Role of endocrine factors and stem cells in skeletal muscle regeneration

Mięśnie szkieletowe zbudowane są z wielojądrzastych, wrzecionowatych komórek. U osób młodych 5–7% jąder związanych z jedną komórką mięśniową należy do komórek satelitowych (satellite cells, SCs) położonych w niszy między sarkolemmą a błoną podstawną. W okresie intensywnego wzrostu liczba SCs w mięśniach jest wysoka, jednak ulega szybkiemu obniżeniu w następstwie starzenia się [51].

W nieuszkodzonych mięśniach SCs nie dzielą się (quiescent state), ale zachowują zdolność do replikacji DNA i podziałów mitotycznych. W wyniku uszkodzenia SCs są aktywowane, dzielą się i różnicują w mioblasty. Następnie mioblasty w wyniku fuzji są włączane do istniejących włókien lub tworzą de novo wielojądrowe miotuby i włókna mięśniowe. Fuzja mioblastów jest jednym z głównych etapów regeneracji, w trakcie którego komórki wykazują ekspresję szeregu białek, m.in. insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (insulin-like growth factor, IGF-1) i białek adhezyjnych zaangażowanych w tworzenie połączeń między mioblastami (tab.1). Proces osiąga apogeum w ciągu 4–5 dni od uszkodzenia. W skrajnych przypadkach, tj. rozległego uszkodzenia mięśnia i ostrego stanu zapalnego, regeneracja może być wspomagana przez komórki niemięśniowe, takie jak rezydujące w mięśniach komórki interstycjalne (interstitial cells, PICs), obecne we krwi komórki hematopoetyczne lub związane z naczyniami krwionośnymi komórki macierzyste o fenotypie CD133+ [6, 21, 103].

Odbudowa mięśni szkieletowych jest bardzo zsynchronizowanym procesem, kontrolowanym przez mechanizmy obejmujące interakcje komórka <−> komórka i komórka <−> środowisko zewnątrzkomórkowe. W mechanizmach tych uczestniczą cytokiny pro- i przeciwzapalne (IL-1β, -1ra, -6, -8, -10, 12, -15, -18 i TNF-α) oraz czynniki wzrostu (tab. 1) uwalniane w ciągu kilku godzin przez komórki mięśniowe i satelitowe oraz obecne w tkance mięśniowej komórki immunologiczne, nabłonkowe, śródmiąższowe i in. Badania potwierdziły także istotny wpływ androgenów na procesy regulacji aktywności SCs. Wymienione grupy cząsteczek, łącząc się z odpowiednim receptorem wykazują różną aktywność, tzn. jedne silnie stymulują proliferację i wzrost komórek mięśniowych, inne mogą hamować [87, 104]. Celem pracy jest przedstawienie aktualnych informacji na temat molekularnych i komórkowych mechanizmów regeneracji mięśni szkieletowych, roli testosteronu i czynników wzrostu w aktywacji SCs oraz możliwości ich terapeutycznego wykorzystania w stymulacji odbudowy uszkodzonych włókien mięśniowych.

Mięśnie szkieletowe mają niezwykłą zdolność do regeneracji i szybkiej naprawy dzięki obecności w tkance mięśniowej SCs. Pozostają w stanie spoczynku do chwili zadziałania bodźca (uszkodzenie włókna mięśniowego), który rozpoczyna wiele procesów prowadzących do odbudowy mięśni. Aktywowane SCs wznawiają cykl komórkowy, dzielą się, następnie różnicują w mioblasty i ostatecznie łączą się z istniejącym włóknem mięśniowym lub formują nowe włókna [33, 56]. Z wiekiem liczba SCs obniża się, tzn. w wieku 20–30 lat SCs stanowią 4–5%, natomiast w wieku 60–80 lat tylko 1% cał-kowitej liczby jąder komórkowych związanych z jedną komórką mięśniową [77]. Według Mackeya i wsp. [51] około 1,3% komórek satelitowych jest mitotycznie aktywnych, ale pod wpływem aktywności fizycznej ich liczba wzrasta wielokrotnie w każdym wieku u osób zdrowych, a także u pacjentów cierpiących na choroby, którym towarzyszy stopniowe osłabienie i zanik mięśni szkieletowych (tab. 2).

Komórki satelitowe obecne w dojrzałych mięśniach szkieletowych charakteryzują się ekspresją czynników transkrypcyjnych z rodziny MRF (myogenic regulatory factor) - MyoD, Myf5, Myf4, miogenina i SOXF (SOX gene family) oraz rodziny Pax (paired box protein) - Pax3 i Pax7 (ryc.1). Wśród dziewięciu białek Pax, główną rolę w procesach miogenezy odgrywają białka Pax3 i Pax7 promując aktywację miogenicznych komórek progenitorowych i zapobiegając różnicowaniu niemiogenicznemu. Obecność czynnika Pax3 stwierdza się podczas rozwoju zarodkowego, natomiast obecność czynnika Pax7 i Myf5 (komórki Pax7+/Myf5+) jest charakterystyczna dla dojrzałych komórek satelitowych w stanie spoczynku, tzw. uśpienia (quiescent). W chwili aktywacji i proliferacji komórek satelitowych stop-niowo zanika ekspresja Pax7 i Myf5 i zwiększona synteza MyoD. Następnie różnicowaniu i fuzji mioblastów oraz tworzeniu nowych miotub towarzyszy ekspresja miogeniny i Myf4. Nie wszystkie SCs różnicują w kierunku włókien mięśniowych, część komórek wykazujących ekspresję Pax7 przy braku ekspresji Myf5 (komórki Pax7+/Myf5−) odtwarza pulę komórek satelitowych [5, 6, 56, 83, 87].

Ryc. 1

Odbudowa włókien mięśniowych nie zawsze przebiega w sposób prawidłowy. Zaburzenia regeneracji mięśni szkieletowych obserwuje się u pacjentów cierpiących na choroby mięśniowe, takie jak dystrofie mięśniowe, rdzeniowy zanik mięśni, choroby nowotworowe lub przewlekła niewydolność nerek, które objawiają się stopniowym osłabieniem i zanikiem mięśni szkieletowych. Analiza proteomiczna ścieżek sygnalizacyjnych obejmujących wymienione czynniki transkrypcyjne dostarcza potencjalnych biomarkerów charakteryzujących się większą swoistością i czułością w porównaniu z dotychczas stosowanymi markerami białkowymi, np. kinaza kreatynowa, troponina, mioglobina czy miostatyna stosowanymi w diagnostyce chorób degeneracyjnych mięśni szkieletowych. Porówanie profili proteomicznych osób zdrowych i chorych, umożliwi w przyszłości wykrywanie zmian patologicznych tkanki mięśniowej, ujawniających się na poziomie komórkowym, przed wystąpieniem zmian klinicznych [30, 73, 102].

Testosteron (T) jest hormonem steroidowym wytwarzanym głównie przez komórki Leydiga (5–7 mg na dobę). Około 98% krążącego we krwi testosteronu występuje w postaci związanej z białkami, jedynie 1–2% to wolny – biologicznie aktywny testosteron. Bezpośredni wpływ na stężenie testosteronu, zarówno u kobiet jak i u mężczyzn, mają zmiany stężenia beta-globuliny osocza wiążącej hormony płciowe (sex hormone-binding globulin, SHBG). T niezwiązany z SHBG nazywany jest testosteronem biodostępnym [47, 63, 84]; wpływa na mięśnie szkieletowe aktywując wewnątrzkomórkowy receptor androgenowy (androgen receptor, AR), który pełni funkcję czynnika transkrypcyjnego (ryc. 2). W nieobecności testosteronu, AR jest związany z czaperonem Hsp90 (heat shock protein 90). Aktywowany AR wiąże się do sekwencji DNA zwanej elementem odpowiedzi hormonalnej HRE (hormone response element) inicjując ekspresję mięśniowej izoformy czynnika IGF-1Ec, który nasila syntezę białka i stymuluje procesy naprawcze, reguluje gospodarkę węglowodanowo-lipidową, przyspiesza wzrost komórki oraz hamuje apoptozę. AR zwiększa także ekspresję miogennych czynników regulatorowych MRF kontrolujących proces różnicowania mioblastów i dojrzewanie miotub. Białka MRF tworzą z innymi czynnikami transkrypcyjnymi kompleksy, które uruchamiają syntezę wielu białek mięśniowych, takich jak desmina, lekkie i ciężkie łańcuchy miozyny, kinaza kreatynowa, receptor acetylocholiny i in. Aktywowany AR osłabia ekspresję miostatyny, która jest negatywnym regulatorem proliferacji SCs oraz hamuje ekspresję FoxO3 (forkhead box protein O3) należącego do rodziny czynników transkrypcyjnych FOXO katabolicznych (forkhead box-containing). Ponadto T reguluje stosunek liczby włókien szybko- (MHC-IIa i MHC-IIx) do wolnokurczących się (MHC-I), w zależności od ekspresji AR w komórkach satelitowych [48, 57, 74]. Englund i wsp. [28] wykazali niedawno, że działanie genomowe i niegenomowe testosteronu w obrębie tkanki mięśniowej jest wystarczające do wywołania wzrostu mięśni szkieletowych i nie wymaga zwiększenia liczby SCs. Autorzy wskazują nowe możliwości terapeutyczne T wspomagajace regenerację mięśni szkieletowych, zwłaszcza przy obniżonej liczbie SCs obserwowanej w starzejących się mięśniach [28]. Obniżenie stężenia T z wiekiem osłabia aktywność transkrypcyjną miogennych czynników regulatorowych oraz nasila ekspresję miostatyny, co zaburza funk-cję mięśni szkieletowych u osób starszych [48, 57, 74].

Ryc. 2

Silnym czynnikiem oddziaływającym na syntezę i zmiany stężenia wolnego T we krwi jest czas wykonywanego wysiłku fizycznego. Największe zmiany obserwowano przy wysiłkach fizycznych trwających 1–3 godzin. Natomiast obniżenie stężenia T następowało, gdy wysiłek fizyczny trwał powyżej 3 godzin (tab. 3). W czasie jednorazowego wysiłku fizycznego wyższy wzrost steżenia T wykazano we krwi nietrenujących osób niż osób regularnie podejmujących aktywność fizyczną.

Stosowanie ćwiczeń siłowych w treningu zdrowotnym zwiększa stężenie całkowitego i wolnego T oraz liczbę SCs i mioblastów osłabiając starzenie się mięśni szkieletowych. U starszych mężczyzn podjęto próby podawania testosteronu, jako profilaktykę sarkopenii. Spadek stężenia T u mężczyzn powyżej 65 lat wynosi 1–2% rocznie. Utrzymywanie stężenia T we krwi 500–1000 ng/dL przez domięśniową iniekcję (100 mg/tydzień przez 4 tyg.), zwiększa syntezę białek mięśniowych, a także czynnika wzrostu IGF-1 oraz siłę skurczu mięśni ocenianą za pomocą ręcznego dynamometru izokinetycznego [22, 26]. Jednak stosowanie steroidów anaboliczno-androgennych wiąże się z poważnymi komplikacjami zdrowotnymi u starszych mężczyzn, takimi jak zaburzenia funkcji gruczołu krokowego łącznie z transformacją nowotworową oraz wzrost wartości hematokrytu >50%, co może nasilić dysfunkcję śródbłonka i zwiększyć ryzyko chorób sercowo-naczyniowych [7]. Wskazuje to, że regularna aktywność fizyczna jest najbardziej bezpiecznym sposobem utrzymania optymalnego stężenia T, zadowalającej masy i siły mięśni szkieletowych oraz uniknięcia chorób towarzyszących starzeniu się i niepełnosprawności w starszym wieku.

Testosteron tworząc kompleks z AR inicjuje ekspresję czynnika IGF-1 i hamuje wydzielanie IGFBP-4 (IGF-bond protein), który tłumi fizjologiczne działanie IGF-1. Obniżenie z wiekiem stężenia testosteronu zaburza oddziaływanie IGF-1 na mięśnie, a to nasila sarkopenię [53].

Insulinopodobny czynnik wzrostu jest wydzielany do krą-żenia głównie z wątroby (izoforma IGF-1Ea) pod wpływem hormonu wzrostu (human growth hormone, hGH) i uczestniczy w jego anabolicznym i miogennym działaniu [94, 95]. Wątrobowa synteza IGF-1 stanowi 50% całkowitej puli obwodowego insulinopodobnego czynnika, pozostała część pochodzi z makrofagów, komórek śródbłonka i mięśni gładkich. IGF-1 wytwarzany w mieśniach szkieletowych (izoforma IGF-1Ec zwana mechanicznym czynnikiem wzrostu) działa wyłącznie w sposób auto- i parakrynowy stymulując proliferację SCs i różnicowanie mioblastów [100]. Interakcja między krążącym a mięśniowym IGF-1 może odgrywać ważną rolę w regulacji masy ciała [95].

IGF-1 oddziałuje na mięśnie przez receptory błonowe IGF-1 (insulin-like growth factor-1 i 2 receptors, IGF-1R). Związanie IGF-1 z receptorem IGF-1R aktywuje kaskady kinaz aktywowanych mitogenami MAPK (mitogen-activated kinase), a dokładnie kinazy regulowanej zewnątrzkomórkowo ERK1/2 (extracellular signal regulated kinase). Funk-cjonalnym następstwem aktywacji kinazy ERK1/2 przez czynniki wzrostowe jest aktywacja biogennych czynników regulatorowych MyoD, miogenina, Myf5 i MRF4, które aktywują transkrypcję swoistych dla mięśni genów. Miogenne czynniki transkrypcyjne podlegają ekspresji w określonej kolejności w komórkach miogennych: Myf5 i MyoD ulegają zazwyczaj ekspresji wcześniej, następnie jest syntetyzowana miogenina i jako ostatni MRF4. Ta kolejność ekspresji czynników miogennych określa wczesne (Myf5/MyoD) i późne (miogenina/MRF4) etapy w regeneracji mięśni szkieletowych. Jest to także związane z funkcjami, jakie pełnią te czynniki w rozwoju i regeneracji mięśni: MyoD i Myf5 odgrywają rolę w transformacji komórek mięśniowych, miogenina kontroluje proces różnicowania mioblastów, natomiast MRF4 jest związany z dojrzewaniem miotub. Zastosowanie inhibiora kaskady MAPK, PD 098059 (specific inhibitor of the activation of MAPK), znosi oddzia-ływanie IGF-1 na mioblasty [33, 38, 53, 57, 87, 94].

Podczas ćwiczeń fizycznych, mięśnie nie tylko wytwarzają więcej IGF-1, ale również wykorzystują w większym stopniu krążący IGF-1 pochodzący z wątroby, komórek immunologicznych lub śródbłonka [84]. Wysiłek fizyczny jest silnym czynnikiem oddziałującym na syntezę i wzrost stężenia IGF-1 we krwi (tab. 4).

Około 95% krążącego IGF-1 występuje w kompleksach z IGFBP-3 i kwasowo labilną podjednostką ALS (acid-labile subunit). Pozostała część jest związana z innymi białkami; mniej niż 1% występuje w postaci niezwiązanej. Kompleksy IGF-1, IGFBP-3 i ALS nie są zdolne do przekraczania bariery naczyń włosowatych, ale odgrywają ważną rolę w stabilizacji cząsteczki, tj. wydłużają okres półtrwania IGF-1 z kilku minut do około 12–15 godzin [95]. Istotne jest to, że w uszkodzonych mięśniach aktywności anabolicznej IGF-1 towarzyszy wysoka ekspresja miostatyny hamując proliferację SCs, różnicowanie mioblastów i regenerację włókien mięśniowych. Blokowanie aktywności miostatyny m.in. przez zwiększenie ekspresji jej antagonisty – folistatyny, może być nową terapią w dystrofiach mięśniowych i poważnie uszkodzonych mięśniach [87].

Postępujące z wiekiem obniżenie stężenia IGF-1 i IGFBP-3, wzrost stosunku IGF-1 do IGFBP-3 jest związane z procesem starzenia tkanek, zaburzeniami funkcji układu mięśniowego i układu krążenia oraz zwiększonym ryzykiem chorób nowotworowych, neurodegeneracyjnych i osteoporozy [38, 98, 99]. Dlatego podjęto próby stosowania rekombinowanej postaci IGF-1 (recombinant insulin-like growth factor, rhIGF-1) w iniekcji podskórnej. Badania przeprowadzone w grupie kobiet w wieku powyżej 70 r.ż. wykazały, że stosowanie rhIGF-1 powoduje wzrost beztłuszczowej masy ciała i obniżenie tkanki tłuszczowej. W grupie, w której podawano wysokie dawki rhIGF-1, zmianom anabolicznym towarzyszyły liczne działania niepożądane, w tym bóle głowy, letarg, obrzęki, bóle stawów i wzdęcia [90]. Ze względu na działanie podobne do insuliny najczęstszym skutkiem niepożądanym egzogennego IGF-1 jest hipoglikemia [17, 40]. Stosowanie IGF-1 oraz innych czynników anabolicznych, tj. T i hGH, powinno być ograniczone wyłącznie do niezbędnego leczenia [42]. rhIGF-1 stosuje się jako długoterminową terapię u pacjentów cierpiących na zespół Larona [17, 40] oraz u osób chorych na dystrofię miotyczną typu 1 (myotonic dystrophy type 1, DM1) [36, 96]. W starzeniu się mięśni najbardziej skutecznną metodą utrzymania optymalnego poziomu ekspresji IGF-1 jest regularna aktywność fizyczna [15]. Zapobiega to nie tylko obniżeniu liczby SCs, ale także usprawnia metabolizm węglowodanów [46].

Możliwości zastosowania komórek macierzystych w regeneracji tkanek doprowadziło do rozwoju transplantologii komórkowej. Sukces działania komórek macierzystych zależy od takich czynników, jak rodzaj zastosowanych komórek i potencjał miogeniczny, sposób podania oraz zdolności do przeżycia w organizmie biorcy. Pierwsze doświadczenia z przeszczepianiem SCs przeprowadzono pod koniec lat 70 ub.w. na modelach zwierzęcych, a w latach 90 ub.w. wykonano pierwsze próby kliniczne. Najwięcej badań dotyczy przeszczepów komórkowych w dystrofiach mięśniowych i niewydolnego mięśnia sercowego. Prowadzone są rownież badania nad wykorzystaniem komórek mięśniowych w nietrzymaniu moczu [11].

Mimo doskonalenia technik inżynierii tkankowej, przeprowadzenie transplantacji komórkowych nadal wiąże się z poważnymi problemami, np. słaba przeżywalność mioblastów spowodowana silną reakcją zapalną i immunologiczną biorcy, generacja reaktywnych form tlenu i apoptoza oraz brak możliwości dystrybucji przeszczepionych komórek w organizmie [71]. W pierwszych badaniach prowadzonych w latach 90 ub.w. określono przeżywalność mioblastów na poziomie 1% po 4 dniach od przeszczepu po podaniu bezpośrednio do mięśnia nawet dużej liczby komórek 100–500 tys. [8, 76]. W innych badaniach dziesięciu chłopców z dystrofią mięśniową Duchenne’a po wstrzyknięciu 100 milionów mioblastów w mięsień piszczelowy przedni tylko u jednego pacjenta stwierdzono obecność przeszczepionych komórek 6 miesięcy po zabiegu, mimo ciągłego stosowania cyklosporyny [58]. Oznacza to, że czas przeżycia komórek po transplantacji jest ograniczony nawet wówczas, gdy reakcja immunologiczna biorcy jest hamowana. Comiesięczne nastrzykiwanie dystroficznych mięśni zdrowymi mioblastami nie doprowadziło do poprawy stanu pacjenta [54]. Późniejsze badania wykazały, że długotrwała hodowla in vitro mięśniowych komórek prekursorowych obniża ich przeżywalność po przeniesieniu do organizmu biorcy [62, 78, 80]. Powtarzane pasażowanie zmienia fenotyp lini potomnych komórek satelitowych, które wykazują skłonność do nieswoistego różnicowania i niskiego poziomu ekspresji białka Pax7 [34].

W celu zwiększenia efektywności transplantacji wykonuje się przeszczepy autologiczne, podejmuje się próby osłabienia reakcji zapalnej przez zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko cytokinom prozapalnym, głównie przeciw cytokinie IL-1β (interleukin 1 beta), której stężenie wzrasta w ciągu 24 godzin po przeszczepie. Ogranicza adhezję neutrofili i limfocytów blokując aktywność cząsteczek adhezyjnych, takich jak selektyny i integryny. Stosuje się preinkubację z antyoksydantami, takich jak N-acetylocysteina, askorbinian lub dysmutaza ponadtlenkowa, co ogranicza stres oksydacyjny i dwukrotnie zwiększa przeżywalność komórek po reimplantacji [39, 72]. Zwiększenie potencjału miogennego uzyskuje się także przez selekcję komórek podczas hodowli lub hodowle mieszane. Zaobserwowano, że najlepiej przeżywają komórki, które najwolniej przylegały do podłoża i wykazywały ekspresję desminy w 75% populacji. Dla porównania, komórki wykazujące ekspresję desminy w ponad 95% populacji, gwałtownie ginęły po przeszczepie (utrata 96% komórek w ciągu 48 godz.) [75]. Kokultury zapewniają bezpośredni kontakt komórek macierzystych pochodzących z różnych tkanek z mioblastami, dzięki czemu mają szanse odpowiedzieć na czynniki wydzielane przez mioblasty, np. IGF-1 i rozpocząć różnicowanie [85].

Innym sposobem zwiększenia potencjału miogennego komórek jest wykorzystanie w hodowlach macierzy zewnątrzkomórkowej (extracellular matrix, ECM), która w warunkach in vivo tworzy rusztowanie zapewniające właściwą strukturę komórek i tkanek oraz miejsce magazynowania czynników wzrostu. Składniki ECM przez wiązanie czynników wzrostu regulują ich dostępność i aktywność w tkance, modyfikując tym samym ich wpływ na mioblasty czy włókna mięśniowe. Głównymi składnikami ECM w mięśniach szkieletowych są kolagen typu I, III, IV, laminina, tenascyna, fibronektyna oraz siarczan dermatanu i siarczan heparanu, które pełnią funkcję strukturalną i wpływają również na adhezję, migrację i fuzję mioblastów [41, 66]. Hodowle SCs i mioblastów otulone ECM zawierającą 72% kolagenu mają większą aktywność proliferacyjną w porównaniu do kultur komórkowych w pożywce niezawierającej kolagenu typu I. Hodowle w ECM zawierającą laminę wykazują wyższą ekspresję Pax7 w porównaniu do hodowanych w obecności kolagenu, żelatyny i fibronektyny [87].

Głównymi cząsteczkami regulatorowymi w tworzeniu, przebudowie i degradacji składników macierzy zewnątrzkomórkowej są metaloproteinazy macierzy (matrix metalloproteinase, MMP). W mięśniach szkieletowych MMP odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy i integralności miofibryli poprzez rozkład ECM i regulację migracji, różnicowania oraz regeneracji komórek [12, 16]. Białka macierzy zewnątrzkomórkowej oddziałują bezpośrednio z receptorami na powierzchni komórki, inicjując szlaki przekazywania sygnałów [88]. W wyniku uszkodzenia włókien mieśniowych dochodzi do degradacji białek ECM i uwolnienia różnych czynników wzrostu związanych z ECM w tym IGF-1 [2, 10]. MMP są odpowiedzialne za uaktywnienie czynników wzrostu, które są związane z powierzchnią komórek. IGF-1 związany z białkami IGFBP tworzy nieaktywne kompleksy, które uniemożliwiają wiązanie się z receptorami (IGF-1R). Proteoliza IGFBP może regulować biodostępność IGF-1, hamując i/lub wzmacniając jego aktywność w wielu typach komórek [52]. Wykazano, że kompleks IGFBP-1 ulega degradacji przez MMP-11, IGFBP-3 przez MMP-1, MMP-2 i MMP-3, a IGFBP-5 przez MMP-1 i MMP-2. Biodostępny IGF-1 indukuje proces proliferacji komórek. Białka IGFBP, oprócz zdolności do regulowania dostępu IGF do receptorów, mogą się wiązać z odrębnymi białkami powierzchniowymi lub białkami w macierzy pozakomórkowej, a te interakcje mają wpływ na wiele funkcji komórkowych [20].

Wykorzystuje się także techniki inżynierii genetycznej, takie jak transferowanie podawanych mioblastów genem kodującym antagonistę receptora interleukiny-1β lub genem kinazy Akt (serine/threonine-specific protein kinase), a to chroni komórki przed niszczącym działaniem czynników apoptotycznych. Zaobserwowano, że wymienione zabiegi znacznie zmniejszają odsetek komórek ginących po 48, 72 i 120 godzinach od transplantacji. Opracowuje się również metody uodparniania przeszczepionych komórek bez konieczności stosowania terapii genowej. Jak wcześniej wspomniano może to być tzw. hartowanie, czyli poddawanie komórek działaniu czynników fizycznych, wysokiej temperaturze (42–43°C) lub hipoksji, które stymulują ekspresję białek ochronnych Hsp [39, 49]. Liu i wsp. [49] zaobserwowali wzrost ekspresji białka Pax7 i samoodnawiania się po zastosowaniu w hodowli mioblastów atmosfery zawierającej 2% tlenu.

Podejmowane są także próby poszukiwania populacji somatycznych komórek macierzystych, które mogłyby znaleźć zastosowanie w rekonstrukcji mięśni szkieletowych. Duże nadzieje na wykorzystanie w chorobach mięśni wiąże się z komórkami macierzystymi pochodzącymi z naczyń krwionośnych o fenotypie CD133+. Komórki te są zdolne do migracji w naczyniach krwionośnych i zasiedlania niemal wszystkich obszarów mięśni szkieletowych. Hodowane z mioblastami są zdolne do rozpoczęcia różnicowania miogenicznego wyrażonego ekspresją Pax7, Myf5, M-kadheryna i CD34. Wprowadzenie ich do krwiobiegu dystroficznych myszy poprawiło regenerację mięśni, utworzyło przez komórki CD133+ włókna wytwarzające dystrofinę oraz zasiedliło przez nie niszy SCs. Obecność komórek CD133+ w mięśniach wpłynęła także na wzrost siły skurczu mieśni [6, 91]. Potencjał miogeniczny komórek CD133+ potwierdzono w innych badaniach [55].

W 2005 r. po raz pierwszy opisano zdolność komórek macierzystych pochodzących ze zrębu tkanki tłuszczowej (adi-pose-derived stem cells, adipose-derived stromal cells, ADSCs) do regeneracji mięśni i ekspresji dystrofiny w mysim modelu dystrofii Duchenne’a (Duchenne muscular dystrophy, DMD) [79]. Obecnie badania obejmują zastosowania ADSCs w regeneracji uszkodzonych miocytów. W rozległych uszkodzeniach mięśni szkieletowych pula endogennych komórek macierzystych, tj. komórek satelitowych może być niewystarczająca do zapewnienia prawidłowej regeneracji. Zaburzona rekonstrukcja włókien mięśniowych często jest związana z utratą masy mięśniowej oraz nadmiernym tworzeniem się tkanki łącznej. Terapie mające na celu poprawę regeneracji mięśni szkieletowych i zapobieganie zwłóknieniu mogą polegać na przeszczepie różnych rodzajów komórek macierzystych zdolnych do różnicowania miogenicznego. Wśród takich komórek są ADSC, które są stosunkowo łatwe do wyizolowania, hodowli i manipulacji [32].

Potencjał miogenny komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej udokumentowano zarówno in vitro, jak i in vivo, po przeszczepie do mięśni myszy mdx (mouse-the genetic homologue of Duchenne muscular dystrophy). Mysz mdx jest najczęściej wykorzystywanym zwierzęcym modelem DMD. Obserwuje się u nich mutacje w eksonie 23, która prowadzi do powstania skróconego białka dystrofiny we włóknach mięśni szkieletowych. Wyniki eksperymentów in vivo wykazały, że miogenne progenitory pochodzące z ADSC można wszczepić w mięsień i przyczynić się do regeneracji miofibryli, czego dowodem są dystrofina i podwójnie dodatnie miowłókna GFP (green fluorescent protein) wykryte do 12 tygodni po przeszczepie. Sugeruje to, że mają one długotrwały potencjał terapeutyczny. Oprócz udziału w regeneracji miofibryli przeszczepione komórki ADSC uzupełniają pulę komórke satelitowych [105]. Potwierdza to, że komórki te mogą skolonizować tkankę i uczestniczyć w jej regeneracji. Niektóre badania sugerują, że ADSC są bardziej podatne na różnicowanie miogeniczne niż komórki macierzyste szpiku kostnego (bone marrow stem cell, BM-MSC). Przeszczep tych komórek do uszkodzonych włókien mięśniowych często poprawia regeneracje przez ich właściwości immunomodulujące [32]. W kilku pracach wykazano obiecujące dane dotyczące udziału ADSC w odbudowie uszkodzonych mięśni szkieletowych. Identyfikacja nowych protokołów i narzędzi może pomóc w przyspieszeniu regeneracji mięśni [29].

Zwrócono także uwagę na populację komórek interstycjalnych (interstitial cells, PICs) rezydujących w mięśniach szkieletowych. PICs charakteryzują się wyższym potencja-łem regeneracyjnym i samoodnawialnością niż do tej pory badane komórki macierzyste wykorzystywane w rekonstrukcji mięśni szkieletowych. Cechą charakterystyczną tych komórek jest brak ekspresji czynnika transkrypcyjnego Pax7, natomiast ekspresja czynnika PW1 współ-uczestniczącego w regulacji szlaku sygnalizacyjnego NFκB/TNF-α [59]. Odkrycie komórek Pax7−/PW1+ jest nadzieją na poprawę efektywności transplantacji komórek macierzystych w chorobach degeneracyjnych i pourazowej rekonstrukcji mięśni szkieletowych [23].

Badania proteomu mięśni szkieletowych prowadzone od 2017 roku potwierdziły, że mięśnie są tkanką niezwykle plastyczną pod względem zmian metabolicznych i adaptacji do zmieniających się warunków wzrostu i odbudowy uszkodzonych włókien mięśniowych [73]. Regeneracja mięśni szkieletowych zależy od wewnętrznej sygnalizacji, a także od interakcji między SCs a ECM, która w warunkach in vivo tworzy rusztowanie zapewniające właściwą strukturę komórek i tkanek oraz miejsce magazynowania czynników wzrostu. Komórki satelitowe obecne w dojrzałych mięśniach szkieletowych pozostają w stanie spoczynku do momentu ich aktywacji pod wpływem ćwiczeń fizycznych lub urazów mięśni. Jednak w takich sytuacjach, jak starzenie się, dystrofie mięśniowe czy choroby wyniszczające, pula aktywnych proliferacyjnie SCs ulega wyczerpaniu, co skutkuje osłabieniem procesów regeneracyjnych, obniżeniem masy i siły skurczu mięśni szkieletowych [56, 66]. Proces odbudowy uszkodzonych mięśni jest kontrolowany przez wiele czynników immuno-endokrynnych, a ważną rolę w tym procesie odgrywa T i IGF-1. Niezależne ścieżki sygnalizacyjne T i IGF-1 oraz interakcja między mięśniową izoformą IGF-1Ec a AR wpływają na aktywację, proliferację, różnicowanie SCs i fuzję mioblastów [47]. Wyjaśnienie zależności pomiędzy sygnalizacją IGF-1 a niegenomową aktywnością AR jest istotne dla opracowania efektywnych terapii przeciwdziałąjących sarkopenii i zapobiegających niepełnosprawności pacjentów z postępującym osłabieniem i zanikiem mięśni. Kilka lat temu podjęto próby podawania testosteronu i rhIGF-1, jednak pojawiające się komplikacje zdrowotne powstrzymały dalsze próby kliniczne. Do tej pory najbardziej bezpieczną metodą utrzymania optymalnego stężenia testosteronu i IGF-1 jest regularna aktywność fizyczna, która zapobiega obniżeniu liczby SCs i osłabieniu potencjału regeneracyjnego mięśni zarówno u osób młodych, jak i starszych [7, 15, 26, 90].

W ostatnich latach zwrócono uwagę na wykorzystanie SCs w medycynie regeneracyjnej i molekularnej szczególnie w chorobach degeneracyjnych i pourazowej rekonstrukcji mięśni szkieletowych. Udział SCs w odbudowie uszkodzonych włókien mięśniowych może być wspomagany przez komórki CD133+ i ADSCs oraz rezydujące w mięśniach komórki interstycjalne PICs. Wprowadzenie PICs do uszkodzonego mięśnia inicjuje w sposób parakrynny wydzielanie cytokiny IL-6 oraz czynników wzrostu, tj. IGF-1, FGF, HGF i 1TGF-β. Czynniki te inicjują proliferację i różnicowanie komórek progenitorowych mięśni szkieletowych oraz stymulują angiogenezę, prowadząc do przyspieszonej odbudowy miofibryli [11, 22, 23, 55, 105].

Potencjał regeneracyjny mięśni szkieletowych jest w dużej mierze determinowany przez mikrośrodowisko komórek macierzystych. Dlatego w celu zwiększenia skuteczności terapii komórkowej stosowane są w hodowlach specjalne rusztowania komórkowe, które stanowią tymczasowe zamienniki naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Powinny one zapewnić komórkom środowisko jak najbardziej zbliżone do naturalnego, determinujące i przyspieszające proces tworzenia nowej tkanki mięśniowej [41, 66, 87].