Nanocząstki o wysokiej zawartości boru jako potencjalne nośniki w terapii borowo-neutronowej^*

Terapia borowo-neutronowa (boron neutron capture therapy, BNCT) jest zaliczana do celowanej radioterapii przeciwnowotworowej. Jej początki sięgają 1932 r., w którym to Chadwick odkrył neutrony. Następnie w 1935 r. Taylor i Goldhaber opisali reakcję wychwytu neutronów przez jądro boru, a rok później Locher zaproponował wykorzystanie tej reakcji w terapii onkologicznej [63]. Natomiast badania kliniczne nad BNCT, jako główną strategią przeciwnowotworową oraz terapią wspomagającą, trwają od lat 50. XX w. Pierwsza opisana próba kliniczna dotyczyła leczenia pacjenta, u którego zdiagnozowano glejaka wielopostaciowego i została przeprowadzona w 1951 r. z wykorzystaniem reaktora jądrowego znajdującego się w Brookhaven National Laboratory w Stanach Zjednoczonych [72]. Następne badania również skupiały się na traktowaniu złośliwych guzów mózgu, które ze względu na głębokie umiejscowienie, dużą dyslokację w strukturze mózgu oraz słabe utlenowanie były trudne do usunięcia za pomocą resekcji chirurgicznej oraz radioterapii i chemioterapii.

Ważnym aspektem w BNCT jest odpowiednie źródło neutronów. Obecnie najpopularniejszym źródłem generującym wiązkę neutronów są reaktory jądrowe, takie jak: KUR w Japonii, RA-6 w Argentynie, THOR na Tajwanie oraz BCTC w Chinach [41]. Jednak ze względu na ograniczenia spowodowane wysokimi kosztami utrzymania, brakiem możliwości wykorzystania w warunkach szpitalnych i ryzykiem skażenia radioaktywnego, prowadzone są prace nad zastosowaniem akceleratorów jako alternatywnego źródła neutronów [58]. Uważa się, że te urządzenia są tańsze, bezpieczniejsze, a dzięki niewielkim rozmiarom mogą być stosowane w warunkach szpitalnych [59]. Obecnie istnieją na świecie dwa akceleratory, które są wykorzystywane w badaniach klinicznych, mających na celu potwierdzenie ich bezpieczeństwa i skuteczności w dostarczaniu wiązki neutronów. Jeden znajduje się na Uniwersytecie Kyoto, drugi w szpitalu w Południowym Tohoku w Fukushimie [37, 41]. Dalsze prace nad doskonaleniem konstrukcji akceleratorów oraz nad pomiarami fizycznymi związanymi z generowaniem wiązki neutronów prowadzone są nie tylko w Japonii [43, 62], lecz także w: Rosji, Finlandii, Izraelu, Argentynie, Włoszech, Korei oraz Chinach [41]. Polska również włącza się w światowy nurt badań nad BNCT. W Narodowym Centrum Badań Jądrowych w Świerku, działającym przy reaktorze MARIA, powstaje stanowisko badawcze przeznaczone do tej terapii.

Badania nad skutecznością i bezpieczeństwem BNCT są rozwijane w takich krajach jak: Stany Zjednoczone, Japonia, Argentyna, Tajwan, Chiny, a także w kilku krajach europejskich – Finlandii, Szwecji, Czechach, Holandii i Włoszech [3, 63] – i skupiają się głównie na traktowaniu regionu głowy i szyi [36, 40], glejaka wielopostaciowego [56, 60], czerniaka [27], raka płuc [10] oraz wątroby [74].

Terapia borowo-neutronowa polega na selektywnym dostarczaniu związków zawierających nieradioaktywny izotop boru (¹⁰B) do komórek nowotworowych, a następnie napromienieniu zmienionego chorobowo miejsca wiązką neutronów termicznych o energii około 0,025 eV. Bor ma wysoki przekrój czynny na wychwyt neutronów, w wyniku czego dochodzi do rozszczepienia jego jądra, a następnie uwolnienia jąder litu (⁷Li) oraz cząstek alfa (⁴He) charakteryzujących się wysokim współczynnikiem liniowego przekazu energii (linear energy transfer, LET), a także promieniowania gamma zawierającego energię rzędu 2,31 MeV (ryc. 1) [3, 47].

Ryc. 1

Zasięg wygenerowanych wysokoenergetycznych cząstek alfa jest ograniczony długością ich ścieżki w tkance, która wynosi 5–9 μm, i jest zbliżony do średnicy pojedynczej komórki. Umożliwia to zmniejszenie uszkodzeń tkanki do miejsc, w których nastąpiło nagromadzenie się odpowiedniej ilości izotopu ¹⁰B, oszczędzając tym samym sąsiadujące niezmienione chorobowo komórki. Ze względu na ograniczoną głębokość przenikania neutronów termicznych, w badaniach klinicznych również stosuje się neutrony epitermiczne (0,025eV–10keV) charakteryzujące się wyż-szą energią i większym zasięgiem, umożliwiającym lepszą penetrację w głąb ciała [47]. Neutrony epitermiczne ulegają spowolnieniu w chwili przechodzenia przez tkankę, co nazywane jest termalizacją. Proces ten ma na celu zmniejszenie ich energii do energii neutronów termicznych (0,025 eV) [19]. Neutrony są elektrycznie obojętne i przechodzą przez ludzkie ciało bez oddziaływań elektrycznych, dopiero w chwili interakcji jądrowych uwalniają duże ilości energii rzędu MeV. Również sam izotop ¹⁰B nie jest radioaktywny, a jego usuwanie z organizmu zależy od tego w postaci jakiego związku występuje [68].

Terapia borowo-neutronowa, mimo wieloletnich wysiłków, nadal pozostaje w fazie badań klinicznych, nie tylko przez ograniczenia związane z dostępnością źródła neutronów, lecz także z powodu braku wydajnych związków zapewniających odpowiednią ilość boru w tkance docelowej. Badania prowadzone są dwoma nurtami, jeden to poszukiwanie nowych drobnocząsteczkowych związków boru, a drugi–z naszego punktu widzenia istotniejszy – to poszukiwanie nośników pozwalających na dostarczenie do guza bogatych w bor nanostruktur. Ponadto biodystrybucja otrzymanych związków, czy też nośników, powinna być zoptymalizowana w celu skutecznego dostarczania boru do tkanki guza, zwłaszcza do różnych subpopulacji komórek nowotworowych, jak i poprawy mikrodystrybucji komórkowej [3, 18, 53].

O przydatności związków/nośników boru w terapii borowo-neutronowej decydują następujące kryteria:

niska toksyczność ogólnoustrojowa,

Innym zagadnieniem jest tzw. efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji (enhanced permeability and retention, EPR), który w nowotworze pojawia się w wyniku utraty ciągłości ściany naczyń krwionośnych. Umożliwia to swobodną dyfuzję nanocząstek do mikrośrodowiska nowotworu. Ponadto w strukturze guza nie występują funkcjonalne naczynia limfatyczne odpowiedzialne za odprowadzanie płynu śródmiąższowego z tkanek. Dzięki temu nanometryczne struktury mogą swobodnie kumulować się w tkance nowotworowej, z której nie będą usuwane [8]. Istotne są także takie właściwości związku jak jego lipofilowość oraz stosowana dawka i droga podania, co przekłada się na stę-żenie tego związku w osoczu. Szczególnym wyzwaniem jest również pokonanie bariery krew-mózg, która chroni mózg przed cząsteczkami z krążenia ogólnoustrojowego, bo wysokie stężenie nośnika boru we krwi maksymalnie zwiększa jego wchłanianie przez naczynia krwionośne mózgu, nato-miast szybkie usuwanie z organizmu zmniejsza jego pobór, wyjątkiem jest tu dotętnicza droga podania związku [3, 75].

Pierwszym wykorzystywanym związkiem boru w BNCT był kwas borowy oraz jego pochodne, takie jak tetraboran sodu (boraks) i pentaboran sodu w roztworze glukozy. Jednak związki te okazały się nieselektywne, charakteryzowały się słabą retencją w komórkach nowotworowych i osiągały za niski stosunek stężenia boru guz/zdrowa tkanka. Ponadto uzyskane wyniki wskazywały na możliwość pojawienia się wielu działań niepożądanych, takich jak: radiodermatozy skóry głowy, owrzodzenia, a także obrzęk mózgu [2, 63, 72].

Obecnie w badaniach klinicznych nad BNCT wykorzystywane są dwa związki: BPA ((L)-4-dihydroxy-borylphenylalanine) i BSH (di-sodium undecahydro-mercapto-closo-dodecacar-borate) (ryc. 2), przede wszystkim ze względu na ich niską toksyczność, naturalne właściwości umożliwiające przenikanie do tkanki nowotworowej oraz retencję w guzie przez określony czas. Związki te jednak charakteryzują się za niską selektywnością, a ze względu na małą zawartość atomów boru muszą być podawane w dużych ilościach w celu zapewnienia odpowiedniego terapeutycznego stężenia [47].

Ryc. 2

BPA to związek po raz pierwszy zsyntetyzowany przez Snydera i wsp. w 1958 r., ale dopiero w latach 1988–1989 został zastosowany w badaniach klinicznych przez Mishima i wsp. [54]. Ze względu na strukturalne podobieństwo do tyrozyny, będącej prekursorem syntezy melaniny, uznano, że BPA może być pochłaniana przez melanocyty i początkowo wykorzystywano ją w leczeniu pacjentów z czerniakiem. Leczenie tego schorzenia opiera się na zasadzie podwyż-szonego poziomu syntezy melaniny przez komórki nowotworowe [5, 27, 47]. Wykazano, że BPA może być również pochłaniana przez inne histologicznie typy nowotworów, w tym guzy mózgu [16]. Do badań klinicznych wykorzystywany jest enancjomer L-BPA, który charakteryzuje się większym nagromadzeniem w komórkach nowotworowych w porównaniu z enancjomerem D i mieszaniną race-miczną. BPA jest związkiem hydrofobowym, dlatego w celu zwiększenia jej rozpuszczalności w wodzie jest często łączona z fruktozą. Jednak wraz ze wzrostem rozpuszczalności w wodzie pochodnych BPA spada ich cytotoksyczność w komórkach czerniaka. Bardziej hydrofilowe cząsteczki BPA mogą być podawane dożylnie, ale niestety zmniejsza to ich zdolność do przenikania bariery krew-mózg [47, 64]. Ze względu na swoją budowę, BPA jest transportowana przez kanały białkowe dla aminokwasów typu L, które przenoszą neutralne analogi aminokwasów zawierających aroma-tyczne łańcuchy boczne. Transporter aminokwasów układu L ulega nadekspresji w różnych typach nowotworów, m.in. w guzach mózgu, a to pozwala na łatwiejsze gromadzenie się BPA w komórkach nowotworowych w porównaniu z otaczającymi, zdrowymi tkankami. Pochłanianie tego związku odbywa się aktywnie, dlatego subpopulacje komórek nowotworowych w stanie spoczynku, czyli takich, które przestają się dzielić, mogą mieć niższy pobór BPA, zmniejszając w ten sposób skuteczność terapii. Jak wykazują dotychczasowe badania, biodystrybucja BPA u pacjentów z glejakiem, czerniakiem oraz nowotworami głowy i szyi osiągnęła stosunek stężeń boru guz/krew w zakresie 1,1–3,6 oraz w przypadku guz/zdrowe tkanki 1,1–2,9 [47, 55].

Drugi związek stosowany w BNCT to BSH (Na₂B₁₂H₁₁SH). Po raz pierwszy był zsyntetyzowany przez Millera i wsp. w 1964 r., a już w 1968 r. został wykorzystany do leczenia pacjentów z glejakiem przez Hatanake i Nakagawe w Japonii [26, 60] oraz Sauerweina i wsp. w Europie [78]. BSH jest anionową pochodną dodekaboranu stosowaną w terapii w postaci soli sodowej. W porównaniu do BPA wykazuje większą hydrofilowość oraz jest transportowany w sposób pasywny do komórek nowotworowych. Ze względu na charakter anionowy, preferencyjnie gromadzi się w guzach mózgu w porównaniu ze zdrowymi tkankami dzięki zaburzonej barierze krew-mózg [47, 88]. Biodystrybucja tego związku osiąga stosunek stężeń boru guz/krew w zakresie od 0,9 ±0,4 do 1,2 ±0,4, natomiast w przypadku guz/zdrowe tkanki 0,7 ±0,1 do 3,6 ±0,6 [47, 82].

Jedną z podstawowych różnic między opisanymi związkami jest to, że BSH zawiera 12 atomów boru na cząsteczkę, natomiast BPA tylko jeden atom. Dlatego biorąc pod uwagę równomierną akumulację molową obu tych związków w guzie, BSH może łatwiej osiągnąć stężenie terapeutyczne 20–35 μg ¹⁰B na 1 g guza [47].

Wykazano nie tylko osobnicze różnice w stopniu pobierania boru, lecz także zależne od typu nowotworu oraz jego strefy. Odmienność histologiczna poszczególnych nowotworów jest najprawdopodobniej odpowiedzialna za różnice w pochłanianiu i retencji BPA, i BSH. Dlatego też prowadzone są badania nad polepszeniem biodystrybucji komórkowej tych związków z uwzględnieniem różnych subpopulacji komórek nowotworowych przez regulację szybkości wlewu czy sposobu podania, który może być dożylny lub dotętniczy. Należy podkreślić, że równoczesne zastosowanie BPA i BSH pozwala na osiągnięcie działania synergistycznego tych związków [25, 29, 58]. Poza wspomnianym już łączeniem BPA z fruktozą w celu osiągnięcia lepszej rozpuszczalności w wodzie, do BSH i BPA można przyłączać związki umożliwiające przekroczenie bariery krew-mózg np. mannitol, czego skutkiem jest lepsza akumulacja boru w guzie. Zostało to potwierdzone in vivo na modelu szczurzego glejaka F98. Zwierzętom, przed podaniem BPA lub BSH, wstrzyknięto hiperosmotyczny roztwór mannitolu. Wyniki wykazały znaczny wzrost stężenia boru w guzie w porównaniu do grup, którym nie podano mannitolu [7].

Inną strategią, mającą na celu zwiększenie ilości BPA dostarczonej do guza, jest zastosowanie aminokwasowych analogów, takich jak L-DOPA, czyli L-3,4-dihydroksyfenyloalanina. Związek ten dzięki strukturalnemu podobień-stwu do BPA jest transportowany do komórek za pomocą transportera aminokwasów układu L. Transport opiera się na mechanizmie antyportowym sprzężonym z substratem, dzięki czemu wstępne dostarczenie L-DOPA zwiększa akumulację BPA w guzie. Strategia ta została potwierdzona in vitro na komórkach glejaka C6 oraz in vivo na szczurach obarczonych tym nowotworem, u których stwierdzono 2,7-krotnie wyższe pochłanianie BPA w guzie niż w grupie traktowanej samym BPA [11]. Zamiast L-DOPA, można wykorzystać L-tyrozynę, która także wpływa na podwyż-szoną akumulację BPA w nowotworze, co potwierdzono na komórkach glejaka 9L [81].

Jednym z rozwiązań prowadzących do zwiększenia pochłaniania BSH przez komórki nowotworowe jest zastosowanie peptydu penetrującego błonę komórkową (cell-penetrating peptide, CPP) przyłączonego do dendrymeru peptydowego zawierającego cząsteczki BSH. Tak przygotowany BSH badano in vitro na komórkach glejaka U87, wykazując znaczny wzrost stężenia BSH w guzie, w porównaniu z komórkami traktowanymi samym BSH, a w badaniach na myszach udowodniono, że BSH-dendrymer-CPP nie gromadzi się w zdrowej tkance, a tylko w guzie. Jest to prawdopodobnie osiągane dzięki dodatnio naładowanej części bogatej w argininę CPP (11 reszt argininy), która sprzyja wewnątrzkomórkowej akumulacji anionowego BSH [52]. Inną strategią, mającą na celu zwiększenie pobierania BSH przez komórki nowotworowe, jest sprzężenie tego związku z glikolem polietylenowym oraz kwasem poliglutaminowym. Badania koniugatu na komórkach raka jelita grubego C26 wykazały znacznie większe pobieranie i akumulację w tych komórkach w porównaniu do preparatów niepegylowanych i samego BSH [51].

W ostatnim 20-leciu rozpoczął się szybki rozwój badań nad nowymi związkami zawierającymi bor zarówno organicznymi, jak i nieorganicznymi. Ważnym aspektem jest wzbogacanie nośników w izotop ¹⁰B, ponieważ jego zawartość w naturalnie występującym borze wynosi 19,9% [47]. Kierunek badań nad związkami III generacji przedstawiono na ryc. 3. Uwagę skupiono na: modyfikowanych pochodnych aminokwasów [4, 33, 34], peptydów i białek [83, 85, 86], ale też nukleozydów [1, 6] i pochodnych cukrowych [31, 44]. Ważną rolę wydają się odgrywać klastery boru i ich pochodne [23] oraz wiele różnych cząsteczek biologicznie czynnych. Jednym z dokładniej badanych nośników boru są liposomy i ich pochodne [21, 42, 48, 49, 84]. Dużą zaletą liposomów jest możliwość ich ukierunkowania w celu selektywnego dostarczenia zamkniętych w nich związków do tkanki nowotworowej.

Ryc. 3

Jedną z możliwości jest sprzężenie liposomów z przeciwciałami monoklonalnymi swoistymi dla antygenu rakowo-płodowego (carcino-embrionic antygen, CEA). W badaniach Yanagie i wsp. takie liposomy selektywnie wiązały się z komórkami ludzkiego raka trzustki AsPC-1 eksprymującymi na swojej powierzchni CEA oraz dostarczały zamknięty w nich związek boru o wzorze Cs₂B₁₂H₁₁SH. Dzięki temu po napromienieniu wiązką neutronów hodowli komórek ich zdolność do przeżycia obniżyła się [84]. Inną strategią jest dołączenie do liposomów naskórkowego czynnika wzrostu (epidermal growth factor, EGF), co umoż-liwia ukierunkowanie na receptor EGF (epidermal growth factor receptor, EGFR) obecny na powierzchni wielu typów komórek nowotworowych. Badania Kullberga i wsp. wykazały zwiększone pochłanianie tak zmodyfikowanych liposomów przez komórki glejaka U-343MGaCl2:6, a dzięki zamkniętej w środku akrydynie związanej z borem, osiągnięto 10-krotne zmniejszenie przeżycia tych komórek po napromienieniu neutronami [42]. Aby skierować nośniki na receptor EGF, można także wykorzystać liposomy związane z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko EGFR. Taką strategię zastosowali Feng i wsp., którzy w immunoliposomach zamknęli BSH. Ich badania wykazały, że BSH był transportowany wyłącznie do komórek eksprymujących receptor. Wybiórczość pochłaniania immunoliposomów stwierdzono również w doświadczeniu in vivo na myszach obarczonych glejakiem U87 [21]. Natomiast Masunagi i wsp. wykorzystali inną modyfikację liposomów za pomocą transferryny i glikolu polietylenowego do zamknięcia w ich wnętrzu GB-10 (decahydrodecaborate-10B) lub BSH. Doświadczenie in vivo na myszach z rakiem płaskonabłonkowym języka SCC VII (squamous cell cancer) wykazało większy wychwyt nośnika przez komórki nowotworowe zawierające receptor i korzystny stosunek stężenia boru guz/krew. Dzięki temu po napromienieniu neutronami miejsca podania, PEGylowane liposomy z transferryną i zamkniętymi związkami boru wykazały większy efekt terapeutyczny niż inne formy tych związków [49].

W przypadku nieorganicznych nanocząstek, badania skupiają się na węgliku boru oraz azotku boru ze względu na dużą zawartość boru w ich strukturze oraz możliwość ukierunkowanych modyfikacji powierzchni.

Węglik boru (B₄C) jest lekkim związkiem nieorganicznym, który charakteryzuje się bogatą zawartością boru, obojętnym charakterem oraz stosunkowo wolną degradacją w organizmie, co czyni go potencjalnym kandydatem do wykorzystania w terapii borowo-neutronowej. Można go otrzymać różnymi metodami, m.in.: spiekania proszków, redukcji karbotermicznej, reakcji w fazie gazowej lub pirolizie polimerów. Dzięki procesom chemicznego i fizycznego osadzania z fazy gazowej ma szeroki zakres stechiometrii oraz struktur polikrystalicznych i amorficznych [77].

Mortensen i wsp., w celu sprawdzenia użyteczności węglika boru w BNCT, przetestowali jego działanie in vitro na mysiej linii komórkowej czerniaka B16F10. Po napromienieniu komórek wiązką neutronów zaobserwowano, że wraz ze wzrostem stężenia B₄C hamowana była proliferacja komórek nowotworowych, podczas gdy sam niepoddany naświetlaniu węglik boru nie wpływał znacząco na ich żywotność [57].

W celu zastosowania w BNCT zbadano różne metody otrzymywania węglika boru, jego strukturę krystalograficzną, wielkość, jednorodność oraz funkcjonalizację za pomocą wielu cząsteczek. Została określona jego cytotoksyczność i działanie na liniach komórkowych oraz na mode-lach mysich. Przykładem są przygotowane przez Ishikawe i wsp. cząsteczki B₄C o wielkości około 200 nm, otrzymane metodą pulsacyjnego laserowego naświetlania rozproszonego związku boru w octanie etylu pod ciśnieniem atmosferycznym i w temperaturze pokojowej. Każda uzyskana cząstka została zamknięta w warstwie grafitowej, która była korzystną modyfikacją powierzchni ułatwiającą połączenie z wybranym lekiem przeciwnowotworowym lub umożliwiającą uzyskanie cząsteczki o specyficznej zdolności do rozpoznawania tkanek [30]. Otrzymany węglik boru z otoczką grafitową przetestowano w warunkach in vitro pod kątem użyteczności w BNCT na linii komórkowej SAS ludzkiego płaskonabłonkowego raka języka (SCC) oraz na nagich myszach z heteroprzeszczepem SAS. Ponadto cząstki B₄C zostały bezpośrednio podane do guza w badaniach przeprowadzonych w warunkach in vivo. Na podstawie doświadczeń zaobserwowano:

zmniejszoną żywotność komórek w hodowlach, mimo że sam B₄C nie wpływał na wzrost komórek;

W wyniku przeprowadzonych doświadczeń obserwowano nieliczne działania niepożądane po podaniu B₄C [30, 32].

Natomiast w badaniach Tsuji i wsp. przygotowano cząstki węglika boru powleczone dodatnio naładowaną poli-L-lizyną i ujemnie naładowanym kwasem poliglutaminowym, a następnie sprzężono z transferryną. Koniugat został przetestowany in vitro na linii raka szyjki macicy HeLa oraz prawidłowych komórkach pochodzących z nerki szczura NRK (normal rat kidney). Wykazano, że modyfikowany węglik boru był internalizowany przez komórki nowotworowe za pomocą receptora transferryny, ale nie był pochłaniany przez komórki NRK. Ponadto w badaniach in vivo koniugat został wstrzyknięty dożylnie myszom, po czym był transportowany do guza, a następnie internalizowany przez komórki nowotworowe w procesie endocytozy w pobliże jądra [76].

Pochłanianie zmodyfikowanych cząstek węglika boru przez komórki potwierdziły także badania Yinghuaia i wsp. Zsyntetyzowali oni jednościenne nanorurki węglowe funkcjonalizowane peptydami, a po podaniu ich myszom z rakiem sutka EMT6 zaobserwowali większą akumulację tych struktur w guzie w porównaniu z wątrobą, płucami, śledzioną oraz krwią [87].

Innym przykładem jest opracowanie przez Petersena i wsp. funkcjonalizacji węglika boru z lizaminą i sekwencją peptydu TAT, która promuje adhezję komórkową oraz pobieranie cząstek. Komórki czerniaka B16-OVA inkubowano z tak modyfikowanym związkiem przez 12 godzin, po czym wstrzyknięto je myszom, a miejsce podania napromieniono wiązką neutronów termicznych po 1, 4 lub 8 dniach po podaniu preparatu. W porównaniu do kontroli nietraktowanej, największe opóźnienie wzrostu guza i wydłużenie przeżycia myszy zaobserwowano, gdy miejsce iniekcji było napromienione po jednym dniu od podania komórek. Potwierdzając, że modyfikowany w ten sposób węglik boru może być wykorzystany w terapii borowo-neutronowej, jako skuteczne narzędzie do opóź-niania wzrostu agresywnego guza litego, jakim jest czerniak B16-OVA [65].

Azotek boru (BN) to nieorganiczny związek boru i azotu o strukturze krystalicznej lub amorficznej. W postaci krystalicznej BN może występować m.in.: w układzie regularnym, heksagonalnym o budowie zbliżonej do grafenu lub układzie podobnym do struktury wurtzytu [67]. Do BNCT często wykorzystuje się heksagonalny azotek boru ze względu na jego chemiczną stabilność, a także tworzone z niego nanorurki, które mają dużą zawartość boru. Wykorzystując różne metody syntezy, można uzyskać wiele odmian polimorficznych tego związku. Istnieje bardzo wiele sposobów mających na celu wytworzenie wysokoenergetycznego wiązania między borem, a azotem, lecz do najważniejszych należy zaliczyć:

azotowanie amoniakiem lub azotem produktów powstałych w wyniku reakcji tlenowych związków boru ze związkami organicznymi zawierającymi w swojej strukturze azot;

Do uzyskania odpowiednich struktur BN przydatne są również techniki, takie jak: wyładowanie łukowe, mielenie kulowe, chemiczne osadzanie z fazy gazowej, pulsacyjne osadzanie laserowe, metody solwotermiczne, kriogeniczna eksfoliacja, sucha eksfoliacja z wykorzystaniem wodorotlenków, eksfoliacja wspomagana sonikacją, eksfoliacja chemiczna np. z wykorzystaniem kwasu o dużej zawartości protonów, czy też wykorzystanie wirowego urządzenia płynowego [9, 20, 24, 71].

Zaletą BN jest jego częściowo polarny charakter, dzięki temu ma większą stabilność, również w układach biologicznych, w porównaniu do nanocząstek węglowych [61]. W celu poprawienia dyspersji w wodzie i płynach fizjologicznych, poddaje się go różnym wariantom funkcjonalizacji powierzchni. Przykładowo zastosowano powlekanie polietylenoiminą i poli-L-lizyną [15], przyłączanie glikodendrymerów [12], niekowalencyjne owijanie glikol-chitozan [13] oraz modyfikowanie Tweenem 80 (monooleinian polioksyetyleno-80-sorbitanu) [28]. Do funkcjonalizacji powierzchni nanorurek azotku boru wykorzystano także rozpuszczalne w wodzie i biokompatybilne PEGylowane fosfolipidy – metoksy-poli(etylenoglikol)-1,2-distearoilosn-glicero-3-fosfoetanoloaminę (mPEG-DSPE o średniej masie cząsteczkowej 5000) [46]. Wykorzystując odpowiednie metody i warunki syntezy, np. metodę solwotermiczną, można uzyskać BN o dużej dyspersji w wodzie [38]. Innym rozwiązaniem jest synteza porowatego hydroksylowanego azotku boru z wykorzystaniem termicznego podstawienia atomów węgla strukturami kwasu borowego w azotkach węgla. Powstały BN wykazuje zwiększoną dyspersję w wodzie, biokompatybilność oraz może służyć jako wydajny nośnik leków przeciwnowotworowych [80]. Wszystkie wymienione modyfikacje powierzchni nanorurek doprowadziły do otrzymania związków dyspergowalnych w wodzie oraz rozpuszczalnikach organicznych. W terapii nowotworów mózgu, azotek boru można także połączyć z transferryną, która umożliwia przejście bariery krew-mózg, dzięki obecności wielu receptorów transferryny na komórkach śródbłonka [14].

Ważnym czynnikiem powodzenia BNCT jest niewielka toksyczność nośników boru w stosunku do zdrowych komórek. Testy cytotoksyczności, przeprowadzone przez Singha i wsp., wykazały, że nanorurki z azotku boru są bardziej cytotoksyczne w stosunku do linii raka szyjki macicy HeLa oraz linii ludzkiego gruczolakoraka piersi MCF-7 w porównaniu do prawidłowej linii ludzkich embrionalnych komórek nerek HEK-293 [71]. Natomiast Kaur i wsp. zsyntetyzowali azotek boru na potrzeby BNCT metodą solwotermiczną z użyciem kwasu borowego i roztworu amoniaku. Następnie przeprowadzili analizę cytotoksyczności tak przygotowanego związku na linii komórkowej HeLa. Badanie wykazało zależne od stężenia pobieranie boru przez komórki. Zaobserwowano, że w stężeniu do 1 mg/ml nie jest on cytotoksyczny, co może sugerować, że w takim maksymalnym stężeniu może być bezpiecznie używany w procedurach biomedycznych. Natomiast przy stężeniu 1,2 mg/ml wskaźnik cytotoksyczności wynosił już 40%. Związek ten nie powoduje wzrostu reaktywnych form tlenu, nie narusza błony jądrowej i nie zmienia gęstości chromatyny jądrowej, co sugeruje, że azotek boru nie powoduje znacznych uszkodzeń komórek [38]. W badaniach Ferreiry i wsp. komórki linii HeLa po inkubacji z nanorurkami azotku boru zostały dodatkowo napromienione wiązką neutronów. Wyniki wykazały, że śmiertelność tych komórek, które pochłonęły nanostruktury, była znacznie większa, niż komórek traktowanych samymi nanostrukturami lub samą wiązką neutronów [22]. W innych badaniach porównywano nanorurki z azotku boru sfunkcjonalizowane DSPE-PEG2000 z BSH i BPA. Koniugat wykazał trzykrotnie większą akumulację w komórkach czerniaka B16 niż BSH, ale słabszą niż BPA. Dzięki temu po napromienieniu komórek wiązką neutronów wywołał śmierć większej liczby komórek nowotworowych w porównaniu do BSH [61]. Wstępny test in vivo na zwierzętach przeprowadzili Ciofani i wsp. Ocenili początkowe bezpieczeństwo biologiczne nanorurek azotku boru przez podanie dożylne tego związku (1mg/kg masy ciała) królikom i przeprowadzenie analizy krwi, w wyniku której nie wykazano zmian podstawowych parametrów oraz upośledzenia funkcji wątroby i nerek. Nie zaobserwowano również toksyczności po jednorazowym podaniu dożylnym w ciągu 72 godzin [14].

Porównując oba związki, nanorurki azotku boru mają przewagę nad nanorurkami węglowymi, ponieważ wykazują obojętność chemiczną, stabilność termiczną oraz właściwości izolacyjne. Ponadto są lekkie, mają doskonałe właściwości mechaniczne, większą odporność na utlenianie oraz są strukturalnie stabilne i biokompatybilne [61]. Badania in vitro i in vivo wykazały, że struktury z azotku boru charakteryzują się mniejszą cytotoksycznością niż ich węglowe odpowiedniki [71]. Nanorurki azotku boru nie hamują wzrostu komórek HEK-293 ani nie indukują szlaków apoptotycznych, podczas gdy nanorurki węglowe mogą hamować proliferację tej linii komórkowej przez indukcję apoptozy i zmniejszenie zdolności adhezji [12, 17]. Ponadto udowodniono, że te węglowe struktury wykazują cytotoksyczność wobec ludzkich keratynocytów [70], mogą hamować wzrost embrionalnych komórek neuronu mózgu szczura [50], a także indukują tworzenie ziarniaków płuc u myszy [45, 79].

Nowotwory są istotnym problemem społecznym, szacuje się, że z powodu chorób onkologicznych na świecie umiera prawie 10 milionów osób rocznie, a w Polsce ta liczba przekracza 100 tysięcy. Mimo że złośliwe nowotwory regionu głowy i szyi, mózgu, czerniaka czy rak płuca lub wątroby stają się celem BNCT w coraz szerszym zakresie, zwiększenie skuteczności terapii wymaga opracowania nowych sposobów dostarczania boru w celu uzyskania stężenia terapeutycznego. Nanocząstki, takie jak węglik boru, azotek boru oraz liposomy zawierające związki bogate w bor stwarzają nowe perspektywy. Oczekuje się, że te nanostruktury, ze względu na obfitość pierwiastka, nie będą wymagały dodatkowego wzbogacania izotopem ¹⁰B. Ponadto, poddane modyfikacjom będą selektywnie ukierunkowane na środowisko nowotworu. Aby mogły zostać wykorzystane w przyszłości w celowanej terapii borowo-neutronowej, związki te wymagają dalszych badań nad bezpieczeństwem i skutecznością ich stosowania.