This work is licensed under the Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
Kampylobakterioza – dane epidemiologiczne, objawy chorobowe
Bakterie rodzaju Campylobacter spp. to Gram-ujemne, mikroaerofilne, ruchliwe, spiralnie skręcone pałeczki należące do klasy Epsilonproteobacteria. Rodzaj ten tworzy 39 gatunków i 16 podgatunków [56]. Od 2005 roku kampylobakterioza jest najczęściej diagnozowaną zoonozą u mieszkańców państw członkowskich Unii Europejskiej. Według danych Europejskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA, European Food Safety Authority) w 2017 roku potwierdzono 246 158 przypadków infekcji pałeczkami Campylobacter, przy wskaźniku zachorowalności 64,8 na 100 000 osób [22]. W Stanach Zjednoczonych w 2017 r. patogen ten był najczęstszą przyczyną chorób przenoszonych przez żywność [58]. W ciągu ostatnich 10 lat częstość występowania i rozpowszechnienie kampylobakteriozy wzrosły również w krajach rozwijających się. Dane z części Afryki, Azji i Bliskiego Wschodu wskazują na endemiczny charakter kampylobakteriozy na tych obszarach, szczególnie u dzieci. Wskaźnik DALY (disability adjusted life-years – lata życia skorygowane niesprawnością) dla zakażeń Campylobacter na całym świecie wynosi 7,5 mln, i wśród czynników etiologicznych biegunek ustępuje tylko wskaźnikowi DALY oznaczonemu dla rotawirusów [64].
Ze względu na łagodny, zwykle, przebieg zakażenia szacuje się, że zgłaszany jest tylko jeden na 47 przypadków kampylobakteriozy, co oznacza, że liczba infekcji Campylobacter jest wielokrotnie zaniżona [32]. W Polsce przyczyną małej liczby odnotowanych przypadków jest najprawdopodobniej nieskuteczny system monitorowania zakażeń tymi pałeczkami. W 2014 roku zapadalność w Polsce wynosiła 1,69 na 100 000 osób i należała do jednej z najniższych w Europie [80]. W krajach rozwijających się, podobnie jak w Polsce, dane epidemiologiczne zakażeń pałeczkami Campylobacter są fragmentaryczne, co wynika z niesprawnego programu nadzorowania przypadków kampylobakteriozy, bądź z jego braku. Jednocześnie, w przeciwieństwie do krajów rozwiniętych, przebieg infekcji Campylobacter u dorosłych jest w większości asymptomatyczny a manifestacja objawów zakażenia obserwowana jest głównie u dzieci poniżej piątego roku życia [73]. Sugeruje to, że kontakt z tym enteropatogenem we wczesnym dzieciństwie prowadzi do rozwoju odporności ochronnej [6, 45].
Kampylobakteriozę u ludzi wywołuje najczęściej infekcja jednym z dwóch gatunków: C. jejuni lub C. coli. W krajach rozwijających się są one przyczyną odpowiednio 89–96% i 4–11% infekcji [76]. Odnotowywane są także nieliczne przypadki zakażeń wywołane przez inne gatunki. tj. C. lari lub C. fetus [44]. Zakażenie Campylobacter może przebiegać bezobjawowo, zwykle jednak wiąże się z występowaniem ostrych stanów zapalnych jelit, którym towarzyszy długotrwała, śluzowata biegunka. Objawy ustępują zazwyczaj samoistnie po około 7 dniach. Niekiedy infekcje pałeczkami Campylobacter prowadzą do rozwoju chorób autoimmunologicznych i neurologicznych, których przykładem jest neuropatia obwodowego układu nerwowego tj. zespół Guillaina-Barré (GBS, Guillain-Barré Syndrome) [19, 29]. Ryzyko jego wystąpienia, zwykle niewielkie (trzy przypadki na 10 000 zdiagnozowanych przypadków kampylobakteriozy), wzrasta po infekcji określonymi serotypami (m. in. HS19, HS41) [87]. U podstaw rozwoju GBS leży zjawisko mimikry molekularnej. Powstające podczas infekcji Campylobacter przeciwciała rozpoznające bakteryjny lipooligosacharyd (LOS) wiążą się z gangliozydami występującymi na powierzchni komórek Schwanna i neuronu (GM1 i GD1a), co aktywuje układ dopełniacza, prowadzi do powstania kompleksu atakującego błonę (MAC, Membrane Attack Complex) i w konsekwencji, do uszkodzenia komórek nerwowych. Przyłączenie się przeciwciał w okolicy węzła Ranviera jest natomiast przyczyną zablokowania kanałów sodowych, a tym samym zaburzeń polaryzacji komórki, czego efektem jest spowolnienie przewodnictwa nerwowego. Ponadto sprowokowana infekcją aktywacja limfocytów T może wywołać migrację makrofagów w kierunku zajętego nerwu, a towarzyszące jej uwolnienie mediatorów stanu zapalnego prowadzić do uszkodzenia mieliny [19]. Aktualne badania wskazują również na związek pomiędzy zakażeniem Campylobacter a występowaniem reaktywnego zapalenia stawów [1, 88], zespołu nadwrażliwości jelita (IBS, Irritable Bowel Syndrome) oraz nowotworów jelita grubego [44].
W przebiegu infekcji znaczenie ma zarówno patogenność zakażającego szczepu, jak i funkcjonowanie układu odpornościowego gospodarza [44]. U ludzi z niesprawnie działającym układem odpornościowym (ludzie starsi, ludzie po przebytych chorobach nowotworowych czy zainfekowani wirusem HIV) Campylobacter jest często przyczyną infekcji uogólnionych oraz posocznicy [44, 76].
Kampylobakterioza – źródło zakażenia
Do transmisji infekcji Campylobacter między ludźmi dochodzi bardzo rzadko. Źródłem zakażenia może być spożycie zanieczyszczonej komórkami patogena wody, niepasteryzowanego mleka czy też mięsa wołowego. Badania epidemiologiczne wykazują jednak, że większość przypadków kampylobakteriozy wywoływanych jest spożyciem zainfekowanego pałeczkami niedogotowanego mięsa drobiowego, co jest zgodne z obserwacją, że głównym rezerwuarem pałeczek Campylobacter jest drób hodowlany oraz dzikie ptactwo [19, 85]. W 2016 r., według raportu EFSA, 36,7% przebadanych tuszek brojlerów dostępnych na rynku europejskim było zanieczyszczonych Campylobacter w liczbie przekraczającej 4 log10 jtk/g mięsa. Niska dawka infekcyjna dla ludzi sprawia, że do zakażeń na tle Campylobacter dochodzi łatwo i często. W ostatnich latach odsetek ten pozostaje na względnie stałym poziomie, choć w roku 2015 dla EU wynosił 47%. Występują też znaczne różnice między poszczególnymi państwami członkowskimi Unii Europejskiej, co jest m.in. wynikiem stosowania różnych strategii pobierania próbek i metod testowania [21, 23]. Na polskim rynku bakteriami rodzaju Campylobacter zanieczyszczonych jest ponad 50% tusz drobiowych [49].
Poziom kolonizacji jelita ptaków przez Campylobacter spp. osiąga nawet 109 jtk/gram zawartości jelita. Większość przeprowadzonych dotychczas badań wskazuje, że wysoki poziom kolonizacji jelit kurcząt nie powoduje objawów chorobowych u ptaków, co uniemożliwia odizolowanie zainfekowanych osobników od stada [54, 93]. Hermans i wsp. sugerowali, że stan taki jest wynikiem nieskuteczności układu odpornościowego kurcząt połączonej z mechanizmami, które przekierowują odpowiedź zwierząt na tolerowanie patogena [35]. Doniesienia z ostatnich lat opisują jednak szkodliwe skutki zdrowotne kolonizacji jelit kurcząt przez Campylobacter [5, 40, 99]. W 2014 r. zaobserwowano np., że uszkodzenia błony śluzowej jelit brojlerów wywołane przez szczep C. jejuni M1, co umożliwiło translokację bakterii, takich jak np. E. coli, ze światła jelita do głębiej położonych tkanek. W efekcie u ptaków wystąpił ostry stan zapalny i biegunka [4, 5, 11, 40]. Uzyskane wyniki nakazują zatem zweryfikowanie przekonania, że Campylobacter jest wyłącznie komensalem ptaków.
Obecność Campylobacter jest wykrywana w przewodzie pokarmowym ptaków hodowlanych dopiero po 2 tygodniu ich życia [17, 67]. Sugeruje to istnienie mechanizmu przeciwdziałającego kolonizacji młodych ptaków przez tego patogena. Spekulowano, że za ten stan odpowiada wysoki poziom swoistych przeciwciał matczynych [12]. Obserwacje, że kurczęta przebywające w stadach razem z dorosłymi są wolne od Campylobacter przez pierwsze kilka tygodni po wylęgnięciu, wydają się to potwierdzać [81]. Istnieją również doniesienia sugerujące, że główną przyczyną, zależnego od wieku, zakażenia kurcząt przez Campylobacter jest zmiana składu mikrobiomu ptaków [31]. Przeprowadzone przez Ijaz i wsp. kompleksowe, codzienne badania mikrobiomu kurcząt od 3 do 35 dnia życia ptaków wykazały, że Campylobacter pojawia się w 16 dniu życia, tuż po zaobserwowaniu najbardziej znaczących zmian w profilach metabolicznych. Nie można wykluczyć, że jest to wynik pojawienia się środowiskowych czynników stymulujących rozwój tych drobnoustrojów [41].
Kampylobakterioza – profilaktyka
Duża liczba przypadków kampylobakteriozy, występowanie poinfekcyjnych powikłań, głównie neurologicznych, jak również rosnąca liczba szczepów Campylobacter opornych na antybiotyki stosowane w terapii (makrolidy i fluorchinolony) powodują, że zakażenia tym enteropatogenem stanowią poważny problem dla służb medycznych. Mikroorganizm ten znalazł się na opublikowanej w 2017 roku, przez Światową Organizację Zdrowia (World Health Organisation), liście gatunków bakterii będących, głównie ze względu na swą antybiotykooporność, największym zagrożeniem dla zdrowia ludzkiego [101]. W związku z tym, w ostatnich latach wysiłki badaczy skupiają się na opracowaniu strategii zapobiegania infekcjom Campylobacter. Ponieważ do zanieczyszczenia tusz drobiowych pałeczkami Campylobacter dochodzi na etapie produkcji, kontrolowanie zakażeń na tym poziomie (ubój, sprzedaż detaliczna i konsumpcja) powinno zmniejszyć liczbę przypadków kampylobakteriozy u ludzi. Strategie stosowane w ramach holenderskiego programu CARMA (Campylobacter Risk Management and Assessment) nie przyniosły jednak spodziewanych rezultatów [33]. Szacuje się, że ograniczenie poziomu kolonizacji przewodu pokarmowego kurcząt przez patogenne szczepy Campylobacter spp. doprowadziłoby do znacznego obniżenia poziomu zachorowań wśród ludzi, a co za tym idzie, znacznej redukcji kosztów opieki zdrowotnej. Spadek liczby komórek Campylobacter w jelitach kurcząt zaledwie o 2 log powinien przełożyć się na około trzydziestokrotne obniżenie częstości występowania ludzkich infekcji [79]. Z początkiem 2018 roku weszło w życie Rozporządzenie Komisji UE (nr 2017/1495) wprowadzające kryterium higieny dotyczące bakterii Campylobacter w tuszach brojlerów, co umożliwi kontrolę zanieczyszczenia tusz podczas procesu uboju ptaków. Ustalono, że dopuszczalna liczba jtk/gram mięsa drobiowego nie może przekraczać 1000. W związku z powyższym analizowane są metody profilaktyki anty-Campylobacter na etapie hodowli drobiu, takie jak: podniesienie higieny na fermach, stosowanie dodatków do pasz lub wody pitnej np. kwasów organicznych i kwasów tłuszczowych, produktów pochodzenia roślinnego, bakteriocyn, bakteriofagów [61]. Wyniki uzyskane przez różne grupy badawcze nie pozwalają na jednoznaczne wnioski. W zależności od użytej metody obserwowano zarówno zmniejszenie poziomu kolonizacji jelit drobiu, jak również brak ochrony przed zasiedleniem jelita [13, 24, 61].
Interesujące badania przeprowadzili w 2015 roku Johnson i wsp. Podczas poszukiwania inhibitorów ekspresji czynnika kolonizacji Campylobacter – flagelliny, zidentyfikowali związki, które silnie hamowały wzrost patogena in vitro [43]. Aktywność anty-Campylobacter w modelu kurzym wykazywała jedynie Campyneksyna A. U połowy kurcząt, które otrzymały ten związek, kolonizacja jelit ślepych przez tego patogena była poniżej poziomu wykrywalności. Jednocześnie u 4 na 9 przebadanych kurcząt w ogóle nie zaobserwowano efektu ochronnego. Rok później Kumar i wsp. [50] zidentyfikowali 12 cząsteczek o właściwościach anty-Campylobacter należących do jednej z pięciu klas chemicznych: aryloamin, piperazyn, pirydazynon, sulfonamidów lub piperydyn. Dziesięć z nich wykazywało aktywność wobec patogena zlokalizowanego w komórkach Caco-2. Zaletą tych cząsteczek jest niska cytotoksyczność w stosunku do komórek Caco-2 i brak aktywności hemolitycznej wobec owczych czerwonych krwinek [50].
Duże zainteresowanie zyskało także stosowanie probiotyków jako środka zapobiegania lub zmniejszania częstości występowania infekcji Campylobacter u drobiu [82]. Obiecujące wyniki otrzymały zespoły Konkel i Jagusztyn-Krynickiej [47, 65]. Zaobserwowali oni, że podanie kurczętom szczepów z rodzaju Lactobacillus, tj. L. crispatus, L. salivarius, L. helveticus i L. gallinarum prowadzi do obniżenia poziomu kolonizacji jelit ślepych ptaków przez Campylobacter [47, 65]. Pałeczki kwasu mlekowego mogą zmniejszać poziom kolonizacji patogenów poprzez stymulację odporności adaptacyjnej, konkurowanie o niszę ekologiczną, koagregację oraz wytwarzanie hamujących metabolitów, takich jak kwasy organiczne czy bakteriocyny [47, 65]. Właściwości anty-Campylobacter wykazuje również Saccharomyces cerevisiae, który po podaniu broilerom per os, znacząco obniżał liczbę komórek patogena w jelicie ślepym, kale i na skórze. S. cerevisiae promował wzrost bakterii z rodzaju Lactobacillus oraz rywalizował z Campylobacter o substancje odżywcze i receptory umożliwiające adhezję do nabłonka jelit [26]. Przyczyną tak odmiennych wyników może być użycie linii kurzych o różnej wrażliwości na Campylobacter i probiotyki. Nie bez znaczenia jest również to, jaki szczep Campylobacter i jakiej wielkości inokulum zastosowano w eksperymencie kolonizacyjnym.
Immunizacja kurcząt
Chów drobiu przeznaczonego na mięso trwa około 42 dni. Z tego powodu kurczęta powinny być zaszczepione krótko po wykluciu, przed ich zetknięciem się z Campylobacter. Szczepionka powinna wywoływać odporność krzyżową przeciw C. jejuni i C. coli, być łatwa w podaniu (per os lub in ovo), tania w produkcji oraz bezpieczna dla zwierząt i ludzi. Znacznym utrudnieniem w osiągnięciu tego celu jest fragmentaryczna wiedza o funkcjonowaniu układu odpornościowego kurcząt oraz o wpływie humoralnej odpowiedzi na skuteczność immunizacji. Wyniki, nielicznych jak dotąd, doświadczeń są kontrowersyjne.
C. jejuni to zewnątrzkomórkowy patogen, choć może przeżyć wewnątrz komórek nabłonka jelitowego, jak również w komórkach układu odpornościowego, takich jak monocyty i makrofagi [37, 98]. Umożliwia to unikanie mechanizmów obronnych układu odpornościowego. Skuteczne przetrwanie wewnątrz komórki wiąże się również z umiejętnością przezwyciężenia stresów fizjologicznych, takich jak środowisko oksydacyjne generowane przez ludzkie jelito i przez nabłonek gospodarza lub komórki odpornościowe.
Ponieważ droga infekcji pałeczkami Campylobacter, niezależnie od gatunku gospodarza, to droga doustna, uważa się, że główną rolę w procesie ochronnym powinny odgrywać przeciwciała IgA obecne w śluzówce jelit. Ich rolę, jak również znaczenie limfocytów B, w odpowiedzi adaptacyjnej kurcząt przeciwko Campylobacter badali w 2017 roku Lacharme-Lora i wsp. [51]. Przeprowadzili oni bursektomię kurcząt (usunięcie torebki Fabrycjusza), w wyniku czego ptaki zostały pozbawione tej klasy limfocytów i, jak stwierdzono, nie produkowały wydzielniczych przeciwciał sIgA. Naukowcy wykazali, że limfocyty B nie odgrywają istotnej roli w redukcji kolonizacji jelita ślepego przez Campylobacter do 7 tygodnia ich życia. Natomiast badanie treści jelitowej ptaków po 9 tygodniach od zakażenia wykazało, że kolonizacja jelita ślepego u ptaków posiadających torebkę Fabrycjusza była mniejsza o ponad 2 log w porównaniu do grupy kurcząt, u których przeprowadzono bursektomię [51]. Wyniki powyższych badań pokazują, że wytwarzanie przeciwciał odgrywa rolę w ograniczaniu infekcji Campylobacter, jednak proces ten wymaga dłuższego czasu aniżeli czas życia komercyjnego kurczęcia (7 tygodni).
Jednocześnie badania przeprowadzone przez Humphrey’a i wsp. [40] wykazały, że znaczący wpływ na wynik zakażenia C. jejuni i odpowiedź immunologiczną ma rasa kurcząt. Cztery komercyjne rasy brojlerów wykorzystane w eksperymencie różniły się czasem trwania i rozmiarem reakcji zapalnych, czego efektem była kolonizacja bądź choroba z uszkodzeniem błony śluzowej jelita [40]. Zaobserwowano również, że nie wszystkie kurczęta tej samej rasy są kolonizowane przez pałeczki eneteropatogena na zbliżonym poziomie, a oporność wydaje się być genetycznie zdeterminowana. Connel i wsp. [18] przy wykorzystaniu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ptasiego genomu zidentyfikowali 219 genów wykazujących różny poziom ekspresji u kur opornych i u kur podatnych na kolonizację przewodu pokarmowego przez C. jejuni. Produkty tych genów biorą udział we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, przekazywaniu sygnałów przez cytokiny, aktywacji limfocytów B i komórek T oraz wytwarzaniu immunoglobulin [18].
Oprócz nikłej wiedzy dotyczącej funkcjonowania układu odpornościowego kurcząt przyczyną dotychczasowych niepowodzeń w opracowaniu szczepionki dla kurcząt jest również wspomniana wcześniej różnorodność genetyczna szczepów Campylobacter.
Bierna immunizacja
Bierna immunizacja polega na podaniu do uodparnianego organizmu surowicy odpornościowej. Hermans i wsp. [36] wykazali, że domięśniowa immunizacja sześciodniowych kurcząt przeciwciałami IgY otrzymanymi z żółtek jaj pochodzących od kur szczepionych lizatem C. jejuni prowadzi do obniżenia kolonizacji o cztery rzędy wielkości w porównaniu do grupy kontrolnej [36]. Dodatkowo zaobserwowano zmniejszoną transmisję Campylobacter do niezarażonych kurcząt. Natomiast w badaniach Paul i wsp. [71] immunizacja dodziobowa ptaków przeciwciałami IgY uzyskanymi z żółtek jaj kur niosek immunizowanych mieszanką 7 antygenów Campylobacter, tj. adhezyną Peb1A, lipoproteiną JlpA (Jejuni lipoprotein A), białkiem CadF wiążącym fibronektynę, podjednostką flageliny FlaA, MOMP (Major Outer Membrane Protein), FlpA oraz składnikiem pompy wielolekowej CmeC nie wykazała efektu ochronnego [71]. Rozbieżne wyniki potwierdzają obserwację, że efekt ochronny zależy od wielu czynników. W przytoczonych wyżej badaniach zastosowano m.in. inny schemat immunizacji oraz model kurzy.
Szczepionki całokomórkowe
Jak dotąd próby opracowania skutecznej szczepionki powstałej w oparciu o zabite komórki patogena, tzw. CWC, nie powiodły się. Jedną z przyczyn niepowodzenia jest wysoka zmienność genetyczna Campylobacter. Dotyczy ona głównie genów kodujących białka biorące udział w syntezie LOS (lipooligosaccharide), CPS (capsular polysaccharide), biogenezie rzęsek czy aparatu ruchu. Występowanie licznych wariantów strukturalnych CPS oraz LOS pozwala na aktywne unikanie działania układu odpornościowego gospodarza [19, 25, 30, 100]. Sekwencjonowanie szczepów C. jejuni NCTC11168, 33292 and 81–176 przed i po pasażu przez przewód pokarmowy broilerów wskazuje, że środowisko to sprzyja powstawaniu zmienności genetycznej C. jejuni. Takiej prawidłowości nie obserwowano po pasażu przez przewód żołądkowo-jelitowy myszy [100]. Rodzaj Campylobacter charakteryzuje „otwarty pangenom”. Oznacza to, że w każdym nowo zsekwencjonowanym genomie szczepów tego rodzaju identyfikowane są unikatowe geny. Porównanie materiału genetycznego 7 szczepów C. jejuni i C. coli wykazało, że geny podstawowe, a więc występujące w genomach wszystkich przedstawicieli rodzaju, stanowią jedynie 59% [60]. Konstrukcja szczepionki CWC dla drobiu wydaje się być dużym wyzwaniem również dlatego, że kurczęta w trakcie swojego życia wielokrotnie ulegają kolonizacji przez różne szczepy Campylobacter spp. [86].
Szczepionki podjednostkowe
Inna strategia zakłada wykorzystanie do immunizacji specyficznych oczyszczonych antygenów (z adiuwantem lub bez) lub dostarczanie ich do organizmu immunizowanego za pomocą odpowiednich nośników np. atenuowanego szczepu Salmonella enterica (sv. Typhimurium lub sv. Enteritidis), E. coli, Eimeria tenella lub nanocząstek. Szczepionki podjednostkowe uważane są za najbezpieczniejsze, lecz ich immunogenność w porównaniu do szczepionek zawierających całe komórki patogena, jest dużo niższa. Kluczową rolę w skuteczności szczepionki podjednostkowej odgrywa wybór antygenu. Potencjalny antygen powinien być rozpoznawany przez układ odpornościowy immunizowanego organizmu. Cechą niezbędną jest jego produkcja in vivo, gdy patogen oddziałuje z komórkami gospodarza. Poza tym antygen szczepionkowy powinien być silnie konserwowany w obrębie różnych serotypów/genotypów, co ma szczególnie duże znaczenie w sytuacji, gdy patogenny organizm cechuje wysoki poziom zmienności genetycznej.
Do tej pory do konstrukcji prototypów szczepionek anty-Campylobacter użyto m.in. podjednostkę flageliny FlaA (flagellin subunit protein A), główne białko błony zewnętrznej (MOMP), składnik pompy wielolekowej CmeC, lipoproteiny CjaA i CjaC, białko związane z peptydoglikanem CjaD, adhezynę PEB1, żelazowy receptor enterobaktyny CfrA (Campylobacter jejuni ferric-enterobactin receptor), dysmutazę ponadtlenkową SodB (Superoxide dismutase B) oraz białko wiążące DNA Dps (DNA binding protein from starved cells). Zastosowanie niezmodyfikowanego FlaA jako antygenu nie chroniło przed zakażaniem heterologicznymi szczepami. W przypadku FlaA-LTB (heat-labile enterotoxin B subunit), rCmeC, Dps SodB oraz FlaA w fuzji translacyjnej z domeną flageliny S. enterica aktywującą TLR5 (Toll-like receptor 5), indukowana odpowiedź immunologiczna (specyficzne wydzielnicze przeciwciała klasy sIgA w śluzie jelitowym oraz IgG w surowicy) zapewniała jedynie ograniczoną ochronę. Natomiast wyniki uzyskane po podaniu białka CjaA były wysoce zmienne, zależne od dawki preparatu, drogi podawania oraz schematu jego aplikacji [10, 16, 53, 92, 103] (Tab. I).
Prototypy szczepionek anty-Campylobacter
Antygen
Kurzy model badawczy
Schemat immunizacji
Adiuwant
Zakażenie Campylobacter
Protekcja
Źródło
Białka rekombinowane, nadprodukowane w systemie ekspresji E. coli
Tradycyjne techniki immunologii molekularnej do identyfikacji szczepionek są czaso- i pracochłonne. Szeroka gama technologii (m.in. STM – Signature-tagged transposon mutagenesis, GSH – Genomic subtractive hybridization, SCOTS – Selective capture of transcribed sequences, sekwencjonowanie całego genomu, badania transkryptomiczne, proteomiczne) w połączeniu z metodami bioinformatycznymi zrewolucjonizowało proces poszukiwania atrakcyjnych kandydatów do konstrukcji szczepionek. Technika IVIAT (in vivo-induced antigen technology) pozwala na przykład na identyfikację genów ulegających ekspresji in vivo, a więc podczas oddziaływania między gospodarzem i drobnoustrojem [77]. Kodowane przez nie białka mogą odgrywać ważną rolę w patogenezie w określonym układzie gospodarz-patogen, a ich potencjalny udział w wirulencji sprawia, że brane są również pod uwagę jako antygeny do opracowania szczepionek podjednostkowych czy jako markery diagnostyczne. Przeszukanie ekspresyjnej biblioteki genomowej (do stworzenia której wykorzystano DNA zsekwencjonowanego szczepu C. jejuni NCTC11168) za pomocą ludzkiej surowicy od rekonwalescentów, wysyconej dodatkowo białkami szczepu Campylobacter hodowanego w warunkach laboratoryjnych, doprowadziło do zidentyfikowania 24 genów. Ich produkty pełnią różne funkcje metaboliczne (m.in. leuC, ptmB, eno i fcl), są zaangażowane w procesy biosyntezy (m.in. tufB) czy procesowanie informacji genetycznej. Dwa geny wykryte w tym eksperymencie (cj1471c oraz cj1587c) biorą udział w transporcie aminokwasów [39]. Podobna analiza została przeprowadzona z wykorzystaniem surowicy od kurcząt wysyconej białkami szczepu Campylobacter hodowanego in vitro [38]. Ten schemat postępowania doprowadził do identyfikacji 28 genów, z których jedynie pięć ulega ekspresji in vivo w obu gospodarzach, co jest prawdopodobnie wynikiem zupełnie innego przebiegu infekcji u ludzi i kurcząt. Zwraca uwagę fakt, że wśród wyróżnionej puli genów nie ma tych kodujących białka wykorzystane do konstrukcji prototypów szczepionek podjednostkowych (cjaA, peb1, dps). Analiza ta nie wykryła również genów takich jak cadF, ciaB, pldA, których unieczynnienie bezsprzecznie, jak wykazano w innych laboratoriach, obniża zdolność mikroorganizmu do kolonizacji.
Zastosowana po raz pierwszy w badaniach nad szczepionką przeciwko menigokokom grupy B „odwrotna wakcynologia” (reverse vaccinology) umożliwia identyfikację antygenów szczepionkowych in silico. Strategię taką zastosowali Meunier i wsp. [62]. W genomie C. jejuni 81176 poszukiwali genów kodujących białka zlokalizowane na powierzchni komórki o potencjalnych właściwościach adhezyjnych. Następnie analizowali antygenowość wybranych w ten sposób 22 białek i obecność epitopów w ich sekwencjach aminokwasowych (VaxiJen, BCPreds). Zwraca uwagę w tej grupie znaczący udział białek związanych z aparatem ruchu Campylobacter [62].
Spośród przetestowanych na brojlerach sześciu białek, cztery zmniejszyły liczbę Campylobacter w stolcu nawet o cztery rzędy wielkości z jednoczesnym rozwojem humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Natomiast w drugim badaniu, pomimo zaindukowania silnej odpowiedzi immunologicznej, nie zaobserwowano protekcji u kurcząt [63].
Trzeba jednak pamiętać, że nie zawsze geny wskazywane metodami bioinformatycznymi/ mikromacierzy kodują białka istotne w indukcji ochronnej odpowiedzi immunologicznej.
Ciekawą strategią mającą na celu przezwyciężenie problemu wysokiej różnorodności genetycznej szczepów Campylobacter, a także zwiększenie efektywności immunizacji, było zastosowanie hybrydowych białek zawierających epitopy różnych antygenów. Prowadzone aktualnie porównawcze analizy genomów oraz proteomów wielu szczepów mają na celu poszukiwanie nowych antygenów Campylobacter przydatnych do konstrukcji szczepionki lub białek potencjalnie z możliwością wykorzystania jako celów nowych leków. W ostatnich latach nastąpił znaczny rozwój narzędzi umożliwiających wydajną analizę in silico. Badania immunoinformatyczne proteomu Campylobacter przeprowadzone w 2017 roku doprowadziły do identyfikacji kilku epitopów, które są konserwowane, prezentowane przez cząsteczki MHC-I i potencjalnie mogą zostać wykorzystane w opracowywaniu szczepionki chroniącej przed kampylobakteriozą [42, 59]. Ich użyteczność musi zostać jednak potwierdzona eksperymentalnie.
Wybór nośnika
Na skuteczność szczepionki, oprócz wyboru antygenów, ma wpływ także wybór nośnika. W tym charakterze stosowane są m.in. atenuowane szczepy różnych mikroorganizmów patogennych, VLPs (Virus Like Particles), wirusów, bakterie komensalne z grupy LAB (Lactic Acid Bacteria) lub też liposomy. Szczepionki podjednostkowe skonstruowane w oparciu o atenuowane szczepy patogenów mają wiele zalet: (1) silnie stymulują odpowiedź humoralną i/lub komórkową nie tylko przeciwko homologicznym antygenom, ale również przenoszonym antygenom heterologicznym, (2) możliwe są różne drogi podania (droga wziewna, donosowa, doustna, dooczna, dopochwowa, doodbytnicza), (3) podane na jeden z wymienionych sposobów indukują mechanizmy odpornościowe związane z błonami śluzowymi jak i ogólnoustrojową odpowiedź immunologiczną, (4) są łatwe i tanie w produkcji, (5) istnieje możliwość ich liofilizacji i przechowywania w temperaturze pokojowej. Przede wszystkim jednak atenuowane patogeny jelitowe przeżywają w środowisku układu pokarmowego zawierającym m.in. różne proteazy, defensyny, lizozym, a zatem są zdolne do ochrony przenoszonego heterologicznego antygenu.
Jako nośnik genów Campylobacter wykorzystywano na przykład żywe, atenuowane szczepy S. enterica sv. Enteritidis lub Typhimurium [34]. W ostatnich latach opracowano szereg ciekawych rozwiązań, m.in. regulowana opóźniona atenuacja, opóźniona synteza antygenu oraz regulowana opóźniona liza, które poprzez zwiększenie zdolności do przetrwania patogena w środowisku gospodarza, umożliwiają wywołanie optymalnej odpowiedzi immunologicznej. Atenuowane szczepy Salmonella były badane jako nośniki antygenów Campylobacter w immunoprofilaktyce kurcząt przez kilka grup badawczych [10, 53, 57, 103, 104]. W kilku eksperymentach stosowano wspomniane wcześniej antygeny CjaA i CjaD. Pomimo użycia tego samego antygenu, poziomy redukcji kolonizacji w eksperymentach ochronnych prowadzonych przez różne grupy badawcze, różniły się diametralnie (od 6 log10 do braku ochrony przed zakażeniem). Trudno wskazać przyczynę tak odmiennych wyników, jako że eksperymenty różniły się m.in. schematem immunizacji, użytym do zakażenia szczepem Campylobacter, rasą kurcząt wykorzystanych w eksperymencie ochronnym, serowarem i rodzajem atenuacji nośnikowego szczepu Salmonella oraz obecnością adiuwantu. Antygen CjaA stosowano także w konstrukcji szczepionki z wykorzystaniem E. tenella jako nośnika. Szczepionka podana dodziobowo skutkowała nieznacznie obniżonym poziomem kolonizacji [16].
Do przenoszenia obcych antygenów w procesie immunizacji wykorzystywane są również bakterie kwasu mlekowego (LAB). Jest to sztucznie wyodrębniona grupa o olbrzymiej różnorodności genetycznej oraz filogenetycznej, której cechą charakterystyczną jest zdolność do produkcji kwasu mlekowego. Dotychczas przeprowadzone badania wskazują, że podanie takich szczepów prowadzi do indukcji odpowiedzi immunologicznej zarówno w błonach śluzowych (sIgA), jak i ogólnoustrojowej reakcji układu odpornościowego przeciwko eksprymowanym heterologicznym antygenom, przy jednoczesnej niskiej odpowiedzi skierowanej przeciwko antygenom szczepu nośnikowego. Jako wektory szczepionkowe posiadają także inne zalety. Umożliwiając immunizację drogą śluzówkową zapewniają większą skuteczność walki z patogenami, dla których to właśnie śluzówka stanowi wrota infekcji. O atrakcyjności bakterii kwasu mlekowego w immunoprofilaktyce lub terapii decyduje również ich oporność na działanie niskiego pH soku żołądkowego oraz zdolność adhezji do komórek nabłonka jelitowego. Kluczową kwestią jest też bezpieczeństwo tych preparatów. Bakterie te (m.in. gatunki należące do rodzajów Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc) posiadają status GRAS, a część z nich zaliczamy do probiotyków, czyli organizmów, których krótkotrwała obecność lub kolonizacja wywiera pozytywny wpływ na wiele elementów fizjologii organizmu gospodarza. Niewątpliwą zaletą są również niskie koszty produkcji tego typu szczepionek oraz możliwość liofilizacji i przechowywania preparatu w temperaturze pokojowej [102].
Jak dotąd, spośród przedstawicieli bakterii z grupy LAB, jako nośnik antygenów Campylobacter wykorzystano szczep Lactococcus lactis. Szczep L. lactis prezentujący na powierzchni rCjaAD wykazywał wyższy efekt ochronny niż szczep L. lactis wytwarzający białko zlokalizowane w cytoplazmie oraz od szczepu L. lactis prezentującego na powierzchni CjaA, jednak różnice te nie były istotne statystycznie; poziom kolonizacji obniżył się jedynie o 1 rząd wielkości [46].
W roli nośników antygenów Campylobacter testowano także cząstki GEM (Gram-positive Enhancer Matrix) uzyskane z komórek L. salivarius. Struktury te zawierają wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP, Pathogen Associated Molecular Patterns), przez co zdolne są do indukowania procesów prozapalnych, a więc mogą wzmocnić działanie immunoterapeutyczne [3, 7]. Dodatkowo nie zawierają one rekombinowanego DNA. Cecha ta bywa wyraźnie podkreślana przez przeciwników stosowania, w różnych dziedzinach życia, GMO (Genetically Modified Organism). Jednak cząstki GEM stosunkowo szybko są usuwane z organizmu gospodarza, przez co indukcja odpowiedzi immunologicznej może wymagać skomplikowanych schematów szczepień, kilkukrotnego podawania preparatu [7].
Szczepionka składająca się z cząstek GEM L. salivarius prezentujących na powierzchni CjaA i CjaD, podana kurczętom podskórnie lub per os, nie prowadziła do obniżenia kolonizacji jelit kurcząt. Natomiast cząstki GEM L. salivarius prezentujące rCjaAD podane in ovo do zarodka kury w niewielkim stopniu obniżyły poziom kolonizacji jelita ptaków przez pałeczki Campylobacter w porównaniu do grupy kontrolnej [46].
Annamalai i wsp. jako nośnik antygenów Campylobacter użyli biodegradowalnych i biokompatybilnych nanocząstek – kopolimeru laktydu z glikolidem. Zarówno białka błony zewnętrznej zamknięte w nanocząstkach jak i same białka błony zewnętrznej podane kurczętom podskórnie znacząco obniżały poziom kolonizacji jelit ślepych przez pałeczki patogena [2].
Atrakcyjnymi nośnikami antygenów szczepionkowych są liposomy. Ich przydatność do celów immunizacyjnych po raz pierwszy opisali Allison i Gregoriadis w 1974 roku [97]. Zaletą liposomów – dwuwarstwowych pęcherzyków złożonych z amfipatycznych fosfolipidów, jest wydłużenie czasu uwalniania antygenu z ich wnętrza, ochrona antygenu przed nadmierną proteolizą i ułatwienie wchłaniania przez komórki prezentujące antygen (APC, Antigen-Presenting Cells) [96, 97], co prowadzi do stymulacji odpowiedzi immunologicznej nie tylko typu humoralnego, lecz także typu komórkowego [84]. Poza tym mogą być one produkowane na dużą skalę, przechowywane przez stosunkowo długi czas i, co najważniejsze, są uznane za bezpieczne i dobrze tolerowane przez organizm [78, 97]. Jak dotąd przeprowadzone nieliczne badania wskazują, że liposomy mogą być z powodzeniem stosowane do stymulacji układu odpornościowego kurcząt [15, 55, 105].
Obiecujące wyniki otrzymano w eksperymencie protekcyjnym, w którym wykorzystano liposomy wykorzystane do przeniesienia hybrydowego białka rCjaAD [46]. U ptaków immunizowanych in ovo zaobserwowano obniżenie kolonizacji o dwa rzędy wielkości w stosunku do grupy kontrolnej. Zwraca jednak uwagę fakt, że w jelitach połowy kurcząt kolonizacja był na poziomie niewykrywalnym zastosowaną metodą, czyli poniżej 1000 jtk/g zawartości jelita. Wyższy poziom protekcji warunkowany przez liposomy może sugerować lepszą ochronę antygenu przed degradacją, jak również większą wydajność pobierania przez komórki prezentujące antygen. Jednocześnie może być to pozytywny efekt wczesnej modulacji systemu immunologicznego, co ma szczególne znaczenie w przypadku brojlerów, których długość życia nie przekracza 8 tygodni
Powierzchnia komórek Campylobacter bogata jest w glikozylowane białka. Mikroorganizmy te przeprowadzają dwa rodzaje procesu glikozylacji: N-glikozylację i O-glikozylację [90]. Dotychczasowe szczegółowe badania szlaku N-glikozylacji białek w komórkach C. jejuni wskazują, że glikoproteiny są silnie immunogennym czynnikiem biorącym udział w kolonizacji jelit kurcząt oraz w procesach adhezji i inwazji do ludzkich komórek nabłonka jelit [68]. N-glikan, konstytutywnie produkowany heptasacharyd, obecny jest we wszystkich izolatach C. jejuni i C. coli. Poznanie poszczególnych etapów syntezy glikanu, jego transportu oraz przyłączania do białek, umożliwia aktualnie jego zastosowanie w procesach biotechnologicznych [90, 91, 95]. Geny C. jejuni warunkujące procesy N-glikozylacji (pgl, protein glycosylation) sklonowane zostały na plazmidzie i wprowadzone do komórek E. coli, co nadało im zdolność glikozylowania białek zawierających odpowiednie motywy [68, 95]. Nothaft i wsp. skonstruowali prototypy szczepionek w oparciu o glikoproteiny [68]. Zastosowali oni dwie strategie. W pierwszej z nich, użyli rekombinowanej, nieaktywnej toksyny ToxC Clostridium diphtheriae zawierającej dziewięć powtórzeń sekwencji aminokwasowej wiążącej glikan. Do ekspresji rekombinowanej proteiny wykorzystali szczep E. coli kodujący białka szlaku glikozylacji C. jejuni. N-glikozylowana toksyna C została podana kurczętom na drodze iniekcji. Skuteczność tego prototypu szczepionki zależna była od zastosowanego schematu immunizacji. W drugiej strategii naukowcy przyłączyli heptasacharyd do zewnętrznego rdzenia lipopolisacharydu (LPS) E. coli K12, szczepu niezdolnego do produkcji antygenu O. Żywe bądź inaktywowane komórki E. coli prezentujące na powierzchni N-glikan C. jejuni podawano ptakom dodziobowo. Obie szczepionki indukowały produkcję przeciwciał typu IgY rozpoznajacych N-glikan, a co najważniejsze u immunizowanych ptaków zaobserwowano obniżenie kolonizacji jelit przez Campylobacter nawet o 8 rzędów wielkości. Szczepionka bazująca na żywych komórkach E. coli była bardziej skuteczna a jej podanie nie wpływało na zmianę składu kurzego mikrobiomu. Podanie wraz ze szczepionką szczepu probiotycznego (Anaerosporobacter mobilis lub L. reuteri) dodatkowo zwiększało jej skuteczność [69]. Należy zaznaczyć, że w wyżej wymienionych doświadczeniach wykorzystano kurczęta SPF (Specific Pathogen Free), pozbawione przeciwciał matczynych anty-Campylobacter, dlatego też powinny one zostać powtórzone z wykorzystaniem brojlerów. Jako nośnika N-glikanu użyto także pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV, Outer Membrane Vesicles). Prototyp szczepionki składający się z tzw. geOMV (glycoengineered Outer Membrane Vesicles), produkowanych w E. coli, podawany per os, także skutkował wysokim obniżeniem poziomu kolonizacji jelit kurcząt przez Campylobacter sp. [74].
Modulacja odpowiedzi immunologicznej
Szczepionki podjednostkowe, zarówno zawierające oczyszczone białka jak i te zawierające polisacharydy otoczkowe, dla zaindukowania wysokiego poziomu odpowiedzi odpowiedniej gałęzi układu odpornościowego wymagają stosowania odpowiednich adiuwantów. Elementem szczepionki, który nie tylko dostarcza antygen w odpowiednie miejsce, ale także może wzmocnić/ ukierunkować odpowiedź immunologiczną organizmu, są nośniki. W immunoprofilaktyce kurcząt najczęściej stosowanymi immunostymulatorami są sole glinu oraz emulsje olejowe. W szczepionkach anty-Campylobacter przeznaczonych dla drobiu jak dotąd testowano tylko kilka adiuwantów: kompletny i niekompletny adiuwant Freunda, Addavax™ (skwalen), modyfikowana toksyna LT E. coli, Montanide ISA 70 VG (emulsja wodno-olejowa) oraz TiterMax Gold (emulsja wodno-olejowa). Pogłębiająca się wiedza dotycząca funkcjonowania układu odpornościowego, głównie aktywności receptorów TLR (Toll-like receptors) oraz mechanizmu działania cytokin, pozwoli na wprowadzenie do praktyki adiuwantów takich jak: CpG – ODN (CpG oligodeoxinucleotides), modyfikowane toksyny, cytokiny czy nanocząstki. Różne objawy infekcji Campylobacter u ludzi i kurcząt sugerują konieczność zastosowania innych adiuwantów w szczepionkach przeznaczonych dla tych dwóch grup docelowych.
Receptory TLR to eukariotyczne białka rozpoznające tzw. wzorce molekularne komórek bakteryjnych (MAMP, Microbe-Associated Molecular Patterns). W większości są to białka transmembranowe, choć niektóre z nich zlokalizowane są w błonach organelli wewnątrz komórek eukariotycznych. Ligandy rozpoznawane przez receptory TLR – lipopolisacharyd, flagelina, lipoproteiny, DNA czy RNA, stanowią kryterium ich podziału. Stymulacja receptora skutkuje uruchomieniem, z wykorzystaniem białek adaptorowych, szlaków przekazywania sygnałów. Skutkiem tych procesów jest indukcja ekspresji genów kodujących czynniki transkrypcyjne a co za tym idzie indukcja ekspresji wielu elementów zarówno wrodzonej jak i nabytej odpowiedzi immunologicznej, wytwarzania wielu cytokin oraz antybakteryjnych peptydów (AMP) [48]. Stymulacja aktywności receptorów TLR przez komponenty szczepionek jest ostatnio obiektem wielu badań. Analizy genomów ludzi i kur wykazały wiele podobieństw ale i różnic dotyczących receptorów TLR. U ludzi zidentyfikowano 10 rodzajów receptorów (hTR1-hTLR10). W genomach kur osiem z nich ma swoje homologi, brak jest TLR9, TLR8 jest nieaktywny, zaś TLR2 występuje w dwu izoformach. Dodatkowymi receptorami TLR, typowymi dla ptaków, są TLR15 oraz TLR21 [8, 27]. Kurzy receptor TLR21 rozpoznający DNA jest odpowiednikiem hTLR9. Stymulacja ptasich TLR21 za pomocą CpG – ODN (CpG – oligodeoxynucleotide) stymuluje głównie typ odpowiedzi Th-1. Choć C. jejuni oddziałuje z kilkoma ludzkimi receptorami TLR w podobny sposób jak z kurzymi, to chromosomowy DNA Campylobacter stymuluje jedynie chTLR21 a nie ludzki hTLR9. Różnice w odpowiedzi ludzkich i kurzych receptorów na kontakt z C. jejuni mogą być jednym z czynników odpowiedzialnych za różny przebieg infekcji [9, 70]. Flagelina Campylobacter będąca silnie immunogennym białkiem, często badana jako składnik prototypów podjednostkowych szczepionek, nie stymuluje receptorów TLR5. W celu modulowania odpowiedzi skonstruowano fuzyjne białko, połączenie flageliny Campylobacter z fragmentem flageliny Salmonella Enteritidis odpowiedzialnym za reakcje z receptorem TLR5. Otrzymany konstrukt przebadano na modelu kurzym. Uzyskano podwyższony poziom specyficznych IgY w surowicy, ale nie IgA w błonach śluzowych [75].
Coraz częściej stosowanymi adiuwantami w prototypach szczepionek są cytokiny o różnych aktywnościach. Ich użycie nie tylko wzmacnia ale także może ukierunkować odpowiedź immunologiczną [83]. W ostatnich latach badano mechanizm działania kilku ptasich cytokin (chIL-2, chIL-6, chIL-10 czy chIL-12) oraz ich efekt adiuwantowy w odniesieniu do kilku prototypów szczepionek, głównie przeciwko chorobom wirusowym. Ze względu na stosunkowo krótki czas przetrwania cytokin w organizmie uodparnianym są one najczęściej podawane w formie DNA (gen kodujący cytokinę sklonowany na plazmidzie pod kontrolą promotora eukariotycznego [14, 20, 89]. Przypuszczalnie cytokiny, dostarczane przy użyciu różnych nośników np. atenuowananych mikroorganizmów, bakterii kwasu mlekowego – LAB, liposomów czy nanocząstek) także znajdą zastosowanie w szczepionkach anty-Campylobacter.
Droga podania antygenu
Droga podania preparatu szczepionkowego to jeden z czynników determinujących poziom odpowiedzi immunologicznej i skuteczność immunizacji. Najczęściej badanymi drogami podania szczepionki jest iniekcja oraz per os. Na drodze iniekcji podawane są oczyszczone, natywne lub rekombinowane białka (SodB, Dps, CmeC, CjaA). Warto wspomnieć, że aplikowane są one często w obecności adiuwantów, czyli substancji wzmacniających odpowiedź immunologiczną tj. Montanid ISA 70VG, TiterMax Gold czy też kompletny adiuwant Freunda.
Podanie antygenu per os umożliwia indukcję śluzówkowego układu odpornościowego przewodu pokarmowego, czyli drogi wnikania organizmu patogennego. Dodatkowo immunizacja dodziobowa jest najkorzystniejszą ekonomicznie formą aplikacji szczepionek (podana w pożywieniu lub w wodzie do picia). Co więcej, użycie szczepów kolonizujących przewód pokarmowy ptaków jako nośników białek immunogennych Campylobacter wydłuża czas ekspozycji organizmu na antygen, co zwiększa szansę wystąpienia skutecznej odpowiedzi immunologicznej.
W badaniach Nothaft i wsp. zaobserwowali zbliżony poziom protekcji u kurcząt, które otrzymały podskórnie N-glikozylowaną nieaktywną ToxC C. diptheria lub dodziobowo żywe komórki E. coli prezentujące na powierzchni N-glikan Campylobacter [68]. Wyniki badań Annamalai i wsp. wskazały natomiast na wyższą skuteczność immunizacji podskórnej w zwalczaniu infekcji jelitowej Campylobacter. Szczepionka powstała w oparciu o białka błony zewnętrznej aplikowana na drodze iniekcji skutkowała obniżonym poziomem kolonizacji jelit ślepych przez pałeczki patogena. Natomiast u kurcząt, które ten sam prototyp szczepionki otrzymały dodziobowo nie zaobserwowano protekcji [2].
Obiecującą drogą podania antygenu jest immunizacja in ovo. Opracowana w latach 90. XX wieku technologia in ovo polega na podaniu antygenów do płynu owodniowego lub bezpośrednio do rozwijającego się zarodka. Immunizacja kurcząt in ovo od dawna jest szeroko stosowana przez przemysł drobiarski w zapobieganiu chorobom wirusowym [66]. Ten sposób aplikacji wykorzystano m.in. w przypadku szczepionki przeciwko chorobie Mareka, nowotworowej chorobie ptaków wywoływanej przez wirusy z rodziny Herpesviridae. Okazało się, że po podaniu szczepionki in ovo znacznie szybciej dochodzi do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej chroniącej ptaki przed zakażeniem [72].
Proces rearanżacji genów immunoglobulin u ptaków występuje tylko raz podczas rozwoju embrionalnego i jest znany jako somatyczna konwersja genów. U kurcząt prekursory limfocytów B wytwarzających przeciwciała (Prebursal Stem Cells) są syntetyzowane między 8 a 14 dniem embriogenezy, a następnie zasiedlają torebkę Fabrycjusza, gdzie są poddawane różnicowaniu i klonowaniu. Dlatego podawanie szczepionki in ovo w czasie, gdy następuje rozwój komórek prekursorowych limfocytów ma swoje uzasadnienie. Dodatkowe zalety tej drogi immunizacji to zmniejszenie stresu w porównaniu z tradycyjnym szczepieniem oraz możliwość automatyzacji procesu szczepienia [94]. Szczepienie in ovo może być dodatkowo połączone z dawką przypominającą podaną dopiero po wykluciu kurcząt
W badaniach Radomska i wsp. [75] u kurcząt, którym in ovo podano białko NHC (białko fuzyjne zawierające flagelinę C. jejuni i domenę flageliny S. Typhimurium aktywującą TLR) nie zaobserwowano efektu ochronnego. Odmienne wyniki otrzymała grupa badawcza Jagusztyn-Krynickiej. Prototypy szczepionek powstałe w oparciu o liposomy zawierające immunogenne białko lub pęcherzyki błony zewnętrznej podane in ovo znacząco obniżały poziom kolonizacji jelit ślepych przez pałeczki Campylobacter [28, 47].
Podsumowanie
Wyniki otrzymane przez wiele grup badawczych pracujących nad konstrukcją szczepionek są trudne bądź nawet niemożliwe do porównania w związku z wieloma zmiennymi tj. wybrany antygen, schemat i droga immunizacji, zastosowanie adiuwantu czy szczep C. jejuni oraz jego dawka użyta w eksperymencie protekcyjnym. Dodatkowo postęp w technikach sekwencjonowania kurzych genomów zwrócił uwagę na istotne różnice genetyczne ras drobiu, które mogą mieć wpływ na funkcjonowanie ich układu odpornościowego oraz mechanizmy warunkujące kolonizację przewodu pokarmowego przez pałeczki Campylobacter.
Również różnorodność genetyczna szczepów Campylobacter hamuje rozwój skutecznej szczepionki. Wymagania skutecznej immunizacji mogą spełnić jedynie schematy szczepień uwzględniające tę różnorodność i złożoność antygenową. Można to osiągnąć albo poprzez wieloantygenowy skład szczepionki, albo przez zastosowanie różnych antygenów w kolejnych immunizacjach. Jednocześnie konieczne są strategie mające na celu wzmocnienie/modulację odpowiedzi immunologicznej kurcząt.
Nie ma wątpliwości, że antygen, obecność adiuwantu jak i wybór nośnika i droga immunizacji muszą być brane pod uwagę w procesie konstruowania skutecznej szczepionki. Trudno jednak przewidzieć, która z zastosowanych strategii przyniesie najlepsze rezultaty.
