Budowa IV systemu sekrecji Legionella pneumophilai jego znaczenie w patogenezie

Bakterie Legionella pneumophila to Gram-ujemne pałeczki, które w środowisku wodnym pasożytują w komórkach wolno żyjących pierwotniaków. Po przedostaniu się do systemów dystrybucji wody bakterie występują w sztucznych rezerwuarach, takich jak: sieci wodociągowokanalizacyjne, systemy klimatyzacyjne, wieże chłodnicze. Wdychanie skażonego wodno-powietrznego aerozolu wytwarzanego przez różne urządzenia może zakażać ludzi. W organizmie człowieka pałeczki Legionella zachowują się jak oportunistyczne patogeny zdolne do proliferacji wewnątrz monocytów i makrofagów alweolarnych oraz komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych, wywołując atypowe zapalenie płuc, zwane chorobą legionistów. Wyniki badań etiologii pneumonii wskazują, że pałeczki Legionella są odpowiedzialne za 2–16% zachorowań, a w zachorowaniach o ciężkim przebiegu 14–37% przypadków, w których śmiertelność przekracza 25%. U chorych z supresją immunologiczną poziom śmiertelności jest jeszcze wyższy i może wynosić 60% [1, 2]. Najczęściej do infekcji dochodzi w środowisku zamieszkania, w czasie podróży oraz podczas pobytu w szpitalu. W Stanach Zjednoczonych liczba zgłoszonych przypadków choroby legionistów wzrosła z 2301 w 2005 r. do 7104 w 2018 r., co oznacza 300% wzrost. W Europie liczba stwierdzonych przypadków tej choroby prawie się podwoiła (1,3/100 000 osób w 2014 r. do 2,3/100 000 osób w 2018 r.). Wzrost liczby przypadków może wynikać ze zmieniających się warunków środowiskowych, które sprzyjają namnażaniu się pałeczek Legionella, a także z rosnącej liczby osób podatnych na infekcję, takich jak osoby starsze i z obniżoną odpornością [3]. Zamknięcie budynków użyteczności publicznej związane z pandemią koronawirusa SARS-CoV-2 doprowadziło do długotrwałej stagnacji wody w instalacjach i stworzyło optymalne warunki do intensywnego namnażania się bakterii Legionella, czego następstwem jest znaczne zwiększenie liczby przypadków choroby legionistów [4].

W cyklu życiowym L. pneumophila występuje faza replikacyjna, w której bakterie namnażają się w parazytosomach pierwotniaków lub w makrofagach człowieka oraz faza transmisyjna, w której bakterie są ruchliwe, gromadzą kwas β hydroksymasłowy, wykazują zwiększoną oporność osmotyczną oraz są bardzo zakaźne. Przejście bakterii z fazy replikacyjnej, która się odbywa w zasobnej w składniki pokarmowe komórce gospodarza, do środowiska wodnego, które nie sprzyja rozwojowi bakterii, wymaga wytworzenia wielu unikalnych cech fenotypowych. Błona zewnętrzna L. pneumophila jest asymetryczną dwuwarstwą lipidową, której wewnętrzną część tworzą głównie fosfolipidy, a zewnętrzną lipopolisacharyd (LPS) [5]. Fosfolipidy L. pneumophila charakteryzują się dużą zawartością (30%) fosfatydylocholiny – fosfolipidu charakterystycznego dla błon komórek eukariotycznych [6]. Część polisacharydowa LPS składa się z 10–75 podjednostek kwasu legionaminowego, który ze względu na obecność grup acetylowych i acetyloamidowych jest wysoce hydrofobowy [7]. Wysoka hydrofobowość warstwy powierzchniowej L. pneumophila zwiększa ich przeżywalność w aerozolu i ułatwia adhezję do membrany komórek gospodarza. Do lipidu A są przyłączone długołańcuchowe hydroksykwasy tłuszczowe, które zwiększają stabilność membrany zewnętrznej. Poza fosfolipidami i LPS-em błona zewnętrzna zawiera lipoproteiny oraz unikalny zestaw transmembranowych białek przybierających postać β-beczułek, których nie stwierdza się w obrębie błony wewnętrznej. Obie warstwy błony wewnętrznej składają się z fosfolipidów oraz białek integralnych i peryferyjnych. Przestrzeń peryplazmatyczna L. pneumophila zawiera stosunkowo cienką warstwę peptydoglikanu, w którego skład wchodzi kwas muraminowy, glukozamina, kwas glutaminowy, alanina i kwas mezodiaminopimelinowy w stosunku molowym 0,8:0,8:1,1:1,7:1 [8]. Bakterie L. pneumophila nie wytwarzają otoczek oraz nie syntetyzują zewnątrzkomórkowych polisacharydów, dlatego makrocząsteczki ściany komórkowej (białka, lipidy, LPS) odgrywają decydującą rolę na każdym etapie oddziaływania z komórką gospodarza. Bezpośredni kontakt między L. pneumophila a komórką docelową indukuje wydzielanie ponad 300 białek efektorowych za pomocą IV systemu sekrecji, które odgrywają podstawową rolę w biogenezie niszy replikacyjnej [9, 10]. Bakterie L. pneumophila pobrane w wyniku spiralnej lub klasycznej fagocytozy przez komórkę makrofaga zostają zamknięte w wyspecjalizowanej wakuoli LCV (Legionella containing vacuole), która zapewnia schronienie przed mechanizmami obronnymi, umożliwia pobieranie składników odżywczych niezbędnych do wewnątrzkomórkowego namnażania się oraz ucieczkę z wyeksploatowanej komórki gospodarza [11].

System sekrecji typu IV (T4SS) Dot/Icm (defective in organelle trafficking/intracellular multiplication) L. pneumophila tworzy złożony aparat białkowy, który spina wewnętrzną i zewnętrzną błonę ściany komórkowej. Model sekrecji i translokacji systemu Dot/Icm zakłada, że jeden z jego komponentów (prawdopodobnie IcmQ) buduje podobne do pilusów struktury na powierzchni bakterii, które tworzą kanały umożliwiające transport substratów poprzez membranę wakuoli zawierającej pałeczki Legionella [12, 13, 14, 15]. Geny kodujące komponenty aparatu Dot/Icm są zorganizowane na chromosomie L. pneumophila w dwa główne regiony, z których każdy ma w przybliżeniu 20 kpz długości (ryc. 1). Część z nich podlega wspólnej regulacji transkrypcyjnej. W regionie I znajduje się 7 genów: dotA, B, C, D oraz icmV, W, X. Kolejne 18 genów dot/icm znajduje się w II regionie, są to: icmS, dotL/IcmO, dotM/IcmP, dotN/IcmJ, dotF/IcmG, dotH/IcmK, dotU/IcmH, icmF, icmQ, icmR, dotO/icmB, dotE/ icmC, dotI/icmL, dotJ/icmM, dotK/icmN, dotP/icmD, icmT [13, 16, 17, 18]. Geny dot/icm są rozmieszczone w kilku klastrach genów: 1) dotD–dotC–dotB, 2) dotM/icmP–dotL/icmO i 3) dotI/icmL–dotH/icmK–dotG/icmE [19]. Większość genów dot/ icm zawiera konserwatywną sekwencję TATACT, położoną w regionie 10 promotora, rozpoznawaną przez czynnik sigma RpoD [18].

Rycina 1

Geny kodujące białka systemu Dot/Icm można podzielić na trzy kategorie fenotypowe:

System Dot/Icm składa się z 27 elementów, należą do nich: białko DotH/IcmK oraz lipoproteiny (DotC, DotD, DotK) błony zewnętrznej, białko peryplazmatyczne (IcmX), białka błony wewnętrznej (DotA, DotE, DotF (IcmG), DotG (IcmE), DotI, DotJ, DotM, DotP, DotU, DotV, IcmF, IcmT i IcmV), ATP-azy związane z błoną wewnętrzną (DotB, DotL, DotO) oraz rozpuszczalne białka cytoplazmatyczne (DotN, IcmQ, IcmR, IcmS, IcmW i LvgA) [19]. Białka te tworzą kilka kompleksów, m.in. kompleks rdzeniowo-transmembranowy (LCTM, Legionella core-transmembrane subcomplex) składający się z pięciu białek (DotC, DotD, DotF, DotG, DotH) oraz kompleks białek sprzęgających (LT4CP, Legionella type IV coupling protein subcomplex) złożony z sześciu białek (DotL, DotM, DotN, IcmS, IcmW, LvgA) [20] (ryc. 2).

Rycina 2

Głównym podzespołem systemu T4SS L. pneumophila jest kompleks rdzeniowo-transbłonowy, tworzący strukturalny szkielet całego systemu. W jego skład wchodzi pięć białek: dwie lipoproteiny zewnątrzkomórkowe (DotC, DotD), dwa białka spinające membranę wewnętrzną (DotF (IcmG), DotG (IcmE)) i jedno białko związane z membraną zewnętrzną DotH (IcmK) [21]. DotF oraz DotG są białkami błony wewnętrznej, których końce karboksylowe oddziałują z białkami błony zewnętrznej (DotC, DotD i DotH), dzięki czemu białka te przemieszczają się do membrany zewnętrznej [6]. Pory w błonie zewnętrznej tworzy białko DotH, którego prawidłowe umiejscowienie w strukturze membrany zależy od lipoprotein DotC i DotD [21, 22]. Kompleks rdzeniowo-transbłonowy L. pneumophila wykazuje funkcjonalną analogię do kompleksu Agrobacterium VirB7-10 [6].

Białko DotD jest zbudowane z dwóch α-helis flankowanych przez przeciwrównoległą trójniciową strukturę β-kartki na jednym końcu białka i mieszaną trójniciową strukturę β-kartki na drugim końcu cząsteczki białka. Domena białka DotD przypuszczalnie tworzy pierścień peryplazmatyczny, który jest częścią umiejscowionego w obrębie błony zewnętrznej kompleksu wyższego rzędu złożonego z białek DotC, DotD i DotH [21]. DotC sąsiaduje z dwiema kopiami białka DotD (DotD1 i DotD2). Między powierzchnią DotD1 i DotD2 występują wiązania wodorowe oraz oddziaływania elektrostatyczne [23].

Białko DotF składa się z 269 aminokwasów i zawiera trzy domeny: N-końcową domenę cytoplazmatyczną złożoną z 50 aminokwasów, hydrofobową domenę transmembranową, zbudowaną z około 20 aminokwasów oraz C-końcową domenę peryplazmatyczną składającą się z około 200 aminokwasów [24]. Białku DotF przypisuje się dwie funkcje: pierwsza z nich zakłada obecność motywu podobnego do motywu występującego w grupie białek SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor-attachment protein receptor), który odpowiada za hamowanie procesu fuzji błon w komórce gospodarza w warunkach in vitro [15, 25]. Druga sugerowana funkcja białka DotF polega na jego bezpośrednim wiązaniu się z substratami transportowanymi podczas procesu eksportu przez kanał translokacyjny systemu T4SS [24].

Białkiem, które spina zewnętrzną oraz wewnętrzną błonę, tworząc centralny kanał w kompleksie rdzeniowym, jest białko DotG. Białko to prawdopodobnie odpowiada za transfer energii z wewnętrznej błony do białka DotH tworzącego kanał w błonie zewnętrznej. Białko DotG wchodzi w interakcje z białkiem DotF na wczesnych etapach przenoszenia substratów za pośrednictwem systemu Dot/Icm, gdyż związanie substratu przez białko DotF może aktywować białko DotG. Po przeniesieniu substratu białko DotF może przekazywać sygnał zwrotny do błony wewnętrznej od strony cytoplazmy, który odpowiada za zmniejszenie aktywności białka DotG [6]. Jednak głównym zadaniem białka DotF jest stabilizowanie struktury kanału lub wpływanie na jego konformację [26].

Proces tworzenia się kompleksu rdzeniowotransmembranowego systemu Dot/Icm L. pneumophila składa się z trzech etapów. W pierwszym etapie dochodzi do wprowadzenia białka DotH do membrany zewnętrznej z udziałem białek DotC i DotD. Odpowiedni poziom ekspresji genów kodujących te trzy białka ma podstawowe znaczenie w formowaniu się okrągłego kanału w kompleksie rdzeniowym systemu. W następnych etapach dochodzi do wbudowania białek DotF i DotG do membrany wewnętrznej oraz ich interakcji z pozostałymi elementami kompleksu w obrębie błony zewnętrznej (DotC, DotD, DotH). Powstaje spinający błonę wewnętrzną oraz zewnętrzną kompleks stanowiący rdzeń T4SS L. pneumophila [6].

Kompleks białek sprzęgających Legionella typu IV (LT4CP) jest umiejscowiony w membranie wewnętrznej. Składa się z białka sprzęgającego typu IV – DotL, białek aparatu Dot/ Icm – DotM, DotN, DotY, DotZ oraz cytoplazmatycznych białek adaptorowych typu IV – IcmS i IcmW, a także białka LvgA, któremu również przypisuje się funkcje adaptorowe [27, 28]. Badania strukturalne wykazały, że rdzeń kompleksu jest utworzony z heteropentameru DotLMNYZ, z którego wystaje elastyczny moduł IcmSW [27]. Centralną podjednostką kompleksu LT4CP jest białko DotL; należy do rodziny białek sprzęgających TraG, które klasyfikowane są jako ATPazy typu AAA+ pełniące funkcje wiązania substratów transportowanych przez kanał translokacyjny systemu sekrecji T4SS [28]. W przeciwieństwie do białek należących do rodziny TraG, białko DotL zawiera około 200 C-końcowych podjednostek stanowiących przedłużenia (CTE, C-terminal extension), które znacznie różnią się długością i sekwencją aminokwasową w porównaniu do innych białek sprzęgających [29]. Białko DotL zawiera cytoplazmatyczną C-końcową domenę z konserwatywnym motywem Walkera A oraz wbudowaną w błonę wewnętrzną domenę N-końcową, która jest powiązana z białkami FtsK/SpoIIIE, należącymi do rodziny translokaz DNA [30]. Podjednostki CTE białka DotL oddziałują z heterodimerem IcmSW powstałym po dimeryzacji białek IcmS i IcmW, a także z białkiem DotN (IcmJ) i LvgA [29]. Ponadto białko DotL dzięki transbłonowym helisom oraz domenie ATPazy odpowiadającej za katalizowanie procesu hydrolizy ATP dostarczającego energię bezpośrednio do translokacji substratu, wchodzi w interakcję z białkiem błony wewnętrznej DotM (IcmP) [31, 32, 33]. Białko DotM przypuszczalnie odpowiada za stabilizację struktury systemu Dot/Icm. Białka DotL i DotM są stabilne jedynie wtedy, gdy są z sobą połączone, a stabilność tego połączenia wzmacnia obecność małego, bogatego w cysteinę białka DotN [34].

Innym elementem kompleksu białek sprzęgających typu IV jest białko LvgA, które wchodzi w interakcje z co najmniej czterema białkami efektorowymi (VpdB, SidH, SetA i PieA) L. pneumophila. Białko LvgA definiowane jest jako białko adaptorowe systemu Dot/Icm, ponieważ jest wymagane do przyłączenia wymienionych białek efektorowych do kompleksu sprzęgającego. Efektory VpdB i SidH mają wspólny motyw FxxxK, do którego wiąże się białko LvgA. Motyw ten nie występuje w SetA i PieA, co wskazuje na zdolność rozpoznawania przez białko LvgA innych motywów wiążących [35]. Kompleks DotL-IcmSW-LvgA nie wykazuje wykrywalnej interakcji z innymi efektorami, takimi jak białka SidJ lub Lpg039319. Hydrofobowa powierzchnia białka LvgA zawierającego w swej strukturze swoistą wklęsłość z łatwością wiąże kompleks IcmSW. Powierzchnia białka LvgA po przeciwnej stronie zawiera hydrofobową strukturę przypominającą kieszeń, która umożliwia wiązanie się z białkami efektorowymi [29, 35].

Białka adaptorowe IcmS i IcmW działają analogicznie do białek opiekuńczych III systemu sekrecji. Są to małe, rozpuszczalne w cytozolu białka o charakterze kwasowym, które wiążą substraty i pełnią różne funkcje. Należą do nich stabilizacja substratów oraz zapobieganie ich agregacji w cytoplazmie bakterii, a także utrzymanie substratów w stanie gotowym do wydzielania [36]. Jednak nie są to funkcje przypisane wszystkim białkom adaptorowym typu IV L. pneumophila, np. substraty należące do rodziny SidE i SidG są stabilne i nie agregują przy braku obecności kompleksu IcmSW [37].

Masa molekularna stabilnego kompleksu białkowego IcmSW wynosi około 85 kDa, a prawdopodobna stechiometria IcmS do IcmW w kompleksie wynosi 2:1 [37]. Kompleks ten odpowiada za przyjmowanie odpowiedniej konformacji przez substraty wydzielnicze systemu Dot/Icm, która umożliwia wiązanie się substratu z białkiem sprzęgającym DotL [13]. Domena umiejscowiona w pobliżu C-końca białka DotL bezpośrednio wiąże kompleks IcmSW, a interakcja ta jest głównym etapem w procesie dostarczania efektorów zależnych od IcmSW przez kanał translokacyjny systemu Dot/Icm. Kompleks IcmSW wiąże substrat w cytoplazmie i utrzymuje go w stanie gotowym do procesu translokacji. Następnie substrat za pośrednictwem C-terminalnej sekwencji stanowiącej sygnał translokacyjny łączy się z białkiem DotL i przemieszcza się w kierunku membrany wewnętrznej. Białko DotL wiąże się bezpośrednio z białkiem błony wewnętrznej DotM. Po wprowadzeniu substratu do kanału translokacyjnego kompleks IcmSW zostaje odłączony od substratu przez reakcję z domeną białka DotL przystosowaną do wiązania kompleksu IcmSW. Prawdopodobnie etap ten przebiega jednocześnie z aktywnym procesem wydzielania substratu poza komórkę bakterii. Uwolniony od białka DotL kompleks IcmSW opuszcza błonę wewnętrzną i przemieszcza się do cytoplazmy komórki bakterii, by powtórnie uczestniczyć w oddziaływaniu z nowymi substratami, a tym samym ukończyć cykl eksportu białek [20].

Białkowe efektory L. pneumophila transportowane przez kanał translokacyjny systemu sekrecji Dot/Icm zawierają swoiste sekwencje sygnalne. Na przykład białko RalF zawiera C-terminalną sekwencję z podstawnikami leucyny lub innymi aminokwasami o hydrofobowym charakterze [38]. Inną sekwencją sygnalną jest motyw E-bloku (EExxE) umiejscowiony w pobliżu C-końca białka efektorowego SidM [34, 39]. Motyw ten przypuszczalnie jest rozpoznawany przez system Dot/ Icm za pośrednictwem podjednostki białka DotM, która zawiera miejsca służące jako platforma wiążąca sekwencje E-bloku [40]. Niedawno zidentyfikowanym motywem jest umieszczony na C-końcu α helisy białek adaptorowych m.in. VpdB i SidH motyw FxxxLxxxK rozpoznawany przez białko LvgA [35]. Wśród 2930 opisanych białek L. pneumophila szczep Philadelphia-1, 257 białek zawiera motyw o sekwencji FxxxLxxxK. Spośród nich 46 białek, w tym białka SidH i VpdB, należą do 280 znanych efektorów L. pneumophila, wskazując na powszechne występowanie tego motywu w białkach podlegających translokacji przez kanał systemu T4SS [17].

Optymalny eksport większości substratów systemu Dot/ Icm, m.in. SdeA, SidG, SidH, AnkD, AnkG, PieA, PppA, PpgA, VipA i WipA, jest uzależniony od etapu wiązania się tych substratów z kompleksem IcmSW. Spośród 34 substratów systemu Dot/Icm 24 z nich wymaga obecności IcmS i/lub IcmW do optymalnego eksportu. Uważa się jednak, że zależna od kompleksu IcmSW translokacja większości substratów systemu Dot/Icm przy braku obecności tego kompleksu jest możliwa, ale przebiega ze znacznie zmniejszoną efektywnością [20]. Prawdopodobnie jest to możliwe dzięki interakcjom m.in. z elementami systemu sekrecji, które ułatwiają rozpoznanie substratów białkowych i ich wprowadzenie do kanału translokacyjnego systemu Dot/ Icm. Eliminacja pojedynczego komponentu systemu sekrecji pośredniczącego w rozpoznawaniu substratu może wpłynąć na wydajność translokacji białka, ale nie powoduje jej całkowitego zahamowania, o ile substrat białkowy zachowuje zdolność do interakcji z innymi składnikami systemu. Przykładem takiej zależności jest translokacja białka RalF, które nie wiąże się z kompleksem IcmSW, a mimo to jest transportowane z dużą wydajnością dzięki interakcji z białkiem DotF [24].

Kompleks IcmSW ma podstawowe znaczenie w procesie translokacji substratów systemu Dot/Icm do cytoplazmy komórki gospodarza. Usunięcie domeny białka DotL wiążącej kompleks IcmSW nie zaburza procesu powstawania funkcjonalnego systemu T4SS, a także nie wpływa na zmianę stabilności DotL w fazie wzrostu L. pneumophila, którą obserwuje się w razie braku białka IcmS. Jednak mutanty L. pneumophila niezdolne do syntezy białka DotL wykazują defekt w procesie eksportu substratów zależnych od kompleksu IcmSW [20]. Brak syntezy białek IcmS i IcmW powoduje, że białko sprzęgające DotL jest destabilizowane i degradowane w sposób zależny od wysoce konserwatywnej proteazy rdzeniowej ClpA podczas przejścia bakterii z fazy wzrostu eksponencjalnego do fazy stacjonarnej L. pneumophila. Degradacja białka DotL może być także spowodowana nieprawidłową interakcją między tym białkiem a translokowanymi substratami. Dotyczy to szczególnie substratów zależnych od kompleksu IcmSW, które z powodu braku obecności białek adaptorowych typu IV wykazują defekt łączenia się z białkiem DotL. Zaburza to mechanizm sekrecji, a nieprawidłowo złożony kompleks kierowany jest na szlak odpowiedzi komórki na warunki stresowe angażujący proteazę ClpA [28].

Integralnymi białkami błony wewnętrznej, które po raz pierwszy zidentyfikowano w IV systemie L. pneumophila, są białka DotU/IcmH i IcmF. Białka homologiczne do białek DotU i IcmH występują powszechnie u bakterii należących do Proteobacteria, a kodujące je geny są powiązane z klastrem genów kodujących konserwatywne białka homologiczne IcmF (IAHP, IcmF-associated homologous proteins). Białka DotU/IcmH i IcmF wykazują podobieństwo do białek systemu sekrecji typu VI, odpowiednio TssL i TssM, w umiejscowieniu w błonie wewnętrznej, topologii białka oraz wzajemnej interakcji i stabilizacji. Mimo braku podobieństwa pierwotnej sekwencji białek TssL i IcmH/DotU, oba białka należą do rodziny DUF2077 (Pfam PF09850). Zawierają podobną drugorzędową strukturę i przypuszczalnie porównywalny sposób pofałdowania struktury białka [41].

Białka DotU i IcmF kodowane przez sąsiadujące ze sobą na chromosomie L. pneumophila geny dotU i icmF odpowiadają za optymalny wewnątrzkomórkowy wzrost bakterii. Utrata pojedynczego genu dotU, icmF lub obu genów jednocześnie podobnie zaburza wewnątrzkomórkową replikację L. pneumophila. Przypuszczalną funkcją białek DotU i IcmF jest stabilizacja systemu Dot/Icm, gdyż mutacja w genach dotU i icmF wpływa na zmniejszenie stabilności białek błony zewnętrznej kompleksu rdzeniowego – DotF, DotG i DotH. Dochodzi wówczas do zmniejszenia liczby komponentów rdzenia systemu Dot/Icm, szczególnie białek DotH i DotG, a to zmniejsza aktywność całego układu. W badaniach z wykorzystaniem mutantów defektywnych w syntezie białek DotU i IcmF zastosowanie nadekspresji jedynie białka DotH przywraca zdolność do wewnątrzkomórkowej replikacji bakterii. Wskazuje to na współdziałanie białek DotU i IcmF w zapobieganiu degradacji białka DotH, a tym samym stabilizacji kompleksu rdzeniowego systemu T4SS L. pneumophila. Ponadto białka te określane są także jako czynniki pomocnicze systemu T4SS, które chronią go przed destabilizacją i degradacją w procesie selektywnej proteolizy przez niezidentyfikowaną jak dotąd proteazę, przy przejściu L. pneumophila z fazy wzrostu wykładniczego do stacjonarnego [34].

Białka cytoplazmatyczne L. pneumophila niezbędne do prawidłowego działania systemu Dot/Icm to IcmR oraz IcmQ [21]. IcmR to małe białko (10-15 kDa) o kwasowym charakterze (punkt izoelektryczny wynosi około 4,5) zawierające hydrofobową α helisę w domenie C-terminalnej. Białko IcmR pełni funkcję białka opiekuńczego dla białka IcmQ, zapobiega jego agregacji oraz interakcji z innymi białkami [38]. Brak białka IcmR u L. pneumophila powoduje pojawienie się agregatów IcmQ w postaci dwóch kompleksów o masie molekularnej 500 i 60 kDa. Białko IcmQ może tworzyć homopolimery o różnej liczbie cząsteczek, jednak regulacja stanu oligomeryzacji kompleksów IcmQ pozostaje nieznana. Białko IcmR może doprowadzić do dysocjacji istniejącego już agregatu białek IcmQ nawet przy braku ATP. Prawdopodobnie dzieje się tak, gdyż wzajemne oddziaływanie między cząsteczkami IcmQ w agregacie jest dynamiczne i ma mniejsze powinowactwo w porównaniu z oddziaływaniem z białkiem IcmR. Nie udało się dotąd udokumentować takiej cechy u białek opiekuńczych należących do systemu sekrecji, nawet u białek opiekuńczych zależnych od ATP [38].

W badaniach in vitro wykazano, że oczyszczone białko IcmQ wiąże się ze sztucznie utworzonymi pęcherzykami lipidowymi, powodując ich pękanie. Mechanizm tego procesu opiera się na elektrostatycznym oddziaływaniu domeny C-końcowej białka IcmQ (Qc), która umożliwia oddziaływanie całego białka z błoną pęcherzyka. Następnie dochodzi do wstawienia domeny N-końcowej białka IcmQ (Qn) do dwuwarstwy lipidowej pęcherzyków i zniszczenia struktury błony. Domena Qn wiąże się także z białkiem IcmR, zapobiegając stabilnemu związaniu się białka IcmQ z błoną pęcherzyka. Dlatego przy braku białka IcmR występuje istotny wzrost białka IcmQ umiejscowionego w błonach L. pneumophila. Prawdopodobnie białko IcmR pełni funkcję regulacyjną w stosunku do białka IcmQ [8]. Domena Qc białka IcmQ zawiera miejsce wiązania dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego, a to powoduje, że kompleks IcmR–IcmQ w połączeniu z NAD⁺, po związaniu z błonami, wspomaga stabilizację lub modyfikację tego białkowego kompleksu w aparacie sekrecyjnym Dot/Icm. Przypuszcza się, że białko IcmQ może być wyspecjalizowaną rybozylotransferazą ADP (ADPRT, ADP ribosyltransferases), która modyfikuje komponenty systemu T4SS [42, 43]. Wiązanie NAD⁺ przez białko IcmQ może stabilizować domenę Qc, umożliwiając działanie tego białka przez interakcję ze składnikami systemu T4SS. Blokowanie wiązania NAD⁺ narusza stabilność białka IcmQ. Domena Qc może działać jako sensor, który umożliwia kompleksowi IcmR-IcmQ interakcję z krytycznym składnikiem systemu sekrecji, podczas gdy wewnątrzkomórkowy poziom NAD⁺ jest wystarczający do zajścia reakcji wiązania. Niski wewnątrzkomórkowy poziom NAD⁺ prowadzi w tym przypadku do zwiększonego tempa zużycia białka IcmQ, co może nastąpić w czasie wzrostu bakterii, w którym poziom innych białek związanych z wirulencją jest również obniżony [44]. Kompleks IcmR-IcmQ wiąże się z błonami zawierającymi kwaśne fosfolipidy [8]. Białko IcmQ podczas łączenia się z membranami przypuszczalnie wykorzystuje dwie reszty argininy występujące w helisie łączącej struktury białka. Mutacje w genach kodujących te cząsteczki argininy powodują prawie 50% utratę zdolności do translokacji białek za pomocą systemu Dot/Icm bez wpływu na poziom ekspresji białka IcmQ L. pneumophila [42].

Białkiem cytoplazmatycznym niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania systemu Dot/Icm jest białko DotB, które pełni funkcję ATPazy [45, 46]. Obecność niewielkich ilości białka DotB stwierdza się także we frakcji błon wewnętrznych L. pneumophila. Białko DotB przyjmuje formę heksamerycznego, wbudowanego w błonę pierścienia o charakterze hydrofilowym. Formowanie się struktury pierścienia nie jest zależne od wiązania ATP. DotB ma konserwatywny motyw Walkera oraz domeny: N-końcową oddziałującą z błoną komórkową, C-końcową o nieustalonej dotąd funkcji oraz domenę ATPazy. Białko DotB jest zaangażowane w sekrecję białek efektorowych za pomocą systemu Dot/Icm [47]. Ekspresja genów kodujących białka DotB oraz DotC zwiększa się po upływie 24 godzin od infekcji komórek Acanthamoeba castellanii przez L. pneumophila [48].

Do białek cytoplazmatycznych o aktywności ATPazy należy także białko DotO/IcmB, którego masa molekularna wynosi 112 kDA. DotO ma postać dimerów, które tworzą układ heksameryczny budujący centralny kanał translokacyjny zakotwiczony w błonie wewnętrznej. W domenie C-końcowej białko DotO zawiera motyw Walkera A oraz B służący do wiązania nukleotydów. Podobny układ występuje także w białku VirB należącym do systemu T4ASS, które wykazuje słabą homologię do białka DotO. Kompleks DotO-DotB jest zaangażowany w zmianę konformacji kanału translokacyjnego w błonie wewnętrznej. Białko DotB w postaci niezwiązanej z DotO przypomina cylinder w kształcie litery V leżący nad białkiem DotO, którego węższy koniec skierowany jest do cytoplazmy komórki. Kanał translokacyjny jest wtedy zamknięty. Po związaniu się białka DotB z DotO dochodzi do obrotu struktury heksamerycznej DotO o około 20 stopni i zmiany konformacji białka DotB, które przyjmuje kształt otwartego cylindra. W wyniku tej modyfikacji następuje otwarcie kanału translokacyjnego. Związanie DotB z DotO jest podstawowym etapem wczesnej translokacji efektorów aparatu Dot/Icm [49].

Do pozostałych białek systemu Dot/Icm umiejscowionych w błonie wewnętrznej należy DotE oraz zidentyfikowane wyłącznie u bakterii z rodzaju Legionella białko DotV. Białka te zawierają cztery transmembranowe helisy, które pod względem organizacji domen w strukturze wykazują podobieństwo do białka TraQ, należącego do systemu koniugacji typu I. Białko DotP jest podobne do białka DotE/DotV, ma przy N-końcowej domenie sekwencję sygnałową, zdolną do odłączenia się od białka, oraz dwie transmembranowe helisy [50].

Innym białkiem błony wewnętrznej jest DotI, które wykazuje znaczne podobieństwo sekwencji aminokwasowej do białka TraM kodowanego przez gen umiejscowiony na plazmidzie koniugacyjnym R64 oraz podobieństwo struktury domeny C-końcowej do białka VirB8 systemu T4ASS. W warunkach in vivo białka DotI i VirB6 mogą tworzyć oligomeryczne pierścienie ułożone w postaci stosu [51]. Poziom syntezy białka DotI jest powiązany z poziomem syntezy jego białkowego homologu DotJ. Białka te wykazują podobieństwo w N-końcowej domenie, ale DotJ nie ma domeny peryplazmatycznej. Białka DotI i DotJ tworzą heterokompleks w błonie wewnętrznej w stosunku molekularnym 1,87:1 (DotI:DotJ). Kompleks ten przyjmuje formę pierścienia otaczającego kanał, przez który odbywa się transport substratów. Aktywność kompleksu białek DotIJ może być związana z ATPazą DotO [52]. Białko DotI jest obecne we wszystkich poznanych jak dotąd systemach T4BSS u bakterii. Natomiast DotJ zidentyfikowano jedynie u bakterii należących do rzędu Legionellales [51]. Innym białkiem umiejscowionym w obrębie błony wewnętrznej, a którego obecność wykazano tylko u bakterii z rodzaju Legionella, jest DotA. Białko to składa się z ośmiu domen spinających błony, dwóch dużych domen peryplazmatycznych (zbudowanych z około 503 i 73 aminokwasów) oraz jednej małej cytoplazmatycznej domeny C-końcowej (składającej się z 122 aminokwasów). Białko DotA zawiera także sekwencję sygnalną, która może się odłączyć od struktury białka. Domena peryplazmatyczna DotA jest umiejscowiona w górnej części centralnego kanału translokacyjnego i odpowiada za stabilizację jego ścian lub może zostać uwolniona [53]. Rozmieszczenie domen transmembranowych w strukturze DotA jest podobne do białek transporterowych typu ABC [54, 55]. Strukturalne podobieństwo wskazuje na możliwość oddziaływania białka DotA z innymi białkami, jako część kompleksu odpowiedzialnego za dostarczanie substratów do fagosomów we wnętrzu makrofagów. Potwierdza to wykazana zdolność wiązania się białka DotA z innym białkiem o niepoznanej dotąd funkcji, którego masa molekularna wynosi 46 kDa. W środowisku zewnątrzkomórkowym białko to razem z białkiem DotA tworzy oligomer przypominający pierścień [50]. Domena cytoplazmatyczna białka DotA przypuszczalnie pełni funkcję łącznika między białkami przenoszącymi energię w cytoplazmie i środowisku zewnątrzkomórkowym. Badania z wykorzystaniem mutantów L. pneumophila niezdolnych do wewnątrzkomórkowego namnażania się wykazały, że istnieje co najmniej jedno białko wiążące nukleotydy, którego funkcją jest przeniesienie energii do kompleksu zawierającego białko DotA [53].

Innym komponentem systemu Dot/Icm umiejscowionym w błonie zewnętrznej jest lipoproteina DotK [56]. Białko to zakotwicza system Dot/Icm w warstwie peptydoglikanu ściany komórkowej bakterii. Mutanty L. pneumophila defektywne w syntezie białka DotK nie namnażają się w komórkach ameb A. castellanii, ale nie tracą tej zdolności w makrofagach [18]. Składnikiem aparatu Dot/Icm jest peryplazmatyczne białko IcmX, dokładnej funkcji tego białka jeszcze nie poznano. Wiadomo, że jego brak wywołuje defekt wewnątrzkomórkowego namnażania się L. pneumophila, ale w dalszym ciągu możliwy jest proces składania systemu T4SS [40].

Do pozostałych białkowych komponentów systemu Dot/Icm o niepoznanych jak dotąd funkcjach należą małe integralne białka błony wewnętrznej IcmT oraz IcmV. Ortologi białka IcmT występują w wielu bakteryjnych systemach T4SS i w systemie koniugacyjnym typu I (TraK) [50]. Geny kodujące białko IcmV, podobnie jak białek IcmW i IcmF, zawierają region, który przypuszczalnie służy wiązaniu regulatorowych czynników transkrypcyjnych [57].

Poza modulowaniem transportu pęcherzykowego efektory systemu Dot/Icm wpływają na przebieg wielu procesów komórkowych gospodarza, takich jak biosynteza fosfolipidów, funkcjonowanie cytoszkieletu, dynamika mitochondriów, apoptoza czy autofagia (tabela 1).

Błona wakuoli wypełnionej bakteriami L. pneumophila wykazuje cechy wspólne dla autofagosomów, w tym ich ścisły związek z błoną ER, co sugeruje ingerowanie w maszynerię autofagii w procesie formowania niszy replikacyjnej. Białko efektorowe RavZ L. pneumophila o aktywności proteazy cysteinowej hydrolizuje wiązanie amidowe między C-końcową glicyną i sąsiednim aminokwasem aromatycznym białka Atg8, które w połączeniu z fosfatydyloetanoloaminą tworzy kompleks odpowiedzialny za dynamikę błony autofagosomalnej. Nieodwracalna inaktywacja białek Atg8 sprawia, że nie dochodzi do utworzenia systemu koniugacyjnego z białkami Atg3 i Atg7, w wyniku czego następuje kontrolowane zahamowanie procesu autofagii [86]. W inhibicji autofagii uczestniczy również białko LpSpl L. pneumophila, które wykazuje homologię do eukariotycznej liazy fosforanu sfingozyny, enzymu precyzyjnie regulującego poziom fosforanu sfingozyny zaangażowanego w stymulację autofagii. Aktywność enzymu LpSpl skutecznie obniża poziom komórkowej sfingozyny i w ten sposób opóźnia autofagiczną odpowiedź gospodarza podczas infekcji mysich makrofagów płuc [63]. Inne białko Lpg1137 o aktywności proteazy serynowej degraduje umiejscowioną w błonie ER związanego z mitochondriami syntaksynę 17 (STX17) zaangażowaną w proces dojrzewania autofagosomu i w ten sposób blokuje autofagię [20]. Sposób wzajemnego oddziaływania efektorów hamujących autofagię oraz strategiczna przewaga obecności kilku supresorów wymagają wyjaśnienia.

W inicjacji mechanizmów obronnych gospodarza podczas bakteryjnej infekcji gromadzone są inflamasomy, czyli wielobiałkowe kompleksy, które działają jak molekularna platforma do rekrutacji i aktywacji kaspaz. Inflamasomy powstają w odpowiedzi na obecność flageliny rzęski, która jest transportowana do cytozolu komórki gospodarza z wakuoli, w której występują L. pneumophila za pośrednictwem IV systemu sekrecji. Bogaty w leucynę C-koniec o strukturze spinki do włosów flageliny zostaje związany przez czynnik NAIP5, a utworzony kompleks oddziałuje z NLRC4, tworząc funkcjonalny inflamasom aktywujący kaspazę-1. Kaspaza-1 przekształca cytokiny IL-1ß i -18 w ich dojrzałe, aktywne postaci i dochodzi do reakcji zapalnej, pojawienia się kanałów w membranie makrofagów aż do śmierci komórki w wyniku pyroptozy. L. pneumophila wykorzystuje różne strategie, które swoiście opóźniają lub hamują szlaki apoptozy gospodarza w celu zapewnienia optymalnych warunków namnażania. Bakterie L. pneumophila uwolnione ze struktur biofilmu wytwarzają znacznie mniej białka flageliny, co pozwala uniknąć aktywacji czynnika NLRC4 [67]. Białko SdhA jest wydzielane do cytozolu komórki wkrótce po pobraniu L. pneumophila i stale jest syntetyzowane podczas wewnątrzkomórkowej replikacji bakterii [53]. Naruszenie integralności błony wakuoli u mutantów niezdolnych do syntezy białka SdhA uwalnia L. pneumophila do cytozolu makrofagów, gdzie bakterie narażone są na działanie przeciwbakteryjnych białek z rodziny GBP, a czego skutkiem jest uwolnienie LPS ze ściany komórkowej bakterii i aktywacja kaspazy-11. Gasdermina D tworzy kanały w błonie i dochodzi do śmierci komórki w procesie pyroptozy [50]. Celem działania efektora SidF są proapoptyczne białka BNIP i Bcl-Rambo, należące do rodziny Bcl-2 [88]. Jedna z domen tego białka wykazuje aktywność fosfatydyloinozytolo-3-fosfatazy, która swoiście hydrolizuje PI(3,4)P2 i PI(3,4,5)P3 i uczestniczy w wzbogaceniu błony fagosomu w PI(4)P, umożliwiając zakotwiczenie innych efektorów systemu Dot/Icm.

L. pneumophila indukuje również ekspresję kilku genów antyapoptotycznych gospodarza przez aktywację jądrowego czynnika transkrypcyjnego NF-κB, który odgrywa główną rolę w regulacji transkrypcji i aktywacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza na infekcję. Białkami aktywującymi NF-κB są efektory LegK1 i LnaB [90]. Białko LegK1 odpowiada za bezpośrednią fosforylację czynnika IκBα, który jest inhibitorem NF-κB. Farmakologiczne blokowanie czynnika jądrowego indukuje apoptozę komórki gospodarza i osłabienie wzrostu L. pneumophila [91]. W początkowej fazie infekcji L. pneumophila dochodzi do stłumienia sygnalizacji NF-κB za pośrednictwem transglutaminazy MavC, która katalizuje kowalencyjnie wiązanie ubikwityny do E2 enzymu UBE2N, hamując w ten sposób tworzenie łańcuchów poliubikwitynowych [38, 89, 92]. Natomiast efektor SidL oraz cytotoksyczne glukozylotransferazy Lgt1, Lgt2, Lgt3 wraz białkiem SidI swoiście obniżają syntezę inhibitora NF-κB [93]. Białko Sidl ma aktywność hydrolazy glikozylowej zależnej od GDP. Jego aktywność jest regulowana przez MesI, który jest jednym z 20 opisanych u L. pneumophila tzw. metaefektorów modyfikujących działanie innych efektorów. Różne regiony białka SidI są zdolne do jednoczesnego wiązania się z efektorem MesI oraz z czynnikiem translacyjnym komórki gospodarza eEF1A, czego skutkiem jest hamowanie translacji białek eukariotycznych [94].

Białko Lgt1 L. pneumophila selektywnie modyfikuje białka gospodarza o masie molekularnej około 50 kDa z użyciem glukozodifosforanu urydyny (UDP-glukozy) jako kosubstratu. Substratem dla tej glukozylotransferazy jest eukariotyczny czynnik elongacyjny eEF1A. Glikozylacja eEF1A powoduje zahamowanie syntezy białka i wywołuje śmierć komórki gospodarza oraz uwolnienie bakterii do otaczającego środowiska i rozpoczęcie kolejnej rundy replikacyjnej [95]. Interakcja Lgt1 z eEF1A jednocześnie indukuje reakcje stresowe w komórce gospodarza, których przejawem jest aktywacja białka regulatorowego szoku cieplnego HSF1 [69]. Ponadto Lgt1 może modyfikować białka szoku cieplnego Hsp70, co może mieć dodatkowy wpływ na indukcję odpowiedzi stresowej w zakażonych komórkach gospodarza [96].

Pięć efektorów L. pneumophila wydzielanych za pomocą IV systemu sekrecji hamuje translację białek gospodarza przez aktywację szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK), modyfikując w ten sposób odpowiedź transkrypcyjną komórki gospodarza [76]. Fosfataza fosfotyrozynowa Ceg4 zawierająca domenę o aktywności dehalogenazy-hydrolazy halo-kwasowej defosforyluje wiele peptydów zawierających fosfotyrozynę i w ten sposób może osłabić aktywację szlaków kontrolowanych przez MAPK zarówno w komórkach drożdży, jak i ludzkich [44].

L. pneumophila bezpośrednio moduluje maszynerię transkrypcyjną komórki gospodarza, wydzielając efektor RomA, który metyluje resztę lizyny (Lys14) histonu H3, blokując ekspresję genów gospodarza [2]. Innym efektorem, który również celuje w jądro komórki gospodarza, jest SnpL, który wiąże się z eukariotycznym czynnikiem SUPT5SH odpowiedzialnym za regulację zależnej od polimerazy II RNA obróbki i elongacji mRNA [41].

Bakterie Legionella pneumophila nabyły rzadką wśród mikroorganizmów zdolność do namnażania się w komórkach fagocytujących, w środowisku naturalnym w wybranych gatunkach pierwotniaków oraz w organizmie człowieka w makrofagach płucnych. Bakterie po przedostaniu się do makrofagów przełamują ich mechanizmy bójcze, powodując rozwój nietypowego zapalenia płuc, zwanego chorobą legionistów. Główną rolę w patogenezie L. pneumophila odgrywa aktywność białek efektorowych wydzielanych za pomocą IV systemu sekrecji Dot/Icm, które kontrolują poszczególne etapy infekcji od chwili pobrania bakterii, zakłócenia przebiegu różnych szlaków komórki gospodarza (przemieszczania się pęcherzyków, syntezy białek, ubikwitylacji, autofagii i apoptozy) aż po ucieczkę z komórki, w której drobnoustroje wyczerpały pulę substancji odżywczych. Poznanie w jaki sposób L. pneumophila precyzyjnie reguluje w czasie i przestrzeni funkcje poszczególnych efektorów, ma decydujące znaczenie w zapobieganiu i skutecznym leczeniu choroby legionistów.

ADP – adenozyno difosforan, ADPRT – rybozylotransferaza ADP, AMP – adenozyno monofosforan, ATP – adenozyno trójfosforan, CTE – C-końcowe podjednostki stanowiące przedłużenia, ER – retikulum endoplazmatyczne, GAP – białko aktywujące GTPazę, GDI – inhibitor dysocjacji nukleotydów guaninowych, GEF – czynnik wymiany nukleotydów guanininowych, GTP – guanozyno-5’-trifosforan, IAHP – białka homologiczne IcmF, LAMP – lizosomalne glikoproteiny związane z błoną, LCTM – kompleks rdzeniowotransmembranowy Legionella, LCV – wakuola replikacyjna Legionella, LT4CP – kompleks białek sprzęgających typu IV Legionella, MAPK – szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenami, NF-κB – jądrowy czynnik transkrypcyjny NF kappa B, PI-4P – 4-fosforan fosfatydylo-mio-inozytolu, S1P – sfingozyno-1-fosforan, SPL – liaza sfingozyno-1-fosforanu STX17 – syntaksyna 17, UDP-glukoza – glukozodifosforan urydyny.