Small Colony Variants – The Cause Of Chronic Infections

Zmienność mikroorganizmów ma ogromny wpływ na ich chorobotwórczość i szeroko pojętą patogenność [28, 33]. Krętki Borreliella burgdorferi przechodzą, najczęściej pod wpływem stresu środowiskowego lub innych niekorzystnych dla bakterii warunków, w formy kuliste czy pozbawione ściany komórkowej. Daje to szansę krętkom Borreliella na długotrwałe przebywanie w zakażonym organizmie bez pobudzenia układu immunologicznego [28, 42]. Helicobacter pylori z form spiralnych przyjmuje postać form kokoidalnych, co najprawdopodobniej ułatwia kolonizację śluzówki żołądka [13], a Candida albicans może występować zarówno pod postacią drożdży pączkujących, jak i wydłużonych struktur (pseudostrzępki, strzępki). Formy wydłużone najczęściej związane są z inwazją i uszkodzeniem tkanek organizmu człowieka [32]. Podobnie jest z pałeczkami Campylobacter jejuni. Mikroorganizmy te pod wpływem braku składników odżywczych, obecności substancji toksycznych, stresu oksydacyjnego czy temperaturowego zmieniają swoją morfologię. Przechodzą w formę kokoidalną, podlegając również zmianom fizjologicznym i genetycznym. Daje to szansę tym bakteriom na przetrwanie w niekorzystnych warunkach środowiskowych przy zachowaniu właściwości infekcyjnych [47]. W niekorzystnych warunkach, np. w sytuacji braku składników odżywczych, tlenu czy niewłaściwego pH Mycobacterium tuberculosis może zmieniać wielkość i kształt komórek. Wykazano możliwość występowania tych mikroorganizmów pod postacią krótkich pałeczek przyjmujących kształt liter V i Y, form wydłużonych czy owalnych, a nawet pozbawionych ściany komórkowej (L-forma bakterii). Przejście w L-formę zauważono u wielu innych mikroorganizmów, i najczęściej ma to miejsce w przypadku zakażeń przewlekłych. Taką zdolność wykazano, między innymi u Bacillus anthracis, B. burgdorferi, H. pylori czy Treponema pallidum [10].

Występowanie mikroorganizmów w różnych formach morfologicznych na ogół wpływa na ich patogenność, daje również możliwość „chowania” się przed mechanizmami obronnymi ustroju gospodarza, co rzutuje na charakter, przebieg i czas trwania infekcji. Sprzyja zwiększonej tolerancji na związki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym czyniąc zastosowaną terapię nieskuteczną (może to mieć związek m.in. ze znacznym spadkiem aktywności metabolicznej „nowych” form morfologicznych) [20, 28]. Nie bez znaczenia są również trudności diagnostyczne z jakimi mamy często do czynienia w przypadku tak zmiennych mikroorganizmów [11, 13, 20].

U niektórych mikroorganizmów mogą powstawać specyficzne odmiany morfologiczne, tzw. formy SCVs – Small Colony Variants, określane w literaturze jako warianty małych kolonii [46, 50]. Pierwszy opisany gatunek, u którego wykryto możliwość tworzenia takich form to Salmonella enterica (S. enterica subsp. enterica serowar S. Typhi), dawniej Eberthella typhosa, co miało miejsce w 1910 roku. Obecnie wiadomo, że taką cechę wykazują zarówno bakterie Gram-ujemne (Pseudomonas aeruginosa, Coxiella burnetti, Burkholderia cepacia, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae czy Brucella abortus) jak i Gram-dodatnie, głównie gronkowce (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococus lugdunensis, Staphylococcus capitis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus czy Listeria monocytogenes) [14, 39].

Warto jednak zaznaczyć, że za najczęstszych „producentów” form SCV uznaje się S. aureus i P. aeruginosa. Większość opracowań, publikacji i badań klinicznych dotyczy właśnie tych mikroorganizmów [16, 26, 39, 43]. Chociaż pierwsze doniesienia o innych koloniach gronkowców można było znaleźć na początku XX wieku to prace opisujące powiązanie obrazu klinicznego z formami SCV S. aureus pojawiły się dopiero w 1994 i 1995 roku [16]. Podobnie jest z P. aeruginosa – od wielu lat obserwowana jest różnorodność fenotypowa pomiędzy izolatami tych szczepów pochodzących od pacjentów chorujących na mukowiscydozę. Nawiązują do tego prace pochodzące już z 1976 i 1977 roku. Jednak pierwsze badania kliniczne, w których skupiono się na fenotypowej charakterystyce izolowanych szczepów, pochodzą z lat 1996–1998 [26].

Odmienne właściwości form SCV rzutują na patogenność jak i charakter zakażeń wywołanych przez bakterie bytujące pod taką właśnie postacią morfologiczną. Najważniejsze, z punktu widzenia klinicznego, cechy charakterystyczne dla SCV w porównaniu do „typowych form” czyli tzw. form dzikich to znacznie wolniejszy wzrost i w konsekwencji mniejsze kolonie, nawet dziesięciokrotnie [5, 24, 45]. Subpopulacje komórek SCV mogą charakteryzować się odmiennymi właściwościami biochemicznymi i metabolicznymi, np. zmienionym metabolizmem węglowodanów [7], utratą zdolności wytwarzania enzymów czy toksyn, zmienioną ekspresją niektórych genów, a więc w pewien sposób zmienioną ekspresją czynników wirulencji [18, 24, 53]. Znacznie obniżona aktywność metaboliczna, której efektem są małe rozmiary komórek, daje również możliwość przeżycia wewnątrzkomórkowego [18, 50] i powoduje zwiększoną tolerancję na związki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, co ma ogromne implikacje kliniczne [11, 16].

Formy SCV S. aureus często tracą zdolność do wytwarzania barwnika, charakteryzują się zmniejszoną hemolizą na agarze z krwią, znacznie zmniejszoną fermentacją mannitolu, a ich wzrost można uzyskać dopiero po 48 godzinach inkubacji [7, 45, 53]. Obniżony potencjał błonowy u form SCV S. aureus jest najprawdopodobniej przyczyną zwiększonej oporności na przeciwdrobnoustrojowe związki kationowe – aminoglikozydy czy daptomycynę [53]. Subpopulacja SCV wykazuje brak aktywności systemu wyczuwania liczebnościowego quorum sensing agr, produkuje także polisacharydowy antygen PIA (polysaccharide intercellular antigen). Formy te charakteryzują się również zwiększoną ekspresją genów odpowiadających za syntezę wiążących białka macierzy pozakomórkowej adhezyn FnBPA, FnBPB (białka wiążące fibronektynę) [50]. Biorą one udział w przyleganiu do powierzchni komórek i tkanek ustroju gospodarza [50].

Podobnie jak u S. aureus odmianę SCV P. aeruginosa charakteryzują mały rozmiar, powolny wzrost oraz zwiększona oporność na antybiotyki. W badaniach in vitro wykazano, że ekspozycja P. aeruginosa na stężenia antybiotyków poniżej wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost skutkuje wytworzeniem form SCV. U form SCV P. aeruginosa zauważono większą zdolność do wydzielania egzopolisacharydu, w przypadku niektórych form głównie zwiększone wydzielanie alginianu, większą możliwość tworzenia biofilmu, oraz znacznie zmniejszone zdolności ruchu. Formy te wykazują również znacznie większą zdolność przylegania do ludzkich pneumocytów [26]. Badania przeprowadzone przez Mirani i wsp. [29] wykazały, że SCV P. aeruginosa mają znaczenie w utrzymaniu trwałości i stabilności biofilmu, a nie w początkowych etapach jego tworzenia – tu główną rolę autorzy przypisują populacji typu dzikiego. W miarę dojrzewania biofilmu pojawiają się formy SCV i zaczynają dominować co może sugerować, że populacja SCV jest „produktem” środowiska biofilmu. Wykazano również, że SCV w biofilmie charakteryzowały się znaczną chropowatością powierzchni, zwiększonymi właściwościami hydrofobowymi komórek i tym samym zwiększoną zdolnością do adhezji i kolonizacji [29].

Wszystkie wymienione właściwości form SCV powodują, że pomimo zmniejszonej zjadliwości, formy te często odpowiadają za zakażenia przewlekłe, nawracające, o słabo zaznaczonych objawach klinicznych i co najistotniejsze, trudne do leczenia. Za najważniejsze uznaje się fakt utrzymywania wewnątrzkomórkowego, czyli zdolność przeżycia w komórkach gospodarza i unikanie działania układu immunologicznego, a także zmniejszoną podatność na związki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym [15, 53]. Małe warianty kolonii są trudne do usunięcia z organizmu człowieka pomimo zastosowania skojarzonej terapii przeciwdrobnoustrojowej [53]. Istotne wydaje się również to, że selekcja takich form może mieć miejsce pod wpływem stosowanej antybiotykoterapii, w trakcie infekcji [18, 24] i co równie ważne, formy Small Colony Variants mogą „wracać” do fenotypu prawidłowego [46]. SCV pochodzące z materiału klinicznego to często właśnie formy niestabilne, powracające do formy „typu dzikiego” [53]. Według niektórych autorów stabilny fenotyp SCV najczęściej izolowany jest od pacjentów z zakażeniami przewlekłymi (np. zapalenie kości i szpiku, mukowiscydoza). Niestabilne odmiany Small Colony Variants to najczęściej formy powstałe po ekspozycji na antybiotyki, głównie aminoglikozydy i trimetoprim, czy warunki imitujące środowisko wewnątrzkomórkowe, przede wszystkim stres oksydacyjny czy niskie pH [45].

Pomimo tego, że prace nad powstawaniem form SCV trwają już od jakiegoś czasu wszystkie aspekty ich tworzenia nadal nie są jasne. Najprawdopodobniej powstają one w wyniku auksotrofii prowadzącej do defektów w elementach łańcucha transportu elektronów i produkcji ATP. Najczęściej dotyczy ona biosyntezy menadionu, heminy, tymidyny czy kwasów tłuszczowych [21].

Antybiotykoterapia wydaje się istotnym elementem przyczyniającym się do powstania form SCV. Nie w każdym przypadku można wykazać korelację pomiędzy typem auksotrofii a zastosowanym antybiotykiem. Dane literaturowe pokazuję jednak, że po zastosowaniu aminoglikozydów najczęściej dochodzi do rozwoju form Small Colony Variants zależnych od menadionu czy heminy. Pojawienie się form SCV zależnych od tymidyny ma miejsce natomiast najczęściej po terapii z zastosowaniem trimetroprimu-sulfametoksazolu. Najprawdopodobniej inne antybiotyki i chemioterapeutyki – klindamycyna, moksyfloksacyna – również sprzyjają transformacji komórek typu dzikiego w formę SCV [16].

Wspomniane już wcześniej zaburzenia w transporcie elektronów mogą prowadzić do zmian w potencjale transbłonowym co może chronić bakterie przed działaniem różnych związków o aktywności przeciwbakteryjnej [25]. Zmniejszenie potencjału transbłonowego skutkuje utrudnionym transportem aminoglikozydów do komórki i tym samym zmniejszoną wrażliwością na antybiotyki aminoglikozydowe, ale jednocześnie zmniejszoną produkcją ATP, co przyczynia się do powstania subpopulacji SCV. Warto zaznaczyć, że w przypadku komórek o fenotypie SCV, w wyniku zaburzeń w syntezie heminy i menadionu, występują defekty w cytochromie lub menachinonie, (nie dochodzi do syntezy cytochromu i menachinonu) czyli składowych łańcucha transportu elektronów [5, 11, 21, 25]. Jest to najprawdopodobniej wynikiem mutacji genów kodujących enzymy, które są zaangażowane w syntezę obu tych cząsteczek [11]. SCV zależne od tymidyny powstają w wyniku mutacji dotyczącej syntazy tymidylanu czyli enzymu, który odpowiedzialny jest za przekształcenie monofosforanu dezoksyurydyny (dUMP) do monofosforanu dezoksytymidyny (dTMP). Tymidynozależne SCV powstają najczęściej po długotrwałej terapii z zastosowaniem trimetoprimu-sulfametoksazolu [11]. Izolacja form SCV zależnych od tymidyny często ma miejsce w przypadku zakażeń przewlekłych np. dotyczących tkanek miękkich czy dróg oddechowych, głównie w przebiegu mukowiscydozy u pacjentów leczonych wspomnianym już wcześniej trimetroprimem-sulfametoksazolem (SXT). SXT działa jak kofaktor syntazy tymidylanowej (thyA) niezbędnej do syntezy tymidylanu. Najprawdopodobniej mutacje w thyA są związane z pojawieniem się zależnych od tymidyny form SCV u S. aureus i ma to związek z leczeniem SXT. W mysim modelu przewlekłego zapalenia płuc porównano myszy leczone i nieleczone SXT wykazując dominację szczepu dzikiego wśród myszy niepoddanych terapii. Autorzy pracy wykazali również, że krótkotrwała ekspozycja na SXT indukuje powstanie tymidynozależnych form SCV u szczepów dzikich S. aureus. Długotrwała terapia skutkuje pojawieniem się form SCV zależnych od tymidyny, ale zależnych od losowych mutacji w obrębie thyA co prowadzi do braku aktywności syntazy tymidylanu [19].

Tuschscherr i wsp. [52] oceniali możliwości leczenia przewlekłego zapalenia kości i szpiku, wrażliwość na antybiotyki jak i zdolność do indukowania tworzenia form SCV przez zastosowane związki przeciwdrobnoustrojowe. Autorzy stosowali m.in. ludzkie osteoblasty i szczepy kliniczne S. aureus izolowane z przewlekłego zapalenia kości i szpiku. W badaniach in vitro wykazano, że gentamycyna, moksyfloksacyna i klindamycyna znacznie częściej stymulowały do pojawiania się wariantów małych kolonii aniżeli, np. cefuroksym czy daptomycyna. Szybkość pojawiania się form SCV oceniali w okresie 1–10 dni od zastosowania antybiotyku, który stosowano w stężeniach równych wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost (MIC) jak i będących wielokrotnością wartości MIC (2 × MIC, 5 × MIC). Gentamycyna i moksyfloksacyna stymulowały do tworzenia stabilnych form Small Colony Variants, klindamycyna zaś niestabilnych, które szybko wracały to fenotypu dzikiego. U wszystkich powstałych subpopulacji SCV nie wykazano auksotrofii względem menadionu, heminy czy tymidyny [52].

W badaniach z zastosowaniem osteoblastów autorzy wykazali zwiększoną częstość tworzenia subpopulacji SCV po 48 h od zastosowania gentamycyny, fosfomycyny i klindamycyny [52].

Selekcja fenotypu SCV może być także wynikiem ekspozycji na stosowane antyseptyki. Subpopulacja SCV nie wykazuje na ogół w takim przypadku żadnej konkretnej auksotrofii [11].

Autorzy pracy z 2020 roku [21] zwracają uwagę, między innymi, na wzajemne oddziaływanie różnych mikroorganizmów względem siebie jako czynnik przyczyniający się do selekcji subpopulacji komórek SCV [21]. W pracy skupiono się przede wszystkim na wpływie innych gatunków na selekcję fenotypu Small Colony Variants u gronkowca złocistego. Jednym z takich oddziaływań jest wzajemna korelacja P. aeruginosa – S. aureus. Te dwa mikroorganizmy często izolowane są razem z różnych zakażeń np. dotyczących ran w stopie cukrzycowej, zapaleń kości i szpiku czy dróg oddechowych u pacjentów z mukowiscydozą. Wydzielany przez P. aeruginosa N-tlenek 4-hydroksy-2-heptylochinoliny (HQNO) poprzez blokowanie transportu elektronów w łańcuchu oddechowym i produkcji ATP hamuje wzrost gronkowca złocistego. W badaniach in vitro wykazano, że długotrwała ekspozycja na HQNO w połączeniu z aminoglikozydami prowadziła do tworzenia komórek o fenotypie SCV zależnych od menadionu [21].

Nie ma istotnych dowodów na to, że inne gatunki indukują tworzenie form SCV, ale jak zaznacza autor wspomnianej pracy [21] jest to możliwe w przypadku każdego mikroorganizmu, który negatywnie wpływa na przeżycie S. aureus. Chodzi tu m.in. o Corynebacterium spp., Streptococcus spp. czy S. lugdunensis [21]. Najczęściej ma to związek z wydzielaniem różnych substancji o działaniu przeciwdrobnoustrojowym przez bakterie, np. lugduniny, antybiotyku peptydowego przez S. lugdunensis czy H₂O₂ przez Streptococcus pneumoniae [21].

Jak zaznacza Stoneham, tworzenie małych wariantów kolonii przez S. aureus, to najprawdopodobniej konstytutywna cecha wzrostu, umożliwiająca ochronę przed zmieniającymi się, przede wszystkim niekorzystnymi, warunkami środowiska [45]. Według Kahl i wsp. [16] mechanizmy tworzenia mogą być różne na różnych etapach zakażenia. We wczesnym etapie zakażenia biorą głównie udział mechanizmy regulacyjne, dające szansę bakteriom na szybką reakcję na zmieniające się warunki środowiskowe (otoczenia), w późniejszym etapie dochodzi do określonych mutacji np. w syntezie tymidyny czy w układzie transportu elektronów [16].

Po przekroczeniu przez gronkowce bariery nabłonka, w reakcjach obronnych organizmu człowieka biorą udział neutrofile, które dążą do zabicia wewnątrzkomórkowego wnikającego patogenu. Odbywa się to przede wszystkim z zastosowaniem aktywnych form tlenu i białek przeciwdrobnoustrojowych (AMP – Antimicrobial Peptides). Warto zaznaczyć, że gronkowce dysponują różnymi czynnikami chorobotwórczości, które ułatwiają im unikanie aktywności układu immunologicznego organizmu człowieka [8]. Nie bez znaczenia jest również zdolność do tworzenia struktur biofilmu przez te mikroorganizmy. Biofilm chroni komórki gronkowców przed niekorzystnym działaniem mechanizmów układu odpornościowego człowieka [8].

S. epidermidis, unika zabicia wewnątrzkomórkowego przez neutrofile głównie poprzez wydzielane polimery. Istotną rolę odgrywają tutaj PGA (PGA – poly-γ-DL-glutamic acid) oraz antygen PIA. PGA utrudnia przebieg procesu fagocytozy, znosi także działanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Podobnie PIA – hamuje fagocytozę i przeciwbakteryjną aktywność peptydów, dodatkowo sprzyja tworzeniu struktur bioflmu [8, 37].

Podobnie jest w przypadku S. aureus. Ten „wszechstronny” mikroorganizm pod względem posiadanych czynników wirulencji, potrafi skutecznie unikać mechanizmów obronnych organizmu człowieka. Podobnie jak u S. epidermidis istotną rolę odgrywa polisacharyd PIA jak i wspomniana wcześniej zdolność tworzenia biofilmu [6, 8]. Z innych czynników należy wymienić toksynę α (rozkłada komórki, głównie leukocyty), koagulazę, białko A (wiąże immunoglobuliny) czy proteazy [6]. Istotnym wydaje się fakt, że na odpowiedź naszego organizmu w odniesieniu do gronkowca złocistego składa się aktywacja zarówno mechanizmów wrodzonych jak i adaptacyjnych. „Rozpoznanie intruza” pobudza komórki fagocytarne, głównie makrofagi i neutrofile, chociaż przez wielu autorów za kluczowe uważane są właśnie neutrofile [1, 8]. W przypadku odpowiedzi adaptacyjnej istotną rolę odgrywają zarówno limfocyty T jak i limfocyty B. Dochodzi do pobudzenia limfocytów T i wytwarzania przeciwciał przez limfocyty B i pojawienia się „pamięci immunologicznej”. Limfocyty T jak i wytworzone przeciwciała mogą wspomagać działanie komórek odpowiedzi wrodzonej [17].

Badania z 2010 roku prowadzone przez Tuchscherr i wsp. [51] pokazują, że zdolność „przetrwania” form SCV S. aureus w organizmie człowieka uzależniona jest od pewnych aspektów (jest wielotorowa). Wyniki badań wyżej wymienionych autorów wskazują na znacznie wyższą ekspresję białek FnBPs u form SCV niż u szczepu dzikiego. Białka te w dużej mierze odpowiadają za wnikanie gronkowców do wnętrza komórek (śródbłonka, nabłonka) organizmu człowieka. Bytując wewnątrzkomórkowo formy SCV nie wywoływały odpowiedzi zapalnej, co miało miejsce w przypadku szczepów dzikich. U form SCV najprawdopodobniej ma to związek ze znacznie niższym poziomem ekspresji tak ważnych dla wywoływania odpowiedzi zapalnej czynników patogenności gronkowców jak produkcja hemolizyny α i aktywność proteazy. W przypadku szczepu dzikiego obserwowano wywoływanie silnej odpowiedzi zapalnej i znaczne zmniejszenie „liczebności” komórek bakteryjnych bytujących wewnątrzkomórkowo. Formy SCV, najprawdopodobniej poprzez wolny wzrost, nie pobudzają silnie własnych komórek ustroju gospodarza do odpowiedzi immunologicznej [50, 51]. Tan i wsp. [48] wykazali również, że po wejściu do komórki formy SCV S. aureus „wyłączają” wytwarzanie toksyn, co daje szansę tym mikroorganizmom na pozostanie w organizmie człowieka przez dłuższy czas bez indukowania odpowiedzi immunologicznej [34, 48]. Autorzy pracy tłumaczą unikanie mechanizmów odpornościowych organizmu człowieka przez formy SCV różnotorowo: przerwanie odpowiedzi prozapalnej, brak działania toksycznego na komórki i odwracalne przełączanie czynników wirulencji [48].

Magryś i wsp. [25] oceniając możliwość przeżycia from SCV S. epidermidis wewnątrzkomórkowo wykazali zdolność wariantów małych kolonii gronkowca skórnego do „uciekania” przed bakteriobójczym działaniem komórek fagocytujących. W zabiciu mikroorganizmu przez komórki żerne pomaga niskie pH fagolizosomu czy wydzielanie tlenku azotu. SCV były w stanie przetrwać w makrofagach. Wyniki przeprowadzonych badań pokazały, że w przeciwieństwie do szczepu dzikiego, który był eliminowany w niskim pH fagolizosomu, formy SCV gronkowca skórnego były w stanie przetrwać w tych niekorzystnych warunkach. Możliwość przeżycia wewnątrz fagolizosomów najprawdopodobniej jest związana z niskim potencjałem transbłonowym subpopulacji wariantów małych kolonii albo ze zmienioną budową ściany komórkowej [25].

Stymulacja syntazy tlenku azotu doprowadza do wydzielania wspomnianego już wcześniej tlenku azotu. Do ekspresji syntazy dochodzi głównie pod wpływem czynników zapalnych. Wydzielany w dużych ilościach tlenek azotu oddziałuje przede wszystkim z białkami fagocytowanych bakterii. Wykazano, że pobudzenie do wydzielania syntazy tlenku azotu w przypadku subpobulacji SCV S. epidermidis było znacznie niższe niż w przypadku szczepu dzikiego [25].

W przypadku P. aeruginosa rolę zarówno w patogenności, ale także w odpowiedzi immunologicznej organizmu człowieka odgrywa lipopolisacharyd (LPS) tych mikroorganizmów. LPS bierze udział w pobudzeniu wrodzonej jak i nabytej odpowiedzi immunologicznej [54]. Endotoksyna pobudza komórki gospodarza głównie do wydzielania mediatorów o działaniu miejscowym jak i ogólnoustrojowym. Pobudza przede wszystkim makrofagi. Po rozpoznaniu LPS przez receptory TLR4 (Toll-like receptor 4) dochodzi do zwiększonej glikolizy przez makrofagi pęcherzykowe i neutrofile, wydzielania cytokin (np. TNFα, IL-1, IL-6 czy IL-8) i wydzielania reaktywnych form tlenu (ROS). Pobudzone przez LPS mitochondria hamują aktywność hydroksylazy prolilowej co umożliwia stabilizację HIF-1α (hypoxia-inducible factor 1). HIF-1α indukuje ekspresję mRNA pro-IL-1β. Wydzielanie dojrzałej IL-1β do środowiska zewnątrzkomórkowego pobudza miejscowe fagocyty do zwiększonej aktywności przeciwdrobnoustrojowej [40].

Warto zaznaczyć, że różne czynniki chorobotwórczości pałeczki ropy błękitnej, szczególnie wydzielane toksyny i enzymy, chronią P. aeruginosa przed działaniem układu immunologicznego organizmu człowieka. Istotną rolę w tym zakresie odgrywają cytotoksyny (ExoS i ExoT utrudniają proces fagocytozy), czy elastaza (głównie inaktywuje przeciwciała klasy IgG i IgA). Piocyjanina z kolei poprzez pobudzenie do wydzielania reaktywnych form tlenu i w konsekwencji do apoptozy komórek układu immunologicznego może prowadzić do zahamowania odpowiedzi immunologicznej [54].

Ważnym elementem w ochronie przed działaniem układu odpornościowego organizmu człowieka jest biofilm tworzony przez te mikroorganizmy. Bakterie w utworzonej strukturze biofilmu mają spowolnioną szybkość replikacji i znacznie wolniejszy metabolizm. Wszystkie cechy biofilmu powodują, że komórki bakterii nie są już tak dostępne dla komórek układu immunologicznego i charakteryzują się znacznie większą opornością na związki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, głównie na antybiotyki [40]. Warto zaznaczyć, że istotną rolę odgrywa zewnątrzkomórkowy polisacharyd, czyli alginian, który jest jednym z najbardziej istotnych i głównych składników biofilmu. Pomaga w dojrzewaniu jak i w utrzymaniu stabilności biofilmu. Jego obfite wydzielanie do przestrzeni międzykomórkowej utrudnia znacznie proces fagocytozy i zwiększa oporność na antybiotyki [27, 54].

Dane literaturowe pokazują, że właściwości fenotypowe Small Colony Variants P. aeruginosa mogą być bardzo różne. Odmiana RSCV charakteryzuje się głównie powolnym wzrostem, zwiększonym wydzielaniem cyklicznego monofosforanu guanozyny (c-di-GMP), zdolnością do agregacji i zwiększonym wydzielaniem egzopolisacharydu (ePS). Wydzielanie c-di-GMP wydaje się kluczowym elementem w przejściu mikroorganizmów z formy planktonowej w biofilmową, stymulując między innymi do zwiększonego wydzielania ePS. Z kolei autoagregacja jak i zwiększone wydzielanie ePS mogą okazać się kluczowe dla unikania odpowiedzi immunologicznej organizmu człowieka przez formy RSCV. Pestrak i wsp. [36] wykazali zmniejszoną odpowiedź fagocytów na formę RSCV w porównaniu do szczepu dzikiego. Autorzy zaznaczają, że mechanizm unikania fogocytozy w tym przypadku nie jest jeszcze do końca jasny, ale najprawdopodobniej związany jest właśnie ze zwiększonym wydzielaniem egzopolisacharydów i co za tym idzie zwiększoną autoagregacją. Według autorów może to sprzyjać unikaniu fagocytozy i przetrwaniu mikroorganizmu w miejscu zakażenia. Ci sami autorzy wykazali również, że formy RSCV P. aeruginosa pobudzają neutrofile do wydzielania reaktywnych form tlenu (ROS). Należy podkreślić, że w odpowiedzi na zakażenie pobudzone neutrofile stymulują do wydzielania różnych związków przeciwdrobnoustrojowych np. peptydów przeciwdrobnoustrojowych czy właśnie reaktywnych form tlenu. Proces ten, właściwie kontrolowany, ma doprowadzić do zabicia patogennej bakterii. Przedłużająca się aktywność neutrofili może być już szkodliwa dla organizmu człowieka doprowadzając do uszkodzenia okolicznych tkanek. Autorzy wykazali zwiększone wydzielanie reaktywnych form tlenu przez neutrofile w odpowiedzi na formę RSCV niż na szczep dziki i jednocześnie zmniejszoną wrażliwość RSCV właśnie na związki o działaniu przeciwdrobnosutrojowym (reaktywne formy tlenu, peptydy przeciwdrobnoustrojowe czy H₂O₂). Wspomniane już wcześniej zjawisko autoagregacji i zwiększone wydzielanie ePS wydają się kluczowe w nadmiernym pobudzeniu neutrofili, ale jednocześnie w zwiększonej tolerancji form RSCV na związki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, pomimo silnej stymulacji neutrofili. Warto zaznaczyć, że RSCV stymulują do silnej, ale jednak nieskutecznej odpowiedzi immunologicznej [36].

Chociaż pierwsze informacje o tworzeniu nowych, różniących się od fenotypu prawidłowego komórek SCV, pojawiły się ponad 100 lat temu, nie wszystkie mechanizmy dotyczące ich powstawania są wyjaśnione. Można przypuszczać, że tworzenie się form Small Colony Variants to jedna ze strategii przetrwania mikroorganizmów, być może forma przystosowawcza do panujących, często niekorzystnych, warunków otoczenia. SCV daje szansę na ucieczkę przed mechanizmami odpornościowymi organizmu człowieka, działaniem antybiotyków czy innych związków przeciwdrobnoustrojowych, a także na kolonizację i w konsekwencji rozwój zakażenia [16, 45].

Znajomość właściwości form SCV i ich znaczenia klinicznego może przyczynić się do właściwego postępowania diagnostycznego i terapeutycznego.