego poprzez stwarzanie dogodnych warunków do zachowania bioróżnorodności i rozwoju mikroorganizmów pożytecznych w ekosystemach