The Role And Importance Of Selected Virulence Factors Determining The Pathogenicity Of Uropathogenic Escherichia Coli Strains

Pozajelitowe patogenne szczepy Escherichia coli ExPEC (extraintestinal patogenic E. coli) charakteryzują się różnorodnymi genotypami, jak i fenotypami, a w ich obrębie wyróżnia się, m.in. grupę uropatogennych szczepów Escherichia coli (uropathogenic E. coli, UPEC) odpowiedzialnych za 75–95% przypadków zakażeń układu moczowego (ZUM), zarówno u dzieci, jak i osób dorosłych [4, 6, 10, 33, 34]. UPEC mogą kolonizować nabłonek układu moczowego człowieka, lecz o ich chorobotwórczości i zdolności do przeżycia w określonym środowisku decydują posiadane czynniki wirulencji i/lub nabyte przez bakterie cechy oporności na antybiotyki [4, 10, 60].

UPEC są niezwykle zróżnicowane pod względem prezentowanych czynników wirulencji. Potencjał inwazyjny tego patotypu związany jest z wytwarzaniem różnych typów adhezyn i inwazyn umożliwiających bakteriom przyleganie do komórek gospodarza, toksyn modulujących odpowiedź immunologiczną i szlaki metaboliczne oraz sideroforów niezbędnych do asymilacji żelaza [4, 38]. Ponadto ogromną rolę w patomechanizmie ZUM odgrywa zdolność tworzenia biofilmu przez szczepy UPEC. Biofilm stanowi bowiem skuteczną barierę dla stosowanych antybiotyków, co niejednokrotnie prowadzi do niepowodzeń terapeutycznych oraz przyczynia się do przewlekłych i nawracających stanów zapalnych układu moczowego [41].

Geny kodujące czynniki wirulencji szczepów UPEC umiejscowione są na ruchomych elementach genetycznych przenoszonych drogą horyzontalnego transferu genów (horizontal gene transfer, HGT). Zmieniające się środowisko stymuluje powstawanie nowych kombinacji genów czynników wirulencji powodując rozprzestrzenianie się nieobserwowanych dotąd patogennych klonów E. coli, wyróżniających się większą zjadliwością i ekspansywnością [4]. Dlatego też kompleksowa wiedza na temat determinant wirulencji szczepów UPEC, tj. sideroforów, receptorów sideroforów, toksyn, genotoksyn, białek Usp i Ag43, czy też zdolności do tworzenia biofilmu umożliwi lepsze poznanie patomechanizmu ZUM, co w przyszłości może posłużyć do opracowania nowych strategii zapobiegania i leczenia zakażeń wywołanych przez UPEC [55].

Żelazo to niezbędny element wielu procesów komórkowych, m.in. zasadniczy kofaktor enzymów zaangażowanych w pierwotny i wtórny metabolizm komórkowy zarówno u organizmów eukariotycznych, jak i prokariotycznych [7, 63].

Pomimo, że w organizmie występuje znaczna ilość żelaza, to przeważająca część jest związana z białkami, takimi jak: hemoglobina, transferryna, laktoferyna lub ferrytyna, co znacznie ogranicza dostępność tego pierwiastka dla drobnoustrojów chorobotwórczych. Skutkuje to zahamowaniem wzrostu bakterii i uniemożliwia dalszy rozwój zakażenia [7, 15, 51, 63]. Szacuje się, iż stężenie wolnego żelaza we krwi wynosi zaledwie 10^–24–10^–25 M, podczas gdy w tkankach wartość ta waha się od 10^–7 do 10^–8. Należy zaznaczyć, iż przytoczone wartości są zdecydowanie niższe od poziomu żelaza wymaganego do prawidłowego przebiegu procesów metabolicznych i podziałów komórkowych bakterii tj. 10⁵–10⁶ M [51, 63]. Niedobór żelaza to główna przeszkoda do wzrostu drobnoustrojów, dlatego też bakterie wykształciły różnorodne mechanizmy umożliwiające pozyskanie tego pierwiastka z organizmu gospodarza. Jednym z nich jest tzw. system wychwytu żelaza wykorzystujący siderofory, takie jak: enterobaktyna (ent), salmochelina (iro), jersiniabaktyna (irp, ybt) i aerobaktyna (iuc), mające zdolność do chelatowania żelaza organicznego ze środowiska [2, 7, 56, 63]. Siderofory można podzielić na pięć głównych klas, tj. katecholany, fenolany, siderofory typu kwasu hydroksamowego, α-hydroksykarboksylany oraz siderofory typu mieszanego. Zgodnie z tą klasyfikacją enterobaktyna i salmochelina zaliczane są do katecholanów, z kolei jersiniabaktyna do fenolanów, a aerobaktyna do sideroforów typu mieszanego [51].

Wśród szczepów UPEC mogą występować różne kombinacje wspomnianych sideroforów, z czego niektóre szczepy wytwarzają wszystkie cztery [57]. Komórka bakteryjna za pośrednictwem sideroforów jest w stanie wiązać żelazo i z powodzeniem konkurować z białkami gospodarza o dostęp do tego pierwiastka [7, 63]. Z kolei receptory błony zewnętrznej dla sideroforów ułatwiają transport kompleksu żelazo-siderofor przez błonę zewnętrzną bakterii do cytozolu, w którym to żelazo jest uwalniane. Wśród szczepów UPEC znanych jest wiele receptorów dla sideroforów, m.in. IroN (receptor dla salmocheliny), IutA (receptor dla aerobaktyny), FyuA (receptor dla jersiniabaktyny), Iha (receptor dla enterobaktyny) [3]. Dla przykładu szczep E. coli CFT073 koduje aż 14 receptorów błony zewnętrznej dla sideroforów oraz 4 systemy biosyntezy i transportu sideroforów, jak również szereg przepuszczalnych TonB zależnych receptorów zaangażowanych w wychwyt żelaza [20]. Co interesujące, badania doświadczalne wykazały, iż w mysim modelu zakażeń górnych dróg moczowych, delecja genów dla TonB receptorów w szczepach UPEC skutkowała osłabienień kolonizacji przez drobnoustroje w okresie 48 godzin od zakażenia [36].

Powszechnym sideroforem występującym w szczepach UPEC jest enterobaktyna [48, 63]. Niemniej jednak, produkcja enterobaktyny nie jest unikalna dla E. coli i została opisana również wśród innych izolatów ZUM, tj. Klebsiella spp., Enterobacter spp. i Citrobacter spp. [48]. Enterobaktyna charakteryzuje się powinowactwem do jonów żelaza rzędu K_d ~10⁻⁴⁹ i konkuruje z transferryną o wiązanie tego pierwiastka w organizmie gospodarza, dlatego też szczepy UPEC syntetyzujące enterobaktynę wykazują zdolność do kolonizacji miejsc ubogich w żelazo, takich jak drogi moczowe [48, 63]. Z kolei w organizmie gospodarza aktywowane neutrofile uwalniają białko lipokalinę 2, zwaną również lipokaliną neutrofilową, związaną z żelatynazą wykazującą zdolność do wiązania się z enterobaktyną i uniemożliwiającą tym samym jej połączenie z żelazem. Lipokalina 2 wykazuje, więc właściwości bakteriostatyczne, zmniejszając konkurencyjny wychwyt Fe³⁺ przez szczepy UPEC, co hamuje ich namnażanie [63].

Kolejnym sideroforem jest salmochelina, po raz pierwszy wykryta u szczepu Salmonella spp., skąd też wywodzi się jej nazwa [51]. Salmochelina powstaje w wyniku glikozylacji enterobaktyny przez glukozylotransferazę [48, 63]. Tego typu modyfikacja enterobaktyny zakodowana w klastrze genów iroBCDEN zlokalizowanym na plazmidzie ColV l, ColBM lub wyspie patogenności (PAI, pathogenicity island), zapobiega jej rozpoznaniu przez lipokalinę 2 [4, 51, 63]. Ze względu na fakt, iż kompleks żelazo-salmochelina nie jest rozpoznawany przez receptor dla enterobaktyny bakterie wykształciły kolejny receptor, tj. IroN, którego główną rolą jest wiązanie i transport do cytoplazmy ww. kompleksów, co umożliwia efektywne wykorzystywanie żelaza przez szczepy UPEC [4, 63]. Co więcej, białku IroN przypisuje się zasadniczą rolę w inwazji in vitro komórek nabłonka dróg moczowych przez szczepy ExPEC [18].

Jersiniabaktyna to kolejny siderofor umożliwiający pozyskiwanie Fe³⁺ z ustroju gospodarza, kodowany na PAI. Jersiniabaktyna po raz pierwszy została wykryta u bakterii Yersinia pestis, zaś w chwili obecnej opisana została jako istotna determinanta wirulencji takich drobnoustrojów jak: Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp., Citrobacter spp. i kilka patotypów E. coli [48, 51, 62]. Jednym z ważniejszych genów obecnych na PAI jest gen fyuA kodujący 71 kDa białko błony zewnętrznej pełniące rolę receptora dla kompleksu Fe³⁺-jersiniabaktyna. Ponadto wyniki badań przeprowadzonych przez Hancock i wsp. [24] wskazują, że FyuA odgrywa istotną rolę w tworzeniu biofilmu przez patogenne szczepy w środowisku ubogim w żelazo, takim jak ludzki mocz. Badania szczepu E. coli VR50, mutanta fyuA, wykazały bowiem aż 92% redukcję zdolności tworzenia biofilmu w porównaniu do szczepu dzikiego.

Podczas gdy enterobaktyna jest wytwarzana i wykorzystywana niemal przez wszystkie szczepy E. coli, to aerobaktyna, salmochelina i jersiniabaktyna oraz receptory dla tych sideroforów występują głównie u szczepów patogennych. Istnieje wiele dowodów potwierdzających istotną rolę systemu wychwytu żelaza u bakterii odpowiedzialnych za zakażenia dróg moczowych. U pacjentów z nawracającym ZUM wśród wyizolowanych szczepów E. coli zaobserwowano zwiększoną syntezę salmochelin i jersiniabaktyny. Podobnie UPEC odpowiedzialne za zapalenie pęcherza moczowego u kobiet kodowały większość z opisanych elementów systemów wychwytu żelaza łącznie z lokus dla biosyntezy i transportu jersiniabaktyny [20, 63].

W badaniach nad szczepionkami zapobiegającymi niepowikłanym ZUM przez szczepy UPEC to właśnie receptory dla sideroforów zlokalizowane na błonie zewnętrznej bakterii są głównym przedmiotem zainteresowań wakcynologów. Okazało się bowiem, że szczepionki zawierające białka będące elementem systemu wychwytu żelaza stanowią skuteczną ochronę przez zakażeniem szczepami UPEC w modelu eksperymentalnym [3, 7].

Alteri i wsp. [1] przeprowadzili badania z wykorzystaniem bioinformatyki, genomiki, transkryptomiki i proteomiki oceniające przydatność, m.in. Iha, IreA, IutA IroN w szczepionkach. Podczas donosowej immunizacji myszy dwa, z czterech badanych receptorów dla sideroforów, tj. IreA, IutA, indukowały odpowiedź immunologiczną, zarówno układową, jak i miejscową, tj. błony śluzowej obejmującą wytwarzanie przeciwciał klasy IgM, IgG i IgA, co zapobiegało kolonizacji pęcherza moczowego przez szczepy E. coli. Spośród 5 379 białek pochodzących ze szczepu E. coli CFT073 odpowiedzialnego za odmiedniczkowe zapalenie nerek (OZN), tylko sześć spełniało wszystkie kryteria określono jako PASivE (pathogen-specific, antigenic, surface-exposed, and in vivo expressed). Obejmowały one: wysoką specyficzność mającą na celu uniknięcie kierowania odpowiedzi immunologicznej na komensalne szczepy E. coli, antygenowość, ekspozycję powierzchniową w celu łatwego rozpoznania przez układ odpornościowy gospodarza oraz ekspresję in vivo [3, 7, 8].

Brumbaugh i wsp. [7] zidentyfikowali czwarty antygen możliwy do zastosowania w szczepionkach, m.in. fyuA, zapewniający skuteczną i długotrwałą odpowiedź humoralną chroniącą przed zakażeniami UPEC.

Należy również podkreślić ważną rolę receptora błony zewnętrznej dla salmocheliny, tj. IroN w zapobieganiu ZUM. Podskórna immunizacja myszy zdenaturowaną formą IroN skutkowała znaczącym wzrostem wytwarzania specyficznych przeciwciał w klasie IgG, jednakże nie wywoływała istotnej układowej, jak i śluzówkowej odpowiedzi przeciwciał w klasie IgA. W modelu doświadczalnym immunizacja z wykorzystaniem receptora IroN zapewniała ochronę przed zakażeniem UPEC w nerkach myszy, jakkolwiek nie zaobserwowano skutecznej ochrony przed zakażeniem w pęcherzu moczowym. Nie jest jednak wykluczone, że dalsze badania skupiające się na zastosowaniu, m.in. adjuwantów lub innej alternatywnej drogi podania szczepionki, umożliwią w przyszłości w pełni skuteczne wykorzystanie IroN w zapobieganiu zakażeniom szczepami UPEC [8].

Podsumowując systemy biosyntezy i transportu sideroforów oraz receptory OM dla sideroforów umożliwiają UPEC wychwyt żelaza, co ułatwia kolonizację i utrzymywanie się w drogach moczowych [57].

Gen usp kodujący białko Usp (uropathogenic specific protein) wykrywa się u 93,4% szczepów E. coli izolowanych od pacjentów z OZN i 88% szczepów pochodzących od pacjentów z przerostem gruczołu krokowego. Dla porównania zaledwie 24% szczepów E. coli izolowanych od zdrowych osób z próbek kału posiada w swoim genomie usp. Wysoką częstość występowania tego genu stwierdzono również w przypadku szczepów E. coli izolowanych od pacjentów z bakteriemią i/lub urosepsą [40, 67].

Po raz pierwszy gen usp został wykryty w szczepie UPEC Z42 wyizolowanym od pacjenta z przerostem gruczołu krokowego. Gen usp (1,8 kb) kodowany jest na małej wyspie patogenności PAIusp wraz z 3 otwartymi ramkami odczytu imu1-3, oznaczanymi również, jako orfU1, orfU2 i orfU3, kodującymi białka OrfU1, OrfU2 i OrfU3 [40, 68]. Istnieją dwa warianty tego genu – uspI i uspII różniące się sekwencją końca 3’ oraz strukturą regionu zawierającego orfUs. W związku z tym, w zależności od wariantów usp i sekwencyjnego układu orfUs, PAIusp można sklasyfikować do czterech podtypów, tj. Ia, Ib, IIa, IIb. Co interesujące, u szczepów E. coli wyizolowanych od pacjentów z ZUM obserwuje się w obrębie PAIusp dwa lub trzy orfUs, podczas gdy, wśród szczepów tzw. kałowych tylko jeden orfU [67]. Na podstawie badań przeprowadzonych przez Kanamaru i wsp. [30] stwierdzono, że 42,4% szczepów UPEC usp⁺ należało do podtypu IIa, podczas gdy 28,4% szczepów do Ia, 9,8% do Ib i tylko 2,7% do IIb. W 2000 r. ukazała się praca Clermonta i wsp. [11] opisująca technikę typowania filogenetycznego, z wykorzystaniem reakcji PCR. Według autorów na podstawie obecności genów markerowych (chuA, yjaA oraz fragmentu DNA oznaczonego jako TspE4.C2, pochodzącego z biblioteki naukowców) szczepy E. coli można sklasyfikować do następujących grup filogenetycznych, tj. A, B1, B2 i D.

Liczne dane literaturowe wskazują, że wirulentne pozajelitowe szczepy E. coli reprezentują głównie grupę B2 i w mniejszym stopniu grupę D, z kolei większość szczepów komensalnych klasyfikuje się do grupy A lub B1 [9]. Wyniki uzyskane przez Kanamaru i wsp. [30] wykazały, iż 94,9% szczepów E. coli posiadających gen usp sklasyfikowano do grupy filogenetycznej B2, natomiast zaledwie 11,4% do grupy A, 13,8% do B1 i 24,3% do grupy D. Ponadto analiza sekwencji nukleotydowej wykazała około 40–45% identyczność regionu C-terminalnego białka Usp z bakteriocynami typu nukleaz, tj. kolicyną E7 E. coli oraz piocyjaniną S Pseudomonas aeruginosa, posiadającymi tzw. motyw H-N-H nukleaz. Z kolei w przypadku N-terminalnego regionu Usp wykazano podobieństwo do białka systemu sekrecji typu VI, tj. Hcp-like [12, 40].

Liczne badania eksperymentalne potwierdziły, że Usp E. coli wykazuje homologię do bakteriocyn typu nukleaz. Bakteriocyny definiowane są jako bakteriobójcze białka lub peptydy wytwarzane przez bakterie. Różnią się one od tradycyjnych antybiotyków tym, że wykazują aktywność wobec bakterii ściśle związanych ze szczepem produkującym. Bakteriocyny typu nukleaz niszczą komórki docelowe poprzez degradację ich kwasu nukleinowego [67]. Ponadto, postuluje się, że białka OrfU1-3 zaangażowane są w ochronę komórek wytwarzających Usp przed ich własną aktywnością nukleazową oraz nadają bakteriom oporność wobec innych bakteriocyn [12, 67]. Szczepy kodujące trzy orfUs są oporne na większą liczbę bakteriocyn, dlatego też mogą być bardziej rozpowszechnione niż bakterie kodujące jedno lub dwa orfUs [67]. C-terminalny region Usp wykazuje homologię z motywem H-N-H. Charakterystyczny motyw H-N-H obserwuje się w obrębie różnego typu nukleaz reprezentowanych przez bakteriocyny typu nukleaz, jak również wśród endonukleaz typu ‘homing’. Co więcej, motyw H-N-H obecny jest również w obrębie nukleaz uczestniczących w różnorodnych procesach biologicznych, takich jak rekombinacja, czy zaprogramowane przegrupowanie DNA podczas różnicowania. H-N-H obserwuje się także w centrum aktywnym niektórych enzymów restrykcyjnych. Należy dodać, że nukleazy te wytwarzane są przez bakterie, wirusy i eukarionty. Już wcześniejsze badania potwierdziły, że Usp wykazuje homologię z bakteriocynami typu nukleaz, np. kolicynami. Większość bakteriocyn typu nukleaz posiada trzy funkcjonalne domeny: domenę nukleazy, domenę translokacji i domenę rozpoznawania receptora. Ich główną rolą jest rozpoznanie specyficznego receptora, translokacja białka do komórki docelowej i ostatecznie degradacja chromosomalnego DNA. W przypadku Usp, oprócz domeny nukleazy stwierdza się również obecność regionu homologicznego do domeny translokacji [68].

Na podstawie badań przeprowadzonych przez Zaw i wsp. [68] stwierdzono, że Usp wykazuje aktywność DNA-zy. Ponadto ukierunkowana mutageneza potwierdziła, że motyw H-N-H w C-terminalnym regionie Usp jest niezbędny do jej aktywności nukleazowej, co wskazuje, że Usp można sklasyfikować do tzw. H-N-H nadrodziny nukleaz. Nipic i wsp. [40] stwierdzili, że Usp jest nowo poznaną genotoksyną oddziaływującą na komórki eukariotyczne, wywołującą, m.in. fragmentację DNA komórek [32]. Co więcej, genotoksyczna aktywność Usp zwiększa się wówczas, gdy Usp występuje łącznie z białkiem Imu2 [22, 37]. Szczepy E. coli posiadające zarówno usp-imu2, jak i usp-imu1-3 mogą wywołać zaokrąglanie komórek, rozpad cytoszkieletu aktynowego i aktywację kaspazy 3 i 7, co w efekcie prowadzi do apoptozy komórek.

Ze względu na fakt, że Usp jest stosunkowo nowo poznanym czynnikiem wirulencji szczepów E. coli wyjaśnienie zarówno samych właściwości tego białka, jak i jego wpływu na komórki eukariotyczne wymaga dalszych badań. Pomimo przeprowadzonych analiz wskazujących, że Usp wykazuje tzw. niespecyficzną aktywność nukleazową podobną do znanych bakteriocyn typu nukleaz, brak jest danych potwierdzających, iż aktywność czy spektrum niszczonych komórek są takie same. W celu poznania jednoznacznej odpowiedzi niezbędne są dalsze badania [68]. Ponadto niezwykle interesująca byłaby ocena czy krótkoterminowa ekspozycja komórek na oczyszczony Usp-Imu2 lub zakażenie szczepami E. coli usp-imu1-3 może aktywować klasyczną DDR (DNA damage response) indukowaną przez CDT, toksynę ‘typhoid’ czy kolibaktynę [22]. Aktywacja DDR następuje w odpowiedzi na uszkodzenia DNA i obejmuje mechanizmy mające na celu aktywację szlaków naprawy DNA. Co więcej, DDR wpływa na punkty kontrolne samego cyklu komórkowego [32].

Należy zaznaczyć, iż w chwili obecnej zidentyfikowano jedynie kilka bakteryjnych genotoksyn. Wśród nich, oprócz Usp wyróżnia się, m.in. toksyny typu AB, tj. rodzinę toksyn CDT (cytolethal distending toxin) oraz toksynę ‘typhoid’ wydzielaną przez Salmonella enterica serovar Typhi. Toksyna CDT zbudowana jest z trzech jednostek, tj. CdtA, CdtB o aktywności DNA-zy i CdtC. Wytwarzana jest przez liczne bakterie Gram-ujemne, m.in. E. coli (EcCDT), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (AaCDT), Haemophilus ducreyi (HdCDT), Shigella dysenteriae (SdCDT), Campylobacter spp. (CjCDT) oraz Helicobacter hepaticus (HhCDT). Toksyna CDT wywołuje uszkodzenia materiału genetycznego, co skutkuje zaburzeniami cyklu komórkowego i apoptozą komórek eukariotycznych [22, 32].

Kolejną genotoksyną jest kolibaktyna zidentyfikowana w 2006 r., wytwarzana przez szczepy E. coli należące do grupy filogenetycznej B2. Kolibaktyna należy do tzw. poliketydowych-nierybosomalnych peptydów. W przypadku kolibaktyny zmiany w materiale genetycznym komórek w odróżnieniu od CDT nie są indukowane przez białka efektorowe, lecz wiążą się z obecnością 54 KB genomowej wyspy, znajdującej się w locus asnW tRNA [22].

Białka autotransporterowe (autotransporter proteins, AT) reprezentujące ogromną rodzinę białek, odgrywają ważną rolę w patogenezie wielu chorób, głównie ze względu na pełnione przez nie różnorodne funkcje biologiczne, tj. adhezja, agregacja, czy formowanie biofilmu. Należy dodać, iż AT są szeroko rozpowszechnione wśród bakterii Gram-ujemnych. Wytwarzają je wszystkie klasy Proteobacteria, jak również liczne gatunki należące do Chlamydiales i Fusobacteriales. Wśród AT wyróżnia się, m.in. AIDA (adhesin involved in diffuse adherence)-I, której reprezentantem jest Ag43 stanowiący białko błony zewnętrznej. Autotransportety AIDA-I zbudowane są z peptydu sygnałowego, ‘passenger domain’, tj. α-domeny oraz ‘translocation domain’, czyli β-domeny [46, 61].

Białko Ag43 (autotransporter protein antigen 43) kodowane jest przez gen agn43, pierwotnie określony, jako flu lokus [61]. Antygen 43 obecny jest u licznych bakterii E. coli, zarówno chorobotwórczych, jak i komensalnych należących do różnych grup filogenetycznych. Należy również podkreślić, że niektóre szczepy posiadają nawet kilka kopii tego genu. W przypadku komensalnych szczepów E. coli 56% z nich koduje agn43. Dla porównania u ponad 90% szczepów UPEC stwierdzono obecność tego genu. Wyniki te sugerują częstsze występowanie agn43 u szczepów chorobotwórczych. W chwili obecnej wyróżnia się co najmniej 5 wariantów allelicznych agn43, tj. agn43 K12, agn43 EDL933, agn43 RS218, agn43a CFT073 i agn43b CFT073 [46]. Ag43 zalicza się do AT, które ulegają glikozylacji przez cytozolowe transferazy. Glikozylacja wpływa na utrzymanie konformacji białek, zapewnia oporność na trawienie proteolityczne, ułatwia adhezję komórkową oraz rozpoznanie komórek gospodarza [31]. Reidl i wsp. [45] wykazali, że O-glikozylacja domen Ag43 doprowadzała do zaburzeń agregacji i znaczącego zmniejszenia adhezji do linii komórek eukariotycznych.

Białko Ag43 pełni wiele ważnych funkcji, m.in. pośredniczy w agregacji komórek, co sprzyja tworzeniu biofilmu, a to z kolei może wiązać się z długotrwałą obecnością bakterii w pęcherzu moczowym. Wyniki uzyskane przez Ulett i wsp. [58] wyraźnie wskazują, że Ag43 (z K-12 E. coli) powiązane jest z wczesnym stadium tworzenia biofilmu. Ag43 ze względu na pośrednictwo w formowaniu biofilmu promuje długotrwałą kolonizację dróg moczowych. Biofilm bakteryjny odgrywa bowiem ważną rolę w przeciwstawianiu się siłom obronnym gospodarza oraz antybiotykom, co z kolei utrudnia skuteczne i szybkie wyleczenie pacjentów [55]. Wyniki badań uzyskane przez Heras i wsp. [25] wskazują, że domena α Ag43 dzięki unikatowej β-helikalnej strukturze w kształcie litery L umożliwia i ułatwia tworzenie agregatów komórkowych poprzez tzw. molekularny mechanizm ‘Velcro-like handshake’.

Białko Ag43 jest szeroko rozpowszechnione u szczepów wywołujących bezobjawową bakteriurię, zapalenie pęcherza moczowego oraz OZN [59]. Badania przeprowadzone przez Lüthje i wsp. [35] wykazały występowanie tego genu u 92% szczepów wywołujących nawrotowe ZUM, co może sugerować ważną rolę tego białka w długotrwałym utrzymywaniu się bakterii w drogach moczowych. Wysoką ekspresję Ag43 zaobserwowano u szczepów tworzących tzw. ‘młody’ biofilm, w przeciwieństwie do szczepów stanowiących biofilm ‘dojrzały’. W związku z czym postuluje się, że Ag43 odgrywa ważną rolę we wczesnym etapie tworzenia biofilmu, jednakże nie jest niezbędne do ‘dojrzewania’ biofilmu. Jest to zgodne z badaniami przeprowadzonymi przez Wallecha i wsp. [61], którzy zaobserwowali najwyższy poziom ekspresji Ag43 u E. coli K12 w początkowej fazie wzrostu bakterii.

Szczep UPEC CFT073 koduje przynajmniej 10 białek AT. W przypadku Ag43 obecne są dwa warianty, tj. Ag43a i Ag43b, kodowane na PAI. Białka te wykazują około 90% homologię w sekwencji aminokwasowych, zaś kodujące je geny około 91% identyczność sekwencji nukleotydowych. Ponadto obserwuje się 85% homologię α-domeny obydwu białek. Pomimo tak dużego stopnia podobieństwa Ag43a i Ag43b różnią się między sobą, np. stopniem agregacji komórek. Podczas gdy Ag43a promuje silną agregację, Ag43b pośredniczy w zdecydowanie słabszej agregacji komórek [25, 58]. Ponadto wykazano, że równoczesna ekspresja fimbrii typu 1, może blokować bezpośredni kontakt komórka-komórka, co skutkuje zmniejszeniem agregacji komórek [59]. Wyniki uzyskane przez naukowców wyraźnie wskazują, że ekspresja Ag43a przez szczep CFT073 jest konieczna do optymalnej kolonizacji pęcherza moczowego w mysim modelu ZUM. Z kolei Ag43b charakteryzuje się słabszymi właściwościami w promowaniu agregacji i tworzeniu biofilmu, co nie sprzyja kolonizacji dróg moczowych [59]. W oparciu o metodę immunofluorescencji ekspresję Ag43 wykazano również wśród szczepów tworzących IBCs, (intracellular bacterial communities), co może sugerować ważną rolę tego białka w wewnątrzkomórkowej fazie wzrostu szczepów UPEC [55].

Biofilm bakteryjny określany jest jako złożona, wielokomórkowa, niejednorodna strukturalnie i zróżnicowana genetycznie tzw. ‘społeczność bakterii’ otoczona warstwą zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS, extracellular polimeric substance) [53, 55]. Wytwarzanie EPS nie jest niezbędne do adhezji bakterii do określonej powierzchni, lecz odgrywa ważną rolę w tworzeniu trójwymiarowej struktury biofilmu [65]. Szacuje się, że komórki bakteryjne stanowią zaledwie 10–25% biofilmu, podczas gdy EPS, aż 75–90% [37]. Biofilm mogą tworzyć bakterie należące do jednego lub kilku gatunków, a także grzyby [55]. Na formowanie biofilmu mają wpływ czynniki środowiskowe, np. obecność substancji odżywczych, czy ciśnienie osmotyczne. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że wzrost osmolarności do 0,3 M NaCl w pożywce hamuje tworzenie biofilmu przez szczepy E. coli oraz ogranicza wzrost badanych bakterii [65]. W zależności od miejsca powstawania i składu gatunkowego biofilm może przyczynić się do rozwoju zakażeń wywołujących implikacje zarówno kliniczne, jak i terapeutyczne. W medycynie bakterie tworzące biofilm na sztucznych powierzchniach, czy innego rodzaju ciałach obcych, tj. protezach ortopedycznych, sztucznych zastawkach serca, cewnikach moczowych, odgrywają istotną rolę w patogenezie, m.in. zapalenia wsierdzia, zapalenia płuc, jak również zapalenia szpiku kostnego oraz pęcherza moczowego [41].

Proces powstawania biofilmu można podzielić na pięć etapów. W pierwszym z nich dochodzi do adhezji bakteryjnej do różnego rodzaju powierzchni, zarówno biotycznych, jak i abiotycznych. O skuteczności przylegania bakterii do powierzchni docelowej decydują właściwości zarówno samej powierzchni, jak również właściwości hydrofobowe powierzchni komórki bakteryjnej. Ponadto duże znaczenie mają oddziaływania międzycząsteczkowe, np. siły van der Waalsa, wiązania jonowe oraz wodorowe. W drugim etapie komórki bakteryjne zostają nieodwracalnie związanie z kolonizowaną powierzchnią i rozpoczyna się proces wytwarzania EPS. W kolejnych dwóch etapach dochodzi do formowania dojrzałego biofilmu, poprzez tworzenie mikrokolonii, intensywne podziały komórkowe oraz dalszą syntezę macierzy pozakomórkowej. Ważną rolę odgrywa w tych etapach proces wyczuwania liczebności (quorum sensing’), w którym to komórki bakteryjne komunikują się ze sobą poprzez uwalnianie, wykrywanie i reagowanie na cząstki sygnałowe stymulujące ich podziały komórkowe oraz regulujące procesy fizjologiczne. W ostatnim etapie pojedyncze komórki bakteryjne lub nawet większe fragmenty biofilmu ulegają dyspersji, a następnie adhezji do nowych powierzchni, nawet odległych anatomicznie [41].

Bakterie tworzące biofilm wykazują wielokrotnie większą oporność (nawet 1000–1500-krotnie) na antybiotyki oraz substancje toksyczne w porównaniu do komórek planktonowych. EPS stanowi bowiem fizyczną barierę utrudniającą opsonizację i fagocytozę przez komórki układu immunologicznego [28, 37, 41]. Co więcej, bakterie w obrębie biofilmu często tworzą różne subpopulacje, cechujące się odrębnymi właściwościami fizjologicznymi, metabolizmem, czy ekspresją genów, dlatego też „wspólnota bakteryjna biofilmu” składająca się z wielu różnych subpopulacji, wykazuje oporność na tak szeroki zakres czynników środowiskowych [28].

W przypadku ZUM niebezpieczne są zwłaszcza implikacje kliniczne związane z tworzeniem biofilmu na cewnikach. Należy podkreślić, że formowanie biofilmu rozpoczyna się natychmiast po umieszczeniu cewnika w pęcherzu moczowym [27]. E. coli dzięki zdolności adhezji do wielu polimerów wchodzących w skład cewników, takich jak: polipropylen, polistyren, polichlorek winylu, czy silikon, jest w stanie trwale i skutecznie je skolonizować [40]. Rozwinięcie się ZUM jest ściśle związane z długością okresu pozostawania cewnika w drogach moczowych, przy czym każdy kolejny dzień zwiększa to ryzyko o 3–8% [26, 27, 41].

Cechą odróżniającą komórki tworzące biofilm od komórek planktonowych jest obecność EPS składającej się, np. z białek, polisacharydów i/lub DNA. Skład macierzy biofilmu różni się także między poszczególnymi gatunkami bakterii [28, 55]. Należy podkreślić, że fimbrie spiralne zostały zidentyfikowane, jako pierwsze tzw. funkcjonalne amyloidy będące zewnątrzkomórkowymi białkami wytwarzanymi przez wiele bakterii jelitowych, w tym E. coli i Salmonella spp. Amyloidy od dziesięcioleci są intensywnie badane, przy czym należy zaznaczyć, że odgrywają one ważną rolę w chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona i Huntingtona. Niedawno odkryto nową klasę amyloidów, określonych, jako tzw. amyloidy funkcjonalne [16].

W przypadku szczepów E. coli, fimbrie spiralne są głównym składnikiem białkowym macierzy biofilmu, przy czym ich produkcja ograniczona jest do wybranych subpopulacji. Ekspresja fimbrii spiralnych jest kontrolowana przez szereg sygnałów środowiskowych i gradientów chemicznych, takich jak temperatura, osmolarność i tlen. Główną podjednostką fimbrii spiralnych jest CsgA, ponadto wyróżnia się, m.in. CsgB i CsgC [16]. Fimbrie spiralne są istotnym czynnikiem wirulencji szczepów UPEC, gdyż ułatwiają kolonizację pęcherza moczowego w mysim modelu doświadczalnym oraz pośredniczą w tworzeniu biofilmu. Należy dodać, że w przypadku nieleczonych zakażeń, może rozwinąć się bakteriemia, wówczas, w próbkach surowicy pochodzących od pacjentów z bakteriemią stwierdza się obecność przeciwciał przeciwko głównej podjednostce fimbrii spiralnych, tj. CsgA, co podkreśla ich istotną rolę w patomechanizmie niektórych zakażeń. Bakterie wytwarzające fimbrie spiralne stymulują w organizmie gospodarza produkcję cytokin prozapalnych, tj. IL-8. Co więcej, szczepy te charakteryzują się wyższym poziomem oporności na przeciwbakteryjny peptyd katelicydynę (LL-37). LL-37 hamuje polimeryzację genów kodujących główną podjednostkę strukturalną CsgA, co zapobiega adhezji bakteryjnej i tworzeniu biofilmu w warunkach in vitro. W chwili obecnej poszukiwane są nowe strategie terapeutyczne zakażeń szczepami UPEC, gdzie istotne zastosowanie mogą mieć chemiczne inhibitory biosyntezy fimbrii spiralnych [28, 55].

Innym ważnym polimerem obecnym w EPS szczepów E. coli jest celuloza będąca liniowym łańcuchem β-(1,4)-monomerów glukozy. W 2001 r. po raz pierwszy opisano wytwarzanie celulozy przez bakterie rzędu Enterobacterales. Ekspresja genów syntezy celulozy jest zazwyczaj uzależniona od głównego regulatora tworzenia biofilmu, czyli CsgD [28]. Ważną rolę w promowaniu kolonizacji dróg moczowych oraz tworzeniu biofilmu przez szczepy UPEC odgrywa również antygen 43 i fimbrie typu 1 [28, 55]. Fimbrie typ 1 pełnią ważną funkcję w zakażeniach dróg moczowych, gdyż biorą udział w stymulowaniu bakteryjnej autoagregacji i formowaniu biofilmu [55]. Co więcej, Floyd i wsp. [19] wykazali, że bakterie eksprymujące fimbrie typu 1 tworzą głównie górną warstwę biofilmu, gdzie zapewniony jest dostęp powietrza. Spadek stężenia tlenu prowadzi do znacznej redukcji ekspresji fimbrii typu 1 na powierzchni komórek bakteryjnych. Na podstawie tych badań można wywnioskować, że prężność tlenu, przynajmniej częściowo, reguluje ekspresję fimbrii typu 1.

Szczepy UPEC, będące czynnikiem etiologicznym 75–95% przypadków ZUM, kodują wiele różnorodnych czynników wirulencji, tj. systemy biosyntezy i transportu sideroforów, receptory OM dla sideroforów, toksyny, białka Usp i Ag43 oraz charakteryzują się zdolnością do tworzenia biofilmu [34, 38, 55, 60]. Potencjał wirulentny UPEC umożliwia nie tylko kolonizację układu moczowego, lecz również ułatwia drobnoustrojom utrzymywanie się w obrębie dróg moczowych nawet przy silnej odpowiedzi układu odpornościowego gospodarza. Ponadto wiele determinant wirulencji umożliwia UPEC dostęp do niezbędnych składników odżywczych, kolejno ich wzrost i namnażanie nawet w tak nieprzyjaznym środowisku jak drogi moczowe. Co więcej, niektóre czynniki wirulencji przyczyniają się do uszkodzenia komórek, co warunkuje dostęp do głębszych tkanek gospodarza [6, 55].

W Polsce, podobnie, jak i na całym świecie, ZUM wywołane przez szczepy UPEC, stanowią ogromne zagrożenia dla zdrowia publicznego. W związku z powyższym, tak cenna jest wiedza na temat czynników wirulencji uropatogennych szczepów E. coli, która może przyczynić się do opracowania nowych opcji terapeutycznych w profilaktyce i leczeniu ZUM i/lub zaowocować rozwojem nowych metod diagnostycznych [55].